專利名稱：：內(nèi)切葡聚糖酶和它的編碼基因與應(yīng)用的制作方法內(nèi)切葡聚糖酶和它的編碼基因與應(yīng)用本發(fā)明涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶和它的編碼基因與應(yīng)用。技術(shù)背景纖維素主要是植物利用二氧化碳和水在太陽能作用下通過光合作用合成的地球上最豐富的可再生的生物質(zhì)(biomass)資源。據(jù)報道，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達1.55Xl(f噸，其中89%尚未被人類利用(DimlapC，ChiangGC.Utilizeition肌drecycleofagriculturewasteseuiciresidues.ShulerMLBocaRaton,Florida.USA:CRCPressInc.1980.19)。纖維素是多個葡萄糖殘基以P-1，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重復(fù)單位為纖維二糖。天然纖維素的基本結(jié)構(gòu)是由原纖維構(gòu)成的微纖維束集合而成。原纖維是由15-40根有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)構(gòu)成的纖維素分子長鏈所組成。纖維素的結(jié)晶部分是由纖維素分子進行非常整齊規(guī)則地折迭排列形成。在天然纖維素中，木質(zhì)素和半纖維素形成牢固結(jié)合層，緊密地包圍纖維素。纖維素酶是能將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一系列酶的總稱，包括三類酶即內(nèi)切一P—1，4一葡聚糖酶(endo+l，4-glucanase,EC3,2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纖維二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2,1.91)和P—葡萄糖苷酶(P-glucosidase，EC3.2.1.21)，這三種酶協(xié)同作用能將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素長鏈分子的內(nèi)部將長纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用于纖維素分子的一端，以兩個葡萄糖殘基為單位進行切割生成纖維二糖，e—葡萄糖苷酶切割纖維二糖生成葡萄糖(TommeP，WarrenRAJ",GilkesNR.1995.Cellulosehydrolysisbybacteriaandfungi.Adv.Microbiol.Physiol.,37:1-81.1995;BhatMK，BhatS.1997.Cellulosedegradingenzymesandtheirpotentialindustrialapplications.BiotechnologyAdvances,15:583-620)。葡萄糖可作為重要的工業(yè)原料生產(chǎn)酒精、丙酮等化工產(chǎn)品。纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對于解決世界能源危機、糧食和飼料短缺、環(huán)境污染等問題具有重要意義。纖維素酶可廣泛應(yīng)用于釀酒、飼料、食品、紡織、造紙等行業(yè)。如纖維素酶作為飼料添加劑可增加飼料的可消化性，減少排泄的糞便量。纖維素酶可取代浮石進行牛仔褲的"石洗"處理，也可處理其它含纖維織物以降低粗糙度和增加光亮。纖維素酶可添加到洗滌劑中以提高洗滌劑的清潔能力(BhatMK.2000.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology.BiotechnologyAdvances,18:355-383)。由于纖維素酶的廣泛用途以及針對不同的用途需要使用不同性質(zhì)的纖維素酶，更由于纖維素酶的效率低、價格高而使以纖維素為原料生產(chǎn)燃料酒精的成本太高以至于無法真正實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此，需要新的纖維素酶。纖維素酶屬于糖基水解酶類(glycosylhydrolases),許多糖基水解酶由一個催化功能域和一個或更多個其它的功能域如碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate-bindingmodules,CBMs)組成，根據(jù)催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶類被劃分成不同的家族(families)(DaviesG.，HenrissatB.1995.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3:853-859;HenrissatB.1991.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J".280:309-316;HenrissatB.，BairochA.1993Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788;HenrissatB.，BairochA.1996.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316:695-696)。根據(jù)Cazy服務(wù)器(server)(http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶類的最新清單，目前糖基水解酶類有108個家族，纖維素酶分屬于糖基水解酶類家族l、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。將未知的纖維素酶與已知的纖維素酶做序列同源性比較可對其進行分類。人類所克隆的大部分纖維素酶基因都是從純培養(yǎng)的微生物中來的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分離、培養(yǎng)的，一般認為可培養(yǎng)的微生物種類只占自然界中微生物種類的1%(AmannRI，LudwigW，SchleiferKH.1995,Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59:143-169)，夷卩么剩余的99%的不可培養(yǎng)的微生物中蘊藏著大量的基因資源。近年來從環(huán)境樣品未培養(yǎng)微生物提取基因組DNA然后構(gòu)建混合基因組DNA文庫以分離基因已是成熟技術(shù)(LorenzP,SchleperC.2002.Metagenome-achallengingsourceofenzymediscovery.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic19-20:13-19)。目前世界上已克隆得到來源于不同環(huán)境的未培養(yǎng)微生物的纖維素酶基因，其中包括Healy等(HealyFG,RayRM,AldrichHC,WilkieAC,IngramLOandShanmugamKT.1995.Directisolationoffunctionalgenesencodingcellulasesfromthemicrobialconsortiainathermophilic,anaerobicdigestermaintainedonlignocellulose.AppMicrobiolBiotechnol.43:667-674.)報道從厭氧高溫木頭堆里克隆到了一個纖維素酶基閔；Rees等(ReesHC,GrantS,JonesB,GrantWD,HeaphyS.2003.DetectingcellulaseandesteraseenzymeactivitiesencodedbynovelgenespresentinenvironmentalDNAlibraries.Extremophiles.7(5):415-421)報道從湖水和湖床沉積物未培養(yǎng)微生物中克隆到2個纖維素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(VogetS,LeggewieC,UesbeckA，RaaschC,JaegerKE,StreitWR.2003,Prospectingfornovelbiocatalystsinasoilmetagenome.ApplEnvironMicrobiol"69(10):6235-6242;VogetS,SteeleHL，andStreitWR.2006.Characterizationofametagenome-derivedhalotolerantcellulase.J.Biotechnol.126:26—36)手艮道從土壤未培養(yǎng)微生物中克隆到3個纖維素酶基因g"w5、"vW柳和ce/5A;Ferrer等(FerrerM,GolyshinaOV,ChernikovaTN，KhachaneAN,Reyes-DuarteD,SantosVA,StromplC，ElboroughK,JarvisG，NeefA,YakimovMM,TimmisKN,andGolyshinPN.2005.Novelhydrolasediversityretrievedfromametagenomiclibraryofbovinerumenmicroflora.EnvironMicrobiol.7:1996-2010)從牛瘤胃未培養(yǎng)微生物中鑒定了9個纖維素酶基因。Feng等(FengY,DuanCJ,PangH,MoXC,WuCF，YuY,HuYL,WeiJ，TangJL，andFengJX.2007.Cloningandidentificationofnovelcellulasegenesfromunculturedmicroorganismsinrabbitcecumandcharacterizationoftheexpressedcellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol,75:319-328)從兔子盲腸未培養(yǎng)微生物中克隆和鑒定了11個纖維素酶基因。這些來源于未培養(yǎng)微生物宏基因組的纖維素酶基因從序列上來說都是新的，說明宏基因組方法是得到新基因的好方法。反芻動物的瘤胃是自然界中纖維素降解最劇烈的主要場所之一，植物的纖維素類物質(zhì)是被瘤胃中共生的纖維素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、細菌、原生動物和古細菌。目甜研究認為瘤胃中有85%的微生物是未培養(yǎng)的(KrauseDO,DenmanSE,MackieRI,MorrisonM，RaeAL,AttwoodGT,andMcSweeneyCS.2003.Opportunitiestoimprovefiberdegradationintherumen:microbiology,ecology,andgenomics.FEMSMicrobiolRev27:663-693),可以推測這些未培養(yǎng)微生物中一定含有大量的基因資源如纖維素酶基因資源，通過構(gòu)建水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫，極有可能從中篩選得到比目前己知的最好的纖維素酶還要好的酶的基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切葡聚糖酶和它的編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的內(nèi)切葡聚糖酶，名稱為Umcel5B，來源于水牛瘤胃未培養(yǎng)細菌，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)自序列表中的SEQIDW.2的氨基端第21-537位氨基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQ的氨基端第21-537位氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由537個氨基酸殘基組成。自序列2的氨基端的第l一20位氨基酸為信號肽(signalpeptide),自序列2的氨基端的的第40—334位氨基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5B同來源于瘤胃未培養(yǎng)微生物的內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank索引號ABX76045)的同源性最高，兩者的相似性為66%、相同性為54%。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的Umcel5B便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述(b)中的Umcel5B可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的Umcel5B的編碼基因可通過將序列表中SEQIDW:l的自5'端第326至1881位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了便于蛋白的分泌表達，還可在所述Umcel5B的氮基末端添加上信號肽序列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至20位氨基酸殘基組成的多肽，得到由序列表中2所示的氨基酸序列組成的蛋白。上述內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因(wm"/J巧也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述內(nèi)切葡聚糖酶的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW:1的5'端第326-1881位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW2:l的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW2:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDJVs:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)，0.P/。SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。其中，序列表中的序列1由2297個脫氧核苷酸組成，自序列1的5'端的第271至1884位核苷酸為柳ceJ5^的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)，自序列1的5'端的第271—273位核苷酸為^;ceJ5^基因的起始密碼子ATG，自序列1的5'端的第1882—1884位核苷酸為w歷ce^^基因的終止密碼子TAA。序列表中序列1編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)序列。自序列表中SEQIDW2:1的5'端第331-1881位核苷酸序列編碼自序列表中的SEQIDJVT2.2的氨基端第21-537位氨基酸殘基序列。含有本發(fā)明基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明通過構(gòu)建水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫和文庫克隆的內(nèi)切葡聚糖酶活性平板檢測篩選法，得到了新的內(nèi)切葡聚糖酶基因，該內(nèi)切葡聚糖酶基因可在宿主細胞中大量表達該基因以生產(chǎn)該內(nèi)切葡聚糖酶，用于纖維素的降解，實驗證明本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纖維素酶活性(達42229U/g)，而且該酶適宜的pH值范圍和溫度范圍非常廣。本發(fā)明所提供內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因可廣泛應(yīng)用于纖維素的降解。圖1為從水牛瘤胃內(nèi)容物樣品中提取的未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA。圖2為水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物基因文庫克隆的限制性內(nèi)切酶5^nHI酶切分析圖。圖3為瘤胃未培養(yǎng)微生物基因文庫中表達內(nèi)切葡聚糖酶活性克隆的篩選，陽性克隆EPI100/pGXNC56所在的平板圖。圖4為能降解羧甲基纖維素的文庫克隆質(zhì)粒pGXNC56的^mHI酶切帶型。圖5為初篩獲得的重組質(zhì)粒pGXNC56轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到的轉(zhuǎn)化子對羧甲基纖維素降解水解圈照片。圖6為表達質(zhì)粒pET-umcel5B重組質(zhì)粒經(jīng)#coI和雙酶切后電泳圖。圖7為重組大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-umcel5B和大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-30a羧甲基纖維素降解檢測。圖8wmce/5B基因的表達、表達產(chǎn)物Umcel5B的純化及活性膠檢測。圖9Umcd5B在不同pH值條件下的酶相對活力曲線。圖10Umcel5B在不同溫度條件下的酶相對活力曲線。圖11Umcel5B的pH耐受性檢測結(jié)果。圖12Umcel5B的溫度耐受性檢測結(jié)果。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(&c力ew'c力^gco7i)株系EPI100(購自Epicentre公司)；表達菌株Rosetta(DE3)(購自Novagen公司)；柯斯質(zhì)粒載體pWEB::TNC(購自Epicentre公司)；文庫制備試劑盒(購自Epicentre公司，pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931);表達載體pET-30a(購自Novagen公司)；限制性內(nèi)切酶、修飾酶、聚合酶及羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose,CMC)等試劑購自Promega、TAKARA、SIGMA或MBI。實施例l、內(nèi)切葡聚糖酶Umcel5B及其編碼基因的獲得一、水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫的構(gòu)建1、水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組的提取取50g水牛瘤胃內(nèi)容物(樣品的來源為南寧市肉聯(lián)廠剛屠宰的水牛的瘤胃，采集的樣品立即用液氮保存)，懸浮在200ml的0.18M磷酸鉀緩沖液(p朋.5)中，輕輕震蕩均勻，放置10分鐘，讓瘤胃內(nèi)容物中的纖維素顆粒自動沉淀，棄上清液，再加入200ml的0.18M磷酸鉀緩沖液(p服.5)洗沉淀塊兩次，最后一次的沉淀塊用直接提取法提取吸附于纖維素顆粒的微生物的宏基因組DNA。在沉淀塊中加入100ml提取緩沖液(100mMsodiumphosphatepH8.0;100mMTirs陽HClpH8.0;100mMEDTApH8.0;1.5MNaCl;1%CTAB;2。/。SDS)混合均勻，在液氮和65。C水浴中反復(fù)凍融三次后，加入2ml的溶菌酶(20mg/ml)溶液(溶菌酶終濃度為0.4mg/ral)37'C水浴1小時，期間每IO分鐘顛倒混勻一次，然后加入2ml的蛋白酶K(50mg/ml)溶液(蛋白酶K終濃度為lmg/ral)37"水浴1小時，期間每10分鐘顛倒混勻一次。加入40mlPVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone)溶液(購自Sigma公司，目錄號P-6755)(PVPP溶液:每100mgPVPP與lml0.18M磷酸鉀緩沖液(pH7.2)混勻)，振蕩30秒，再加入2ml3MCaCl2溶液，振蕩30秒后，在BeckmanCoulterAvantiJ-E離心機(購自BeckraanCoulter公司，目錄號369003)JA-10轉(zhuǎn)頭用8，000g室溫離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管。在沉淀物中再加入100ml提取緩沖液，混合均勻，在65。C放置60分鐘，期間每10分鐘顛倒混勻一次，8,000g離心20分鐘，合并兩次的上清液。在上清液中加入等量的氯仿，上下顛倒離心管混勻，8,000g離心10分鐘，取上清入另一個離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻后即見DNA絮狀沉淀析出，用滅菌的Tip頭挑出絮狀DNA，用70%乙醇洗兩次，于室溫中晾干，用5mlTE溶解。2、水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組的純化獲得30kb以上的DNA將DNA粗提物加到S印hadexG200(購自Pharmacia公司，目錄號17-0080-01)的層析柱(200mmX10mm，含有2XPVPP(購自Sigma公司，目錄號P-6755)上，用TE緩沖液洗脫，按每組分lml分段收集洗脫液，每一組分加入lOO)al的3M醋酸鈉溶液(pH5.2)及l(fā)ml異丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7%瓊脂糖凝膠電泳后切下含30kb以上的DNA的凝膠，用電洗脫法回收純化DNA，回收純化的DNA電泳圖如圖1所示，其中泳道1為ADNA(48.5kb);泳道2為入DNA用EcoRI酶切(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道3為從水牛瘤胃內(nèi)容物提取的DNA粗提物；泳道4為經(jīng)過S印hadexG-200凝膠初步純化的DNA;泳道5為經(jīng)過電洗脫法回收得到的30kb以上的DNA。3、純化獲得30kb以上的末端補平的水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組為了用上述電洗脫法回收純化的DNA制作基因文庫，首先對這些DNA進行末端補平，以產(chǎn)生平頭末端而和文庫制備試劑盒(購自Epicentre公司的文庫制備試劑盒pWEB::TNCcosraidcloningkit,目錄號WEBC931)中已處理好的同樣具平頭末端的pWEB::TNC載體相連，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入6)alIOX末端修補緩沖液(330niMTris—醋酸(pH7.8)，660mM醋酸鉀，lOOmM醋酸鎂，5mMDTT)，6(il2.5mMdNTP混合物(每種dnNTP2.5mM)，6|ul10mMATP，10ug30kb以上的DNA，2|il末端修補酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)(購自Epicentre公司的文庫制備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)，加滅菌的去離子水補充到總體積60ul。25'C下放置45分鐘，再轉(zhuǎn)移到7(TC水浴鍋放置10分鐘以終止酶反應(yīng)，1.0%低熔點瓊脂糖凝膠電泳后切下含30kb—45kb的DNA的凝膠進行DNA回收。4、末端補平后的水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組與pWEB::TNC的連接反應(yīng)將上述末端補平后回收的DNA片段與文庫制備試劑盒中已處理好的具平頭末端的pWEB::TNC載體在T4DNA連接酶的作用下連接起來，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入12pl無菌水，2fllIO倍快速連接緩沖液(10XFast-LinkLigationBuffer),l|illOmMATP，lplpWEB::TNC載體(O.5pg)，3|il低熔點瓊脂糖凝膠回收的30kb—45kb的DNA(0.1iagAd)，1^1快速連接DNA連接酶(Fast-LinkDNALigase,2單位/pl)(購自Epicentre公司的文庫制備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)，混勻后在25。C下放置2個小時，再在7(TC放置10分鐘以終止酶反應(yīng)。5、水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫的獲得及質(zhì)量檢驗連接反應(yīng)產(chǎn)物用人包裝蛋白包裝，具體方法為將在冰上剛剛?cè)芑娜氚b提取物(購自Epicentre公司的文庫制備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931)的一個組分，總共50ul/管)25pl立即轉(zhuǎn)移到一個新的滅過菌的微量離心管中并快速置于冰上，再往其中加入IO)al連接反應(yīng)產(chǎn)物，充分混勻后置于30°C90分鐘后，再往其中加入另外25pl溶化的人包裝提取物，充分混勻后置于30°C90分鐘，向其中加入500iil噬菌體稀釋緩沖液(10mMTris-HCl(pH8.3),100mMNaCl，10mMMgCl2)，得到560pl包裝反應(yīng)產(chǎn)物。再將上述得到的560pl包裝反應(yīng)產(chǎn)物加入到5.6mL的0D6。。=1.0的宿主大腸桿菌EPI100培養(yǎng)液(培養(yǎng)基為LB(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;pH7.0)+10mMMgS04)中，25。C下放置20分鐘讓上述得到的包裝的入噬菌體吸附和侵染宿主細胞fco"'EPIIOO，在含氨芐青霉素(終濃度為100ug/mL)和氯霉素(終濃度為12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，lOg;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;瓊脂粉，15g，pH7.0)上篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)子。結(jié)果共獲得約15，000個轉(zhuǎn)導(dǎo)子，任意提取14個克隆的質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶及^ffl酶切后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，結(jié)果所有質(zhì)粒除都有一個5.8kb的載體片段外，都含有插入片段，且沒有發(fā)現(xiàn)有兩個質(zhì)粒具有相同的酶切帶型，酶切結(jié)果如圖2所示，其中泳道1為XDNA用化oRI酶切片段(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.Okb，8.Okb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb，1.5kb);其它泳道分別為使用限制性內(nèi)切酶"3MH酶切的文庫克隆質(zhì)粒。結(jié)果表明文庫含有非常隨機的插入DNA片段，插入片段最大的為42kb，最小的為22kb,平均大小為35kb。說明文庫的克隆容量也是相當(dāng)大的，文庫的質(zhì)量相當(dāng)好。二、內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因(咖ce^5S)的獲得1、從水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫中篩選表達內(nèi)切葡聚糖酶活性的克隆用平板影印法將步驟一中在含氨芐青霉素和氯霉素的LA平板上得到的文庫(每平板約200個菌落左右)分別影印到含0.5%羧甲基纖維素(carboxylmethylcellulose，CMC)(購自Sigma公司，目錄號C-5678)、氨節(jié)青霉素(終濃度100"g/mL)和氯霉素(終濃度12ug/ml)的LA平板上，將平板倒置于37t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時后，將培養(yǎng)好的含羧甲基纖維素的LA平板用質(zhì)量百分含量為0.5%剛果紅溶液染色15分鐘，用1M的NaCl溶液脫色15分鐘，然后檢測菌落周圍有無水解圈。結(jié)果如圖3所示，箭頭所指的菌落為周圍有水解圈的克隆。結(jié)果表明篩選到l個菌落周圍有水解圈的克隆(EPI100/pGXNC56)，進一步提取該克隆的質(zhì)粒DNA并將其命名為pGXNC56，用限制性內(nèi)切酶^3/dH完全酶切pGXNC56后，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖4所示，pGXNC56除有一個5.8kb的載體片段外，還有另外5條fe/sHI片段，大小分別為18.0kb，7.5kb，6kb(和載體帶重疊)，3,5kb和2.5kb。結(jié)果表明pGXNC56含有37.5kb的插入片段。其中，圖4中，泳道1為人用fcoRI酶切后的片段(片段大小從大到小依次為:21.2kb,7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小從大到小依次為:10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb,1.5kb，lkb);泳道3為pGXNC56Afe/aHI(從上至下分別為18.Okb，7.5kb，6kb，5.8kb，，3.5kb和2.5kb)。為了證實pGXNC56的插入片段確實含有內(nèi)切葡聚糖酶基因，用pGXNC56質(zhì)粒DNA和空載體pWEB::TNC分別轉(zhuǎn)化Aco乃'EPIIOO，在含氨芐青霉素(100ug/mL)的LA平板上篩選轉(zhuǎn)化子，隨機挑取由每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的IO個轉(zhuǎn)化子點接到含質(zhì)量百分含量為0.5。/。羧甲基纖維素的LA平板上，37C培養(yǎng)24小時后，用0.5%剛果紅溶液染色15分鐘，用1M的NaCl溶液脫色，然后觀察菌落周圍有無水解圈，結(jié)果表明所有10個由空載體pWEB::TNC轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子周圍都沒有水解圈，所有10個由pGXNC56轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子周圍都有水解圈，其中一個轉(zhuǎn)化子的檢測結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pGXNC56的插入片段上確實含有內(nèi)切葡聚糖酶基因。圖5中，右邊的菌落為初篩獲得的重組質(zhì)粒pGXNC56轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到的轉(zhuǎn)化子(能降解羧甲基纖維素)，左邊的菌落為空載體pWEB::TNC轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到的轉(zhuǎn)化子(不能降解羧甲基纖維素)。2、內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因(^7C^/5扔的獲得為了測定重組質(zhì)粒pGXNC56上內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA序列，采用亞克隆的方法對該基因進行定位。依次使用限制性內(nèi)切酶AcoRI對重組質(zhì)粒pGXNC56進行了亞克隆，亞克隆的步驟取質(zhì)粒pGXNC56用化oRI完全酶切后加入連接酶在25。C連接一個小時(在pGXNC56完全酶切后，該重組質(zhì)粒含有的載體pWEB::TNC的3.0kb的部分可以利用來克隆各個外源五coRI片斷)。連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，在含質(zhì)量百分比含量為0.5%羧甲基纖維素的LA培養(yǎng)基平板上篩選有活性的克隆。在任意挑選24個表達羧甲基纖維素酶活性的克隆，提取質(zhì)粒做五coRI酶切分析，其中一個質(zhì)粒克隆有最少的外源片段，將此質(zhì)粒命名為pGXNC5614。質(zhì)粒pGXNC5614的五coRI酶切分析表明該質(zhì)粒有3kb和4kb的兩個外源片段。分別將3kb和4kb的兩個外源片段回收與載體pGEM3zf(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue,在含質(zhì)量百分比含量為0.5%羧甲基纖維素的LA培養(yǎng)基平板上再次篩選有羧甲基纖維素酶活性的克隆，含該兩個片段與載體pGEM3zf(+)的正確重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子均無羧甲基纖維素酶活性，說明pGXNC5614的插入片段中編碼羧甲基纖維素酶的基因中有一個五coRI位點。最后將目的基因定位在7kb的化oRI酶切片段上(即含有該7kb片段的重組質(zhì)粒為上述的pGXNC5614)。將該重組質(zhì)粒pGXNC5614寄送大連寶生物工程公司采用雙脫氧核苷酸法對該亞克隆進行雙向雙鏈測序。測序結(jié)果用軟件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的軟件對DNA序列進行分析，如Blast(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),得到內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因，該基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名為咖ce^^。自序列表中序列1的5'端的第271至1884位核苷酸為Mzce^5^的開放閱讀框(OpenReadingFrame,0RF),由1614個核苷酸組成，自序列1的5'端的第271—273位核苷酸為湖"755基因的起始密碼子ATG,自序列1的5'端的1882—1884位核苷酸為咖ce25^基因的終止密碼子TAA。內(nèi)切葡聚糖酶基因，ce75A編碼一個含537個氨基酸的蛋白質(zhì)Umcel5B，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列，用DNAStar軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為60317.83道爾頓，等電點pl為5.15。用簡單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http://smart,embl-heidelberg.de)分析內(nèi)切葡聚糖酶Umcel5B的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自序列2的氨基端的第1一20位氨基酸為信號肽(signalp印tide)，自序列2的氨基端的第40—334位氨基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Uracel5B同來源于瘤胃未培養(yǎng)微生物的內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank索引號ABX76045)的同源性最高，兩者的相似性為66%、相同性為54%。實施例2、咖ce25S在大腸桿菌中的表達1、可表達咖ce75i的重組載體(pET-咖ce7幼)的構(gòu)建帶有編碼信號肽的基因在體內(nèi)表達后很有可能將表達產(chǎn)物分泌到細胞外。為避免表達產(chǎn)物分泌到細胞外，只需要人工合成序列1的自5'端第326位至1881位堿基(即咖c^59基因中除編碼信號肽功能域和終止密碼子外的DNA序列)，1556bp,預(yù)計其編碼蛋白的分子量為58.39332KDa，等電點pi為4.98。人工合成w/^e^^基因除了信號肽和終止密碼子以外的全部序列(即自序列1的5'端第326-1881位核苷酸序列)，合成腿ceJ幼基因兩端帶有10///7J力o/酶切位點，將合成后并測序表明正確的鵬c^朋基因片段用辰oJ浙J力o/酶切后，插入載體pET-30a(+)(購自Novagen公司)的7Vco/^7i7o/位點間，得到重組表達載體，將該重組載體進行酶切和測序鑒定，將酶切和測序表明含有w歷ce^^基因編碼序列的正確的重組載體命名為pET-湖ce75凡起始密碼子和終止密碼子由表達載體pET30a(+)提供。表達產(chǎn)物的N端和C端分別有一個由表達載體提供的His標(biāo)簽(6XHisTag)。其中，pET-w歷ce^55重組質(zhì)粒的酶切電泳圖譜如圖6所示，圖6中可以看到重組質(zhì)粒經(jīng)vVco///7J力o/雙酶切后釋放出一條5.3kb的載體帶和一條與人工合成歷ce^55基因經(jīng)fcoRI和酶切后同樣大小的1.556kb的片段。圖6中，泳道1為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb);泳道2為重組質(zhì)粒經(jīng)Abo/浙屈o/雙酶切后結(jié)果。2、wmce/55基因在co//RosettaTM(DE3)中的表達把pET-咖ceJ朋轉(zhuǎn)化至￡coh'RosettaTM(DE3)中得到含有pET-鵬ceJ幼的轉(zhuǎn)化子RosettaTM(DE3)/pET-"/zceJ551，挑取RosettaTM(DE3)/pET-哪ce255單菌落于含質(zhì)量百分比含量為0.5呢羧甲基纖維素的LA培養(yǎng)基平板上(含氯霉素34ug/mL，卡那霉素25ng/ml，IPTG1.0mmol/L)，同時用RosettaTM(DE3)/pET-30a(+)[轉(zhuǎn)入pET-30a(+)的RosettaTM(DE3)]作為空白對照，37"培養(yǎng)24小時。菌體經(jīng)氯仿破壁后用質(zhì)量百分濃度為0.5%剛果紅溶液染色15分鐘，用lmol/L的NaCl溶液脫色，然后觀察菌落周圍有無水解圈。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明重組菌RosettaTM(DE3)/pET-咖ceJ5W周圍有水解圈，而空白對照RosettaTM(DE3)/pET-30a周圍無水解圈，說明靶基因在Acoh'RosettaTM(DE3)中已經(jīng)高效表達出了有纖維素(羧甲基纖維素)降解活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。圖7中右邊的菌落為重組大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-umcel5B(能降解羧甲基纖維素)，左邊的菌落為含有空載體的大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-30a(不能降解羧甲基纖維素)。3、Umcel5B的表達和純化1)RosettaTM(DE3)/pET-umcel5B菌體發(fā)酵接種RosettaTM(DE3)/pET-咖cel5B到10ml含有34ug/ml氯霉素(CAM)與25ug/ral卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C200rpm培養(yǎng)過夜。取5ml過夜培養(yǎng)物到100ml含有34ug/ml氯霉素(CAM)與25yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，在37°C培養(yǎng)200rpm培養(yǎng)至OD,為0.6。加入IPTG至終濃度為lmM，繼續(xù)培養(yǎng)5個小時，5,OOOg離心收集菌體。共作2瓶樣品，收集200ml的培養(yǎng)液的菌體。2)Uracel5B的提取與純化在步驟l)收集獲得的菌體中，按每克菌體重量加入5ml的裂解緩沖液(50mMNaH2P04，3OOmMNaCl,10mMimidazole(咪唑)，lmMPMSF(苯甲基磺酰氟)，pH8.0)，懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，置冰上30分鐘。用超聲波破碎細胞，400w作用20次，每次作用時間IOs，每次作用間隔12s。12，000g離心20分鐘，收集上清得到Umcel5B粗酶液。取5ul用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的純度。Umcel5B的純化使用Qiagen公司的TheQIAexpressionistkit試劑盒(方法參照試劑盒說明書)。按每4ml上述獲得的裂解上清液加入lml質(zhì)量百分比含量為50%的NI-NTA膠體，在4。C用200rpm搖60分鐘，混合物灌注到TheQIAexpressionistkit試劑盒附帶的柱子。加4ml洗滌緩沖液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl,20mMimidazole,lmMPMSF,pH8.0)到柱子里，緩慢攪拌，重復(fù)沖洗6次。加入0.5ml的洗脫緩沖液(50mMNaH2P04,300mMNaCl，250mMimidazole,ImMPMSF,pH8.0),收集流出物，重復(fù)洗脫8次。合并8管蛋白質(zhì)，即為鎳柱純化后的Umcel5B，取5ul用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的純度。選擇Amershambiosiences的陰離子柱(MonoQ)在蛋白質(zhì)純化儀AKTAexplorer來進一步純化Umcel5B，選擇的洗脫緩沖液是pH值為6.5的磷酸緩沖液(含1M的NaCl)，結(jié)果在鹽濃度達到約0.3M的時候目的蛋白被洗脫下來，取3ul洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖8所示，表明Umcel5B經(jīng)陰離子柱純化后已達到SDS-PAGE單條純。為了檢測純化的Umcel5B是否還有內(nèi)切葡聚糖酶活性，用活性膠染色法進行了檢測，過程如下。首先Umcel5B在聚丙烯酰胺變性膠上進行蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)，然后對電泳后在變性膠中已變性的Umcel5D進行復(fù)性處理。復(fù)性處理把電泳后的變性膠浸入在50ml的復(fù)性緩沖液中(復(fù)性緩沖液的配制:Tris3,025g，0.5MEDTA(pH8.0)5ml，0-巰基乙醇0.173ml，加水至總體積500ml)，4。C下浸泡30分鐘，更換復(fù)性緩沖液，重復(fù)三次，前兩次在復(fù)性緩沖液中添加0.5ml的異丙醇。再用10mMpH7.0的磷酸鉀緩沖液洗膠兩次。把復(fù)性膠貼在含質(zhì)量百分比含量為0.5%羧甲基纖維素的LA培養(yǎng)基平板上，用塑料袋包裹培養(yǎng)皿，在37r中保溫l小時。取出平板用質(zhì)量百分比濃度為0.5%剛果紅溶液染色15分鐘，用lmol/L的NaCl溶液脫色?；钚阅z檢測純化的Umcel5B具有CMCase(內(nèi)切葡聚糖酶)活性(附圖8)，說明umcel5B是按正確的閱讀框架表達的。圖8中l(wèi)為分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker);2為Umcel5B基因的表達的粗酶液；3為鎳柱純化后的Uracel5B;4為分子篩純化的Umcel5B;5為Umcel5B的活性膠檢測。4、Umcel5B酶學(xué)特性的研究內(nèi)切葡聚糖酶的酶活測定采用DNS法，具體操作如下1)配制DNS試劑稱取10克NaOH用約400mlddH20溶解，再稱取10克二硝基水楊酸、2克苯酚、0.5克無水亞硫酸鈉、200克四水酒石酸鉀鈉，將其溶解于約300mld膽2O中，兩種溶液混合，定容到1升，避光保存。2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取9只薄壁試管，按下表加入溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混勻后在沸水中反應(yīng)5分鐘，室溫冷卻，用酶標(biāo)儀測A530。3)酶活測定取10^1步驟3中的步驟(2)中獲得的Umce15B酶液(Umce15B濃度為0.316mg/ml)，加入pH值4.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液中，再加入300pl質(zhì)量百分比含量為1%CMC(羧甲基纖維素)(溶劑為pH值相同的O.IM檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液)溶液反應(yīng)，在45。C溫度下反應(yīng)IO分鐘，待反應(yīng)結(jié)束后加入lml步驟l)制備的DNS試劑置于沸水中水浴5分鐘，室溫冷卻，用酶標(biāo)儀測As30。酶活(IU)定義為1U為每分鐘催化產(chǎn)生lpmol還原糖所需的酶量。比活力的定義每g蛋白質(zhì)所含的酶活力(U/g)。結(jié)果表明，Umcel5B對羧甲基纖維素的在最適pH值4.0最適溫度45。C下比活力為42229U/g。4)酶的最適pH值的測定測定Umcel5B在37°C,pH范圍為2.58.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液中的酶活，梯度為0.5。具體方法為分別取10(!l步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液，分別加入190^1pH值為2.58.0(梯度為0.5)的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液中，再分別加入300W質(zhì)量百分含量為1%CMC(羧甲基纖維素)(溶劑為與之前相同pH值的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液)溶液，在37X:反應(yīng)10分鐘后，加入lml步驟(l)制備的DNS試劑置于沸水中水浴5分鐘，室溫冷卻，用酶標(biāo)儀測As30。酶活(IU)定義為1U為每分鐘催化產(chǎn)生lpmol還原糖所需的酶量。在37。C的反應(yīng)條件下，Umcel5B在pH4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中的比活力最高，以此為100%，換算各pH值下的相對酶活力，結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明Umcel5B的最適pH為4.0。5)酶的最適溫度的測定在最適pH4.0條件下測定不同溫度下(25°C80°C)的Umcel5B酶活。具體方法為分別取10pl步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液，加入19(^1pH值為4.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液中，再加入300W質(zhì)量百分含量為1%CMC(羧甲基纖維素)(溶劑為pH值為4.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液)溶液，分別置于25。C80。C(梯度為5。C)進行反應(yīng)10分鐘后，加入lml步驟(1)制備的DNS試劑置于沸水中水浴5分鐘，室溫冷卻，用酶標(biāo)儀測As3。。酶活(IU)定義為lU為每分鐘催化產(chǎn)生l)Limol還原糖所需的酶量。在pH值為4.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩沖液中反應(yīng)條件下，Umcel5B在45。C時比活力最高，以此為100%，換算各溫度下的相對酶活力，結(jié)果如圖10所示，結(jié)果表明Umcel5B的最適溫度為45°C6)酶的pH耐受性測定將步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液保存于不同pH值(pH2.5-10.0，梯度為0.5)的緩沖液中，于4"C放置24小時后在最適pH值4.0和最適溫度45t:下測定酶活(方法同步驟3))。其對照(即100%的活力)是未處理的步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液在pH4.0，45。C下所測得的活力。結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明Umcel5B在pH4.010.0之間保持24小時后仍具有80%以上的活力，這說明該酶具有較好的pH耐受性。7)酶的溫度耐受性測定將步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液保存于最適pH值的緩沖液中，置于不同溫度下(20°C70°C，梯度為5。C)放置1小時后在該酶的最適pH值和最適溫度下測定酶活(方法同步驟(3))。其對照(即100%的活力)是未處理的步驟3中的步驟(2)中獲得的Umcel5B酶液在pH4.0，45。C下所測得的活力。結(jié)果如圖12所示，結(jié)果表明5(TC以下，Umcel5B都能保持80。/。以上的相對活力，說明該酶在相當(dāng)大的溫度范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。序列表〈160〉2〈210〉1<211〉2297<212〉薩〈213〉未知〈220〉<223〉〈400>1ggggttccgcatgacattaaaa3tctttagtaaga/ttact"gctggtgcaagaacatggcagggactgg3tgatgaa^ggacaccagtggtcatcgatxcaatggctgctgga^c3gaaacgaaatgcgccattaacaaaga^tcgc^Lgcccttg犯ttggc卿atgaatctgctgaac3aatctggatctalcgtttatca"tggcagcttttgaagttgacagacggtctcatgaggcacatttcccctataaaaaatatttatttaacaaataatttggcactcagcgtgggctg肌tc3gagac鄉(xiāng)cagggttgMcagtcg3atgccagtactagccaatgatggatgacgaattatgccaaacctggt3gtt3CCtg犯g3犯3gta^tgcaaagggctccattattataaCC犯gtggLggCcagaaccagcgcgcgttcgagcg卿卿ctggg卿卿ccgaa犯gtgtaggcgtatcgcctacttcaaatatcgctttgctaaggcagaaccttggtatactggggacggagccatacg娜組ggttgcatcgtgagcgacctacgtttaaggacg肌caaatgggcttttcgtccaacacctatatctggtcacagtcattatctgagaaccgccggtatcggtcttcaatcaggttgg犯tggtgtgg犯gtatttg^tgUccacctgacgacgsggccctcaaataaatccaagattttgaacacgctcgcagcctgtcacgtgtgccagatg犯gcgtgaatgtccatcg3ca^agtcatacgaccaga肌cgagcctg^ta^gtgctcggccagtaatcattttccgtcgataaccggtg犯tatggaattagcccaccttctactcctgacctggcctgttxatgggag卿gcggMCtg8CCttttaga犯aa60tctaagaaaccattattatc120ttcgtcttcaaga^ttctca180gtaaatttgc3g^gttt"tt240ctctacttttgctgtgtgga300agactgctaccgetagctgtc360atgccagtagcggtagcaaa420caaagcccgaactc3tg犯a480taacatggtataaccatatg540ttcacgaggtggtgg3Ct3t6003tga^c8ggtgacggcacg660agtcaaagtacgaatatxtg720agttgctttt780ctactgacgacggctataag840gtaaaacaggtggc犯caac900gcgccgctaaCgCgSLtg^d960agctgcatagctatcctgac1020tgatcagtaccatt肌犯cg1080ccacattcaggacttggcct1140tttatgcgatggactatttc1200ggatgggtctctctgacgga1260ctga^catt1320attcttcgaagggtactgtt1380tgttcgttccatcctctatg1440ataaactcgacttcaccgac1500tatgatgatattcagttcatgtataataMggtggatggcagaagatacccagtggtctt1560tcaatggatgggaaagcgttcgacggtgccgacttcagcgcttccagcgtstatggcatt1620caMcgggcgatac肌agacatcggtcttgactttcgatgcctcggcttatggatatgtt1680txtaaatatgagatggtgatccaaggacacggcgttatcatgaaaaaggttactgtaaga1740gcaccttccggtacgtcagcaattccccttatcaaagcagattatccagataataccatc1800atatacaacctcaatggccagcgtgtcgaaacgcctcgtaagggaatctatatccagaac1860ggcaaaaaatacatagcacaataacggctactgacttctgaaaagaacgcccccgactac1920ttatcacaagcaatcgggggctacaaaaaacctttatatttgaaaaaccttattatttat1980tcacctggaacttagtgtcaccatccttgaagaaggcgttgatc"tgcttggcggcagcaa2040taccggcattgatattggcctcggcagtctgagcacccatcttcttcggagtcgagaagt2100aacggccactgaacttggcgaactcgtgatcggcatcaggcatgatgtcggtg已caaact2160tcagatcgtcacgctcctgcatcagctgaatcagctcagcctcgttgatcacttccttac2220gggctgtgttcacgaggataccacccttcttcatcttacccaccagcgcagcattgatgc2280tctgcttggtctcaggc2297<210〉2<211〉537〈212〉PRT〈213〉未知〈220〉<223〉<400〉2MetLysLysThrLeuLeuLeu15HisAlaLysAlaGinAspPhe20MetGlyValGlyTrpAsnLeu35SerLysGinGlyLeuGluSer5055UuCysGlyMetLeuValLeuGlyThr1015GluThrAlaThrGluAlaValLysAsn2530GlyAsnThrLeuAspAlaSerSerGly4045GluThrTyrTrpGlyGinProValThr60L>ysPro65ArgValProValGluLeuMetLysMetMetLysGluAlaGlyPhe7075TrpTyrAsnHisMetAspThrSerAspGluAspGinGluTrp100MetThr85MetLysCysTyrAsnHisArgValMet90GluValValAspTyrCyslieGly115GinTrpLeuHisHis105AsnValHisHisGlyThr130SerLysTyrGluTyr145TyrAspGinLysVal120SerThrAlaThrAla135TrpLysGinlieAsp125AspGlyGlyTyr110ThrLysLeu150LeuPheGluSerTyr140AsnGluPheGluAsnLysTrp180AlaLeu165AsnGluProAlaAsnAsnTyr195LysAsnArgAsnAsnAsn210AlaAlaAsnAlaMet225lieliePheGinLysLeuPheArgThr185AsnTyr170AspThrAla155AsnGluMetLeuAspValAlalie80ThrVal95VallieGlyAspValLysLysAsp160AspAsp175AlalieVal200ValValAsnThrLeu215AlaLeuGluLeuGlyTyrLys190ArgLysThrGlyGly205SerAlaSerSerLys230HisSerTyrProTyr220GluGluSerAlaLysLeuLysTrpPro290Leu245ValAspAsnLeuPro235TrpGinAsnGluSerlie260AlaProVallieAsp250SerThrlieLysArg275ThrAsnLeuAsplie265GlyGluTyrAlaGlyHis240SerAsn255AsnLeuTyr295lie280TyrAsnGluAsnThr270PheArgThrArg300Thr285GluLeuAlaLeuTyrAla305ThrPheMetTyrAspTrpAlaPheAsnGin340PheGlySerAla355AlaMetTyrAspGlyAsnLys435GinAsn420AlaSerAlalieProLeu500GlyAsnLeuAsn515GinAsnGly530TyrMet325ProPhelieLysLysThrLysGluAlaGly310315GlyLeuSerAspGlylieThrVal370PheValProSerSer385GluLeuThrTyrAspLeuAlaGluGlyLysPheGluGlyGlu345ProGly330ThrTyrLeuThrValHisAspTyr360LysThrLeuGluGlylie450SerAlaTyrGly465GlyVallieMetLys405GlyPheGly丁yrLys485lieMet390LeuGlyAspAspGlu375LeuThrAspValAspPheThrTrpGinGlyAsp410lieGly395TyrTrp380GluArgLysSer365GlyAspAspAspProSerGlyLys425AspPheSerAlaAla440LysThrSerValThr455SerLysTyrGluVal470LysValThrValLeu460ValSer445ThrLysAlaAspGinArgValLysLysTyrlie535Glu520AlaTyr505ThrGinArg490ProAspAsnThrArgProArgLysSerAla350SerGluVallieLeu430SerPhelieGly320GluPro335TyrHisLysGlyGlyValGluVal400GinPhe415SerMetValTyrAspAlaMet475AlaProSerGlylieGinGlyHis480ThrSer495lieTyrGly525lie510lieTyrlie權(quán)利要求1、一種內(nèi)切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)自序列表中的SEQID№.2的氨基端第21-537位氨基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQID№.2的氨基端第21-537位氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切葡聚糖酶，其特征在于所述內(nèi)切葡聚糖酶具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。3、權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID処1的5'端第326-1881位核苷酸序列;2)序列表中SEQIDW:l的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW2:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權(quán)利要求3或4所述的內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的重組表達載體。6、含有權(quán)利要求3或4所述的內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。7、含有權(quán)利要求3或4所述的內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的宿主菌。8、權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素降解中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求3或4所述的內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因在纖維素降解中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種內(nèi)切葡聚糖酶和它的編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種內(nèi)切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№2；2)將序列表中SEQID№2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。實驗證明本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纖維素酶活性(達42229U/g)，而且該酶適宜的pH值范圍和溫度范圍非常廣。本發(fā)明所提供內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因可廣泛應(yīng)用于纖維素的降解。文檔編號C12N9/42GK101225378SQ20081005669公開日2008年7月23日申請日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者馮家勛,唐紀(jì)良,方穎慧,段承杰申請人:廣西大學(xué)