專利名稱：編碼重組人尿鈉素的基因及利用該基因生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種編碼重組人尿鈉素的基因，本發(fā)明還涉及利用該基因生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法。
背景技術：
尿鈉素(Urodilatin，UNP)是1988年德國學者Forssmann從人的尿液中純化獲得的一種多肽激素[1]。人的尿鈉素(hUNP)是由32個氨基酸組成的多肽，它的分子量為3507Da。尿鈉素具有降低平均動脈血壓、利尿以及促進尿鈉排泄的功能，能夠抑制血漿中血管緊張肽原酶的活性以及醛固酮和內皮素的分泌[2]，促進腎小球的濾過速率，松弛血管平滑肌，降低血管的系統(tǒng)阻抗。
尿鈉素和心鈉素(Atrial natriuretic peptide，ANP)是由126個氨基酸組成的心擴張激素原(Cardiodilatin prohormone)分別經(jīng)過不同的翻譯后加工而形成的激素[3]。尿鈉素主要在腎臟組織產(chǎn)生，由心擴張激素原的Thr95-Tyr126肽段組成，心鈉素主要在心房組織合成加工，由心擴張激素原的Ser99-Tyr126肽段組成。尿鈉素和心鈉素在體內可被磷酸化而導致生物活性的下降[4]。尿鈉素對中性內肽酶(neutral endopeptidase，E.C.3.4.24.11)有一定的耐受性，而心鈉素則易被中性內肽酶水解而導致生物活性的下降喪失[5]。實驗表明，在相同的使用劑量時，尿鈉素產(chǎn)生的促尿鈉排泄及利尿作用顯著強于心鈉素[6，7]。
臨床研究結果表明，rhUNP是治療充血型心衰竭的一種安全有效的藥物[8]。與目前用于治療心衰竭的多肽藥物ANP相比，rhUNP具有療效快，使用劑量低，副作用小等優(yōu)點。此外，rhUNP對支氣管孝喘以及急性腎衰也具有治療作用[9，10]。
用基因工程制備低分子量多肽，目前一般采用兩種方法一是通過融合蛋白表達，二是通過多肽基因串聯(lián)表達。兩種方法均能克服單獨表達低分子量多肽時出現(xiàn)的翻譯效率低、表達產(chǎn)物易受蛋白水解酶降解的缺陷[11]，并且均可以通過插入某些特定序列(如His-tag)從而簡化表達產(chǎn)物的純化方法。此外，某些載體蛋白具有提高目標多肽的可溶性，促進其折疊形成活性構象的功能。采用上述方法制備多肽，均必須通過酶學或化學裂解途徑以獲得目標多肽。由于化學裂解反應條件較難控制，往往存在化學修飾副反應，產(chǎn)物的均一性和活性較低。截至目前為止，我們尚未發(fā)現(xiàn)涉及與重組人尿鈉素的表達、純化與活性鑒定相關的文獻。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達的編碼重組人尿鈉素的基因。
本發(fā)明另一個目的是提供一種成本低、效果好的制備重組人尿鈉素(rhUNP)的方法。
本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的編碼重組人尿鈉素的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所述，該序列含有大腸桿菌偏愛密碼子，適合用大腸桿菌進行表達制備重組人尿鈉素。
利用SEQ ID NO.1生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，包括下列步驟a.在DNA水平，將含有SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.1的雙鏈DNA與含有硫氧還蛋白和組氨酸標簽編碼基因的表達載體連接，形成硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白表達載體，用該表達載體轉化大腸桿菌，經(jīng)誘導，該大腸桿菌表達產(chǎn)生硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白中的尿鈉素為重組人尿鈉素；b.用腸激酶裂解硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，裂解產(chǎn)物用Zn-Sepharose親和柱進行純化，裂解產(chǎn)物中的硫氧還蛋白以及少量未被酶解的硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose親和柱上，重組人尿鈉素留存于樣品穿過液中，收集，純化，鑒定即可。
Zn-Sepharose親和柱也可以用吸附了過渡金屬的Sepharose親和柱，如Ni-Sepharose親和柱、Co-Sepharose親和柱替代。
所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其中有硫氧還蛋白和組氨酸標簽編碼基因的表達載體是pET32a。
所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其中大腸桿菌是BL21；誘導劑是IPTG、色氨酸或阿拉伯糖。
所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其中在所述硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白表達載體中，編碼硫氧還蛋白、組氨酸標簽以及人尿鈉素的基因位于同一閱讀框架。
所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其中SEQ ID NO.6插入位置在SEQ ID NO.1上游。
SEQ ID NO.6經(jīng)表達后的氨基酸序列為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO.7)，該氨基酸序列作為腸激酶識別位點，通過腸激酶的裂解作用，使重組人尿鈉素從硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白中游離出來。
優(yōu)選的利用大腸桿菌表達制備重組人尿鈉素的方法是a.在DNA水平，將SEQ ID NO.3用限制性核酸內切酶KpnI和XhoI酶解，并與經(jīng)KpnI和XhoI酶切消化的表達質粒pET32a連接，用連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，該大腸桿菌表達產(chǎn)生硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白中的尿鈉素為重組人尿鈉素；b.用Zn-Sepharose親和柱純化大腸桿菌表達的硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶裂解處理后再次上樣至Zn-Sepharose親和柱，裂解產(chǎn)物中的硫氧還蛋白以及少量未被酶解的硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose親和柱上，從硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白中裂解產(chǎn)生的游離的重組人尿鈉素不能與Zn-Sepharose柱結合，因此留存于上樣穿過液中。
可以采用兔胸主動脈條的血管舒張效應測定上述重組人尿鈉素的生物活性。
由于在硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白表達質粒中，編碼硫氧還蛋白和組胺酸標簽以及人尿鈉素的基因位于同一閱讀框架，故表達的融合蛋白中含組胺酸標簽序列，故可方便地通過Zn-Sepharose親和層析柱來純化。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明解決了可供工業(yè)化生產(chǎn)rhUNP的工程菌的構建，建立了rhUNP的高效表達、純化及鑒定工藝，制備出了具有和人尿鈉素(hUNP)標準品相似比活性的rhUNP；同時，利用基因工程的方法制備hUNP比從組織中提取hUNP的生產(chǎn)成本更低，并可避免用化學方法合成hUNP造成的環(huán)境污染。
本發(fā)明還具有下列特點1、用融合蛋白表達的方式來制備rhUNP。
用基因工程制備低分子量多肽，一般采用兩種方法，一是通過融合蛋白表達，二是通過多肽基因串聯(lián)表達。兩種方法均能克服單獨表達低分子量多肽時出現(xiàn)的翻譯效率低、表達產(chǎn)物易受蛋白水解酶降解的缺陷[11]，并且均可以通過插入某些特定序列(如His-tag)從而簡化表達產(chǎn)物的純化方法。此外，某些載體蛋白具有增加目標多肽的溶解度，促進其折疊形成活性構象的功能。但采用上述方法制備多肽，都必須通過酶學或化學裂解途徑以獲得目標多肽。
通過基因串聯(lián)途徑表達制備的hUNP多聚體，在采用化學或酶學方法裂解時往往不能直接獲得具有野生型氨基酸序列的rhUNP單體，此外，化學裂解反應條件較難控制，存在化學修飾副反應，產(chǎn)物的均一性和活性較低。因此我們選擇用蛋白水解酶裂解融合蛋白的方式來制備rhUNP。
2、選用大腸桿菌表達系統(tǒng)來制備rhUNP。
由于hUNP只有32個氨基酸殘基，僅有1對二硫鍵，無糖基化位點，且去磷酸化的hUNP具有更高的生物活性，適合用原核細胞表達，并且大腸桿菌表達系統(tǒng)成本低，產(chǎn)量高，效果好，因此選用大腸桿菌表達系統(tǒng)來制備rhUNP。
3、選擇pET32a為融合蛋白表達載體。
最初曾使用大腸桿菌分泌型表達載體pET22b來制備thioredoxin-hUNP融合蛋白，但發(fā)現(xiàn)分泌至細菌周質腔的量不到總表達量的5％，且融合蛋白的純化回收得率較低。因此選擇pET32a為融合蛋白表達載體，該載體中有編碼大腸桿菌thioredoxin以及His-tag的基因序列。當hUNP基因通過KpnI/XhoI位點插入pET32a后，編碼thioredoxin、His-tag和hUNP的基因位于同一閱讀框架，表達的融合蛋白可以方便地通過Zn-Sepharose親和層析來純化。
4、通過腸激酶的酶解使rhUNP解離出來。
本發(fā)明在hUNP基因的上游插入了GAC GAC GAT GAC AAA序列，該序列編碼的氨基酸Asp-Asp-Asp-Asp-Lys為腸激酶的識別位點，可以通過腸激酶的酶解使rhUNP解離出來。
用腸激酶裂解thioredoxin-hUNP是因為腸激酶能夠在廣譜pH(4.5～9.5)和較寬溫度(4～45℃)范圍內特異性的水解底物[12]，且thioredoxin-hUNP融合蛋白經(jīng)腸激酶裂解獲得的rhUNP具有和野生型完全一致的氨基酸序列。迄今為止，尚未見用腸激酶來制備rhUNP的報道。
5、腸激酶裂解產(chǎn)物中的rhUNP純化。
經(jīng)腸激酶裂解處理后，裂解產(chǎn)物中的thioredoxin載體蛋白以及少量未被裂解的thioredoxin-hUNP融合蛋白仍含有His-tag序列，可以被吸附到Zn-Sepharose親和柱上，而rhUNP分子中已不含有His-tag，不能與Zn-Sepharose結合，因此留存于上樣穿過液中。
6、核苷酸序列為適合大腸桿菌表達的序列，含有大腸桿菌偏愛的密碼子。
7、本發(fā)明用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達制備硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白的過程中，采用硫氧還蛋白作為融合伴侶，使得1L硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白的工程菌可表達124mg左右的硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白。并且，所制備的重組人尿鈉素具有和人尿鈉素標準品相似的比活性。


圖1為hUNP PCR產(chǎn)物與重組質粒pET32a/hUNP酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜。
圖2為經(jīng)Zn-Sepharose親和層析純化的硫氧還蛋白-重組人尿鈉素融合蛋白SDS-PAGE電泳圖。
圖3為硫氧還蛋白-重組人尿鈉素融合蛋白的腸激酶裂解產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖譜。
圖4為制備型C4反相HPLC純化rhUNP色譜圖。
圖5用C18反相HPLC鑒定rhUNP的純度。
圖6為rhUNP質譜圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
本發(fā)明的材料1.菌株大腸桿菌DH5α和BL21購自Novagen公司。
2.質粒pET32a購自Novagen公司(產(chǎn)品代碼69015-3)。
3.酶腸激酶購自Novagen公司；T4 DNA連接酶和限制性內切酶購自TaKaRa公司(產(chǎn)品代碼D2011A)。
4.其它試劑UNP標準品購自American Peptides公司；質粒提取和DNA片段回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；Zn-Sepharose購自Pharmacia Biotech；半制備型C4反相HPLC色譜柱(300mm×30mm)為Waters公司產(chǎn)品；乙腈和三氟乙酸購自Fisher公司。
5.PCR模板和引物由Invitrogen公司合成。
引物的序列為上游5’-GTT GGT ACC GAC GAC GAT GAC AAA ACC GCT CCG CGT TCT C-3’(SEQ ID NO.4)下游5’-GGT GAG CTC TTA GTA ACG GAA GGA GTT ACA GCC CAG ACC AG-3’(SEQ ID NO.5)hUNP模板的序列為5’-GGT ACC GAC GAC GAT GAC AAA ACC GCT CCG CGTTCT CTG CGT CGC TCC AGC TGC TTC GGT GGC CGT ATG GAC CGT ATC GGT GCACAG TCT GGT CTG GGC TGT AAC TCC TTC CGT TAC TAA GAG CTC-3’(SEQ IDNO.3)hUNP模板的序列中含有編碼重組人hUNP的基因(SEQ ID NO.1)(即第22位～120位)和編碼腸激酶識別位點基因(第7～21位)，其余為酶切位點。
名詞術語的說明說明1大腸桿菌DH5α為常用的克隆菌，BL21為常用的表達菌。(詳見《生物化學與分子生物學實驗常用數(shù)據(jù)手冊》吳冠蕓等主編，科學出版社1998，p426)。
說明2雙鏈DNA(是由兩條核苷酸鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵作用而配對形成的雙螺旋結構。詳見《生物化學》第三版上冊王鏡巖朱圣庚徐長法主編，高等教育出版社2002，p486-487)。
說明3PCR擴增(PCR聚合酶鏈式反應。詳見《分子克隆實驗指南》第三版上冊J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學出版社2002，p611-612)。
說明4質粒(質粒是染色體外的DNA分子，其大小范圍在1Kb至200Kb以上不等。大多數(shù)來自細菌的質粒是雙鏈、共價閉合的環(huán)狀分子，以超螺旋形式存在。詳見《分子克隆實驗指南》第三版上冊J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學出版社2002，p2-3)。
說明5連接(連接是指在一定條件下，由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5‘端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵的過程。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p198)。
說明6轉化(轉化是指重組DNA分子導入受體細胞的過程。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p204-206)。
說明7感受態(tài)細胞(感受態(tài)細胞是指處于容易接受外源DNA狀態(tài)的細菌細胞。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p204)。
說明8質粒序列測定(質粒序列測定是指將基因和基因組轉化為具有明確結構的化學物質的過程。詳見《分子克隆實驗指南》第三版下冊J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學出版社2002，p981)。
說明9引物(引物是指與模板DNA待擴增區(qū)兩側的堿基相互補的短核苷酸鏈。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p238)。
說明10模板(模板是指PCR擴增時的DNA或RNA核苷酸鏈。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p240)。
說明11硫氧還蛋白(Thioredoxin)(硫氧還蛋白是作為基因融合表達系統(tǒng)中的伴侶蛋白，特別適用于在大腸桿菌胞質中表達高產(chǎn)量的可溶性融合蛋白。詳見《精編分子生物學實驗指南》奧斯伯等著，金冬雁校科學出版社1998，p652)。
說明12LB培養(yǎng)基(1升LB培養(yǎng)基其成分為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，詳見《分子克隆實驗指南》第二版金冬雁校p908)。
說明13IPTG(IPTG是異丙基硫代半乳糖苷。詳見《現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫(yī)出版社1998，p130)。
說明14SDS-PAGE(SDS-PAGE為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳?！毒幏肿由飳W實驗指南》奧斯伯等著，金冬雁?？茖W出版社1998，p336-337)。
說明1516％Tricine SDS-PAGE(是一種用于分離肽類物質的凝膠電泳，配方詳見《生物化學與分子生物學實驗常用數(shù)據(jù)手冊》吳冠蕓等主編，科學出版社1998，p192)。
說明16HPLC反相柱層析(HPLC包含一個其內充滿固定相的柱管，液相的流動相在高壓下，以泵輸入柱管，流動相經(jīng)柱管流出。在柱管的前方有個進樣器和泵，柱后有一個檢測器，其后再聯(lián)一個記錄儀。詳見《微生物藥品化學與分析》顧覺奮等主編，軍事醫(yī)學科學出版社1996，p214)。
說明17質譜分析(詳見下文“質譜聯(lián)用技術在生物大分子分析中的應用”龍耀庭，陸妙琴?；瘜W進展，1994，6(3)244-248)。
說明18EC50(EC50為半數(shù)效量。詳見下文“半數(shù)效量分析模型在小鼠血清溶血素測定中的應用”徐以平，張晶，李龍，石年。湖北職業(yè)技術學院學報，2003，6(3)74-77)。
實施例一、pET32a/hUNP表達質粒的構建pET32a/hUNP表達質粒的構建以化學合成的hUNP基因為模板，采用PCR擴增hUNP雙鏈DNA。PCR擴增條件為5.0fmol hUNP模板(SEQ ID NO.3)，50pmol的上游引物(SEQ ID NO.4)和下游引物(SEQ ID NO.5)，0.25U taq酶，94℃變性2min后進行以下26個循環(huán)94℃、30s；52℃、1min；72℃、40s，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收，用KpnI/XhoI雙酶切，回收大片段(約120bp)與經(jīng)過KpnI/XhoI消化的表達質粒pET32a用T4DNA連接酶連接形成pET32a/hUNP質粒，并轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，用KpnI/XhoI雙酶切鑒定陽性克隆，對pET32a/hUNP質粒進行序列測定。
二、Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表達及純化1.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表達用pET32a/hUNP質粒轉化E.coli BL21感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種至含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基，置37℃振搖過夜。過夜菌按2％(v/v)接種于新鮮LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50μg/mL)，37℃、200r/min振搖培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導3.5hr，離心(8000rpm，10min，4℃)并收集菌體。
2.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的純化按每克菌體加入7.5mL裂解緩沖液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.9)的比例，在4℃用超聲破菌，將裂解的菌液用20000r/min，4℃離心30min，收集上清。上清液上樣至預先用平衡緩沖液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑，pH7.9)平衡的Zn-Sepharose層析柱(2.5cm×5.0cm)，用洗滌緩沖液(25mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，40mmol/L咪唑，pH7.9)充分洗滌，再用洗脫緩沖液(25mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.9)洗脫。收集thioredoxin-hUNP融合蛋白，用SDS-PAGE檢測其純度。
三、Thioredoxin-hUNP融合蛋白的酶解及酶解產(chǎn)物的純化1.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的酶解將用Zn-Sepharose親和層析純化的thioredoxin-hUNP樣品在4℃對20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.4透析過夜，補加CaCl2至終濃度2.0mmol/L，酶與底物(thioredoxin-hUNP)按1∶75的重量比加入腸激酶，37℃酶解6h，用16％Tricine SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的酶切效果。
2.融合蛋白酶解產(chǎn)物的純化將thioredoxin-hUNP酶解產(chǎn)物上樣至預先用25mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L NaCl，pH7.9緩沖液平衡的Zn-Sepharose親和柱(2.5cm×5.0cm)，收集穿過峰，即得rhUNP粗品液，經(jīng)超濾濃縮至蛋白濃度為2mg/mL左右。濃縮液經(jīng)半制備型C4 HPLC反相柱(C4烷基鍵合硅膠柱，300×30mm)層析，用緩沖液A(0.1％三氟乙酸)和B(95％乙腈，0.1％三氟乙酸)進行梯度洗脫，梯度洗脫的條件為用16％的緩沖液B洗滌3分鐘，然后在40分鐘內緩沖液B的濃度由16％上升至45％(相同時間點的緩沖液A與B的濃度總和為100％)。收集rhUNP的紫外吸收峰(220nm)，柱溫25℃，流速10ml/min，得rhUNP純品液。用NaOH調節(jié)pH至5.0后，對5mmol/L的NH4HCO3溶液充分透析，冷凍干燥。用Tricine SDS-PAGE進行純度鑒定，并做質譜分析。
四、rhUNP的活性測定通過對兔胸主動脈條的血管舒張效應來測定rhUNP的生物活性，測定方法參照文獻[6，7]。取主動脈剪成3cm左右的動脈條，在37℃恒溫的麥氏浴槽內加入20mL臺氏溶液(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaH2PO40.065g、Glucose 1.0g、CaCl20.2g，定容(蒸餾水)至1000mL，調pH為7.4)，通空氣。對血管條加掛1.0g負荷，保持1h，每隔20min更換一次臺氏液，用記錄儀監(jiān)測血管條的張力變化。待基線穩(wěn)定后，加入腎上腺素，至終濃度為1.5×10-4mg/mL，此時血管條的張力顯著增加，當張力升至最高并穩(wěn)定10min后，記錄其血管張力變化。充分洗去麥氏浴槽中的腎上腺素，并重新加入20mL臺氏液，按累積濃度加樣法加入rhUNP樣品(設置5×10-7mg/mL、1.5×10-6mg/mL、3.0×10-6mg/mL、5×10-6mg/mL、1×10-5mg/mL、2×10-5mg/mL、3.5×10-5mg/mL、5.5×10-5mg/mL系列濃度)，記錄血管張力的變化。計算hUNP標準樣品和待測樣品的EC50，根據(jù)EC50值來比較標準品和待測品的生物活性。
實驗結果(一)pET32a/hUNP表達質粒的構建以化學合成的hUNP基因為模板，用PCR擴增hUNP模板(SEQ ID NO.3)雙鏈DNA(圖1中B列)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳純化后通過KpnI/XhoI酶切位點插入表達載體pET32a，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞。用KpnI/XhoI雙酶切鑒定、篩選陽性克隆(見圖1)，圖1中，A列為DNA分子量標志；B列為SEQ ID NO.3雙鏈DNA，C列為pET32a/hUNP雙酶切消化產(chǎn)物。并對陽性克隆的pET32a/hUNP質粒進行全序列分析，結果表明序列完全正確(包含SEQ ID NO.3)。
(二)Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表達與純化用經(jīng)測序鑒定正確的pET32a/hUNP表達質粒轉化E.coli BL21，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50μg/mL)，經(jīng)IPTG誘導后，thioredoxin-hUNP的表達量占菌體總蛋白的27％(干重)，每升細菌培養(yǎng)液(即步驟二.1中IPTG誘導后離心前的含細菌菌體的培養(yǎng)液，下同)可得thioredoxin-hUNP融合蛋白124mg。Thioredoxin-hUNP融合蛋白經(jīng)純化后經(jīng)凝膠電泳掃描儀測定純度可達80％(見圖2)。圖2中，A列為蛋白分子量標準；B列為Thioredoxin-hUNP純化產(chǎn)物。
(三)融合蛋白的裂解及rhUNP的純化當腸激酶和thioredoxin-hUNP按1∶75的比例混合，置于37℃反應6h后，超過86％的融合蛋白被酶解，解離出thioredoxin(MW15000Da)和rhUNP(MW 3500Da)(圖3)。圖3中，A列為蛋白分子量標準；B列為對照(不加腸激酶裂解時)；C列為thioredoxin-hUNP腸激酶裂解產(chǎn)物(標*為rhUNP)。
裂解產(chǎn)物經(jīng)Zn-Sepharose親和柱層析，rhUNP存在于穿過液中，不被Zn-Sepharose柱吸附。將rhUNP穿過液超濾濃縮后進一步用半制備型C4反相HPLC柱純化，rhUNP樣品被洗脫(見圖4，標*為rhUNP)，收集rhUNP，用C18反相HPLC檢測rhUNP樣品的純度達95％以上(見圖5，A為樣品HPLC圖譜，B為標準品HPLC圖譜)。質譜測定rhUNP樣品的分子量為3507Da(見圖6，標*為rhUNP)，與hUNP的理論分子量相吻合。從每升細菌培養(yǎng)液可得rhUNP純品4.8mg。獲得的rhUNP經(jīng)測序為SEQ ID NO.2。該氨基酸序列與野生型hUNP氨基酸序列一致。
(四)hUNP的活性測定活性測定結果表明，本發(fā)明制備的rhUNP和hUNP標準品均對兔胸主動脈條具有強烈的血管舒張效應，二者的EC50分別為(1.72±0.42)×10-6mg/mL及(1.64+0.48)×10-6mg/mL，說明二者的比活性幾乎相等。
參考文獻[1]Schulz-Knappe P，F(xiàn)orssmann K，Herbs F，et al.Isolation and structure analysis of‘urodilatin’，a new peptide of the cardiodilatin-ANP-family，extracted from human urine.KlinWochenschr，1988；66752-759. Carstens J，Jensen KT，Pedersen EB.Effect of Urodilationon renal hemodynamics，tubular function and vasoactive hormones.Clin Sci 1997；92397-407. Vesely DL.Natriuretic peptides and acute renal failure.American Journal ofPhysiology，2003；285167-177. Dorner T，Gagelmann M，F(xiàn)eller S，Herbst F，F(xiàn)orssmann W.Phosphorylation anddephosphorylation of the natriuretic peptide urodilation(CDD-/ANP-95-126)and the effecton biological activity.Biochemical and Biophysical Research Communications，1989；163830-835. Gagelmann M，Hock D，F(xiàn)orssmann W，Urodilation(CDD-/ANP-95-126)is notbiologically inactivated by a peptidase from dog kidney cortex membranes in contrast to atrialnatriuretic peptide/cardiodilatin(CDD-/ANP-99-126).FEBS Letter，1988；233249-254. Hildebrandt DA，Mizelle HL，Brands MW，Hall JE，Comparison of renal action ofurodilatin and atrial natriuretic peptide.American Journal of Physiology，1992；262R395-399. Forssmann W，Meyer M，F(xiàn)orssmann K，The renal urodilation systemclinicalimplications.Cardiovascular Research，2001；51450-462. Elsner D，Muders F，Muntze A，Efficacy of prolonged infusion of Urodilatin(ANP-99-126)in patients with congestive heart failure.Am.Heart J.1995；129765-773. Fluge T，orssmann W，Kunkel G，et al.，Bronchodilation using combinedurodilatin-albuterol administration in asthmaA randomized，double-blind，placebo-controlledtrial，.Eur.J.Med.Res.1999；4411-415. Meyer M.Wiebe K，F(xiàn)orssmann W，et al.，Urodilatin as a new drug for the therapy ofacute renal failure following cardiac surgery.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.1997；24374-376. Gottesman S.Genetics of proteolysis in Escherichia coli.Annual Review Genetics.1989；23163～98. Collins-Racie LA，McColgan JM，Grant KL，et al.Production of recombinantbovine enterokinase catalytic subnit in Escherichia coil using the novel secretory fusionpartner DsbA.Biotechnology，1995；13982 987.
序列表<110>劉建寧<120>編碼重組人尿鈉素的基因及利用該基因生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法<160>7<210>1<211>99<212>DNA<213>artificial<220>
<223>重組人尿鈉素肽編碼基因<400>
accgctccgc gttctctgcg tcgctccagc tgcttcggtg gccgtatgga ccgtatcggt 60gcacagtctg gtctgggctg taactccttc cgttactaa99<210>2<211>32<212>PRT<213>artificial<220>
<223>重組人尿鈉素肽的氨基酸序列<400>
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg1 5 10 15Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe20 25 30Arg Tyr32<210>3<211>126<212>DNA<213>artificial<220>
<223>人工合成的hUNP模板序列<400>
ggtaccgacg acgatgacaa aaccgctccg cgttctctgc gtcgctccag ctgcttcggt 60ggccgtatgg accgtatcgg tgcacagtct ggtctgggct gtaactcctt ccgttactaa 120gagctc126<210>4
<211>40<212>DNA<213>artificial<220>
<223>上游引物<400>
gttggtaccg acgacgatga caaaaccgct ccgcgttctc40<210>5<211>41<212>DNA<213>artificial<220>
<223>下游引物<400>
ggtgagctct tagtaacgga aggagttaca gcccagacca g 41<210>6<211>15<212>DNA<213>編碼腸激酶識別位點的核苷酸序列<400>
gacgacgatg acaaa 15<210>7<211>5<212>PRT<213>腸激酶識別位點的氨基酸序列<400>
Asp Asp Asp Asp Lys1 權利要求
1.編碼重組人尿鈉素的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所述。
2.利用權利要求1所述核苷酸序列生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其特征在于包括下列步驟a.在DNA水平，將含有SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.1的雙鏈DNA與含有硫氧還蛋白和組氨酸標簽編碼基因的表達載體連接，形成硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白表達載體，用該表達載體轉化大腸桿菌，經(jīng)誘導，該大腸桿菌表達產(chǎn)生硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白中的尿鈉素為重組人尿鈉素；b.用腸激酶裂解硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白，裂解產(chǎn)物用Zn-Sepharose親和柱進行純化，裂解產(chǎn)物中的硫氧還蛋白以及少量未被酶解的硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose親和柱上，重組人尿鈉素留存于樣品穿過液中，收集，純化，鑒定即可。
3.根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其特征是含有硫氧還蛋白和組氨酸標簽編碼基因的表達載體是pET32a。
4.根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其特征是大腸桿菌是BL21。
5.根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其特征是誘導劑是IPTG、色氨酸或阿拉伯糖。
6.根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法，其特征是在所述硫氧還蛋白-尿鈉素融合蛋白表達載體中，編碼硫氧還蛋白、組氨酸標簽以及人尿鈉素的基因位于同一閱讀框架。
7.根據(jù)權利要求2所述的生產(chǎn)重組人尿鈉素的備方法，其特征是SEQ ID NO.6插入位置在SEQ ID NO.1上游。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼重組人尿鈉素的基因及利用該基因生產(chǎn)重組人尿鈉素的方法。該基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1所述。該方法將含有SEQ ID No.6和SEQ IDNo.1的雙鏈DNA與含有硫氧還蛋白和組氨酸標簽編碼基因的表達載體連接，形成硫氧還蛋白－尿鈉素融合蛋白表達載體，用該表達載體轉化大腸桿菌，誘導表達產(chǎn)生硫氧還蛋白－尿鈉素融合蛋白，用腸激酶裂解硫氧還蛋白－尿鈉素融合蛋白，裂解產(chǎn)物用Zn－Sepharose親和柱進行純化，重組人尿鈉素留存于樣品穿過液中，收集，純化，鑒定即可。該序列可在大腸桿菌系統(tǒng)高效表達，該方法成本低、效果好，適合產(chǎn)業(yè)化應用。
文檔編號C07K14/435GK1869227SQ200610040790
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權日2006年6月1日
發(fā)明者孫自勇, 劉建寧 申請人:劉建寧