專利名稱：豬糖基磷脂酰肌醇錨1蛋白編碼基因gpi1作為豬抗病育種遺傳標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬的分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，具體涉及與腸毒素 大腸桿菌(ETEC) F4 ad受體相關(guān)的豬糖基磷脂酰肌醇錨1蛋白編碼 基因GP/ 7的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，縮寫 為SNP)的檢測方法。
背景技術(shù)：
在豬病中，仔豬瀉痢是最普遍而重要的疾病，由腹瀉使仔豬的死 亡率達(dá)11.5%-29.5%，其中大腸埃希氏菌(foc/^Wc/^ co/z'簡稱E.coZ/) 引起的發(fā)病率和死亡率占整個發(fā)病率與死亡率的56.2%和24.7%，值 得一提的是致病性的抗原特性是可變的，已發(fā)現(xiàn)的菌體 (O)抗原血清型就有100多種，給研制疫苗及藥物治療帶來很大困 難，因此，從根本上開展豬對腸毒素大腸桿菌病抗性遺傳機(jī)制研究， 進(jìn)行抗病育種，已引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。
腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起仔豬瀉痢的主要病原體之一， 它可引起仔豬黃痢、仔豬白痢、豬水腫病等多種大腸桿菌病。ETEC 與共生性非致病性大腸桿菌不同，其致病性決定于它們在宿主小腸上 皮細(xì)胞上的定居能力和產(chǎn)生腸毒素的能力，兩者缺一不可。ETEC定 居宿主小腸上皮細(xì)胞能力是由菌體表面的特異菌毛介導(dǎo)的，這種 ETEC特異菌毛通常稱為定居因子或粘附素。在引起仔豬瀉痢的ETEC中，已發(fā)現(xiàn)的粘附素有K88 (F4)、 K99 (F5)、 F17、 F18等多種，其中初生仔豬腹瀉是由F4引起的。這些 粘附素要在小腸粘膜附著，還必須在小腸粘膜上皮細(xì)胞刷狀緣有特異 性受體，不同豬只腸粘膜有無特異性受體是由基因控制的，無受體的 豬在受到細(xì)菌感染時(shí)不發(fā)病，表現(xiàn)為抗性，因此尋找和篩選該受體的 遺傳標(biāo)記是培育出抗性豬的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用S差異顯示法篩選F4 ad受體的相關(guān)基因； 本發(fā)明的另一個目的是篩選與黏附性(受體有無)相關(guān)的SNP， 以期應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括以下步驟
(1) 分別采集不同品種初生仔豬的小腸，采用體外黏附測定檢 測各樣品的黏附性；
(2) 提取小腸上皮細(xì)胞總RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
(3) 利用S差異顯示引物實(shí)施差異PCR，采用聚丙烯酰胺凝膠 電泳和銀染法顯示PCR產(chǎn)物；
(4) 將差異帶回收后再PCR擴(kuò)增，以增加差異DNA數(shù)量；
(5) Northern blot鑒定陽性差異帶；
(6) 將陽性差異帶克隆并測序后，將序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫同源性分
析；
(7) 根據(jù)測序結(jié)果和序列分析結(jié)果，篩選與受體有關(guān)的基因；
(8) 根據(jù)相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)引物，對樣品進(jìn)行擴(kuò)增、領(lǐng)!l序；(9)篩選與黏附性(受體有無)相關(guān)的SNP。
本發(fā)明采用PCR與DNA測序結(jié)合的方法首先篩選出G尸/ 7基因 為F4 ad受體的相關(guān)基因，繼而從豬G/V 7基因上篩選到與受體相關(guān) 的SNP，并且通過生產(chǎn)實(shí)踐驗(yàn)證確定GP/7基因?yàn)镕4ad受體相關(guān)基 因，篩選的SNP為與F4ad受體相關(guān)的SNP。本發(fā)明篩選的豬G尸/7 基因的SNP可作為豬抗病育種輔助選擇的遺傳標(biāo)記，從而培育出抗 性豬，具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi) 容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。


圖1為實(shí)施例的技術(shù)路線圖2為顯微鏡下的黏附型的黏附情況圖(X1000); 圖3為顯微鏡下的不黏附型的黏附情況圖(X1000); 圖4為S差異片段電泳其中，R為不黏附型，S為黏附型，M為100bpDNAladder,箭 頭所示為差異片段；
圖5為Northem雜交其中，R為無受體，S為有受體；
圖6為F4ad受體差異帶9序列的BLAST結(jié)果圖； 圖7為F4ad受體差異帶4序列的BLAST結(jié)果圖； 圖8為引物2擴(kuò)增的G/Y7基因序列同源比對結(jié)果圖； 圖9為引物2擴(kuò)增的GP/J基因序列同源比對結(jié)果圖；其中，a3、 a5、 a6、 b7為有受體個體，c6、 c9、 a8、 b8為無受 體個體，箭頭處顯示的是突變位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例的技術(shù)路線如圖1所示(1)分別采集大約克初生仔豬 30頭和沙子嶺初生仔豬33頭的小腸，采用體外黏附測定檢測各樣品 的黏附性；(2)提取小腸上皮細(xì)胞總RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA; (3)利用S差異顯示引物實(shí)施差示PCR，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳 和銀染法顯示PCR產(chǎn)物；(4)將差異帶回收后再PCR擴(kuò)增，以增加 差異DNA數(shù)量；(5) Northern blot鑒定陽性差異帶；(6)將陽性差 異帶克隆并測序后，將序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫同源性分析；(7)根據(jù)測序結(jié) 果和序列分析結(jié)果，篩選與受體有關(guān)的基因；(8)根據(jù)相關(guān)基因的序 列設(shè)計(jì)引物，對樣品進(jìn)行擴(kuò)增、測序；(9)篩選與黏附性(受體有無) 相關(guān)的SNP。
實(shí)施例l兩個豬種F4受體黏附差異研究
解剖1周齡內(nèi)沙子嶺豬33頭、大約克豬30頭，取豬小腸組織用 于制備上皮細(xì)胞刷狀緣和保存于液氮中用于提取RNA。
取大腸桿菌懸液和仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣懸液各0.1 ml 置于1.5ml離心管中，加入甘露糖(0.4 mg/ml)1 u 1，輕輕混合，室溫 培養(yǎng)30min，不時(shí)輕搖?；鞈液蟮我坏斡谳d玻片上，酒精燈下微熱烘 干，再加一滴結(jié)晶紫染色液，3min后用水沖洗載玻片，酒精燈下微 熱烘干，油鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)20個形態(tài)清晰的細(xì)胞上所黏附的細(xì)菌數(shù)。
判斷標(biāo)準(zhǔn):在油鏡下隨機(jī)檢測20或更多形態(tài)清晰的刷狀緣，對于 單個的刷狀緣，多于兩個細(xì)菌黏附其上判為黏附；對于仔豬個體樣， 樣品中至少有10%的刷狀緣結(jié)合多于2個細(xì)菌才判為黏附;少于10% 的刷狀緣結(jié)合多于2個細(xì)菌，但多于10%的刷狀緣結(jié)合1 2個細(xì)菌， 判為弱黏附。最后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照(黏附型見圖2，不黏附型見 圖3)。
統(tǒng)計(jì)兩個豬種的黏附比率，如表l所示
表l兩個豬種黏附型比較
菌株類型品種樣本數(shù)黏附個體數(shù)黏附個體比值不黏附不黏附個體
個體數(shù)比值
F4 ab大約克30200. 667100. 333
F4油沙子嶺33240.72790. 273
F4 6tc大約克3020.067280.933
F4 ac沙子嶺3330. 091300. 909
F4 ;ad大約克30120.柳180. 600
F4 3d沙子嶺3380. 242250. 758
兩個豬種在三種血清型的黏附比率均表現(xiàn)為ab型的最大，ad型 的次之，ac型的最小。其中ab型的均超過了 0.6，而其他的均低于 0.4， ac型的黏附比更低于O.l。可見，初生仔豬患仔豬黃痢主要是大 腸桿菌F4ab型與仔豬小腸上皮細(xì)胞刷狀緣結(jié)合。沙子嶺豬ab型的黏 附個體比率為0.727，稍高于大約克的0.667; ad型的黏附個體比率 為0.400，顯著高于大約克的0.242 (p<0.05)。
試驗(yàn)結(jié)果表明F4 ab黏附素對大約克豬和沙子嶺豬均黏附強(qiáng)烈， 而F4 ac則表現(xiàn)為不黏附。也意味著兩個品種中均存在較高頻率的F4abR -F4acR。
圖2和圖3分別是黏附與不黏附型圖。由圖2可見，刷狀緣結(jié)合 了多個細(xì)菌，而圖3則不然。試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法在顯微鏡下能夠 非常清楚的觀察到黏附情況，從而對個體黏附型進(jìn)行準(zhǔn)確判定。
實(shí)施例2差異片段的獲得
一、 cDNA的合成
取實(shí)施例1中保存于液氮中的豬小腸組織，采用常規(guī)方法提取總 RNA，并進(jìn)行定量、純度和完整性檢測，再用無RNase的DNase I 處理總RNA，采用Fermentas公司的第一鏈cDNA合成試劑盒中的 oligo(dT)引物進(jìn)行cDNA的合成。
二、 S差異顯示引物
S差異顯示引物由上海英駿生物有限公司合成，每個引物濃度為 20uM。引物序列如下
(1) 5'P隨機(jī)引物共10條:
Pl:5，.隱ATTAACCCTC ACTAAATGCTGGGGA-3 ，
P2:5，-ATTAACCCTC ACTAAATCGGTC ATAG-3 ，
P3:5，隱ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3 ，
P4:5，陽ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3 ，
P5:5，隱ATTAACCCTC ACTAAAGATCTGACTG-3 ，
P6:5，陽ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGTG-3，P7:5，陽A1TAACCCTC ACTAAATGCTGTATG-3 ，
P8:5，ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3，P9 : 5，-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3， P10:5'-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3' (2) 3'oligo(dT)引物共9條
T2: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCTTTnTTTTAC-3， T3: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCT^TnnTTAG-3,
T5: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3'
T7: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3， T8: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTnTTGC-3， T9: 5，-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3， 三、長距離PCR (LD-PCR) 1、 PCR循環(huán)參數(shù)
前4個循環(huán)使用低嚴(yán)謹(jǐn)條件，后28個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)條件。 94。C,6min; 4CTC， 5 min; 68°C， 5 min。 94。C，2min; 40°C， 5min; 68°C， 5min。 94。C，lmin; 60°C， 1 min; 68°C， 2min。 7 min。 2、 PCR操作流程
(1)融化下述試劑
①10XPCR反應(yīng)緩沖液。②dNTP混合物。③25mMMgCl2。④
1個循環(huán) 3個循環(huán) 28個循環(huán)
另外68°C，
9引物P與T。⑤實(shí)驗(yàn)cDNA樣品。⑥純水。完全融化后保持上述溶液 在冰上，使用之前混合好，以避免鹽濃度的局部差異。
(2) 對每一個差異顯示即樣品與引物組合，在0.2mlPCR管中加 入如下反應(yīng)成分
0.8 iiL 實(shí)驗(yàn)cDNA樣品 0.8uL P引物 0.8 yL T引物
(3) 根據(jù)表2所示準(zhǔn)備主體混合物
表2 PCR反應(yīng)體系成分
成分1個rxnn個rxns
IOXPCR反應(yīng)緩沖液2 uL2n uL
(包含1.5mM MgCl2)
dNTP混合物(5mM每個)0.2 ii L0.2n ii L
無菌水15.1 uL15.1n tiL
Taq DNA聚合酶0.3 uL0.3n ix L
主體混合物體積應(yīng)比PCR操作分析的總數(shù)量大10%,如總共分 析10個反應(yīng)管，則應(yīng)準(zhǔn)備11個反應(yīng)管上述成分，因?yàn)橛捎诓僮骰騮ips 與移液槍等原因存在誤差。在每一個實(shí)驗(yàn)中，另準(zhǔn)備一個否定控制(沒 有模板DNA)。 TaqDNA聚合酶最后加入，然后通過上下移液徹底混
(4) 每個PCR反應(yīng)管加入上述主體混合物17.6pL，構(gòu)成總體積 20jj1。
(5) 旋渦混合器上混合后輕輕離心
(6) 開啟PCR儀，當(dāng)PCR儀達(dá)到94'C時(shí)，放PCR管到PCR儀中(簡單的熱起始)。
(7) PCR結(jié)束后將進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染顯示。 四、結(jié)果討論
兩個豬種共63頭豬小腸總RNA濃度與純度檢測結(jié)果表明，總 RNA濃度在560 1152iig/ml之間，純度在1.75 2.00之間， 一般在 1.85左右，說明采用提取的總RNA質(zhì)量高，基本無蛋白質(zhì)污染，可 保證mRNA擴(kuò)增的順利進(jìn)行。通過檢測總RNA完整性表明提取的總 RNA分子完整，沒有發(fā)生降解。S差異顯示部分結(jié)果見圖4，采用在 S差異顯示的109個引物組合的PCR中，在F4 ad黏附差異帶檢測中， 共檢測到24條差異條帶，其中有13條在黏附型中特異表達(dá)，11條 在不黏附型樣品中特異表達(dá)。
實(shí)施例3差異片段的回收、再擴(kuò)增、純化與Northern blot
本發(fā)明的差異片段指在S差異顯示中，在黏附型樣品中表達(dá)， 但在非黏附型樣品中不表達(dá)，或者在非黏附型樣品中表達(dá)，但在黏附
型樣品中不表達(dá)的基因片段，即為實(shí)施例2中，F(xiàn)4ad黏附差異帶檢 測中，檢測到的24條片段。
用干凈的手術(shù)刀從實(shí)施例2中得到的銀染凝膠片上切下所需的 差異帶，回收其中的DNA，并對差異片段實(shí)施再擴(kuò)增、純化與回收 步聚，之后進(jìn)行Northern印跡雜交，確定總RNA中樣品同源RNA 的存在與否或樣品中特定RNA分子的大小和豐度。
結(jié)果顯示
1、在24條S差異片段的再擴(kuò)增PCR中，有l(wèi)條差異片段沒能實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)為多帶或無帶，估計(jì)這些差異片段實(shí)際可能包 含幾條大小相近的片段，需要通過其它方法才能分離出來，本實(shí)施例 將其作為假陽性差異，沒作進(jìn)一步分析。
2、在23個再擴(kuò)增差異片段中，Northern blot (見圖5)結(jié)果表 明有3個差異片段表現(xiàn)為假陽性。說明在差異顯示中找到了 20個陽 性差異片段，陽性率為87% (20/23)。
實(shí)施例4陽性差異片段的克隆、測序與序列分析
本實(shí)施例中的材料為通過實(shí)施例3確定的純化后的陽性差異片 段，通過感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定等過程，克隆 陽性差異片段，然后送上海英駿生物有限公司測序，將測序結(jié)果到 NCBI網(wǎng)站通過BLAST程序進(jìn)行同源比對，再根據(jù)比對結(jié)果確定該 片段是否為新基因或者與某一基因有較大長度的高同源性。
克隆載體送測序公司測序后，到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對， 本試驗(yàn)共測序了20條片段，其中比對結(jié)果有高同源性(>85%)且同 源的長度大于60個堿基的片段有2條，比對結(jié)果見圖6和圖7;有 同源性但低于85%或同源的長度較短的片段有12條，其余11條為新 基因片段。20條片段序列已登錄到GenBank中，登錄號分別為 DQ217772、 EC268686 、 DW286736 DW2867939 、 EB739624 EB739627和EE392468 EE392477
1、 BLAST結(jié)果表明
(1)如圖5所示，BLAST結(jié)果表明，F(xiàn)4ad黏附差異帶9，即引 物P4 X T6擴(kuò)增之差異片段與glycosylinositolphohatidyl anchor 1(G尸/ 7)有91%(216/237)的同源性?？梢娫摶蚺cF4 ad受體有無存 在相關(guān)。
(2)如圖6所示，BLAST結(jié)果表明，F(xiàn)4ad黏附差異帶4，與絲 氨酸蛋白酶有87% (63/72)的同源性。 2、 F4受體的相關(guān)報(bào)道
F4受體已從上皮細(xì)胞刷狀緣、小腸膜和粘液中提取。它可能是 一種復(fù)合糖[1()]。而Grange和Mouricout報(bào)道它可能是74 kDa的轉(zhuǎn)鐵 蛋白，以及一種小腸中性鞘糖脂。
GPI錨定蛋白是一類通過其羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu) 錨定于真核細(xì)胞膜表面的蛋白。細(xì)胞中存在很多這種類型的蛋白，其 中包括各種功能的蛋白細(xì)胞表面的酶、受體、粘附分子、特異性抗原 等，起著免疫識別，補(bǔ)體調(diào)節(jié)及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要作用。不同類的GPI 蛋白，GPI的分子結(jié)構(gòu)不盡相同，但均含有一組最基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 主要由膽胺甘露糖，葡萄糖胺,和肌醇連接而成。GPI錨定蛋白主要參 與細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與環(huán)境間的作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞 粘附、補(bǔ)體調(diào)節(jié)等。
GPI微域由GPI錨定蛋白、鞘糖脂、膽固醇、src家族蛋白酪氯 酸激酶PTK、 G蛋白和細(xì)胞骨架蛋白、少量穿膜蛋白等組成。GPI錨 定蛋白通過與這些組分相互作用來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外的信號傳遞。
作為膜的組成成分，GPI的乙醇胺，通過酰氨基結(jié)合于羧基端， 并成為蛋白質(zhì)固定于膜的錨，結(jié)合到GPI的蛋白稱為GPI錨蛋白。 磷脂酶C(尸ZT)能釋放蛋白質(zhì)錨定于糖基磷脂酰肌醇，人糖基磷脂酰肌醇被PLC分解產(chǎn)生IP3和DG，它們是重要的第2信使。雖然還不 清楚為什么這么多蛋白質(zhì)與人糖基磷脂酰肌醇錨蛋白有關(guān)，但己知 GPI與一些蛋白質(zhì)功能有關(guān)(Brownand Waneck)。例如，作為活躍的 免疫系統(tǒng)的抗原，GPI錨蛋白對MHC表達(dá)的抗原有調(diào)控作用。人中 目前至少知道一個疾病，即突發(fā)性夜血紅素尿是由于GPI錨蛋白缺陷 引起的。因此，GPI基因可望作為F4ad受體的候選基因進(jìn)一步研究， 目前還沒有關(guān)于F4ad受體相關(guān)基因的報(bào)道。
由于GPI蛋白具有如此廣泛的作用，瘋牛病辦公室創(chuàng)建和支持了 GPI蛋白網(wǎng)站(h加:〃cvber-dwe.comMom/gpi.html)。該網(wǎng)站站提供 了有關(guān)糖基磷脂酰肌醇(GPI，是許多蛋白以及阮病毒蛋白結(jié)合于膜 上的錨點(diǎn))的信息。同時(shí)，網(wǎng)站還提供了許多相關(guān)鏈接和資源。
根據(jù)GPI錨定蛋白的的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)分析，它與K88受體有著復(fù) 雜的關(guān)系，可以作為候選基因進(jìn)行深入研究。
綜上所述，GPI蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能都與F4受體的相關(guān) 報(bào)道相吻合，因此該基因很可能是F4 ad的相關(guān)基因。
本發(fā)明綜合同源比對的結(jié)果和對基因功能的了解，選擇了 GP/J 基因?yàn)镕4ad受體的相關(guān)基因，并進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例5豬相關(guān)基因SNP篩選
本實(shí)施例隨機(jī)選擇黏附型和不黏附型樣本各4個，提取基因組 DNA。根據(jù)人基因cDNA序列(Genbank登錄號為NM 153487) 設(shè)計(jì)了4對引物(如表3所示)分別對所有F4 ad黏附型個體(a3、 a5、 a6、 b7)和所有不黏附型個體(c6、 c9、 a8、 b8)進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送測序公司測序，測序結(jié)果SEQ ID NO.l、 SEQID N0.2、 SEQIDNO,3、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO-5、 SEQIDNO,6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
采用DNAStar軟件之Seqman程序?qū)ι鲜?條序列進(jìn)行同源比 對，篩選與黏附性有關(guān)的SNP，其中引物2的擴(kuò)增測序比對結(jié)果如圖 8和圖9所示。
表3引物序列
編號序列長度位置Tm
15'-TCAGTTMGGCTGCTGCTGT-3，2033568
25'-CTTCTGGAGACCMCATTCG-3'2086368
35'-GCTACMCATGGACATCCTG-3'20100966
45'-GTCTTGTTCACCTCAGCCAT-3'20152567
55'-GTTAGACAGCAGAGGCAATG-3'20163766
65'-ATCTGTTGCACGTAGACACC-3'20218566
75'-GTGTATGAGAAGGAGGCTCG-3，20229867
85'—CATCTGCTCCATCTCTGCTT-3'20336568
結(jié)果表明，在第242、 243堿基位置，所有F4ad黏附型個體均 為AT，而所有不黏附型個體均為TG。而在其它位置，如第19堿基 位置、24堿基位置等雖然存在SNP，但這些SNP都與黏附性沒有相 關(guān)性。該結(jié)果表明，引物2所擴(kuò)增產(chǎn)物在第242、 243堿基位置的突 變很可能就是影響F4ad受體黏附性差異的原因。而在其它位點(diǎn)，雖 然發(fā)現(xiàn)一些SNP (如第19、 24堿基)，但這些SNP與樣品的黏附性 無關(guān)，因此不予考慮。
對其它3對引物的測序結(jié)果分析，未發(fā)現(xiàn)一 SNP在所有黏附/不 黏附個體中特異表現(xiàn)。因此認(rèn)為該區(qū)段不存在影響?zhàn)じ叫缘亩鄳B(tài)位 占。
實(shí)施例6與黏附性有關(guān)的SNP在生產(chǎn)實(shí)踐中的驗(yàn)證在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬場用ETEC F4感染初生仔豬，采集腹瀉和 腹瀉的初生仔豬各30頭血樣，提取基因組DNA，利用引物l、 2擴(kuò) 增，并檢測其SNP。
1、 引物
引物1: 5'-GCTACAACATGGACATCCTG-3' 引物2: 5'-GTCTTGTTCACCTCAGCCAT-3'
2、 PCR
PCR反應(yīng)體系，如表4所示
_表4 PCR反應(yīng)體系中各組成成分_
成分 用量(ixl) 終濃度
Total volume 40 PCR循環(huán)參數(shù)如下
34個循環(huán)94。C，4min; 94°C， 30s; 61°C， 40s。 72°C， 7min。
結(jié)果表明，在30頭腹瀉的初生仔豬中，引物擴(kuò)增產(chǎn)物在第242、 243堿基位置均為AT，而30頭不腹瀉的初生仔豬基因型均為TG。 上述結(jié)果表明GPI l基因?yàn)镕4ad受體相關(guān)基因，本發(fā)明得到的SNP 為與F4ad受體相關(guān)的SNP。
10 X buffer MgCl2 dNTPs
FP
RP
Taq polymerase DNA template
1 X
2.5mM
0.2 mM
0.2|iM
1U 50-500 ng
o o 8 2 2 4 8
16序列表.txt
SEQUENCE LISTING <110>劉定發(fā)，蔣雋，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉豬糖基磷脂酰肌醇錨1蛋白編碼基因GPI l作為豬抗病育種遺傳標(biāo)記的應(yīng)用
<130〉
<160> 8
〈170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 245
<212> 腿
〈213〉 豬(Sus scrofa)
<400〉 1 cgcatccagcagctacagat ggcatatccggagg鄉(xiāng)atctaacaatgag60
atagtcacaggtcgaggtgt agggcactcac鄉(xiāng)ggacagtgcaagatctag￡iaggt￡i￡it120
tatgcggggcttcagaaggg ttgatggaaggaagtagttactgaacctag卿ggcaggc180
aggg"tccctggctggagctg aaatcttaggtggagggatatacaagcagagatggagcag240
at gag245
〈210〉 2 〈211〉 250 〈212〉 腿 〈213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 2 ccccccggcttgctcccact犯agatggca1:a_tccgtagaataaactg3ggaggatctaa60
caatgagatagtcacaggtc gaggtgtagggcactcacaagggacagtgcaagatataaa120
aggtaattatgcggggcttx卿agggttgatggaagg犯gtagttactgaacctagaga扁
ggc鄉(xiāng)c鄉(xiāng)gtttttggct ggagctga犯tcttaggtggaaccacagat240
ggagcagstg250
<210〉 3 〈211〉 243 〈212〉 腿 〈213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 3 ccgctcaccactacagatgg catatccgtagaata犯ctgaggagg3tct肌c肌tgaga60
tagtcacaggtcgaggtgta gggcactcac鄉(xiāng)gg織gtgcaagatctagaaggtaatt120
atgcggggcttc卿agggt tgatgg卿gaagtagttactgaacctagagaggcaggca180
gggtccctggctggagctga aatcttaggtggagggfitatacaagcagagatggagc卿240
tga243
<210> 4 <211> 241 〈212〉 D區(qū) <213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 4 ccgctcagcctactatagat ccatt;cgtagataaactgEig gaggettctaa60
gtcacaggtcgaggtgtagg gcactcac犯gggacagtgc犯gatcteiga120
gcggggcttx卿agggttg atggaaggaagtagttactg犯cctag3gaggcaggcagg180
17gtccctggct ggagctgaaa tcttaggtggagggatatacaagcsgagatggagcagatg240 241
<210〉 5 <2U> 246 〈212〉 DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 5 agtatccaac gcgatacaga tggcatatccgtagaataaactgaggaggatct犯caatg60
agat;agtcac aggtcgaggt gtagggcactcacaagggacagtgcaagatCt3g33ggta120
attatgcggg gcttc卿ag ggttgatggatactgaacct卿gaggcag180
gcagggtccc tggctggagc tgaaatcttaggt卿ggg3tatacaagcagagtggggag240
c卿tg246
<210> 6 <211> 245 <212〉 DNA <213> 豬(Sus scrofa)
<400〉 6 cagccggagc gatagagatg gcatatccgtgaggaggatctaacaatgag60
at兆tC3C3g gtcgaggtgt agggcactcaca郷gacagtgcaagatct120
tatgcggggc ttc卿aggg ttgatggaaggaagtagttactgaacctagagaggcaggc180
agggtccctg gctggagctg a組cttaggtggagggatatacaagc站agtg鵬恥ca240
g3tgt245
<210> 7 〈211〉 240 〈212〉 DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
<400> 7 cagctcgtac tctagttggc tatccgtatatgactgagcgaggatctaac犯tgagatag60
tcacaggtcg eiggtgtaggg cactcacaagggacagtgcaagatctagaaggtaattatg120
cggggcttca gaagggttga tggaaggaagtagttactgaacctagagaggc柳caggg180
tccctggctg gagctgaaat cttaggtggagggatatacaagc柳gtgggagcagatga240
〈210〉 8 <211〉 241 〈212〉 腿 <213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 8 gctcgagact aggttggcat atccgtagaataaactgEiggaggatctaacaatgagatag60
tcacaggtcg a.ggtgtaggg cactcacaagggaC3gtgC3agatetagaa ggtaattatg120
cggggcttca g紛gggttga tgg幼gg犯gtagttactga3cct鄧agag gesggcaggg180
tccctggctg gagctgaaat cttaggtggaagcagagtg3 t鄧cagat;ga240
24權(quán)利要求
1、一種篩選豬抗病育種的遺傳標(biāo)記，其特征在于它包含克隆得到一個豬糖基磷脂酰肌醇錨1蛋白編碼基因GPI1的特異DNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，其中序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的8條序列經(jīng)同源比對后，確定在第242位堿基處有一個堿基突變T242—A242，第243位堿基處有一個堿基突變G243—T243。
2、 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬的分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，具體涉及與腸毒素大腸桿菌F4ad受體相關(guān)的豬糖基磷脂酰肌醇錨1蛋白編碼基因GPI 1的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明采用δ差異顯示PCR的方法首先篩選出GPI 1基因?yàn)镕4ad受體的相關(guān)基因，繼而在豬GPI 1基因上篩選到與受體相關(guān)的SNP，并且通過生產(chǎn)實(shí)踐驗(yàn)證確定GPI 1基因?yàn)镕4ad受體相關(guān)基因，且篩選的SNP為與F4ad受體相關(guān)的SNP。本發(fā)明篩選的豬GPI 1基因的SNP可作為豬抗病育種輔助選擇的遺傳標(biāo)記，從而培育出抗性豬，具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12Q1/68GK101487045SQ20081002591
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者劉定發(fā), 周紅麗, 施啟順, 柳小春, 雋 蔣 申請人:劉定發(fā);蔣 雋;湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)