專利名稱：：用于沙門菌、副溶血弧菌和大腸桿菌O₁₅₇:H₇多重熒光PCR同步檢測的引物和探針序列的制作方法用于沙門菌、副溶血弧菌和大腸桿菌0157:H7多重熒光PCR同步檢測的引物和探針序列
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌核苷酸片段多重熒光PCR同步檢測的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
：沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7是重要的食源性致病菌，主要通過污染的動物源性食品如水產(chǎn)品等感染人類、導致食物中毒、腸傷寒、尿毒癥等，嚴重時可導致死亡。因此，這三種致病菌備受關(guān)注，是我國乃至世界多數(shù)發(fā)達國家對進出境水產(chǎn)品等動物源性產(chǎn)品必須檢驗或監(jiān)控的致病菌。水產(chǎn)品是我國出口歐美的主要農(nóng)產(chǎn)品，多年來為我國的出口創(chuàng)匯作出了很大貢獻。隨著世界各國對食品安全的高度重視，各國對進口食品包括水產(chǎn)品的檢測要求越來越高，往往需同時檢測沙門氏菌、副溶血性弧菌等多種致病菌。然而，目前尚未有能同時檢測水產(chǎn)品中多種致病菌的方法與相關(guān)標準。雖然關(guān)于這三種致病菌的檢驗有各種快速檢測方法，如免疫磁株富集法、酶聯(lián)免疫吸附法、自動酶聯(lián)免疫熒光法、顯色培養(yǎng)基法、DNA探針技術(shù)、PCR技術(shù)等，但由于這些方法存在這樣或那樣的缺點而未得到廣泛推廣，事實上，我國相關(guān)部門對水產(chǎn)品致病菌的檢驗基本還停留在傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)上，不但費時，往往需要47天時間，還可能因操作繁雜，所用試劑多而導致漏檢。2005年17月我國輸美水產(chǎn)品就有11批次因被美國FDA檢出沙門氏菌而被扣留，給企業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失。因此，在水產(chǎn)品檢驗中迫切需要一種可同時檢測多種致病菌的快速、簡便、準確、高效、經(jīng)濟的檢驗方法。實時熒光PCR(RealTimePCR，)技術(shù)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，它不僅具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點，3而且由于該法采用引物和探針的"雙保險"，因此特異性更強。由于實時熒光PCR不但可以檢測單一的病原菌，而且能實現(xiàn)多種病原菌的同步檢測，因此更經(jīng)濟更省力也更快速。故實時熒光PCR已成為檢測領(lǐng)域越來越重要的一種檢測手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于同步檢測沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌核苷酸片段的引物探針序列。引物序列包括<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>基于上述目的，木發(fā)明采用以下具體實施方案利用多通道熒光PCR儀可同時分別檢測多種熒光素的特點，將檢測上述三種致病菌核苷酸基因片段相應(yīng)的探針分別標記不同的熒光報告基團，經(jīng)過反復試驗，優(yōu)化多重熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，建立了可同步檢測水產(chǎn)品中沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌的多重熒光PCR檢測方法。再根據(jù)已建立的檢測方法，配制方便使用的檢測試劑盒。通過采用該檢測試劑盒及檢測方法，便可簡便快速、特異靈敏地檢測水產(chǎn)品中上述三種致病菌。基于本發(fā)明研制的水產(chǎn)品致病菌多重熒光PCR檢測試劑盒包括下列試劑1)DNA提取液1管，內(nèi)裝TE液，pH8.0;2)PCR反應(yīng)液1管，內(nèi)裝熒光PCR反應(yīng)液，包括％《酶、dNTP、含Mg2+的Buffer;3)引物探針1管，內(nèi)裝沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H73對引物探針。4)陽性對照模板1管,內(nèi)裝適當濃度的沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌的DNA。5)陰性對照模板l管，內(nèi)裝經(jīng)傳統(tǒng)檢測方法證實無沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7污染的水產(chǎn)品樣品增菌6h后提取的DNA。6)去離子水1管，內(nèi)裝無DNA酶的滅菌去離子水。基于木發(fā)明建立的多重熒光PCR檢測方法，按下列步驟進行1)樣品的處理與DNA模板的提取取樣品25g，用3。/。NaCl緩沖蛋白胨水制成l:IO勻漿，置36'C士rC培養(yǎng)6h，取增菌液lmL,加入1.5mL滅菌離心管中，14000rpm離心10min，吸去上清液，加入0.8mLDNA提取液混勻，14000卬m離心10min，吸去上清液，加入50pL去離子水，震蕩混勻，沸水浴10min，冰浴5min，13000rpm離心5min，取上清液為樣品DNA模板，保存于fC。2)試劑配制將試劑從冰箱取出后，置室溫融化，2000rpm離心10sec。根據(jù)樣品數(shù)按下表計算試劑用量。試劑名稱反應(yīng)液.引物探針用量ML10xn8xnn=l(陰性對照)+1(陽性對照)+樣品數(shù)+0.5(損耗)將計算好的試劑加入一適當體積離心管中，混勻后，2000rpm離心10sec。向每個設(shè)定反應(yīng)孔加入18mIV孔。3)加樣將陽性對照模板、陰性對照模板和樣品DNA模板分別加入反應(yīng)孔，2pL/孔。用反應(yīng)膜封住反應(yīng)孔，置于熒光PCR儀上檢測。4)反應(yīng)參數(shù)設(shè)置選擇多通道檢測模式，在CY5，F(xiàn)am和Hex通道上打v，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)為95°C5min;95°C，10s，60°C，30s(分別檢觀UCY5_沙門氏菌，F(xiàn)am—大腸桿菌0157:H7，Hex—副溶血性弧菌熒光信號)，4045個循環(huán)。5)結(jié)果判斷(1)質(zhì)控標準——陰性對照無Ct值，且無擴增曲線；——陽性對照Ct<30，且擴增曲線明顯呈對數(shù)增長?！珀幮院完栃詫φ詹荒軡M足以上條件，則實驗視為無效。(2)判定和報告——無Ct值，且無擴增曲線，判為陰性結(jié)果，可報告25g樣品中未檢出相應(yīng)的致病菌。——Ct值〈35，且擴增曲線明顯呈對數(shù)增長，判為陽性結(jié)果?！狢t值45，判為可疑，應(yīng)重復試驗一次，如Ct值仍-35，且擴增曲線明顯呈對數(shù)增長的，則判為陽性；或延長樣品增菌培養(yǎng)時間4h以上，再重新檢測。本發(fā)明的優(yōu)點1木發(fā)明提供的引物探針的檢測靈敏度可達10cfo/反應(yīng)體系，對樣品增菌6h后，對樣品的檢測靈敏度可達10cfU/25g，說明其具有良好的靈敏度。2本發(fā)明提供的引物和探針對不含有目的菌的樣品均無擴增信號，說明其具有良好的特異性。3由于木發(fā)明采用多重熒光PCR技術(shù)，實現(xiàn)同步檢測三種致病菌，大大減少了工作量，節(jié)省了檢測試劑，降低了檢測成木。4基于本發(fā)明研制的水產(chǎn)品致病菌多重熒光PCR檢測試劑盒可方便檢測使用。圖1是利用本發(fā)明涉及的檢測試劑盒及檢測方法檢測陽性和陰性樣品的沙門氏菌擴增曲線圖2是利用木發(fā)明涉及的檢測試劑盒及檢測方法檢測陽性和陰性樣品的副溶血性弧菌擴增曲線圖3是利用本發(fā)明涉及的檢測試劑盒及檢測方法檢測陽性和陰性樣品的大腸桿菌0157:H7擴增曲線圖。具體實施方式實施例檢測試劑盒水產(chǎn)品致病菌(沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7)多重熒光PCR檢測試劑盒，該試劑盒可供20份水產(chǎn)樣品檢測。具體組成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>樣品1:人為添加適當濃度的沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌的蝦仁。樣品2:經(jīng)SN標準檢測證實無沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌的蝦仁。檢測步驟應(yīng)用上述試劑盒和樣品進行檢測。1)樣品的處理與DNA模板的提取取上述蝦仁25g，加入3。/。NaCl緩沖蛋白胨水225mL，制成l:IO勻漿，置36'C士rC培養(yǎng)6h，取增菌液lmL，加入1.5mL滅菌離心管中，14000rpm離心10min，吸去上清液，加入0.8mLDNA提取液混勻，14000rpm離心10min，吸去上清液，加入50[iL去離子水，震蕩混勻，沸水浴10min，冰浴5min，13000rpm離心5min，取上清液為待測樣品DNA模板。2)試劑配制將試劑從冰箱取出后，置室溫融化，2000rpm離心10sec。按下表計算試劑用量。試劑名稱PCR反應(yīng)液.引物探針用量mL10x4.58x4.5n=l(陰性對照)+1(陽性對照)+2(樣品數(shù))+0.5(損耗)將45^LPCR反應(yīng)液和36mL引物探針分別加入1.5mL離心管中，混勻后，2000rpm離心10sec，分別向設(shè)定的陽性反應(yīng)孔、陰性反應(yīng)孔和樣品反應(yīng)孔中加入18mIV孔。3)加樣將陽性對照模板、陰性對照模板和樣品DNA模板分別加入對應(yīng)的反應(yīng)孔，2pL/孔。用反應(yīng)膜封住反應(yīng)孔，置于多通道熒光PCR儀上檢測。4)反應(yīng)參數(shù)設(shè)置選擇多通道檢測模式，在CY5，F(xiàn)am和Hex通道上打v，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)為95°C5min;95°C，10s，60°C，30s(分別檢測CY5_沙門氏菌，F(xiàn)am—大腸桿菌O^H7，Hex—副溶血性弧菌熒光信號)，40個循環(huán)。5)試驗結(jié)果(1)質(zhì)控標準—一陰性對照均無Ct值，且無擴增曲線；——陽性對照沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7陽性對照Ct值分別為27.34，19.86，27.51，且擴增曲線明顯呈對數(shù)增長。詳見圖1圖3。陰性和陽性對照滿足質(zhì)控標準，實驗有效，可進行結(jié)果判定。(2)判定和報告樣品編號菌名ct值結(jié)果判定1沙門氏菌21.94陽性副溶血性弧菌18.72陽性大腸桿菌0157:H724.92陽性2沙門氏菌-陰性副溶血性弧菌-陰性大腸桿菌0157:H7-陰性8權(quán)利要求1.一種用于沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O157:H7三種致病菌核苷酸片段多重熒光PCR同步檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括2.—種用于沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌0157:H7三種致病菌核苷酸片段多重熒光PCR同步檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>全文摘要一種用于沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O₁₅₇:H₇三種致病菌核苷酸片段多重熒光PCR同步檢測的引物和探針序列。引物序列為(見圖)。文檔編號C12Q1/10GK101440391SQ20081002924公開日2009年5月27日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者林彩華,林志雄,穎蔡,許如蘇,陳其生,陳冠武申請人:中華人民共和國汕頭出入境檢驗檢疫局被以下專利引用(2),