專利名稱：一種基于氧化還原酶的還原型輔酶q10的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含羥基或氧-金屬基的化合物，尤其是涉及一種使用氧化還原酶生產(chǎn)高 純度(〉98.5%)穩(wěn)定性好的還原型輔酶Q10的方法。
背景技術(shù)：
1957年，美國(guó)威斯康辛大學(xué)的格林博士領(lǐng)導(dǎo)下的一個(gè)研究小組首先從牛心臟中分離了一 種黃色物質(zhì)。接著，卡爾4i克斯博士以幾微克樣品測(cè)定了它的結(jié)構(gòu)，它就是以后幾十年里被 廣大科學(xué)工作者深入研究和廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品及化妝品行業(yè)，成為給人類健康帶 來巨大好處的天然物質(zhì)即輔酶QIO (氧化型)。
輔酶Q10的發(fā)現(xiàn)被稱為營(yíng)養(yǎng)研究方面的里程碑。米切爾博士因發(fā)現(xiàn)了輔酶Q10在能量產(chǎn) 品過程中的作用，獲得了 1987年的諾貝爾獎(jiǎng)，而?？怂挂惨?yàn)樗芯枯o酶Q10在醫(yī)藥方面 的應(yīng)用而獲美國(guó)醫(yī)藥成就的最高獎(jiǎng)。
自發(fā)現(xiàn)輔酶Q10以來，世界各國(guó)的學(xué)者進(jìn)行了廣泛深入的生理化研究，闡明了輔酶QIO 在能量代謝中的途徑和作用，證實(shí)具有以下方面的功效
輔酶Q10是人體呼吸過程電子傳遞和ATP產(chǎn)生的基本物質(zhì)，它在人體內(nèi)的含量直接決定 著人體細(xì)胞的能量水平。輔酶Q10通過自身氧化還原結(jié)構(gòu)的變化阻止生物體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì) 的過氧化，清除自由基；輔酶Q10通過刺激人體代謝而具有減肥作用；輔酶Q10在治療心血 疾病特別是充血性心力衰竭方面有突出的療效；輔酶Q10在治療病毒性肝炎、艾滋病、腫瘤 有一定的輔助治療效果；Q10可以有效預(yù)防心力衰竭、心率失常、.中風(fēng)、高心壓、動(dòng)脈硬化、 肌肉萎縮、牙齦萎縮等疾??；Q10也是優(yōu)良的化妝品添加劑，具有強(qiáng)大的清除自由基的能力， 在皮膚的抗衰老、抗炎癥、防皺、美白等方面顯示了良好的應(yīng)用性能。
目前輔酶Q10可以通過化學(xué)合成、發(fā)酵等方面得到，生產(chǎn)技術(shù)是成熟的。
還原型輔酶Q10是近幾年提出的輔酶Q10的還原態(tài)，與輔酶Q10比較具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 還原型輔酶Q10可以增加細(xì)胞能量，因?yàn)檠趸驮诩?xì)胞中要還原成還原型才可以起 抗氧化作用；
2、 還原型輔酶Q10在人體中吸收率要高于氧化型的輔酶Q10;
3、 氧化型輔酶Q10和還原型輔酶Q10的抗氧化作用機(jī)理不同，氧化型輔酶Q10是在細(xì)胞內(nèi)起作用，而還原型輔酶Q10是在人體血液中直接具有抗氧化作用；
4、 還原型輔酶Q10在做藥品時(shí)，可以制備更多的新劑型，例如可以制備針劑，直接進(jìn) 行靜脈滴注；
5、 氧化型輔酶Q10是黃色，而還原型輔酶Q10是白色，更容易生產(chǎn)各種形式的化妝品;
6、 與輔酶Q10比較，還原型輔酶Q10有更高的在人身體中的生物利用率，該化合物以 用作優(yōu)良食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、保健用食品、營(yíng)養(yǎng)劑、飲料、化妝品、動(dòng)物藥物、治療藥物 等應(yīng)用領(lǐng)域。
正因?yàn)檫€原型輔酶Q10有許多優(yōu)點(diǎn)，所以世界范圍內(nèi)的科學(xué)家都在高度關(guān)注和研究還原 型輔酶Q10的生產(chǎn)和應(yīng)用開發(fā)。目前已公開發(fā)表的還原型輔酶Q10的專利有 中國(guó)專利CN1551864A(W02003/006412)還原型輔酶Q10的制備方法； 中國(guó)專利CN1551863A(WO2003/006410)制備還原型輔酶Q10油性產(chǎn)物的方法； 中國(guó)專利CN1861556A生產(chǎn)具有優(yōu)異處理性質(zhì)的還原型輔酶Q10晶體的方法； 中國(guó)專利CN1527807A(WO2003/006408)利用防氧化效果高的溶劑生產(chǎn)還原型輔酶Q10 的方法；
中國(guó)專利CN1723181A(WO2004/063131)純化還原型輔酶Q10的方法； 中國(guó)專利CN1599603A(WO2003/032967)還原型輔酶QIO的穩(wěn)定方法； 中國(guó)專利CN1620413A(WO2003/062182)還原型輔酶Q10的穩(wěn)定方法和組合物； 中國(guó)專利CN1525951A(W02003/008363)還原型輔酶Q10D的穩(wěn)定方法及酸性結(jié)晶方法； 中國(guó)專利CN101087598A(WO2006/075502)含有還原型輔酶Q10的固體制劑及其制造方
法；
中國(guó)專利CN1849287A(WO2005/033054)穩(wěn)定性優(yōu)異的還原型輔酶Q10結(jié)晶及含有還原 型輔酶Q10結(jié)晶的組合物。
以上公開的專利申請(qǐng)采用的共同技術(shù)路線是以高純度輔酶Q10為原料，用不同的類型的 溶劑溶解，采用化學(xué)法把輔酶Q10還原成還原型輔酶Q10，再采用不同的技術(shù)進(jìn)行純化、結(jié) 晶生產(chǎn)性能穩(wěn)定的還原型輔酶QIO。這些專利的生產(chǎn)方法存在的共同缺點(diǎn)是在還原時(shí)要加 入化學(xué)化合物，而這些化合物對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響，需要通過復(fù)雜的方法把這些化合物去 掉，并進(jìn)行不斷的純化，因而造成生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的在制備還原型輔酶Q10的方法中所存在的需要在還原時(shí)加入 化學(xué)化合物，而這些化合物對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響，需要通過復(fù)雜的方法把這些化合物去掉，并進(jìn)行不斷的純化，因而造成生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品穩(wěn)定性差等問題，提供一種
改進(jìn)的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是使用氧化還原酶的生物技術(shù)。氧化還原酶(oxidordeuctase)是能催 化兩分子間發(fā)生氧化還原作用的酶的總稱。其中氧化酶(oxidase; oxydase)能催化物質(zhì)被氧 氣所氧化的作用，脫氫酶(dehydrogenase)能催化從物質(zhì)分子脫去氫的作用，主要是存在與 細(xì)胞中。氧化還原酶催化底物的氧化或還原，反應(yīng)時(shí)需要電子供體或受體，因此在反應(yīng)時(shí)添 加必要的催化劑。
本發(fā)明包括以下步驟
1) 將純度大于99。/。的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶QIO- (4 30) :1;
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.1 0.5個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在40 5(TC，在柱型反應(yīng)器內(nèi)輔酶Q10被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶Q10，把從柱底流出的含有還原型輔 酶Q10的溶液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔 酶Q10產(chǎn)品。
在步驟1)中，溶劑最好選自乙醇、丙酮、乙酸乙酯、已垸、環(huán)已烷、石油醚等中的至 少一種，優(yōu)選丙酮、乙醇中的至少一種；按體積比混合溶劑中水的含量最好為0% 2%，優(yōu) 選0.15% 1%;溶解的溫度可為40 100"C，優(yōu)選40 6(TC;所述溶解最好在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn) 行。
在步驟2)中，所述載體最好選自活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高嶺石、氧化鋁、硅 膠、大孔樹脂、多糖離子交換樹脂、高分子離子交換樹脂、DEAE-纖維素、CM纖維素等中 的一種，優(yōu)選高分子離子交換樹脂和大孔樹脂，例如型號(hào)為L(zhǎng)S 958的丙烯酸系陰離子交換 樹脂和型號(hào)為XDA 8的大孔吸附樹脂；所述超濾可分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔 徑為l 5pm;第二級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為0.001 0.02pm，通過二級(jí)超濾可以將含有還 原型輔酶Q10的溶液中殘留的酶及微小的不溶雜質(zhì)全部排除；所述濃縮是將含有還原型輔酶 Q10的溶液濃縮到溶液中還原型輔酶Q10的濃度為質(zhì)量百分比5% 10%;所述結(jié)晶是將濃縮 后的溶液在5 26'C的條件下，結(jié)晶6 24h，晶體在40 45'C下真空干燥4 10h，即得高純 性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;所述反應(yīng)器最好充入99.9%氮?dú)?，盡可能減少與空氣的接觸。 氧化還原酶可選自EC1. 1. 1氧化還原酶(氫或電子受體為醇、NAD或NADP的氧化還原酶)、 EC1. 2. 1氧化還原酶(氫或電子受體為醛或酮基、NAD或NADP的氧化還原酶)等中的一種，優(yōu)選EC1. 2. 1氧化還原酶，定義為輔酶Q10氧化還原酶。
在傳統(tǒng)的概念中酶是催化水溶性底物的反應(yīng)，在有機(jī)溶劑中不僅不能反應(yīng)，還會(huì)引起酶
蛋白的變化，但實(shí)驗(yàn)證明，這種概念是片面的，許多酶在無(wú)水或含微水(<2%)的有機(jī)溶劑 中，酶不僅能催化特殊反應(yīng)，而且穩(wěn)定性會(huì)顯著提高，由于介質(zhì)的改變，使酶具備了不少水 相中所不具備的特點(diǎn)，如有利于疏水底物的反應(yīng)，能明顯提高酶的熱穩(wěn)定性，能催化在水中 不能進(jìn)行的反應(yīng)，能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，提高酶的專一性，易于實(shí)現(xiàn)固定化，產(chǎn)品容易回收 等優(yōu)點(diǎn)。
與輔酶Q10比較，還原型輔酶Q10有更高的在人身體中的生物利用率，該化合物可以用 作優(yōu)良食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、保健用食品、營(yíng)養(yǎng)劑、飲料、化妝品、動(dòng)物藥物、治療藥物等 應(yīng)用領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例絕不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
輔酶Q10/還原型輔酶Q10的HPLC分析方法
柱SYMMETRY Cl8 (250x4.6mm);
流動(dòng)相C2H5OH : CH3OH=4 :3 (v/v);
檢測(cè)波長(zhǎng)210nm;
流速lml/min;
柱溫30°C。
實(shí)施例1
取300g (含水量50%左右)的XDA 8吸附樹脂，裝入直徑40mm,長(zhǎng)600mm的帶加 套的玻璃柱中，用3個(gè)柱體積的無(wú)水乙醇洗樹脂，再用去離子水洗去柱內(nèi)樹脂吸附的乙醇。 取30g輔酶Q10氧化還原酶，用1000ml的去離子水在4(TC的溫度下溶解，并向溶液中加入 5g抗壞血酸。在保持柱內(nèi)溫度40 45'C的條件下，把酶溶液緩慢從柱頂加入柱內(nèi)，流速控制 在0.5個(gè)柱體積/h。加完酶的溶液后，再用含去離子水1。/。的丙酮溶液2000ml，從柱頂緩慢加 入柱內(nèi)，流速控制在1個(gè)柱體積/h。
取30g99.3。/。的輔酶QIO，在50'C的溫度下溶于900ml丙酮中，在溶液中加入10ml含有 lg抗壞血酸的去離子。把溶液從柱頂緩慢加入柱內(nèi)，流速控制在30ml/h，從柱底流出的溶液 直接進(jìn)入2000ml三角瓶中，并充氮?dú)獗Ｗo(hù)。收集從柱底流出的所有還原型Q10的溶液，在 溫度40。C的條件下，用孔徑0.02pm的聚丙烯腈膜進(jìn)行過濾，濾液自然降溫至室溫，并在l(TC 的溫度下結(jié)晶24h，過濾晶體，晶體在40 45'C的溫度下真空干燥8h，即得28.1g還原型輔酶QIO， HPLC檢測(cè)純度為99.3%。 實(shí)施例2
取300g (含水量50%左右)的LS 958丙烯酸系的陰離子交換樹脂，裝入直徑40mm， 長(zhǎng)600mm帶加套的玻璃柱中,用3個(gè)柱體積的去離子水洗柱。再用4%的NaOH水溶液洗柱內(nèi) 樹脂，流速為l個(gè)柱體積/h，再用去離子水洗至柱底流出液pH8 9，再用4。/。的HCl水溶液 洗樹脂，流速控制在1個(gè)柱體積/h，再用去離子水洗至柱底流出液pH5 6。
取30g輔酶Q10氧化還原酶，用1000ml的去離子水在4(TC溫度下溶解，并向溶液中加 入5g抗壞血酸。在保持柱內(nèi)溫度40 45X:的條件下，把酶溶液緩慢從柱頂加入柱內(nèi)，流速 控制在0.5個(gè)柱體積/h，再用含去離子水P/。的丙酮溶液2000ml，從柱頂緩慢加入柱內(nèi)，流速 控制在1個(gè)柱體積/h。
取30g99.3。/。的輔酶QIO，在4(TC的溫度下溶于400ml己垸溶液中，在溶液中加入10ml 含有l(wèi)g抗壞血酸的去離子水。把溶液緩慢從柱頂加入柱內(nèi)，流速控制在15ml/h，柱內(nèi)反應(yīng)溫 度控制在40 45'C。從柱底流出的溶液直接進(jìn)入2000ml的三角瓶中，并充氮?dú)獗Ｗo(hù)。收集 從柱底流出的所有含還原型輔酶Q10的溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在溫度4(TC的條件下，真空蒸餾 去掉已烷，再向濃縮物中加入600ml，無(wú)水乙醇，在溫度40 5(TC的條件下，用孔徑0.02pm 的聚丙烯腈膜進(jìn)行過濾，濾液自然降至室溫，在20'C的溫度下，結(jié)晶10h，過濾晶體，晶體 在40 45"C的溫度下，真空干燥8h，即得28.3g還原型輔酶Q10， HPLC檢測(cè)純度為99.3%。
實(shí)施例3
1) 將純度大于99M的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶QI(NIO : 1;溶劑為乙 醇，按體積比混合溶劑中水的含量為0.15%，溶解的溫度為6(TC，所述溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn) 行。
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.1個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在45'C，在柱 型反應(yīng)器內(nèi)輔酶Q10被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶QIO，把從柱底流出的含有還原型輔酶Q10的溶 液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。 所述載體為活性炭或氧化鋁，超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為3pm;第=級(jí) 采用聚丙烯腈膜，孔徑為0.01pm，通過二級(jí)超濾可以將含有還原型輔酶Q10的溶液中殘留的 酶及微小的不溶雜質(zhì)全部排除；濃縮是將含有還原型輔酶Q10的溶液濃縮到溶液中還原型輔 酶Q10的濃度為質(zhì)量百分比7%，結(jié)晶是將濃縮后的溶液在20'C的條件下，結(jié)晶10h，晶體在4(TC下真空干燥8h，即得高純性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;所述反應(yīng)器充入99.9%氮?dú)猓?盡可能減少與空氣的接觸。氧化還原酶為氫或電子受體為醇、NAD或NADP的氧化還原酶。 實(shí)施例4
1) 將純度大于99n/。的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶Q10-20 : 1;溶劑為丙 酮，按體積比混合溶劑中水的含量為2%，溶解的溫度為4(TC，溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.4個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在43'C，在柱 型反應(yīng)器內(nèi)輔酶Q10被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶QIO，把從柱底流出的含有還原型輔酶Q10的溶 液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。 載體為多孔玻璃或硅膠，超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為4Hm;第二級(jí)采用 聚丙烯腈膜，孔徑為0.005pm，通過二級(jí)超濾將含有還原型輔酶Q10的溶液中殘留的酶及微 小的不溶雜質(zhì)全部排除；所述濃縮是將含有還原型輔酶QIO的溶液濃縮到溶液中還原型輔酶 Q10的濃度為質(zhì)量百分比5%，結(jié)晶是將濃縮后的溶液在15"C的條件下，結(jié)晶6h，晶體在42°C 下真空干燥7h，即得高純性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;反應(yīng)器充入99.9%氮?dú)?，盡可能減少 與空氣的接觸。氧化還原酶為NADP的氧化還原酶。
實(shí)施例5
1) 將純度大于99。/。的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶(^10=4 : 1;溶劑為乙 酸乙酯或已垸，按體積比混合溶劑中水的含量為1%;溶解的溫度為80°C，溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù) 下進(jìn)行。
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物八用蠕動(dòng)泵以0.2個(gè)柱體積/11的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在40'C，在柱 型反應(yīng)器內(nèi)輔酶Q10被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶QIO，把從柱底流出的含有還原型輔酶Q10的溶 液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。 載體為酸性白土或高嶺石；超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為1^im;第二級(jí)采 用聚丙烯腈膜，孔徑為0.001jim，通過二級(jí)超濾將含有還原型輔酶Q10的溶液中殘留的酶及 微小的不溶雜質(zhì)全部排除；濃縮是將含有還原型輔酶Q10的溶液濃縮到溶液中還原型輔酶 Q10的濃度為質(zhì)量百分比6%;結(jié)晶是將濃縮后的溶液在5'C的條件下，結(jié)晶15h，晶體在45°C 下真空干燥4h，即得高純性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;反應(yīng)器充入99.9%氮?dú)?，盡可能減少與空氣的接觸。氧化還原酶為EC1.2.1氧化還原酶(定義為輔酶Q10氧化還原酶)。 實(shí)施例6
1) 將純度大于99。/。的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶(510=30 : 1;溶劑為環(huán) 已烷，按體積比混合溶劑中水的含量為0.5%;溶解的溫度為45'C，溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.5個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在46"C，在柱 型反應(yīng)器內(nèi)輔酶QIO被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶QIO，把從柱底流出的含有還原型輔酶QIO的溶 液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。 載體為大孔樹脂或DEAE-纖維素；超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為2tim;第 二級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為0.015pm，通過二級(jí)超濾將含有還原型輔酶Q10的溶液中殘留 的酶及微小的不溶雜質(zhì)全部排除；濃縮是將含有還原型輔酶Q10的溶液濃縮到溶液中還原型 輔酶Q10的濃度為質(zhì)量百分比8%;結(jié)晶是將濃縮后的溶液在l(TC的條件下，結(jié)晶20h，晶 體在43。C下真空干燥5h，即得高純性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;反應(yīng)器充入99.9%氮?dú)?，盡 可能減少與空氣的接觸。氧化還原酶為￡<:1.2.1氧化還原酶(氫或電子受體為醒或酮基)。
實(shí)施例7
1) 將純度大于99。/。的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制， 溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑輔酶Q10-15 : 1;溶劑為石 油醚，按體積比混合溶劑中水的含量為0.8%;溶解的溫度為IOO'C，溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
2) 將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟l)所得的 產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.3個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在5(TC，在柱 型反應(yīng)器內(nèi)輔酶QIO被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶QIO，把從柱底流出的含有還原型輔酶QIO的溶 液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。 載體為多糖離子交換樹脂或高分子離子交換樹脂；超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜， 孔徑為5pm;第二級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為0.02jim，通過二級(jí)超濾將含有還原型輔酶Q10 的溶液中殘留的酶及微小的不溶雜質(zhì)全部排除；濃縮是將含有還原型輔酶QIO的溶液濃縮到 溶液中還原型輔酶Q10的濃度為質(zhì)量百分比10%;結(jié)晶是將濃縮后的溶液在26C的條件下， 結(jié)晶24h，晶體在45X:下真空干燥10h，即得高純性能優(yōu)良的還原型輔酶Q10;反應(yīng)器充入 99.9%氮?dú)?，盡可能減少與空氣的接觸。氧化還原酶為EC1丄1氧化還原酶(NADP的氧化還 原酶)。
權(quán)利要求
1. 一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將純度大于99％的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制，溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑∶輔酶Q10＝4～30∶1；2)將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將步驟1)所得的產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.1～0.5個(gè)柱體積/h的流速連續(xù)進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持在40～50℃，在柱型反應(yīng)器內(nèi)輔酶Q10被酶轉(zhuǎn)化成還原型輔酶Q10，把從柱底流出的含有還原型輔酶Q10的溶液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即得還基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟l)中，溶劑選自乙醇、丙酮、乙酸乙酯、已垸、環(huán)已垸、石油醚中的至少一種。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟l)中，按體積比混合溶劑中水的含量為0% 2%。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟l)中，溶解的溫度為40 100'C。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟l)中，所述溶解在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟2)中，所述載體選自活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高嶺石、氧化鋁、硅膠、大 孔樹脂、多糖離子交換樹脂、高分子離子交換樹脂、DEAE-纖維素、CM纖維素中的一種。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟2)中，所述超濾分為二級(jí)，第一級(jí)采用聚丙烯腈膜，孔徑為l 5pm;第二級(jí)采用 聚丙烯腈膜，孔徑為0.001 0.02pm。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟2)中，所述濃縮是將含有還原型輔酶Q10的溶液濃縮到溶液中還原型輔酶Q10的 濃度為質(zhì)量百,分比5% 10%;所述結(jié)晶是將濃縮后的溶液在5 26。C的條件下，結(jié)晶6 24h， 晶體在40 45'C下真空干燥4 10h。
9. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟2)中，所述反應(yīng)器充入99.9%氮?dú)狻?br> 10. 如權(quán)利要求1所述的一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，其特征在 于在步驟2)中，氧化還原酶選自EC1. 1. 1氧化還原酶、EC1. 2. 1氧化還原酶中的一種。
全文摘要
一種基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法，涉及一種含羥基或氧-金屬基的化合物。提供一種改進(jìn)的基于氧化還原酶的還原型輔酶Q10的制備方法。將純度大于99％的輔酶Q10用混合溶劑溶解，得產(chǎn)物A，混合溶劑用溶劑和水配制，溶解輔酶Q10時(shí)，按體積/質(zhì)量比，混合溶劑的用量為混合溶劑∶輔酶Q10＝4～30∶1；將氧化還原酶固定在載體上，把含有酶的載體裝入柱型反應(yīng)器中，將產(chǎn)物A用蠕動(dòng)泵以0.1～0.5個(gè)柱體積/h的流速進(jìn)入柱形反應(yīng)器，柱內(nèi)溫度保持40～50℃，把從柱底流出的含有還原型輔酶Q10的溶液進(jìn)行超濾濃縮結(jié)晶，即可得到高純度、性能穩(wěn)定的還原型輔酶Q10產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12P7/66GK101429530SQ200810072370
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者周贊興, 張水陸, 朱法科, 林木榮 申請(qǐng)人:廈門金達(dá)威維生素股份有限公司