專利名稱：一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法，制備的紫菌紅 素乙在食品行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素(carotenoids)是一類呈黃色、橙黃色或紅色的多烯類化合物， 所有的光合生物以及許多非光合細(xì)菌、古菌和真菌均可在體內(nèi)合成類胡蘿卜素。 類胡蘿卜素具有著色、抗氧化、抑癌、防動(dòng)脈硬化、增強(qiáng)免疫、有利視覺保護(hù) 等多種功能，在食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。目前， 類胡蘿卜素已被FA0和WHO等國際組織認(rèn)定為A級(jí)營養(yǎng)色素，并在50多個(gè)國家 和地區(qū)作為營養(yǎng)、著色雙重功能的食品添加劑而被廣泛應(yīng)用于保健食品及醫(yī)藥 和化妝品工業(yè)。類胡蘿卜素通?？赏ㄟ^化學(xué)合成、植物提取和微生物發(fā)酵三種 方法生產(chǎn)，但由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素具有不受環(huán)境條件限制、便于 工業(yè)化生產(chǎn)、工藝簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來引起國內(nèi)外的 普遍重視。
類胡蘿卜素種類很多，如番茄紅素、a-胡蘿卜素、胡蘿卜素、葉黃素、 玉米黃素、紫菌紅素等。紫菌紅素乙(又名玫紅品，Rhod叩in)，是紫菌紅素的 一種，是無環(huán)四萜類化合物的天然類胡蘿卜素。純品為紫色結(jié)晶，熔點(diǎn)182 183°C (苯/石油醚)，分子式是C4。H580，結(jié)構(gòu)式為
郝常明等(1999)通過柱層析和薄層色譜分析了光合細(xì)菌中的類胡蘿卜素， 結(jié)果表明，光合細(xì)菌中存在番茄紅素、紫菌紅素乙和紫菌紅素丁三種類胡蘿卜 素。呂曉玲等(2003)用薄層層析法、分光光度法以及HPLC法對紅酵母中的色 素成分進(jìn)行分離和初步鑒定，共分離出四種組分，其中組分4可能是P-胡蘿卜 素，2和3可能是類胡蘿卜素中的紫菌紅素和丫-胡蘿卜素，組分1屬于非類胡 蘿卜素。平山修(1978)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)Rp.capsulatus達(dá)到后期時(shí)，在5000 Lux 下培養(yǎng)的菌體含有相當(dāng)多的螺菌黃素和羥基螺菌黃素，而在100 Lux下培養(yǎng)的 菌體中番茄紅素和紫菌紅素積累較多。
紫菌紅素乙主要來源于微生物，已報(bào)道的來源微生物主要有紅假單胞菌、 光合細(xì)菌、紅酵母等，目前尚無關(guān)于從熒光假單胞菌提取紫菌紅素乙天然色素 的報(bào)道。本制備方法的發(fā)明人之一趙博光在其發(fā)明專利(ZL 200410065471.7)
中公開了一種無菌松材線蟲的培養(yǎng)方法，其中飼喂松材線蟲的食物之一是滅活
的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluoresceins)GcM5-lA ( CCTCCNo: M 204065)。 我們在培養(yǎng)這種細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，在合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，該菌能積累一種 紫紅色的成分，該成分的吸收光譜與類胡蘿卜素的吸收光譜相似，我們進(jìn)一步 優(yōu)化了適合該菌累積這種色素的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件以及色素提取方法。本發(fā)明 首次公開了一種利用熒光假單胞菌(/^et^o/z70/7as /7woresce/7S GcM5-lA)制備 紫菌紅素乙的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用微生物制備紫菌紅素乙的新方法，該方法 提供了一種可用于制備紫菌紅素乙的新的微生物，即熒光假單胞菌GcM5-lA
(尸sei/a^077as /7"oresce/is GcM5-lA)。依據(jù)該方法制備的紫菌紅素乙可廣泛 用作食品或化妝品添加劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先培養(yǎng)熒光假單胞菌GcM5-lA，所用的培養(yǎng)基為 改良LB液體培養(yǎng)基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01% MgS04 ，pH7.5)，培養(yǎng)溫度是25-32"C，振蕩培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為100 200r/min，大量培養(yǎng)時(shí)間為12 24h,再轉(zhuǎn)接到大量的改良LB培養(yǎng)基中，相同 條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 64h，得濕菌體。
培養(yǎng)液中的菌體經(jīng)離心收集，用蒸餾水懸浮后，超聲波細(xì)胞破碎后，用1 6倍于蒸餾水體積并添加了終濃度為0. 01% 0. 1%維生素C的丙酮于25-50。C浸 提，為加快提取速度，可在超聲條件下浸提。離心，取上清液，反復(fù)浸提三次， 合并浸提液，減壓濃縮，得到紫菌紅素乙粗品。
紫菌紅素乙粗品經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先 洗脫出來的色素帶，減壓濃縮后，于-18'C結(jié)晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍干 燥后，即得到紫菌紅素乙純品，所用的洗脫劑石油醚與乙酸乙酯的體積比為2: 1-1: 2，優(yōu)選體積比為1: 1。
本發(fā)明方法優(yōu)化了適合熒光假單胞菌GcM5-lA累積紫菌紅素乙的培養(yǎng)基、 培養(yǎng)條件以及色素提取方法，提供了一種制備紫菌紅素乙的新方法，工藝簡單， 操作方便。本發(fā)明得到的紫菌紅素乙純品經(jīng)薄層層析分析和EIMS鑒定，結(jié)構(gòu)與 紫菌紅素乙標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)一致。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1:
第一步，細(xì)菌培養(yǎng)與色素提取
挑取熒光假單胞菌(Psewc/o/z o77as/7woresce/7sGcM5-lA)單菌落于20mL改 良LB液體培養(yǎng)基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，28。C，165r/min振蕩培養(yǎng)24h;后轉(zhuǎn)接到2L改良LB 培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h。 8000g離心15min收集菌體，得濕菌體 15. 9g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，0。C條件下進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反復(fù)15次)后，加入300ml添加了終濃度為0.05%維生素(作為抗 氧化劑的丙酮，封口后，于45。C下超聲波振蕩浸提4h， 4'C，10000g離心10min， 取上清液。反復(fù)浸提3次，合并浸提液，減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品浸膏1. lg。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上硅膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:l) 作為洗脫劑，共得到三個(gè)明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮后，于-18。C結(jié)晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍干燥后，得紫菌紅素乙純品 48. 6mg。
紫菌紅素乙的結(jié)構(gòu)鑒定
采用Agilent5973型質(zhì)譜儀(EI離子源)對樣品給出產(chǎn)品質(zhì)譜，數(shù)據(jù)處理 后的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的紫菌紅素乙的譜圖匹配，匹配度達(dá)90%;純品與紫菌 紅素乙標(biāo)準(zhǔn)品的丙酮溶液同時(shí)進(jìn)行TLC(GF254)分析，分別以石油醚-乙酸乙酯(2: 1)，石油醚-丙酮(2: 1)，石油醚-乙酸乙酯(3: 1)做展開劑，兩者的RF值 均一致，確定所得到的產(chǎn)品為紫菌紅素乙。
實(shí)施例2:
第一步，細(xì)菌培養(yǎng)與色素提取
挑取熒光假單胞菌(/^e"t/o/Ho/7as/7i/aresce77sGcM5-lA)單菌落于20mL改 良LB液體培養(yǎng)基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0. 01% MgS04 ， pH7. 5)中，25°C， 200r/min振蕩培養(yǎng)12h;后轉(zhuǎn)接到2L改良LB 培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)64h。 8000 g離心15min收集菌體，得濕菌體 16.7g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，0。C條件下進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反復(fù)15次)后，加入50ml添加了終濃度為0.0W維生素C作為抗氧 化劑的丙酮，封口后，于25。C下超聲波振蕩浸提5h， 4。C，10000g離心10min， 取上清液。反復(fù)浸提3次，合并浸提液，減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品浸膏0. 99g。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上硅膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=2:l) 作為洗脫劑，共得到三個(gè)明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮后，于-18。C結(jié)晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍干燥后，得紫菌紅素乙純品 41. 3mg。
實(shí)施例3:
第一步，細(xì)菌培養(yǎng)與色素提取
挑取熒光假單胞菌(/^ewc/o/z o/7as/7woresce/7sGcM5-lA)單菌落于20mL改 良LB液體培養(yǎng)基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，32°C， 100r/min振蕩培養(yǎng)12h;后轉(zhuǎn)接到2L改良LB 培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。 8000g離心15min收集菌體，得濕菌體 11.8g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，(TC條件下進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反復(fù)15次)后，加入300ml添加了終濃度為0. 1呢維生素C作為抗氧 化劑的丙酮，封口后，于50。C下超聲波振蕩浸提2h, 4。C,10000g離心10min， 取上清液。反復(fù)浸提3次，合并浸提液，減壓濃縮,得紫菌紅素乙粗品浸膏0. 91g。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上硅膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:2) 作為洗脫劑，共得到三個(gè)明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮后，于-18。C結(jié)晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍干燥后，得紫菌紅素乙純品 39. 4mg。
權(quán)利要求
1.一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法，其特征在于按如下步驟操作用改良LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)熒光假單胞菌GcM5-1A；培養(yǎng)液中的菌體經(jīng)離心收集，用蒸餾水懸浮后，超聲波細(xì)胞破碎，用1～6倍于蒸餾水體積并添加了終濃度為0.01％～0.1％維生素C的丙酮于25-50℃浸提，離心，取上清液，反復(fù)浸提三次，合并浸提液，減壓濃縮，得到紫菌紅素乙粗品；紫菌紅素乙粗品經(jīng)硅膠柱層析，以體積比為21-12的石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃縮后，于-18℃結(jié)晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍干燥后，即得到紫菌紅素乙純品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法， 其特征在于所用的改良LB液體培養(yǎng)基為1. 0% NaCl， 1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母提 取物，1.0%葡萄糖，0.01% MgS04 ，pH7.5，培養(yǎng)溫度是25-32°C，振蕩培養(yǎng)時(shí)， 搖床轉(zhuǎn)速為100 200r/min,大量培養(yǎng)時(shí)間為12 24小時(shí)，再轉(zhuǎn)接到大量改良 LB培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 64小時(shí)，得濕菌體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法， 其特征在于對菌體進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎的條件是(TC，16(k，工作10s，間隔15s， 反復(fù)15次。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法， 其特征在于為加快紫菌紅素乙的提取速度，采用超聲振蕩浸提2-5小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法， 其特征在于洗脫劑石油醚與乙酸乙酯的優(yōu)選體積比為1: 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用熒光假單胞菌制備紫菌紅素乙的方法。用改良LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)熒光假單胞菌GcM5-1A；培養(yǎng)液中的菌體用蒸餾水懸浮后，超聲波細(xì)胞破碎，用1～6倍于蒸餾水體積并添加了終濃度為0.01％～0.1％維生素C的丙酮浸提，將浸提液減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品；粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃縮，低溫結(jié)晶，紫色晶體經(jīng)過濾、冷凍干燥后，即得到紫菌紅素乙純品。本方法優(yōu)化了適合熒光假單胞菌GcM5-1A累積紫菌紅素乙的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件以及色素提取方法，工藝簡單，操作方便，制備的紫菌紅素乙可廣泛用作食品或化妝品添加劑。
文檔編號(hào)C12P7/04GK101368191SQ20081013982
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者李榮貴, 趙博光, 郭群群, 郭道森 申請人:青島大學(xué);趙博光