專利名稱：：花生矮化病毒熒光定量rt-pcr檢測試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑及制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)城本發(fā)明涉及檢測花生矮化病毒的生物制劑，具體涉及花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)屬于黃瓜花葉病毒屬，病毒粒體球形，直徑約30nm。該病毒寄主范圍較廣，自然條件下可侵染花生、菜豆、大豆、煙草、苜蓿、三葉草、刺槐等作物，能夠引起葉片褪綠，并發(fā)展成綠色與淺綠相間的花葉，新長出的葉片通常展開時是黃色的，但可以轉(zhuǎn)變成正常綠色，葉片變窄小，葉緣有時出現(xiàn)波狀扭曲；病株結(jié)莢少而小，有時畸形或開裂?；ㄉ《局饕垦料x以非持久性方式在田間傳播，也可通過蚜蟲與汁液傳播。目前，該病毒主要分布于美國、加拿大以及中歐等國，為我國對外公布的檢疫性有害生物?；ㄉ《镜臋z測方法主要包括生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)等。生物學(xué)鑒定方法耗工費(fèi)時，需要隔離溫室，檢測周期較長；血清學(xué)方法常用的是雙抗體夾心酶聯(lián)檢測技術(shù)，適用于多樣本的初篩，具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測靈敏度較低，且常常由于抗體制備的質(zhì)量問題而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。RT-PCR是用于檢測病毒核酸的技術(shù)方法，具有較好的敏感性和特異性，但需要進(jìn)行DNA電泳等PCR后處理，接觸有毒試劑溴化乙錠，易發(fā)生交叉污染而造成假陽性結(jié)果。熒光定量RT-PCR(Real-timefluorescentRT-PCR)是近幾年發(fā)展起來的RT-PCR技術(shù)與熒光檢測相結(jié)合的方法，其原理是使用能特異標(biāo)記核苷酸序列的熒光物質(zhì)，利用熒光信號的積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR過程，具有檢測周期短、特異性與靈敏度髙以及無需PCR后處理等優(yōu)點(diǎn)。以TaqMan水解探針為例，探針一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，通常狀態(tài)下，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，熒光基團(tuán)的熒光被淬滅基團(tuán)吸收。當(dāng)PCR進(jìn)入退火階段時，熒光探針特異的結(jié)合在兩條引物之間，在延伸階段被聚合酶的5'端外切酶活性切開。熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，儀器檢測出熒光。由于熒光信號伴隨著PCR模板的擴(kuò)增而增長，因此可以根據(jù)熒光信號是否增長來確定模板是否擴(kuò)增。熒光PCR儀在反應(yīng)過程中連續(xù)的檢測熒光信號的變化，當(dāng)熒光信號增強(qiáng)到某一闡值時，此時的循環(huán)次數(shù)(Ct)就被記錄下來。該Ct值與反應(yīng)體系中起始模板量的對數(shù)值有嚴(yán)格的線性關(guān)系。因此，除了可定性確定反應(yīng)體系中是否含有目標(biāo)RNA之外，還可以對反應(yīng)體系中的模板RNA進(jìn)行相對定量。普通TaqMan探針的Tm值為6572'C，片段長度為2540nt，由于其髙特異性的特點(diǎn)，如果探針與目標(biāo)基因序列沒有完全匹配，則會發(fā)生檢測效率低甚至沒有熒光信號的產(chǎn)生等問題。因此，在針對株系變異較大的病毒進(jìn)行熒光RT-PCR檢測時，由于難以設(shè)計(jì)長片段的完全匹配合適的熒光探針，就必須采用TaqManMGB(MinorGrooveBinder)探針技術(shù)。T叫ManMGB探針由于3'端具有MGB分子，提髙了探針的Tm值，從而使探針長度縮短，以滿足整個熒光RT-PCR的反應(yīng)條件。因此，研究建立特異、敏感、可對低含量PSV病毒侵染、隱性感染或持續(xù)帶毒寄主進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究等方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種對花生矮化病毒具有特異性高、敏感性強(qiáng)，定量和快速檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑。本發(fā)明還提供了該檢測試劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明系選擇花生矮化病毒的CP(外殼蛋白)編碼基因的保守片段為耙目標(biāo)，應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；將設(shè)計(jì)的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實(shí)驗(yàn)，得到最合適的引物和探針。本發(fā)明所述的花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為76bp，引物和探針序列為引物PSVTF:5'-cagatgccatccctcga國3'PSVTR:5'-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3'探針5'-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3'本發(fā)明所述的花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法由下述步驟組成一、選擇花生矮化病毒CP編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，該保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為cagatgccatccctcgatcatecaacctttgtttctagcaagaagtgtcg50tcctgggtacacgtacacttcgttgg76二、應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；三、引物和探針的合成采用P—乙腈磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行01igoDNA的合成；四、探針合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)為FAM，3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子；熒光報告基團(tuán)FAM也可以用TET、VIC、JOE等發(fā)光基團(tuán)代替；五、將設(shè)計(jì)合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針；六、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過大量實(shí)際樣品的檢測應(yīng)用評估，得到擴(kuò)增效率和特異性好的所述的引物和探針。本發(fā)明的花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑是將RT-PCR技術(shù)與熒光檢測相結(jié)合，構(gòu)建并篩選出上述擴(kuò)增效率和特異性好的一對引物和一條探針，克服了常規(guī)RT-PCR費(fèi)時、易污染以及擴(kuò)增后需電泳檢測等缺點(diǎn)，可對樣品中的PSV進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性與定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。具體優(yōu)點(diǎn)如下1、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢領(lǐng)IJ試劑相比，具有特異、敏感的優(yōu)點(diǎn)；可對樣品中低含量的PSV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒寄主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，是一種非常適合PSV檢測的方法。2、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢測試劑相比，具有適用范圍廣，使用安全的優(yōu)點(diǎn)；可對果實(shí)、葉片、種子、媒介昆蟲等多種樣品中的PSV進(jìn)行快速檢測，適用范圍廣；本發(fā)明克服了常規(guī)RT-PCR的產(chǎn)物須電泳檢測、接觸有毒試劑的缺點(diǎn)，降低了生物安全隱患，提高了使用安全性。3、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢測試劑相比，具有檢測量大和快速檢測的優(yōu)點(diǎn)；可同時進(jìn)行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險；常規(guī)RT-PCR的檢測時間一般6小時以上，本發(fā)明無需擴(kuò)增后的電泳分析，樣品檢測時間在4小時之內(nèi)。4、與常規(guī)RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR作出一個定量的、客觀的估計(jì)，判斷出陽性、陰性和可疑結(jié)果，Ct值為40.0可確定為陽性和陰性的臨界值。更重要的是熒光定量RT-PCR特別適用于保存時間長而無法進(jìn)行分離病毒的大批量樣品的快速檢測。5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內(nèi)作出定性、定量檢測結(jié)果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測實(shí)際樣品中PSV的特異、敏感和穩(wěn)定的方法。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1、設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明選擇PSV外殼蛋白編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過GenBank中報道的PSV各株系的CP編碼基因序列進(jìn)行同源性分析比較，選定PSV特征基因的保守片段(76bp),應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針的合成采用p—乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行01igoDNA的合成探針，合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。將設(shè)計(jì)合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實(shí)驗(yàn)后，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的一對引物和一條探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為76bp。2、RNA提取取100^L體積的研磨勻漿樣品上清液，加入700nLTrizol試劑，室溫振蕩充分混勻5min，加入200nL氯仿，充分顛倒混勻15sec，12000r/min(4'C)離心10min，小心吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，12000r/min(4'C)離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次，干燥后溶于20經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水中。3、PSV熒光定量RT-PCR擴(kuò)增PSV熒光定量RT-PCR采用25pL體積反應(yīng)液，在ABI7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42'C反轉(zhuǎn)錄5min,95'C預(yù)變性10sec;95'C變性5sec，60'C延伸31sec，擴(kuò)增40個循環(huán)。引物和探針的濃度進(jìn)行精確篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值(ARn)。每次檢測時，設(shè)立陽性對照和陰性對照陽性對照采用感染PSV的花生葉片，經(jīng)Trizol試劑方法提取得到的含有PSV核酸的總RNA;陰性對照采用健康花生葉片，經(jīng)Trizol試劑方法提取得到的植物組織總RNA。每個樣品檢測做3管平行試驗(yàn)，在陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗(yàn)有效，可進(jìn)一步判斷結(jié)果。每個樣品須作多個備份，以進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)。4、PSV熒光定量RT-PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)采用同屬的CMV、TAV以及PStV、CRSV、MCMV、BPMV和健康花生葉片提取液等樣本進(jìn)行特異性比較檢測。對感染PSV的葉片樣品，采用Trizol試劑方法提取得到含有PSV核酸的總RNA，進(jìn)行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測，比較它們的敏感性，常規(guī)RT-PCR采用的引物與熒光定量RT-PCR的引物一致。5、PSV熒光定量RT-PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)在評估熒光定量RT-PCR檢測PSV方法中的組內(nèi)和組間試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時，用陽性樣品和陰性樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，每次試驗(yàn)的每個樣品做6個平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。6、PSV定量用標(biāo)準(zhǔn)品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及樣品中病毒RNA含量的計(jì)算參照吳云峰主編《植物病毒學(xué)原理與方法》(西安地圖出版社，1999年，第八章)采用密度梯度分離方法得到純化的PSV病毒，經(jīng)過Trizol試劑方法得到病毒的純RNA，用分光光度計(jì)測定其OD26o值來進(jìn)行RNA模板定量，OD26o值為1相當(dāng)于40pg/mL單鏈RNA。采用DEPC處理水，把提取得到的病毒純RNA稀釋定量到100ng/^L。對該RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10—i10—倍稀釋的RNA模板用于熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，以模板濃度的對數(shù)值為X軸，Ct值為Y軸作回歸曲線并得出回歸方程。根據(jù)結(jié)果換算，可從未知樣品的Ct值得出其含有PSV病毒的RNA含量。7、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低Ct值和最高ARn，提高擴(kuò)增效率和敏感性。應(yīng)用不同RNA模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品，對設(shè)計(jì)的引物與探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的使用終濃度，釆用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。8、對樣品的檢測對表現(xiàn)矮化、褪綠等癥狀的花生葉片樣品以及CMV、TAV、PStV、CRSV、MCMV、BPMV和健康花生提取液等樣本進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果表明，陽性樣品均具有典型的擴(kuò)增曲線，Ct值小于35.0，陰性對照及陰性樣品均無典型擴(kuò)增曲線，也無Ct值。三個平行試驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定一致。證明熒光定量RT-PCR檢測PSV的特異性強(qiáng)、敏感度高和重復(fù)性好。9、PSV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測程序9.1標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒組份(25jiL反應(yīng)X100次):<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>按照優(yōu)化的反應(yīng)條件配制。9.2操作方法9.2.1總RNA提取(1)取0.110克組織樣品，按1:10(克mL)加入蒸餾水，充分研磨勻漿，2000r/min,4。C，離心10min。(2)取100pL上清液加入700nL溶液I，充分振蕩混勻，室溫靜置5min，徹底裂解。(3)加200nL氯仿，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec。12000r/min，4'C,離心10min。(4)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min。12000r/min，4'C,離心10min,棄上清液。(5)沉淀用70%乙醇洗滌一次，晾干后，溶于20^L經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水中?？芍苯佑糜诜崔D(zhuǎn)錄或-70'C保存?zhèn)溆谩?.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200pL光學(xué)PCR反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為25nL，向反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)定量按需要對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，至少7個稀釋度。(3)設(shè)立對照陽性對照和陰性對照各設(shè)2管。9.2.3擴(kuò)增在ABI7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42'C反轉(zhuǎn)錄5min，95'C預(yù)變性IOsec;95'C變性5sec，60。C延伸31sec，擴(kuò)增40個循環(huán)。9.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定閾值線設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)——陰性對照無Ct值，并且無典型擴(kuò)增曲線?！栃詫φ盏腃t值應(yīng)小于35.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，2個陽性對照擴(kuò)增曲線基本重合，特別是在熒光臨界值(Ct值)附近。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效?！坑玫臉?biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，7個點(diǎn)具良好的線性范圍，平臺區(qū)匯于一起，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。(3)結(jié)果描述及判定——陰性無Ct值或無擴(kuò)增曲線，表示樣品中無花生矮化病毒。——陽性Ct值應(yīng)小于等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在花生矮化病毒?！行г瓌tCt值在35.0~40.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無Ct值或無典型擴(kuò)增曲線判為陰性，否則判為陽性?！扛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作出定量。序列表<110>寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院<120>花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑及制備方法和應(yīng)用<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>20<212>RNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)外殼蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)的用于檢測PSV特異性熒光探針序列<400>15'-catccaacctttgtttctag-3'20<210>2<211>17<212>RNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)外殼蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)的用于檢測PSV的特異性引物序列<400>25'陽cagatgccatccctcga-3'17<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)外殼蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)的用于檢測PSV的特異性引物序列<400>35'-ccaacgaagtgtacgtgtacc-321<210>4<211>64<212>RNA<213>花生矮化病毒(PSV)<400>4cagatgccatccctcgatcatecaacctttgtttctagcaagaagtgtcg50tcctgggtacacgtacacttcgttgg7權(quán)利要求1、花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為76bp，引物和探針序列為引物PSVTF5′-cagatgccatccctcga-3′PSVTR5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′探針5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′。2、權(quán)利要求1所述的花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由下述步驟組成(1)選擇花生矮化病毒的CP編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，該保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為cagatgccatccctcgatcatccaacctttgtttctagcaagaagtgtcg50tcctgggtacacgtacacttcgttgg76(2)應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；(3)引物和探針的合成采用p—乙腈磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行01igoDNA的合成；(4)探針合成同時進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子；(5)將設(shè)計(jì)合成的多對引物和探針進(jìn)行最佳配對篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針；(6)經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過大量實(shí)際樣品的檢測應(yīng)用評估，得到擴(kuò)增效率和特異性好的所述的引物和探針。3、權(quán)利要求1所述的花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑在制備PSV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了花生矮化病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑及制備方法和應(yīng)用，系選擇花生矮化病毒特異且各株系之間比較保守的CP編碼基因片段為靶目標(biāo)序列，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)并合成，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為76bp，引物和探針序列為引物PSVTF5′-cagatgccatccctcga-3′，PSVTR5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′，探針5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′；本發(fā)明克服了常規(guī)RT-PCR費(fèi)時、易污染以及擴(kuò)增后需電泳檢測等缺點(diǎn)，可對樣品中的PSV進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性與定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12Q1/70GK101429563SQ20081012232公開日2009年5月13日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者楊文潮,聞偉剛,陳先鋒申請人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院