專利名稱：結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種結合藻紅膽素(PEB)的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(all叩hycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nra的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley A J, Cai Y A， GlazerA N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98 (19): 10560 10565)。我們發(fā)現，藻藍蛋白alpha亞基裂合酶不僅可以催化PCB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結合，還能催化藻紅膽素PEB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結合。通過基因工程技術，藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白；把藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表達載體。利用以上表達載體，通過基因工程菌，可以直接生成結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領域。結合PEB的藻藍蛋白類熒光蛋白質具有與天然藻藍蛋白不同的光譜特性可為生物學檢測以及醫(yī)療檢測提供更多選擇。本發(fā)明為藻藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用于醫(yī)藥和生物工程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的方法。 它是應用藻藍蛋白alpha亞基裂合催化藻紅膽素(PEB)與藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共 價結合，制備結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。將含有藻藍蛋白alpha亞基裂 合酶基因、藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達質粒依 次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產結合PEB的藻藍蛋 白alpha亞基類熒光蛋白質。
本發(fā)明的技術方案是這樣的 一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的 制備方法，其特征在于包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到 alpha亞基裂合酶表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第 二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力W和peZ^或其同源基因克隆于第 三個表達載體中，得到/w/和/ eZ^表達質粒；
(4) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因或其同源基因克隆于第四個表達 載體中，得到peM表達質粒；
(5) 將alpha亞基裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、力o7和peZ^表達質粒及pe似 表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，應 用此工程菌通過發(fā)酵工程能生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質；發(fā)酵后， 按常規(guī)蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
上述的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法中，所述的宿主菌 為大腸桿菌；所述的alpha亞基裂合酶基因是指與^7a6ae朋sp. PCC7120中cpcf和c/ cF基 因或屈2a/w'/ o幼s sp. PCC7603中cpcf和cpc尸基因同源的基因；所述的藻藍蛋白alpha亞基 類脫輔基蛋白基因是指與^朋6ae/ a sp. PCC7120或必^/w'/josm sp. PCC7603中同源的 基因。
本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質，大腸桿 菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質類似的蛋白，提取方便；
4、生成結合PEB的新型藻藍蛋白alpha亞基類色素蛋白，具有與天然藻藍蛋白alpha亞 基類色素蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選擇；


圖1為本發(fā)明中CpcE/CpcF催化下生成的結合PEB藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的 吸收和熒光光譜，其中實線為吸收光譜，虛線熒光光譜。
具體實施例方式
下面以實例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。 實施例1
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經測定完 成，7stw770幼s sp. PCC7603部分序列已經測定。勘a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Ja/w'/70Si/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所查到序列中找到所需基因；Ca7ot力r^r sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peZ^和； eZ^)。通過基因工 程方法，將^a&e朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpcF克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-c;x^-cpc尸，在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將」/7a&e朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-""，在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白alpha亞基脫 輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和； eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-Z o7-; e力A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-/ eW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因"d在pET30中是在feoRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因 cpcf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是I和尸"I之間，裂合酶基因 cpc尸在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是￡boR V和i7w I之間；PEB合成酶 基因是3個(力o厶pe似禾[]pe/^)，力W和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個多克隆位點AfcoI和尸"I之間，々e力5在第二個多克隆位點Afetel和X力ol之間，pe似在 pACYCDuet-1中第二個多克隆位點《gill和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-cpcf-CjDc尺pET30-cpcA pCDFDuet-力o7-z eZ^和pACYCDuet-pe/W轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 2CTC至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩沖 液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光 蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。其吸收與熒光光譜見附圖1中所示，其中實線為500nm光照射 后的吸收光譜，虛線為熒光光譜。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜;取100pL飽和培養(yǎng)物,無菌轉接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。=0, 3 0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心l分鐘(10000g， 4'C)棄 去上清，收集沉淀菌體；用lmL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (10000g， 4'C)去上清，菌體沉淀用lOOiaL預冷的O. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構 建好的質粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42。C熱休克90s，冰浴5分鐘后加入300pL LB培養(yǎng) 基，37'C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37 "C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取100pL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。=0. 5-0. 7時， 冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、2CTC、 150轉/分，表達約12小時。離心收集 細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產物熒光量，選取熒光產量高的菌株進行大量 表達。
實施例2(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， vK 7柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^ a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019， J扁'層網p. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；C^"力rix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(和peZ^)。通過基因工 程方法，將M 7a肌'/7owssp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因和c/ c尸克隆 于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-c/ t^-"c尸，在大腸桿菌中能表 達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋力ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-cpcA在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白alpha亞基脫 輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/ o/-/ eZ^，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpd在pET30中是在ScoRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因 cpcf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是辰o I和尸"I之間，裂合酶基因 cpc尸在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和i7 o I之間；PEB合成酶 基因是3個(力o厶peM禾[]pe/^)， 7 o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個 多克隆位點Afcol和尸"I之間，peM在第二個多克隆位點M/el和Z力oI之間，pe^在 pACYCDuet-l中第二個多克隆位點^ill和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-c/ cf-cpc尸、pET30-cpc力、pCDFDuet-力o7-; eZ^和pACYCDuet-轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的
LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩沖 液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光 蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^7sA3e/ s sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M Z3歷i;7os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^7a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019， M Ja/w'愿"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；Ca7W力ri義sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和； eZ^)。通過基因工 程方法，將力/7s6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ cf和cpc尸克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-c; c,，在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將#. 7ayw'/70s"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-cpcA在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白alpha 亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peZ^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpd在pET30中是在fcoRV和/力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 cpc￡在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和尸"I之間，裂合酶基因 c; c尸在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和J力ol之間；PEB合成酶 基因是3個(力o厶peM和； eM)，力o7和pe朋在同一個載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個 多克隆位點yVcoI和尸WI之間，peM在第二個多克隆位點7W/el和J/ oI之間，pe似在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點S^II和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-cpc^-c; c尸、pET30-cpcA pCDFDuet-力o7-pe6S和pACYCDuet-/ e力力轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩沖 液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光 蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例4
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種細fe謹sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M 7a/z i"ams sp. PCC7603部分序列已經測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019，必Ja/M'/7as"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所查到序列中找到所需基因；^7"力rijr印.PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和peZ^)。通過基因工 程方法，將h肌'/7os"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因c; cf和cpcF克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將M^/w'/70^^ sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-c; cA在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白alpha 亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-/ o7-/^/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-/ e^4，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因m"在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因c/ cf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和尸st I之間，裂合酶基因c/ c尸在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是AcoRV和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶peM禾卩；7e/^)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點AfcoI禾B尸"I之間，peZ^在第二個多克隆位點A^el和J/ oI之間，peZ^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點5^11和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-cpcf-pET30-cpcA pCDFDuet-Z o7-; e/^和pACYCDuet-peM轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophylthio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例5
(1)從GeneBank中可以査到，藻種如a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成，尨7a/zw'/70犯s sp. PCC7603部分序列已經測定。力朋&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， M Ja/w'加siAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所查到序列中找到所需基因；sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe6i9)。通過基因工程方法，將^ a6ae/J3 sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因c; c^和cpc尸克隆于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-c; cF，在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將」朋6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于Novagen 公司購買的pCOLADuet-l中，所得質粒叫pCOLADuet-c/JcA在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和/ eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7，e力A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpd的片段在pCOLADuet-1中是在第一個多克隆位點的^boR I和尸" I兩個酶切位點之間；裂合酶基因ccf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是 AfcoI和尸Wl之間，裂合酶基因c/ cF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 fcoRV和之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶peW和pe/^)， Zw7和pe/^在同一個載 體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和尸"I之間，pe/^在第二個多克隆位點 I和i7 o I之間，/ e^在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和J力o I之間。 基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-cpc^-c/ c,、 pCOLADuet-c/ cA pCDFDuet-力o7-pe65和pACYCDuet-; eZ^ 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體 細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應的 藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， vK Ja肌V os〃s sp. PCC7603部分序列已經測定。/J朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019，屈7s/w'/ aws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；CW"力r^ sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eM和peM)。通過基因工 程方法，將必Ja啦'/70s"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpc尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-c々c尸，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋Z7ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于Novagen 公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-cpcA在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; e/^，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-; e力A在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cp^的片段在pCOLADuet-l中是在第一個多克隆位點的AcoR I和尸st I兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是 Afcol和尸WI之間，裂合酶基因cpC在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 fcoRV和JZ oI之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶禾H pe6扔，力o7和； e/^在同一個載 體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和尸"I之間，peM在第二個多克隆位點 Afafe I和Z/ o I之間，/ e似在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將pETDuet—cpcf-c/ cF、 pCOLADuet—c/ cA pCDFDuet—Z o7-; e/^和pACYCDuet—/ e/W 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0仏。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體 細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的 藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種勘a/we朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， vK 7a力w'/7as〃s sp. PCC7603部分序列已經測定。A atee/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為 BA000019，屈7a啦'"osiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；^7W力r^r sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工 程方法，將A7a6ae/7a sp. PCC7120中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpc尸克隆于 Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpcF,在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒 中同樣的酶切位點上。
(2) 將必^3肌V70幼s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-l中，所得質粒叫pCOLADuet-c; cA在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ ei^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-; e似，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpd的片段在pCOLADuet-l中是在第一個多克隆位點的^coR I和尸W I兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是 AfcoI和尸"I之間，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 fcoRV和JZ oI之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶禾tl peZ^)，力o7和pe65在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點Abo I和I之間，々eZ^在第二個多克隆位點 yWe I和J/ o I之間，在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點^^1I禾卩i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-cpcf-pCOLADuet-cpc刀、pCDFDuet-力o7-;7e/^和pACYCDuet-pe似 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體 細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的 藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例8
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種勘a6朋朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， 7a/M'/70s"s印.PCC7603部分序列已經測定。力/ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為
BA000019, # 7a/w'"o幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可 從所査到序列中找到所需基因；CW"/^i義sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在 GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工 程方法，將尨Z9/w'/7asi/s sp. PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因和cpc尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大腸桿菌中能 表達藻藍蛋白alpha亞基裂合酶CpcE/CpcF，得到藻藍蛋白alpha亞基裂合酶表達質粒。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將必^3/m'朋sm sp.PCC7603中的藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-c/ cA在大腸桿菌中能表達藻 藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白，得到藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe力歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; e/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因的片段在pCOLADuet-l中是在第一個多克隆位點的AcoR I和尸5^ I兩個酶切位點之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是 AfcoI和/^n之間，裂合酶基因c/ cF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 fcoRV和Wo I之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 和； e/^)， / W和peZ^在同一個載 體pCDFDuet-l中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和尸"I之間，pe65在第二個多克隆位點 yVofe I和J力o I之間，在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總麗A作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-c/ cf-c/ cF、 pC0LADuet-cpd、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A;離心收集菌體 細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的 藻藍蛋白類熒光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍藻中的alpha亞基裂合酶、藻藍蛋白alpha亞基類脫輔 基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因來制備結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋 白質，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBaiik中已公開全序列的藍藻 ^7a&e朋sp.PCC7120和已公開部分序列的藍藻尨Ja肌'朋仰s sp. PCC7603、 Ca7"力rj'x sp.PCC7601為例對本發(fā)明方法加以說明，本領域的技術人員可以根據上述公開的內容采用其 它原料實施本發(fā)明。
權利要求
1. 一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到alpha亞基裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法，將藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因ho1和pebB或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到ho1和pebB表達質粒；(4)用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個表達載體中，得到pebA表達質粒；(5)將alpha亞基裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、ho1和pebB表達質粒及pebA表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發(fā)酵工程能生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的alpha亞基裂合酶基因是指與 爿朋6朋朋sp. PCC7120中c/ cf和cpcF基因或尨h肌'/70幼s sp. PCC7603中cpcf禾Q cpc尸基 因同源的基因。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白 基因是指與^/Ja6ae朋sp. PCC7120或M〗柳j'/ osiAs sp. PCC7603中同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結合藻紅膽素(PEB)的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，是通過應用藻膽蛋白alpha亞基裂合酶催化藻紅膽素與藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，制備結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質；本發(fā)明的方法應用生物過程生產結合PEB的藻藍蛋白類alpha亞基熒光蛋白質，是一種環(huán)境友好的生產方法。藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質能應用于生物學和醫(yī)藥功能材料領域，特別是應用為生物學和醫(yī)學檢測領域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101475952SQ200810025648
公開日2009年7月8日 申請日期2008年1月4日 優(yōu)先權日2008年1月4日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學