專利名稱：結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)別藻藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其 吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅 藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變?cè)逅{(lán)蛋 白(allophycocyanin，簡稱APC)。藻紅蛋白、藻紅藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白和變?cè)逅{(lán)蛋白含alpha (a )和beta ( P )亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔 基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白 的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使 得藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；藻紅藍(lán)蛋白吸收約570nm的 可見光，發(fā)射約630nm的熒光；藻藍(lán)蛋白吸收約620咖的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；變 藻藍(lán)蛋白吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。藻紅蛋白結(jié)合的輔基色 素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB);藻紅藍(lán)蛋白的alpha亞基結(jié)合的輔基色素 為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB);藻紅藍(lán)蛋白的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán) 膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB);藻藍(lán)蛋白和變?cè)逅{(lán)蛋白結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素 PCB。
藻膽蛋白具有提高人體免疫力，促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生等功能，能抑制癌細(xì)胞生長，對(duì)癌 細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷力，是一種無毒無副作用的理想光敏劑，可減輕腫瘤化療的副作用。藻膽 蛋白作為一種天然色素，也可作為高級(jí)天然色素應(yīng)用于食品和化妝品中。藻膽蛋白由于還具 有強(qiáng)烈的熒光性，在分子生物學(xué)上可用于制備熒光探針，適用于免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和 分子生物學(xué)等方面的研究。
在月/73力ae朋sp. PCC7120中aZrt^/7基因和5y"ec/wc/s"s sp. PCC 6803中sZrW必 基因分別編碼beta裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的beta裂合酶。這些beta裂合酶能催 化藻藍(lán)膽素與別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光 性質(zhì)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，beta裂合酶還能催化藻紅膽素(PEB)與別藻 藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，生成新型的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)。藻紅膽素 PEB 可由 H01 、 PebA 、 PebB 協(xié)同催化生成 (Alvey, R. M., Karty, J. A. etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10), 2448-2463 (2003))。在絕 大部分的藍(lán)藻和紅藻中，都存在有編碼藻紅蛋白脫輔基蛋白、藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白、變?cè)逅{(lán) 蛋白脫輔基蛋白、beta裂合酶以及藻紅膽素生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而 具有異形胞的藍(lán)藻中存在藻紅藍(lán)蛋白；隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的變?cè)逅{(lán)蛋白 的基因。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的藻 膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍(lán)藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723, 2002.04.17。 一種水華藍(lán)藻制備藻藍(lán)蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白。別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良 的熒光性質(zhì)，為了發(fā)展別藻藍(lán)蛋白類新型熒光探針，可以分子設(shè)計(jì)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。 本方法為別藻藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域奠定 了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法， 它是應(yīng)用beta裂合酶催化藻紅膽素與別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備結(jié)合PEB 的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；將含有beta裂合酶基因、別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因和藻紅 膽素生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過這種方法得到的 基因工程菌生產(chǎn)結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法， 其特征在于包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta 裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá) 載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o/和pe/^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到pe^表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力W和pe65表達(dá)質(zhì)粒及表 達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用 此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白 質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌;所述的beta裂合酶基因是指與加a力ae/ a sp. PCC7120中aZrt W7基因或5y/ ec力oc/s"s sp. PCC6803中Wri^必基因同源的基因；所述的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與力朋力ae朋 sp. PCC7120或5)77ec/ ocwz^s sp. PCC 6803中別藻藍(lán)蛋白基因同源的基因。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型別藻藍(lán)蛋白，具有與天然別藻藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒 光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖1為本發(fā)明制備的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcA的吸收與熒光光譜；其中 實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
圖2為本發(fā)明制備的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcA2的吸收與熒光光譜;其中
實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
圖3為本發(fā)明制備的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcB的吸收與熒光光譜；其中
實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
圖4為本發(fā)明制備的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcD的吸收與熒光光譜；其中 實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
圖5為本發(fā)明制備的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcF的吸收與熒光光譜；其中
實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例1
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^/7^朋朋
sp. PCC7120和分/ ec力ocj^"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^ a力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/ ocy"& sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因和pe亂 Calothrix sp.PCC7601己經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可 從所查到序列中找到所需基因(peM和； eM)。 A7a&e朋sp.PCC7120中的a化。W7基因克 隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a&M77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將力朋&e朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因aPd 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-3/ cA在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(; eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-z7e力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因apd在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 alrt^77在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 peW和peZ^)， hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和J力o I之間，在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5WII和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZr。^;7、 pET30-a/ cA pCDFDuet-hol-peM和pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。其吸收與熒光光譜見圖1所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為 熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C
振蕩培養(yǎng)過夜。取10(VL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C) 棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用IO(VL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu) 建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基， 37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培 養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5tnl含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 5-0. 7時(shí)， 冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光、20攝氏度、150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收 集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測(cè)其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大 量表達(dá)。
實(shí)施例2
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7atee/7a sp. PCC7120和5)77ec力oc/^is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y/ ec/ oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe65)。 爿朋tee朋sp. PCC7120中的aln^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7z^W 7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將^7a6a朋asp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apcA 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-apc^，在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A2。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe6歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o7-/)eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵cA在pET30中是在化oRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 a7r0^^在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、pe^和pe65)， hol和pe/bi9在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe65 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)A^e I和J力o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《^11和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a7i"W77、 pET30-apcA、 pCDFDuet-ho1-; e力5和pACYCDuet-/ e^轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L, 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。其吸收與熒光光譜見圖2所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為 熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例3
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種力/ja&朋a sp. PCC7120和5>77ec/ ocys"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。/1/ a力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y/ ec/ oc/"j's sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(一 和peM)。 ^7a&e"a sp. PCC7120中的Wr。W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7rW77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將力朋Z^朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵" 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-3pcA在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/w/和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7了eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵M在pET30中是在^boRV和Wo I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因WrOW7在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、pe^和； e力v9)，hol和pe^9在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe/W在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J力o I之間，在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)S^II和J/wI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a7r膨7、 pET30-邵cS、 pCDFDuet-hol-peM和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophylthio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l謹(jǐn)ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。其吸收與熒光光譜見圖3所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式于實(shí)施例1相同。實(shí)施例4
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種^7sZ^e/7asp. PCC7120和分/ ec/ oc/s"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。A 3tee/7S sp.PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y/7ec力ocy"A sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和pe力萬)。力朋tee/ a sp.PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sZn9577，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將^a/^e朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因砂c"克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-apcA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在fcoRV和oI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a7rW77在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 peZ^和peM)，hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Aye I和J力o I之間，/^W在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ 7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZrt^77、 pET30-apc從pCDFDuet-hol-/ e/^和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。其吸收與熒光光譜見圖4所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種A7aAae/7a
sp. PCC7120和分/7ec/ ocy"A sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成?！古?ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 6>/ ec/ oc/"^s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為
BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因
序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pe似和/^A")。
」朋tee朋sp. PCC7120中的a^rt^/7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sZr^/ 7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將勘^朋朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵C 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-a/x:尸，在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 37^ W7在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 /7eW和/ e力^)， hol和pe/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe/W 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)；We I和Z力o I之間，peM在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《^1I和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a7r。577、 pET30-spc,、 pCDFDuet-hol-/ e力5和pACYCDuet_/ eiM轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37X:振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。其吸收與熒光光譜見圖5所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為 熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例6
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種力"a力se"asp.PCC7120和分/7ec力ocj^z^s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/ oc;^tis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和/ eM)。 5>/7ec/ oc_Kstis sp. PCC 6803中的slr2似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- ^j"i，似仏在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將^ afee朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apd 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-a/ cA在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和； eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peZ^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵"在pET30中是在fcoRV和i7wl兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 Wt^似9在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 和； e65)， hoi和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hoi在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)A^e I和J/w I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- W/^似久pET30-apcA pCDFDuet-hoi-pe/ 5和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于PH7.0的
LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代_(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl
thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，
生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破
碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例7
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^ a力a朋a sp. PCC7120和5>/7ec/ ocy"J's sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^"Wae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5y/7ec力oc7stis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pe^和pe力萬)。 5y/ ec力ocj^tis sp. PCC 6803中的s7/^似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- Wri"似A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將勘W朋朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵cA 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-邵c丄，在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A2。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力W-; eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因apc4在pET30中是在^boRV和o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 W/^^^在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 和peZw9)， hol和pe65在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，/^A》 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofe I和i7 o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和 i7wl之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- s7r2,、 pET30-apd pCDFDuet-hol-peM和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D咖為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l國ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例8
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7a&朋s sp. PCC7120和5>/7ec/ ocj^"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^7a力ae"a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y"ec/ oc/"^ sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe65)。 5y"ec力ocj^"s sp. PCC 6803中的WriY^9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- W/^ 必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將力朋/^e朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因a;x^ 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-邵cA在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜/ eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-z eM,在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c萬在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 Wr^似^在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、pe^和peZ^)， hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofe I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《§711和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- s7/^似久pET30-a/7c& pCDFDuet-ho1-/ e/^和pACYCDuet-pe/W轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例9
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7a&朋a sp. PCC7120和5y/ ec力ocy"A sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/ oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。 5>/7ec/ oc/sZ^s sp. PCC 6803中的s7t^似^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- ^/^似5>，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將^3/^朋sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c" 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-a; cA在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和/ e/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在fcoRV和J/ o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 Wri^49在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 和peM)， hol和/ e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe力S 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《g7II和 之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- sZri^4久pET30-pCDFDuet-hol-pe/^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種^7a&e/7a sp. PCC7120和6y朋c/ ocj^^s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。勘a6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/ oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe65)。 5>/7ec/ ocyWis sp. PCC 6803中的slriY^9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- W/^。必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將七W朋/7a印.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵W 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-apc尸，在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe力A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eZ^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得
質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e/^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因a; c,在pET30中是在化oRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因sJri^^9在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 pe^和/ e65)， hol和pe/bi9在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，/ eZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Afefe I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)勘7II和 X/ o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- s7riY^久pET30-a/ c尸、pCDFDuet-hol-pe/^和pACYCDuet-/ e力力轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種力朋6朋朋 sp. PCC7120和5y/7ec/ oc/"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。Z朋tee/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， ^y/ ec/wc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因。e似和peM)。 Z朋Z ae/7a sp.PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-alrt^77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5y"ec力oc/"^s sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因邵d克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-apcA在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-;;eM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因即d在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 a7r^77在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 peM和peZ^)， hol和； e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7VWe I和i7 o I之間，peM在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)i5^7II和 oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZrt W7、 pET30-apd、 pCDFDuet-hol-pe/ 5和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 2CTC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例12
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^^&朋a sp. PCC7120和5y"ec力ocy"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，加ec/ ocp"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。e/M禾tl pe力萬)。 力朋tee朋sp.PCC7120中的3//^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7/^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 應(yīng)用基因工程方法將5J77ec力ocy"" sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因apc^克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-apc"，在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o7-/ e/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eZ^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵M在pET30中是在feoRV和屈ol兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 a7rW77在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 peM和pe力")， hol和； eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，/ e/^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofel和i7wl之間，； e^/在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)i5^II和 屈ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a7r。W7、 pET30-邵c仏pCDFDuet-hol-/7eZ 5和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例13
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7a&e/7a
sp. PCC7120和5y/ ec力ocy"j's sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^a力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5>77ec/ oc/Wis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為
BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因
序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe/W和； eZ^)。
^ a6se/7a sp. PCC7120中的a化M77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a77^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將Sj7^c力M乂s"s sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因apc/ 克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-邵cA在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/7e/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在A"RV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 aZrt W7在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 peZ^和peZ 5), hol和pe6A在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，peZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Abte I和J力o I之間，/7eM在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^§711和 I力oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-alrt W7、 pET30-a; cZ 、 pCDFDuet-ho1-/ e力5和pACYCDuet-pe/M轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-|3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例14
(l)采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種^^fe朋a
sp. PCC7120和分朋c力oc/stis sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y"ec力ocy"i5 sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(一 和pe亂 爿朋力ae朋sp. PCC7120中的aZr。W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7^ W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5>/7eC/ OC/"A sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因3pcf克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-3^c尸，在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w卜peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; e/^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和J力ol兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 aZrt W7在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 和pe力5)， hol和pei^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，； e^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Afefe I和i7 o I之間，pe/^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^711和 J/ o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZrt W7、 pET30-邵c尺pCDFDuet-hol-pe/^和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例15
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。藻種力/7a6s朋a sp.PCC7120和6y/ ec力oc/s"'s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。如36ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 6y"ec/wc/"ys sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。 5"/"ec力ocystis sp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- W/^似A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5y/jec力ocy"A sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因邵"克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-邵cA在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和； eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵d在pET30中是在AcoRV和J/w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 WriY 必在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 pe^和 hol和/ e力i9在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J力o I之間，peZ^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^11和 勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- WriY^久pET30-a/ c力、pCDFDuet-hol-/ e65和pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH7.0的
LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophylthiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例16
(1) 釆用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種力朋6朋朋 sp. PCC7120和5y"ec力oc/s〃s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^ a力ae"a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y/2ec力oc7"A sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peZvl和pe6萬)。 分77ec/ ocys"s sp. PCC 6803中的W/^ 必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- WriV必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5y"ec/wc/"" sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因邵M克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-a/ c&在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(Ao7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜pe6A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-z eM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵"在pET30中是在fcoRV和Z/w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 slr^ 必在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 pe^和peZ^)， hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，/ e力5 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J/ o I之間，在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5WII和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- sZr^^久pET30-a/ c^、 pCDFDuet-ho1-; e/^和pACYCDuet-pe/^/轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0仄。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例17
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7s&朋a sp. PCC7120和^Sy/ ec/ oc/"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。A a力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 5y"ec力ocystis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601己經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe/W和pe65)。 5y/7ec/wcys"s sp. PCC 6803中的slri"似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- WriY 必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，禾偶相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5y朋c力oc;^n's sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因邵c"克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-即c"，在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w/-/ eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c/ 在pET30中是在^boRV和Wol兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 s7r2W9在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、 和p"5), hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，pe65 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和Io I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^711和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- WriV^1、 pET30-spcA pCDFDuet-ho1-peZ^和pACYCDuet-pe力力轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例18
(1) 采用基因工程方法，可以從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中査到。藻種^7a&朋s sp. PCC7120和6>/7ec/wcj^"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測(cè)定完成。^a力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019， 6y/ ec/ oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為 BA000022，可從全序列中找到所需基因；Calothrix sp.PCC7601已經(jīng)部分測(cè)序，所用到基因 序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe65)。 5y/ ec力ocy"is sp. PCC 6803中的sZri"似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pETDuet- W/^^A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 應(yīng)用基因工程方法將5y/7ec力oc/"is sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因apc尸克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-a/ cF，在大腸桿菌中 能表達(dá)脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在AcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因
sZri似9在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，PEB合成酶基因是3個(gè)(hol、peM和peM)，hol和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，hol在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Nco I和Pst I之間，/ e/^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和X力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)。上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- s^r^似久pET30-a/ c尸、pCDFDuet-hol-/ e/^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的beta裂合酶、別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白和藻紅膽 素生物合成酶基因或其同源基因來制備結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生 物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中己公開全序列的藍(lán)藻A a力ae/7a sp. PCC7120 和5y/7ec力ocj^z^s sp. PCC6803，已經(jīng)部分測(cè)序的sp. PCC7601為例對(duì)本發(fā)明方法 加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒及pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指與^7a^朋a sp. PCC7120中a^rt 《77基因或5)v7ec/ ocystis sp. PCC 6803中s7riY^9基因同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是 指與^7a6ae朋sp. PCC7120或6>/7ec/ oc/"is sp. PCC 6803中別藻藍(lán)蛋白基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應(yīng)用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻紅膽素(PEB)與別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法；別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101481698SQ200810025689
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請(qǐng)人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司