一種魚(yú)精蛋白專用編碼基因及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種魚(yú)精蛋白專用編碼基因及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種魚(yú)精蛋白專用編碼基因及其利用該 編碼基因制備魚(yú)精蛋白的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 鮭魚(yú)又稱三文魚(yú)，是深海魚(yú)類的一種，為常用的食品之一，中國(guó)產(chǎn)的大馬哈魚(yú)便是 鮭魚(yú)的一種。鮭魚(yú)在淡水環(huán)境下出生，之后移到海水生長(zhǎng)，又會(huì)回到淡水繁殖。成熟雄魚(yú)的 精巢組織稱魚(yú)精，因具有異味，多被廢棄或作廢料。但魚(yú)精中含有魚(yú)精蛋白（Protamine)，魚(yú) 精蛋白也稱精蛋白，是一種堿性蛋白質(zhì)，主要存在于魚(yú)類（鮭魚(yú)、鯡魚(yú)、鱒魚(yú)）的成熟精子細(xì) 胞中，與DNA緊密結(jié)合在一起，以所謂的核精蛋白的形式存在。
[0003] 魚(yú)精蛋白相對(duì)分子量小，一般由30~50個(gè)氨基酸組成，分子中2/3以上的氨 基酸都是精氨酸，等電點(diǎn)在pH10~12,可溶于水和烯酸，加熱不凝固。根據(jù)堿性氨基酸 組成的種類和數(shù)量不同，可將魚(yú)精蛋白分為單魚(yú)精蛋白（monoprotamine)，雙魚(yú)精蛋白 (diprotamine)和三魚(yú)精蛋白（triprotamine)3種。其中，單魚(yú)精蛋白僅含一種組分精氨 酸，如鮭、鯡和虹鱒精蛋白等；雙魚(yú)精蛋白含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸，如鯉精蛋白；三魚(yú) 精蛋白含有3種堿性氨基酸，如鰱、舞精蛋白。研宄表明常見(jiàn)魚(yú)精蛋白并不是單一組分，它 們通常是由幾種成分組成的混合物，如鯡魚(yú)精蛋白經(jīng)離子交換層析后分離出3種成分，且 成分之間彼此非常相似，而紅鱒魚(yú)精蛋白則由6種差別極小的成分組成。不同魚(yú)種魚(yú)精蛋 白在氨基酸組成比例上有很大的差別，但是它們存在很多相似的特征。Yoshiko研宄了 12 種魚(yú)類的魚(yú)精蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)12種魚(yú)精蛋白的N-末端均為精氨酸或丙氨酸，且均含有4個(gè) 較長(zhǎng)的和2個(gè)較短的精氨酸簇，分別被Thr或Ser、Gly-Gly、Pro-lie或Val-Val特征性殘 基分隔開(kāi)。
[0004] 在動(dòng)物精細(xì)胞中還存在著一種與魚(yú)精蛋白結(jié)構(gòu)非常相似的蛋白質(zhì)一組蛋白，組蛋 白也是一種堿性蛋白質(zhì)，與細(xì)胞中DNA結(jié)合起著維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，其分子結(jié)構(gòu)比魚(yú) 精蛋白復(fù)雜，通常由H1、H2A、H2B、H3、H4五種組分組成。在精子細(xì)胞成熟階段，魚(yú)精蛋白逐 步代替組蛋白而與DNA結(jié)合使DNA處于穩(wěn)定且不轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)。國(guó)外學(xué)者的研宄表明魚(yú)精蛋 白的形成經(jīng)歷了組蛋白-中間蛋白-精蛋白的轉(zhuǎn)化過(guò)程，在此過(guò)程中，中間蛋白可能存在 TP1和TP2兩種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，因而可以解釋魚(yú)精蛋白含有兩種或多種組分；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)不 同成熟度和成熟階段的魚(yú)類精巢中精蛋白成分和含量的不同，完全成熟的魚(yú)類精巢更適合 于提取魚(yú)精蛋白，而不成熟或未完全成熟的魚(yú)精蛋白中雜蛋白較多，這些雜蛋白或許是不 成熟的魚(yú)精中未完全轉(zhuǎn)變成魚(yú)精蛋白的組蛋白或中間蛋白。因此，提取魚(yú)精蛋白時(shí)考慮魚(yú) 的性成熟程度是很有必要的。
[0005] 自1937年McClean等報(bào)道了魚(yú)精蛋白能夠抑制傷寒埃氏桿菌的生長(zhǎng)、Miller等 發(fā)現(xiàn)魚(yú)精蛋白能夠抑制多種好氧菌和厭氧菌的呼吸代謝從而影響其成長(zhǎng)繁殖之后，魚(yú)精蛋 白的抑菌作用才受到人們的廣泛關(guān)注，作為化學(xué)防腐劑的替代品逐漸出現(xiàn)在食品添加劑行 列。
[0006] 魚(yú)精蛋白的一個(gè)重要特點(diǎn)就是具有良好的抑菌活性，它能明顯的抑制革蘭氏陽(yáng)性 (G+)、霉菌、酵母的生長(zhǎng)，對(duì)巨大芽孢桿菌、枯草桿菌等也有一定抑制作用。起初研宄人員認(rèn) 為，魚(yú)精蛋白只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑制作用明顯，對(duì)革蘭氏陰性菌（G-)、霉菌及酵母幾乎沒(méi)有 抑制作用，但后來(lái)研宄的結(jié)論表明并非如此，認(rèn)為魚(yú)精蛋白的抑菌性與革蘭氏反應(yīng)沒(méi)有直 接關(guān)系。也有研宄表明鮭精蛋白對(duì)G+和G-均具有明顯抑制作用并且對(duì)霉菌和酵母抑制作 用更強(qiáng)。魚(yú)精蛋白對(duì)不同微生物的最低抑菌濃度因菌種的不同有較大差異，比如雖然魚(yú)精 蛋白具有較強(qiáng)的抗霉菌作用，但對(duì)Walemiasebi、Aspergillus等幾乎沒(méi)有作用。
[0007] 魚(yú)精蛋白能夠抑制微生物的生長(zhǎng)，這引起人們對(duì)其抑菌機(jī)理的探討。國(guó)內(nèi)外學(xué) 者針對(duì)于此做了大量研宄，目前存在的理論主要有：一是魚(yú)精蛋白作用于微生物的細(xì)胞壁 和質(zhì)膜系統(tǒng)；二是該蛋白作用于細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)或功能蛋白；三是魚(yú)精蛋白作用于遺傳物 質(zhì)。Antohi等通過(guò)研宄提出了魚(yú)精蛋白作用于微生物細(xì)胞壁而起抑菌作用這一假設(shè)性論 斷；Arden等認(rèn)為魚(yú)精蛋白通過(guò)影響細(xì)胞質(zhì)膜的功能而具有抑菌效果；Kashket和Berger 等人的研宄結(jié)果表明魚(yú)精蛋白通過(guò)影響微生物細(xì)胞質(zhì)膜而影響微生物對(duì)脯氨酸的吸收； Mishihara的研宄發(fā)現(xiàn)魚(yú)精蛋白可以抑制細(xì)菌細(xì)胞中葡萄糖和氧氣的消耗，認(rèn)為魚(yú)精蛋白 可能是吸附在微生物細(xì)胞的表面并破壞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜引起的；也有觀點(diǎn)認(rèn)為魚(yú)精蛋白抗菌 效果是通過(guò)對(duì)這2個(gè)部位（細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜）共同作用而產(chǎn)生的疊加效果；魚(yú)精蛋白還 可以使細(xì)胞喪失積累亮氨酸的能力，阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，直至破壞能量傳導(dǎo)和營(yíng)養(yǎng) 的攝取，還可降低ATP合成，損害細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子電動(dòng)勢(shì)的產(chǎn)生能力，從而抑制細(xì)胞的新陳代謝 能力；也有研宄表明在半致死濃度時(shí)魚(yú)精蛋白還可抑制基因轉(zhuǎn)錄。由此可見(jiàn)，對(duì)于魚(yú)精蛋白 的抑菌機(jī)理，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了大量深入的研宄，觀點(diǎn)不一，抑菌機(jī)理宄竟怎樣還有待于進(jìn) 一步探索和研宄。
[0008] 由于魚(yú)精蛋白在抑菌防腐方面以及安全性、穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)性等方面都具有眾多的 優(yōu)勢(shì)，魚(yú)精蛋白代替化學(xué)防腐劑使用在食品行列有著廣闊的前景。此外，魚(yú)精蛋白主要可用 于因注射肝素過(guò)量所引起的出血，且無(wú)其他藥品可替代，抑制腫瘤生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)肝功能， 促進(jìn)細(xì)胞繁殖發(fā)育。
[0009] 因?yàn)槔麧?rùn)低以及魚(yú)精蛋白本身的不可替代性，而且鑒于魚(yú)精蛋白的原料有季節(jié) 性，原料受自然制約性很強(qiáng)，導(dǎo)致出現(xiàn)供貨緊張的情況。自2011年開(kāi)始，南京、武漢、南通等 地魚(yú)精蛋白紛紛告急，很多心臟病手術(shù)被迫停止。由于魚(yú)精蛋白完全是天然成分，具有很高 的安全性，具有安全、無(wú)毒、無(wú)副作用的優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型防腐劑，在食品工業(yè)中具有廣闊 的應(yīng)用前景。我國(guó)魚(yú)資源豐富，充分開(kāi)發(fā)魚(yú)白資源，變廢為寶，有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 益，但是直接提取產(chǎn)量有限。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于提供一種魚(yú)精蛋白專用編碼基因。
[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于提供一種利用上述編碼基因制備魚(yú)精蛋白 的方法。
[0012] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之一的：一種魚(yú)精蛋白專用編碼基 因，該編碼基因的堿基序列如SEQIDNO: 1所示。
[0013] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之二的：一種利用上述編碼基因制 備魚(yú)精蛋白的方法，其包括如下具體操作：
[0014] (1)將權(quán)利要求1所述編碼基因與載體pET22b連接后轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)，獲得工 程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro;
[0015] (2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro單菌落并接種入含Ampl00yg/ml的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，之后按1:100的體積比轉(zhuǎn)入含AmplOOyg/ml的乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培 養(yǎng)20h，接著于4°C、6000rpm條件下離心20min，然后收集菌體，并置于-80°C下保存；
[0016] (3)將步驟（2)收集到的菌體經(jīng)-80°c和4°C反復(fù)凍融三次裂解菌體，加入破菌液， 且每1克菌體加入10毫升破菌液，并于4°C，10000rpm下離心20min，離心結(jié)束后分別收 集沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接著采用沉淀洗滌液洗滌沉淀兩 次，之后用沉淀溶解液溶解洗滌后的沉淀，得溶解液；將溶解液經(jīng)NiSepharose親和層析 進(jìn)行純化洗脫，所用洗脫液的組分為0.5MNaCl、20mMNaH2P04、500mMImidazole、8MUrea、 pH= 7. 4,最終洗脫液中的蛋白即為純化后的融合蛋白CYGB-Pro;
[0017] (4)將步驟（3)所得純化后的融合蛋白CYGB-Pro進(jìn)行CNBr裂解，具體地：將純化 后的融合蛋白CYGB-Pro,置于通風(fēng)櫥中，并于通風(fēng)櫥中加入濃度為0. 2M的濃鹽酸終、終濃 度為50mg/ml的CNBr，避光室溫裂解24h，之后加入等體積的ddH20滅活CNBr;然后采用流 速為3mL/min的G-25分子篩進(jìn)行脫鹽純化，即得所述魚(yú)精蛋白，且脫鹽純化采用的平衡液 和洗脫液均為去離子水。
[0018]進(jìn)一步地，所述破菌液的組分：0?5MNaCl，2