專利名稱：：一種提高2-酮基-l-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonicacid，KGA)又稱維生素C，簡(jiǎn)寫為KGA，本發(fā)明涉及一種維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。通過研究微量元素液(金屬離子、維生素、氨基酸)對(duì)維生素C發(fā)酵的影響，得到維生素C發(fā)酵最顯著的影響因素。
背景技術(shù)：
：維生素C，又稱抗壞血酸，作為人體必需的一種維生素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于制藥、食品、飲料、化妝品和飼料等工業(yè)中。隨著維生素c應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，維生素c的市場(chǎng)需求量也在不斷的增長。最早實(shí)現(xiàn)維生素c工業(yè)化生產(chǎn)的工藝是德國Reichstein于1934年發(fā)明的五步化學(xué)反應(yīng)和一步生物轉(zhuǎn)化，先將葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-Gulonicacid，2-KGA)，再經(jīng)酯化生成維生素C。但該法存在能耗高、消耗大量有機(jī)溶劑、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。因此需要開發(fā)更經(jīng)濟(jì)、更具有競(jìng)爭(zhēng)力的生物轉(zhuǎn)化法或完全生物轉(zhuǎn)化法。與"萊氏法"生產(chǎn)維生素C的六步化學(xué)反應(yīng)相比，用微生物從D-山梨醇或D-葡萄糖經(jīng)兩步發(fā)酵生成2-KGA，再經(jīng)甲醇酯化生產(chǎn)維生素C的生物技術(shù)法具有工藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低廉，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。玉米漿是玉米淀粉等產(chǎn)品加工過程中的浸泡水經(jīng)濃縮至含固形物70%左右后得到的副產(chǎn)品，其構(gòu)成成分較復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上(按干基計(jì))，氨基酸、生物素和維生素(如煙酸等)含量較豐富。玉米漿作為一種較好的微生物生長或代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)劑已廣泛應(yīng)用于酶制劑、抗生素、生化藥物等眾多發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)過程。在維生素C發(fā)酵過程中，玉米漿批次之間的差異會(huì)造成2-KGA的產(chǎn)量和發(fā)酵周期不穩(wěn)定。確定菌體生長和產(chǎn)酸需要的特殊生長因子是控制2-KGA生產(chǎn)穩(wěn)定性的先決條件。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是得到一種維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。檢測(cè)玉米漿中的主要微量元素(金屬離子、維生素、氨基酸)，并利用微量元素混合液代替玉米漿進(jìn)行維生素c發(fā)酵，研究維生素c發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。本發(fā)明的技術(shù)方案一種提高2-酮基-L-古龍酸KGA發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，2-酮基-L-古龍酸又稱維生素C，確定維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素，采用正交試驗(yàn)來考察金屬離子混合液、氨基酸混合液及維生素混合液在維生素C發(fā)酵中的作用；在得出金屬離子混合液是細(xì)胞生長、KGA合成和L-山梨糖消耗的顯著影響因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)考察各種金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響；發(fā)現(xiàn)，增加Mg^濃度能促進(jìn)KGA合成，是維生素C發(fā)酵的顯著影響因素；利用氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"okc^"ojc>y/^w)IFO3293和巨大芽孢桿菌(5ac"/wsmegafen'i/w)ATCC21916為生產(chǎn)菌株；優(yōu)選后確定的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5,玉米漿粉5，用硫酸鎂或氯化鎂調(diào)節(jié)Mg"濃度達(dá)到0.17g,磷酸二氫鉀1;pH6.7-7.0;搖瓶培養(yǎng)條件將3(TC、200rpm下培養(yǎng)18h的混菌種子以10。/。的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于3(TC、200rpm條件下培養(yǎng)72h。采用優(yōu)化組合進(jìn)行維生素C發(fā)酵的KGA產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為75.2g/L和0.94g/g，與普通培養(yǎng)基相比，KGA產(chǎn)量(67g/L)和產(chǎn)率(0.84g/g)分別提高了12.24%和11.9%。1、菌株巨大芽孢桿菌ATCC21916(萬flc說w5megflteWwm，俗稱大菌)、氧化葡萄糖酸桿菌IFO3293(G7wco"o6acterojqy&附，俗稱小菌)，購自美國典型微生物菌種保藏中心。兩種菌株進(jìn)行混合種子培養(yǎng)，即為混菌種子。2、培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基(g/L):山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3,玉米漿粉0.15，尿素1，碳酸鈣1，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀1;瓊脂20(斜面培養(yǎng)基)，pH6.7-7.0。優(yōu)選試驗(yàn)所用發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5，硫酸鎂0.1，磷酸二氫鉀1，微量液根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求添加；pH6.7-7.0。所述微量液由金屬離子混合液，維生素混合液及氨基酸混合液根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求組成。所述金屬離子混合液CaCl23.48g,CuCl20.02g，NaC18.96g，ZnCl20.35g，KC189.99g，KH2P0429.75g，MgCl26H20128.67g,MnCl2'4H200.27g，F(xiàn)eCl3'6H201.54g，自來水定容至1L;所述維生素混合液維生素B,0.09mg，維生素B20.59mg，維生素B32.3mg，維生素B62.4mg，維生素B120.12mg，煙酸23.00mg，泛酸0.02mg，生物素0.03mg，自來水定容至1L;所述氨基酸混合液甘氨酸18.40g，酪氨酸5.30g，精氨酸10.40g，脯氨酸27.70g，谷氨酸51.40g，絲氨酸13.60g，丙氨酸38.20g，亮氨酸32.20g，蘇氨酸11.90g，組氨酸9.00g，賴氨酸8.80g，纈氨酸19.60g，甲硫氨酸7.40g，異亮氨酸11.60g,苯丙氨酸11.20g，天冬氨酸20.25g,半胱氨酸1.40g，自來水定容至1L。3、搖瓶培養(yǎng)將30°C、200rpm下培養(yǎng)18h的混菌種子以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于3(TC、200rpm條件下培養(yǎng)72h。優(yōu)選后確定的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5，玉米漿粉5，硫酸鎂或氯化鎂調(diào)節(jié)Mg^濃度達(dá)到0.17g,磷酸二氫鉀1;pH6.7-7.0。KGA濃度的測(cè)定高效液相色譜(HPLC)儀器Agilent1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測(cè)器、視差折光檢測(cè)器和工作站)，色譜條件色譜柱AminexHPX-87H(300mmx7.8mm);流動(dòng)相0.4mmol/LH2SO4;流速0.5mL/min;柱溫35°C;檢測(cè)器UV:210nm;進(jìn)樣體積5^lL。樣品制備精確吸取0.1mL的發(fā)酵液加入0.9mL去離子水中，混勻，按發(fā)酵液:ZnS04(72g/L):K4Fe(CN)6'3H20(36g/L)=l:l:l的比例混合均勻，13000r/min離心lOmin，過濾，進(jìn)樣。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用三種混合液替代玉米漿，得出金屬離子混合液是影響細(xì)胞生長、KGA合成的最重要因素，其中Mg^是KGA合成的最顯著影響因素。采用優(yōu)化組合進(jìn)行維生素C發(fā)酵的KGA產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為75.2g/L和0.94g/g，與普通培養(yǎng)基相比，KGA產(chǎn)量(67g/L)和產(chǎn)率(0.84g/g)分別提高了12.24%和11.9%。圖1三種混合液正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析△KGA;□菌體濃度；o山梨糖消耗；xKGA產(chǎn)率。圖2三類金屬離子正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析AKGA;o菌體濃度；o山梨糖消耗；xKGA產(chǎn)率。圖3Mg2+，Ca2+，Zr^+正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析△KGA;□菌體濃度；〇山梨糖消耗；XKGA產(chǎn)率。具體實(shí)施例方式經(jīng)檢測(cè)玉米漿中金屬離子含量、氨基酸含量和維生素含量如表l-表3所示表l玉米漿中金屬離子含量<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2玉米漿中氨基酸含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例1三種混合液對(duì)維生素c發(fā)酵的影響采用正交試驗(yàn)來考察金屬離子混合液、氨基酸混合液和維生素混合液在維生素C發(fā)酵中的重要作用。按照丄25(53)正交試驗(yàn)因素水平表安排正交試驗(yàn)，其中各種混合液的水平是玉米漿中各氨基酸、維生素、金屬離子混合液含量的倍數(shù)。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4、表5。表4￡25(53)正交試驗(yàn)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據(jù)Montgomery(1991)的方法，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了直觀分析，結(jié)果如圖1所示。可以看出，在所選擇的濃度范圍中(1)金屬離子混合液是影響混菌細(xì)胞生長、L-山梨糖消耗和KGA合成的最重要因素；(2)增加氨基酸混合液的濃度也可以促進(jìn)細(xì)胞生長和KGA合成，但對(duì)L-山梨糖消耗沒有顯著影響；(3)增加維生素混合液的濃度對(duì)細(xì)胞生長、L-山梨糖消耗和KGA合成都沒有顯著影響。實(shí)施例2金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，按照金屬離子對(duì)KGA合成途徑的關(guān)鍵酶L-山梨糖脫氫酶的作用分為三組(l)對(duì)L-山梨糖脫氫酶有激活作用的離子Mg2+，Ca2+，Zn2+;(2)對(duì)L-山梨糖脫氫酶有抑制作用的離子Cu2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+;(3)其它離子K+，Na+，Cr2+。P加入第三類金屬離子中，一并考查。同樣采用正交實(shí)驗(yàn)來考查這三類金屬離子在維生素C合成中的重要作用。按照丄16(43)正交試驗(yàn)因素水平表安排正交試驗(yàn)，氨基酸和維生素的含量分別為5倍和l倍。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6、表7。表6￡16<;43)正交試驗(yàn)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>及實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)Montgomery(1991)的方法，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了直觀分析，結(jié)果如圖2所示。可以看出，在所選擇的濃度范圍內(nèi)(l)第一組金屬離子是影響KGA合成和L-山梨糖消耗的最重要因素，其對(duì)混菌菌體生長和KGA產(chǎn)率也有一定促進(jìn)作用；(2)增加第二組金屬離子的濃度可以抑制KGA合成，降低KGA產(chǎn)率，但對(duì)細(xì)胞生長和L-山梨糖消耗沒有顯著影響；(3)增加第三組金屬離子的濃度對(duì)細(xì)胞生長、KGA合成和L-山梨糖消耗也有一定促進(jìn)作用。實(shí)施例3第一組金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響在實(shí)施例2基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用正交試驗(yàn)方法考查第一組金屬離子(Mg2、Ca2+，Zr^+)對(duì)KGA合成中的重要作用。按照丄16(43)正交試驗(yàn)因素水平表安排正交試驗(yàn)。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8、表9。表8丄16(;43)正交試驗(yàn)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了直觀分析，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，在所選擇的濃度范圍內(nèi)(1)增加Mg"濃度可以促進(jìn)KGA合成，但對(duì)細(xì)胞生長和L-山梨糖消耗沒有顯著影響；(2)增加Ca+，Zr^+濃度對(duì)細(xì)胞生長、KGA合成、L-山梨糖消耗都沒有顯著影響。實(shí)施例4培養(yǎng)基中玉米漿濃度為5g/L，培養(yǎng)基中MgS+濃度為玉米漿中Mg"濃度的2倍，即培養(yǎng)基中Mg^濃度達(dá)到0.17g/L時(shí)，KGA產(chǎn)量最高。選取批次不同的五種玉米漿，分別記為A，B，C，D，E。分別檢測(cè)各批次的Mg^含量，用于維生素C發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表IO。表10各批次玉米漿的Mg^含量及實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用MgS04調(diào)節(jié)玉米漿中Mg^含量，使培養(yǎng)基中Mg^濃度達(dá)到0.17g/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表11所示?？梢钥闯稣{(diào)節(jié)Mg^濃度后，各批次的KGA產(chǎn)量明顯提高，且各批次間差異顯著減小。結(jié)果表明，控制玉米漿中的Mg^含量能夠顯著提高維生素C生產(chǎn)穩(wěn)定性。表ll調(diào)節(jié)Mg^濃度后各批次玉米漿的發(fā)酵結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種提高2-酮基-L-古龍酸KGA發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，2-酮基-L-古龍酸又稱維生素C，其特征是確定維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素，采用正交試驗(yàn)來考察金屬離子混合液、氨基酸混合液及維生素混合液在維生素C發(fā)酵中的作用；在得出金屬離子混合液是細(xì)胞生長、KGA合成和L-山梨糖消耗的顯著影響因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)考察各種金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響；發(fā)現(xiàn)，增加Mg2+濃度能促進(jìn)KGA合成，是維生素C發(fā)酵的顯著影響因素；利用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)IFO3293和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)ATCC21916為生產(chǎn)菌株；優(yōu)選后確定的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5，玉米漿粉5，用硫酸鎂或氯化鎂調(diào)節(jié)Mg2+濃度達(dá)到0.17g，磷酸二氫鉀1；pH6.7-7.0；搖瓶培養(yǎng)條件將30℃、200rpm下培養(yǎng)18h的混菌種子以10％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于30℃、200rpm條件下培養(yǎng)72h。全文摘要一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。2-酮基-L-古龍酸KGA又稱維生素C，本發(fā)明用三種混合液代替玉米漿，采用正交試驗(yàn)考察金屬離子混合液、氨基酸混合液及維生素混合液在維生素C發(fā)酵中的重要作用。在得出金屬離子混合液是細(xì)胞生長、KGA合成和L-山梨糖消耗的最顯著影響因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)考察各種金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響。發(fā)現(xiàn)，增加Mg²⁺濃度可以促進(jìn)KGA合成，是維生素C發(fā)酵的最顯著影響因素。采用優(yōu)化組合進(jìn)行維生素C發(fā)酵的KGA產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為75.2g/L和0.94g/g，與普通培養(yǎng)基相比，KGA產(chǎn)量(67g/L)和產(chǎn)率(0.84g/g)分別提高了12.24％和11.9％。文檔編號(hào)C12P39/00GK101338335SQ200810021590公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月7日優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日發(fā)明者杰劉,劉立明,靜張,堅(jiān)陳申請(qǐng)人:江南大學(xué)