專利名稱：一種左旋肉堿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種左旋肉堿的制備方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自本世紀初，科學家從動物肉類中攝取出左旋肉堿(L-carnitine)以來，它的營養(yǎng)保健作用一直受到人們的關(guān)注。L-肉堿是二位學者Gulewjisch和Krimberg于1905年在肉類濃縮液中發(fā)現(xiàn)的，1927年L-肉堿的化學結(jié)構(gòu)被證實。1952年Fracuke在肝的濃縮液中分離出L-肉堿并命名為維生素_B。 1958年Frize找出L_肉堿有脂肪氧化作用，肉堿能剌激脂肪氧化的速度。1986年"芝國營養(yǎng)學院雜志"報導"必需營養(yǎng)的專題討論會"中認為L-肉堿是L體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。 左旋肉堿(L-carnitine)是一種類維生素的功能因子，化學名為L-3-羥基-4-三甲銨丁酸，分子式C7H15N03，穩(wěn)定性好，能耐200°C以上的高溫，在PH3-6的溶液中可放置1年。它是動物體內(nèi)與能量代謝有關(guān)的化合物，生化作用有①促進脂肪酸P-氧化；②調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)?；嚷剩虎劬W(wǎng)羅過量的或非理性的?；鶊F；④影響氨基酸的代謝；⑤與尿素結(jié)合促進體內(nèi)氨的排出，防止過量氨產(chǎn)生的毒性。另外，左旋肉堿對脂溶性維生素及Ca、 P的吸收也有作用；可間接參與糖元異生過程；防止高血氨；參與精子的成熟過程等。隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，左旋肉堿逐漸應用于食品、醫(yī)藥保健領(lǐng)域，并已被瑞士、法國、美國和世界衛(wèi)生組織法定為多用途營養(yǎng)劑。 關(guān)于左旋肉堿的制備有很多種方法，人們一直在探討更好的工藝來生產(chǎn)左旋肉堿。最早期的左旋肉堿是從肉浸膏中分離出來的，典型的方法是Carter等1952年用450g牛肉浸膏提取到了0.6g純晶肉堿。第二種方法是始于賴氨酸和蛋氨酸的生物合成法。第三種方法是化學合成法，目前已知化學合成法有十幾條途徑，以環(huán)氧氯丙烷、氯乙酰乙酸乙酯、甘露糖醇等為原料，工藝路線均較長。后來又發(fā)展到了消旋體拆分的方法，包括化學拆分、生物拆分和酶法拆分及右旋肉堿的再利用。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物發(fā)酵法、從脫氫肉堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法和基因重組技術(shù)也在不斷的運用到左旋肉堿的生產(chǎn)當中。 酶轉(zhuǎn)化法也是一種生產(chǎn)左旋肉堿較為先進的方法，它是利用純化的酶或菌體細胞將L-肉堿代謝的前體物質(zhì)(目前包括7- 丁基甜菜堿、巴豆甜菜堿、D肉堿或3-脫氫肉堿)轉(zhuǎn)化為L-肉堿。酶轉(zhuǎn)化法具有環(huán)境友好、成本低、產(chǎn)品安全性高等特點，是很有吸引力的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種左旋肉堿的制備方法。 本發(fā)明所說的左旋肉堿的制備方法，是用采自于的土壤樣品中的分離得到的假單胞桿菌，采用微波誘變的方法對其進行篩選，得到高產(chǎn)酶菌株并進行增值培養(yǎng)，再將菌株細胞微囊固定化，然后加入反應底物巴豆甜菜堿，在超聲波輔助條件下進行反應。假單胞桿菌
4所產(chǎn)生的高效水解酶將巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化為左旋肉堿。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
(1)產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)、篩選 將采自于土壤中的含有假單胞桿菌的樣品自然風干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法進行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，用254nm的紫外分析儀進行觀察，挑取長勢良好的菌落接至新鮮固體平板，經(jīng)過單胞分離純化
幾代后轉(zhuǎn)移至試管斜面，置于4t:冰箱中保存?zhèn)溆谩?將試管斜面上的菌株用無菌水洗脫，按10%的接種量接至種子培養(yǎng)液中3(TC振搖(160r/min)培養(yǎng)24h。取稀釋至10mL的上述種子液分為2mL裝入小試管，用低溫熱分散法消除微波的熱效應。采用微波爐對菌液進行誘變處理。將微波誘變處理后的菌液稀釋后取0. 2mL涂布到平板培養(yǎng)基中，3(TC倒置培養(yǎng)1_3天至單菌落出現(xiàn)。挑取長勢較好的單菌落反復進行搖瓶發(fā)酵復篩。 經(jīng)過發(fā)酵復篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基搖瓶中，35t:下，
轉(zhuǎn)速160r/rain培養(yǎng)24h，即得到細胞種子液。
(2)高產(chǎn)酶菌株細胞的固定化 在無菌水中加人種子培養(yǎng)液，取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，攪拌均勻，用于滴制膠囊。此溶液脫氣后，通過氣流微囊發(fā)生器滴人質(zhì)量濃度為6%P匿DAAC(聚二甲基二烯丙基氯化銨)溶液中。室溫下溫和攪拌，反應培養(yǎng)的含細胞微膠囊。30min后，洗去表面殘余的PDMDAAC，即得待培養(yǎng)的固定化細胞。
(3)左旋肉堿的制備 固定化細胞培養(yǎng)將包菌后的膠囊，加入到含固定化細胞培養(yǎng)基中(pH7. 0)的搖瓶中，轉(zhuǎn)速150r/min搖床培養(yǎng)120h。 固定化細胞培養(yǎng)好后，在培養(yǎng)基中加入反應底物巴豆甜菜堿，用超聲波輔助處理，反應溫度為37t:，經(jīng)過24h后測定，底物的轉(zhuǎn)化率達到了 80%。 本發(fā)明中用微波誘變處理法篩選高產(chǎn)酶菌株，彌補了用傳統(tǒng)方法篩選的不足，通過微波誘變方法，去除了產(chǎn)酶量低的菌株，得到了產(chǎn)酶量較高的菌株，再經(jīng)過增值培養(yǎng)，獲得了試驗所需的高產(chǎn)酶菌株。然后用微囊法將菌體細胞包埋，目的在于提高菌體細胞所產(chǎn)酶的利用率。在酶解反應階段又增加了超聲波輔助技術(shù)，超聲波在不破壞細胞的前提下，增加了細胞膜對反應底物的通透性，使底物與酶能充分的結(jié)合，明顯的提高了底物的轉(zhuǎn)化率和酶的使用率。 左旋肉堿(L-Carnitine，又名左卡尼汀、肉毒堿、維生素BT)，是一種廣泛存在于機體組織的特殊氨基酸，它將長鏈脂酰基帶人線粒體內(nèi)氧化釋放出能量，又可將線粒體內(nèi)的短鏈?；\送到膜外。調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外酰基CoA/CoA的比率等，因此它是脂肪代謝的必須輔助因子。自左旋肉堿1905年被發(fā)現(xiàn)，一個世紀以來人們不斷探索拓展它的新用途，近年來左旋肉堿在我國臨床、保健食品等方面得到了廣泛的應用。首先，在慢性腎衰腹膜血透方面的應用?，F(xiàn)今左旋肉堿作為藥品應用于臨床上最多的當屬在血液透析方面的應用，在給予尿毒癥血液透析患者促紅細胞素(EPO)常規(guī)治療的同時加用左旋肉堿，可使患者Hb及Hct顯著升高。同時，大量動物和人體實驗都證實，補充左旋肉堿對治療心血管疾病大有益處。它能改善心肌的能量代謝，又能降低充血性心力衰竭患者的病死率，改善心力衰竭的自然病程。補充左旋肉堿，可使缺血缺氧心肌從無氧酵解方式回到脂肪酸氧化方式，從而使 心肌細胞的能量代謝得以恢復，減少了無氧酵解產(chǎn)生的有害物質(zhì)在心肌細胞內(nèi)的堆積，起 到了預防和減輕心肌損傷、提高患者心耐量，減少心絞痛發(fā)作頻率等作用。另外，左旋肉堿 可以促進病人脂肪代謝，增加脂肪組織特別是腹部脂肪組織的利用，減輕中心型肥胖。降低 病人血清甘油三酯水平，有助于防止動脈粥樣硬化。左旋旋肉堿還能迅速分解脂肪，釋放能 量，恢復體力，現(xiàn)已經(jīng)成為減肥產(chǎn)品中的一種不可少的原料。 總之，經(jīng)證實，左旋肉堿是一種公認的安全、無毒的營養(yǎng)強化劑，其在脂肪代謝方 面的生理功能可以使之廣泛應用于臨床疾病的治療、減肥食品、嬰幼兒母乳化奶粉、運動員 功能性飲料、中老年營養(yǎng)補充劑以及添加于飼料中喂養(yǎng)豬、牛、羊、雞、魚。隨著醫(yī)療科學技 術(shù)水平的不斷進步，人民生活水平的提高，左旋肉堿新的用途還將得到更大的拓展。
權(quán)利要求
一種左旋肉堿的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)、篩選將采自于土壤中的含有假單胞桿菌的樣品自然風干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法進行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，用254nm的紫外分析儀進行觀察，挑取長勢良好的菌落接至新鮮固體平板，經(jīng)過單胞分離純化幾代后轉(zhuǎn)移至試管斜面，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒃嚬苄泵嫔系木暧脽o菌水洗脫，按10％的接種量接至種子培養(yǎng)液中30℃振搖(160r/min)培養(yǎng)24h。取稀釋至10mL的上述種子液分為2mL裝入小試管，用低溫熱分散法消除微波的熱效應。采用微波爐對菌液進行誘變處理。將微波誘變處理后的菌液稀釋后取0.2mL涂布到平板培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)1-3天至單菌落出現(xiàn)。挑取長勢較好的單菌落反復進行搖瓶發(fā)酵復篩。經(jīng)過發(fā)酵復篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基搖瓶中，35℃下，轉(zhuǎn)速160r/rain培養(yǎng)24h，即得到細胞種子液。(2)高產(chǎn)酶菌株細胞的固定化在無菌水中加人種子培養(yǎng)液，取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，攪拌均勻，用于滴制膠囊。此溶液脫氣后，通過氣流微囊發(fā)生器滴人質(zhì)量濃度為6％PDMDAAC(聚二甲基二烯丙基氯化銨)溶液中。室溫下溫和攪拌，反應培養(yǎng)的含細胞微膠囊。30min后，洗去表面殘余的PDMDAAC，即得待培養(yǎng)的固定化細胞。(3)左旋肉堿的制備固定化細胞培養(yǎng)將包菌后的膠囊，加入到含固定化細胞培養(yǎng)基中(pH7.0)的搖瓶中，轉(zhuǎn)速150r/min搖床培養(yǎng)120h。固定化細胞培養(yǎng)好后，在培養(yǎng)基中加入反應底物巴豆甜菜堿，用超聲波輔助處理，反應溫度為37℃，經(jīng)過24h后測定，底物的轉(zhuǎn)化率達到了80％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所述的涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)溫度 為26。C -28。C，培養(yǎng)時間為36h-48h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所述的采用微波爐對菌液進行誘變處理，其特征在于微波的使 用頻率為2450Hz，輸出功率為800W，處理時間為140s-160s。
4. 根據(jù)權(quán)利1中所述的幾種培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的組成成分如下斜面(平 板)培養(yǎng)基瓊脂1. 5%，蛋白胨0. 5%，牛肉膏3%， MnS04. H200. 05%，酵母粉0. 3%， NaCl 2眉，KC1 0. 01%， CaCl2. H20 0. 15% ， Fe2 (P04) 30 . 001 % ， MgCl2. 6H20 0. 55% ， MgS04. 7H20 0.69%。蒸餾水配制，調(diào)pH7. 3-7.4，滅菌。種子培養(yǎng)基玉米漿3. 0% ;氯化鈉0. 3% ;葡萄糖1. 5%。蒸餾水配制，調(diào)pH7. 3-7. 4， 滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米漿2.5%，氯化鈉0.3%，葡萄糖2.0%，硫酸氨0. 1%，硫酸鎂 0. 05% ，氯化鈷0. 01 % ，調(diào)pH7. 3-7. 4，滅菌。固定化細胞培養(yǎng)基2%富馬酸，1%酵母浸膏，1%蛋白胨，0.3%巴豆甜菜堿鹽，其余為 蒸餾水，調(diào)pH7.0，滅菌。
5. 根據(jù)權(quán)利(2)中所說的取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，其特征在 于稀釋后的種子液是指加無菌水將原種子液稀釋為原濃度的1/5，NaCS(纖維素硫酸鈉)所加的量為稀釋后種子液的4% (m/v)。
6.根據(jù)權(quán)利(3)所說的用超聲波輔助處理，其特征在于所說的超聲波的使用頻率為 20kHz ，功率為10W。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種左旋肉堿的制備方法。是用采自于的土壤樣品中的分離得到的一種假單胞桿菌，采用微波誘變的方法對其進行篩選得到高產(chǎn)酶菌株，再進行增值培養(yǎng)，然后將菌株細胞微囊固定化后加入反應底物巴豆甜菜堿，在超聲波輔助條件下進行酶解反應得到左旋肉堿。反應底物在24h后的轉(zhuǎn)化率就達到了80％，明顯的提高了底物的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12R1/38GK101712969SQ20081012154
公開日2010年5月26日 申請日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者吳菁, 陳群 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁