專利名稱：鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素 (PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其 吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin,簡稱CPE)、藻紅 藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin,簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍(lán)蛋 白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基 中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。 藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā) 射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的 可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nni的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒 光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié) 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素 為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號放大作 用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和醫(yī)療檢測等 領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。
PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。與前人的方、法不同，我 們發(fā)現(xiàn)Anabaena sp. PCC7120中a115339基因編碼betal55裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源 的betal55裂合酶。這類betal55裂合酶不僅能催化藻藍(lán)膽素PCB與PEC的beta亞基及其同 源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基 (或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了 PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。 藻紅膽素PEB可由HOl、 PebA、 PebB協(xié)同催化生成(Alvey,R.M.，Karty，J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated LightRegulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10), 2448-2463 (2003))。通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基 因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基 蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過 化學(xué)交聯(lián)等方法實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。藻紅藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的 連接，可用于生物學(xué)檢測以及醫(yī)療檢測領(lǐng)域。這種結(jié)合PEB的新型藻紅藍(lán)蛋白，為開發(fā)新型 熒光探針提供了更多的選擇。本方法為藻紅藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝 品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合的藻紅膽素(PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒 光蛋白質(zhì)的制備方法，它是應(yīng)用betal55裂合酶催化PEB與鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類 脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備新型藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)(天然狀態(tài)下藻紅藍(lán)蛋白類脫 輔基蛋白是與PCB結(jié)合)。將含有betal55裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔 基蛋白基因拼接的基因、PEB生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程 菌，通過如此設(shè)計(jì)的基因工程菌生產(chǎn)新型鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋 白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到 betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因 拼接后克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和pW5或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和/ eZ^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe似或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到/ e^表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe力i9 表達(dá)質(zhì)粒和pe^表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相 應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻 紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案也可以是這樣的 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和 鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力W和pe65或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到Zw/和peZ^表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因/^W或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到pe/^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 將betal55裂合酶和鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力W和pe力5表達(dá)質(zhì) 粒和pe似表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工 程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的 宿主菌為大腸桿菌；所述的betal55裂合酶基因是指與Aa力am3 sp. PCC7120中a"M^^基 因同源的基因；所述的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^朋&e朋sp. PCC7120或 7a/z y/jams sp. PCC7603中pec萬基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)，大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型藻紅藍(lán)蛋白，具有與天然藻紅藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒 光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖1為本發(fā)明中A115339催化下生成的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光
蛋白質(zhì)的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例1
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M ^肌';70SiAS sp. PCC7603和CWoMr&sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力/jaZ^e朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec仏a"53J久力o7); yK 7a7U'/7a /s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(peci9); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe/^)。通過基因工程方法，將力朋&e/7a sp.PCC7120中的aW5^J9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7753J9，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a6a朋a sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pecA和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼在pET30中在tT/w I和5^n兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 pec^在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a"MW在pETDuet-1 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和J/ o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶和peM)， 力W和voeZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afcol禾卩,"1之間，/ e^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和J7 o I之間，/ e似在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)v ^ I1和 J力ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet—a^55J久pET30-sa~pec5、 pCDFDuet—Z o7—peZ^和pACYCDuet—peM轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。其吸收與熒 光光譜見圖l所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜;取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g, 4'C)棄去 上清，收集沉淀菌體;用lmL預(yù)冷的O. lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g, 4'C) 去上清，菌體沉淀用100nL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好 的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min, 42。C熱休克90s，冰浴5rain后加入300nL LB培養(yǎng)基，37°C 低速振蕩培養(yǎng)45min,無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至 形成可見的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 5-0. 7時(shí)， 冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、20°C、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收集細(xì) 胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大量表 達(dá)。
實(shí)施例2
(1)從GeneBank中可以查到，藻種^朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
M 7柳i/ms〃s sp. PCC7603和Ca"t/ n> sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^3a力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(peM、 aWMJA力o7);
血Ja肌'"o^ys sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(pec"); Cs7"/ w';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe6")。通過基因工程方法，將v^a&e朋 sp.PCC7120中的aWM，效基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775^3義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^/7a6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec萬(C84A)和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-^-pec^(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ e力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa在pET30中在^ " I和《WII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 pec5(C84A)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W75^^效在 pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)餘7II和J力ol之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶 j e^和pe力5)，力o7和； eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，/ o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和 At I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和i7 o I之間，在pACYCDuet-l中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)^711和化o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aW5^J義pET30-sa"pec5(C84A) 、pCDFDuet-力o7-pe力^和pACYCDuet-
轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腦ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， ;K 7a/wV osfAS sp. PCC7603和CaJ"力ri;r sp. PCC7601部分序列己經(jīng)測定。力/7a力ae/7asp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec^、 s"5"M^、力oO; 必7a歷i/jasiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(z ec^); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。e/^和peZ^)。通過基因工程方法，將A^力a朋a sp.PCC7120中的aW53，效基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a^5^JA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-^-pecA鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔 基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)恥l和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; e^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因pec5拼接后連接到pC0LADuet的fcoR I和尸"
I之間；裂合酶基因a^5^J^在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^1I和J力oI之間；
PEB合成酶基因是3個(gè)(力o/、 pe似和peM)，力o/和pe65在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)餘o I和Z5" I之間，/ eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和J力o I之間，/ e似 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《^1I和J7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a"5JJ久pCOLADuet-sa~pecA pCDFDuet-力o -; eZ^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0"。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^/7a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， ^ 7a7u77as〃s sp. PCC7603和sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力朋Z ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因。ec^、 a"53J義Z o7); M 7a肌'/70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(peci9); Ca7"Arz';sr sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe/W和/ eZ^)。通過基因工程方法，將^ 3力3e/ a sp.PCC7120中的aL^^9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7753JA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7atee朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pecS (C84A)和鏈霉
親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫
pC0LADuet-幼-pec5 (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo) 記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; e似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因^和脫輔基蛋白基因pecS (C84A)拼接后連接到pCOLADuet的化oR I和尸"I之間；裂合酶基因a"5^J9在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^711和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶/ e^和/ e65)，力o7和pe6A在同一個(gè)載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)I和J力o I 之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 )將pETDuet-、pCOLADuet-sa~pec5(C84A) 、 pCDFDuet-力o7-peZ A和 pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1睡1/L， 20。C至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋 白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5
(1)從GeneBank中可以査到，藻種細(xì)6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
必7a/w'/ os"s sp. PCC7603和Ca7"力ri;r sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^ a^e/7a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec5、 s775^3^、力o7);
vK 7a/w'/ osi/s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(/;eci9); CW"力/7'jf sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(和peZ^)。通過基因工程方法，將」朋6朋朋 sp. PCC7120中的a7^5M9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，藻紅藍(lán)蛋白類 脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-l 中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-pec^ -aWM滯，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶 以及鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe6歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力W-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM,在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因； e"拼接后連接到pETDuet的fcoR I和尸"I 之間，a〃5M9處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5Wn和之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶
和peM)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和 尸"I之間，pe65在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)甜e I和Z力o I之間，pe/W在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"/ ec^"a"5^R pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入大腸桿
菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培
養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D卿為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl
thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，
生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞,
加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例6
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Zg/M'/ o iAssp. PCC7603和6^"/ ri;rsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^7a力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(/ ec仏aW53J久力o7); 尨7a/w'/7oms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ecv9); C^"/^i^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ eM和/ eZ^)。通過基因工程方法，將」朋6ae/7a sp. PCC7120中的a^M^效基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，藻紅藍(lán)蛋白類 脫輔基蛋白基因/ ecMC84A)和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-^-pecMC84A) -a^^JJA在大腸桿菌中能表 達(dá)betal55裂合酶以及鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; eZ^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因(C84A)拼接后連接到pETDuet的￡boR I 和At I之間，a"5J滯處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ 711和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè) (力o厶/7eW和peM)， Z o7和/ eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)
I和At I之間，； eZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)T^/e I和i7 o I之間，在pACYCDuet-1中 第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^WII和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-sa"pecMC84A)-a^5"J滯、pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親 和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例7
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種A a6朋y a sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， ^ 7ayz/i/ o^As sp. PCC7603和Ca7"/ n>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^aAae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec5、 a775JJ9、力o7); #. 7柳i/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pecS); Ca7ot/ r& sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe/^)。通過基因工程方法，將 sp.PCC7120中的a^5"^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-aJ75^Jft在大腸桿菌中能表達(dá)betal 55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將M 7a啦';7asi/s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-幼-pecA鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表 達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋 白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe力幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得
質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。即鏈霉親和素基因幼在PET30中在^PT71和S《7II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 / ec^在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^5JJ^在pETDuet-l 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《711和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶z eM和peM)， 力o7和pe/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力W在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸W I之間， 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《711和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet—a775339、 pET30—s^; ec5、 pCDFDuet-力o7—/ e力5和pACYCDuet—/ eM轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例8
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
7a肌V7as"s sp. PCC7603和C^ot/^i;f sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。Z/7a/^朋a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec仏aL^M義力o7);
M 7a/w'/70s^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序
列中找到所需基因(pec萬)；Ca7"力n'義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(; eM和peZ^)。通過基因工程方法，將力朋力ae朋
sp.PCC7120中的W75"M9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫
pETDuet-a7753^^，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通
過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將尨Ja肌'/30s"s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^(C84A)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-^-pecA(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; eZ^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因^在pET30中在I和)5^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 pec5(C84A)在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a77MW在 pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處7II和i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶 pe/W和peZ^)， Z o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，Zw7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)7feo I和 尸"I之間，pe6i9在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)vWe I和/力o I之間，pe/W在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)和屈o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(5) 將pETDuet-a"^^從pET30-sa"/ ec"(C84A) 、pCDFDuet-力o7-pe力5和pACYCDuet-/ eW
轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0
的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD柳為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷
(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表
達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離
心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純
得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例9
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋Z ae朋sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， yK 7a/w'加s"s sp. PCC7603和sp. PCC7601部分序列己經(jīng)測定。^ a力3e朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec仏a^5^J義力o7); 必J柳^70s〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ecS); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因。eZ^和peZ^)。通過基因工程方法，將力/7a力朋朋 sp. PCC7120中的a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775^JA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將尨h/w'/7osiAS sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒叫 pCOLADuet-sa-/^c萬，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔 基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pe"拼接后連接到pCOLADuet的^boR I和尸" I之間；裂合酶基因a^5^3^在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和之間； PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入pe^禾[]pe/^)，力o7和pe力v9在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和,"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和Wo I之間，peZ^ 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ill和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在
18T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a^5J3久pC0LADuet-_sa~; ec5、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-peW 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^7a/ ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7柳i/jows sp. PCC7603和CaJ"/ rijf sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力/ aZ^e/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pecA a^5"義力o7);
7柳/77os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec5); Ca川t力ri^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和pe/ 5)。通過基因工程方法，將^73&e朋 sp.PCC7120中的a"MJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-aL^ ^，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將M 7柳i/7o幼s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pecS (C84A)和 鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒 叫pC0LADuet-幼-(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在 大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素 標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-/ e/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因(C84A)拼接后連接到pCOLADuet的^boR I和尸st I之間；裂合酶基因aW5^39在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《 7II和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 peM和pe^9)，力o/和/ e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l
中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vbo I和尸st I之間，pe/^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I
之間，pe^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《 711和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 )將pETDuet-a77M滯、pCOLADuet—sa"pec5(C84A) 、 pCDFDuet—力o7—pe力5禾口 pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋 白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1)從GeneBank中可以查到，藻種^ s6ae/7a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
iZ 7a/w'"osi^ sp. PCC7603和CaJ"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^7aZ ae/3a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pecA、 a775"M義力o7);
必7a/wV osiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序
列中找到所需基因。ecv ); Ca7"力rh sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pe/W和pe65)。通過基因工程方法，將^7a6ae朋
sp. PCC7120中的a775J，效基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，將必ia/w'/ws^
sp. PCC7603中藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/^c5和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆
于Novagen公司的pETDuet-1中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-pec^ -a775J3A在大腸
桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶以及鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe6歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因/ ec5拼接后連接到pETDuet的￡boR I和尸"I 之間，a"5M9處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)"^ II和J力ol之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 peM和pe65)，力o7和/ e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和 At I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7fefe I和化o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)和化o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"pec5^775"JW、 pCDFDuet-Z o7-pe/^和pACYCDuet-pe似轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培 養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，
加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親 和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例12
(1)從GeneBank中可以査到，藻種」朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
7a/w'/7os"s sp. PCC7603和sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力朋6ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec^、 a775JJA力o7);尨7柳i/ os"s印.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec^); CaA tAri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ e/^和pe/^)。通過基因工程方法，將力/73力ae/7a sp. PCC7120中的a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，將vK 7ayw'/ os〃s sp. PCC7603中藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因； ec萬(C84A)和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接 后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-peCi (C84A) -a7^^J義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶以及鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白 的融合蛋白。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因^和脫輔基蛋白基因pec^ (C84A)拼接后連接到pETDuet的fcoR I 和尸"I之間，a^MW處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^7II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè) peW和/jeM)，力o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn) Afco I和/^t I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Ato I和J力o I之間，pe/W在pACYCDuet-1中 第二個(gè)多克隆位點(diǎn)設(shè)7II和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-s3"pec^(C84A)-a^5^J久pCDFDuet-/w卜/ eM和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至006。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl
thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親 和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的betal55裂合酶、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、藻 紅膽素生物合成酶基因或其同源基因來制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻 力/7a6ae/ a sp. PCC7120和已經(jīng)部分測序的尨7a啦7 osi/s sp. PCC7603和Ca7oz^ri;r sp. PCC7601 為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施 本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒和pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征 在于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和 鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因AW和p&5或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和pe力5表達(dá)質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到/ e^表達(dá)質(zhì)粒；(4) 將betal55裂合酶和鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe65表達(dá)質(zhì) 粒和peM表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工 程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的betal55裂合酶基因是指與爿朋力ae朋sp. PCC7120中aW5J，效基因同源的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與^7a6ae/ja sp. PCC7120或?qū)?柳i/ aws sp. PCC7603中pec^基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應(yīng)用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻紅膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101481697SQ200810025688
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司