專利名稱：：抗害蟲的新穎蘇云金芽孢桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種新穎的蘇云金芽孢桿菌菌株，特別是關(guān)于一種具有crylAa、crylAb、crylC、crylD以及crylF的基因片段的蘇云金芽孢桿菌菌株。
背景技術(shù)：
：隨著人們對于生活品質(zhì)的重視以及環(huán)保意識的興起，目前以生物性殺蟲劑取代傳統(tǒng)農(nóng)藥來避免食物鏈的最終累積的趨勢已成為主流。其中，蘇云金芽孢桿菌是生物性殺蟲劑中最廣為應(yīng)用的，且使用簡便又安全。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種昆蟲病原細(xì)菌，為革蘭氏陽性桿菌，在營養(yǎng)缺乏或環(huán)境不良的時候，蘇云金芽孢桿菌會進(jìn)入不分裂的半靜止期，或是分化形成孢子和殺蟲結(jié)晶蛋白。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲結(jié)晶蛋白對于部分害蟲有抑制其生長的作用，但對哺乳類動物及鳥類均無害。因此，過去20年來科學(xué)家已分離出許多蘇云金芽孢桿菌內(nèi)的殺蟲基因，并研制成重組基因產(chǎn)品。蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素基因位于質(zhì)體上，因此很容易進(jìn)行轉(zhuǎn)化基因工程。早期的內(nèi)毒素重組基因大多限制于單一基因片段的轉(zhuǎn)化。最近則利用多重內(nèi)毒素基因或是差異性很大的基因，甚至是嵌合基因(chimeric)，以增強(qiáng)殺蟲效果、擴(kuò)大殺蟲范圍或是改良蘇云金芽孢桿菌本身對于不良環(huán)境的抵抗力。各類蘇云金芽孢桿菌毒蛋白間的類源關(guān)系，因其內(nèi)含質(zhì)體核酸序列的變異所產(chǎn)生的殺蟲結(jié)晶蛋白不同，殺蟲對象也不同，主要分成六大類(Hofte和Whiteley，1989.InsecticidalcrystalproteinsofBacillusthuringiensis.Microbiol.Rev.53:242-255;Gill等，1992.ThemodeofactionofBacillusthuringiensisendotoxins.Annu.Rev.Entomol.37:615-636;Gleave等，1993.ScreeningbypolymerasechainreactionofBacillusthuringiensisserotypesforthepresenceofcryV—likeinsecticidalproteingenesandcharacterizationofaeryVgeneclonedfromB.thuringiensissubsp.kurstaki.Appl.Environ.Microbiol.59:1683—1687;Lereclus等，1993.DiversityofBacillusthuringiensistoxinsandgenes,pp.37_69In〃Bacillusthuringiensis,AnEnviromentalBiopesticide:TheoryandPrctice〃P.F.Entwistle，J.S.Cory，M.J.BaileyandS.Higgs.Eds.JohnWileyandSonsLtd.Press,England;Shin等，1995.DistributionofcryV-typeinsecticidalproteingenesinBacillusthuringiensisandcloningofcryV—typegenesfromBacillusthuringiensissubsp.kurstakiandBacillusthuringiensissubsp.entomocidus.Appl.Environ.Microbiol.61:2402-2407;Kostichka等，1996.CloningofacryV_typeinsecticidalproteingenefromBacillusthuringiensis:thecryV_encodedproteinisexpressedearlyinstationaryphase.J.Bacteriol.178:2141-2144)，其中Cryl類對鱗翅目有毒殺蟲效果，Cry2類對鱗翅目及雙翅目或只對雙翅目有效，Cry3類只對鞘翅目有效，Cry4只對雙翅目有效，Cry5不產(chǎn)生結(jié)晶，部分可殺鱗翅目和鞘翅目，部3分不可，CytA則是無特定殺蟲作用范圍，但會產(chǎn)生細(xì)胞溶解和溶血的效果(cytolyticandhemolyticefficiency)，其中所編碼(encode)的氨基酸以cryl最多，而cytA最少。美國專利號5，827，514與5，965，428分別批露具有殺蟲作用的CrylAc與CrylF不同片段的嵌合蛋白；美國專利號7，070，982更批露了CrylAb、CrylAc與CrylF的雜合蛋白。臺灣專利號224139更批露一種包含有crylAa、crylAb、crylC與crylD基因片段的單一菌株。由上述文獻(xiàn)可知具有多重內(nèi)毒素基因的產(chǎn)物的殺蟲效果，遠(yuǎn)大于單一基因產(chǎn)物的抗害蟲作用。因此，不論是以遺傳工程的方式或是天然篩選所分離的具有多重內(nèi)毒素基因的菌株，仍為目前科學(xué)家所積極尋求的。
發(fā)明內(nèi)容承上所述，本發(fā)明首先提供一種抗害蟲的蘇云金芽孢桿菌菌株，其具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF基因片段。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株還含有crylAdl基因片段。本發(fā)明另提供一種用于控制害蟲的組合物，該組合物為可接受的載體及殺蟲有效量的內(nèi)毒素，該內(nèi)毒素得自具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF基因片段的蘇云金芽孢桿菌菌株。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)一步含有crylAdl基因片段。本發(fā)明再提供一種控制害蟲的方法，其包括對受害蟲侵襲的區(qū)域或預(yù)防害蟲寄生的區(qū)域施加有效量的蘇云金芽孢桿菌菌株及/或具其內(nèi)毒素的組合物，其特征在該蘇云金芽孢桿菌菌株具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF基因片段。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)一步含crylAdl基因片段。本發(fā)明更提供一種分離的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株A603的代謝物，蘇云金芽孢桿菌A603依據(jù)布達(dá)佩斯條約，于公元2008年8月21日保藏于德國微生物菌種保藏中心，生物材料樣品保藏編號為DSM21764。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株可用于控制害蟲。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲選自鱗翅目的夜蛾科、螟蛾科、巻葉蛾科以及菜蛾科所組成組的其中之一。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為夜蛾科的甜菜夜蛾。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為夜蛾科的斜紋夜蛾。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為夜蛾科的粉紋夜蛾。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為螟蛾科的豆野螟。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為螟蛾科的粉斑螟。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為巻葉蛾科的茶小巻葉蛾。根據(jù)上述構(gòu)想，其中該害蟲為菜蛾科的小菜蛾。為了易于說明，本發(fā)明得通過下述的較佳實(shí)施例及圖示而得到充分了解，并使得熟習(xí)本技藝的人士可以據(jù)以完成，然而本發(fā)明的實(shí)施方式并不限制于下列實(shí)施例中。圖1為本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌菌株A603的內(nèi)毒素基因型的電泳分析圖；圖2為本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌菌株A603的內(nèi)毒素表達(dá)的蛋白質(zhì)電泳圖；圖3為本發(fā)明以PCR擴(kuò)增的crylAdl基因產(chǎn)物的電泳分析圖；以及圖4為以不同IPTG濃度誘導(dǎo)CrylAdl表達(dá)的蛋白質(zhì)電泳分析圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種新穎的蘇云金芽孢桿菌菌株，該蘇云金芽孢桿菌菌株能夠抑制害蟲的生長。以下為該蘇云金芽孢桿菌菌株的來源、純化與分離方式、鑒定方式以及抗目標(biāo)害蟲的效果的詳細(xì)說明。菌種采集由臺灣云林縣褒忠鄉(xiāng)農(nóng)會谷倉采集到的粉塵樣品，每份樣品約采集10克，以塑料袋封裝后，保存于4t:。飾中,分貼！^將每份樣品取0.5克重并劇烈振蕩懸浮于10毫升的無菌水中，依據(jù)Akiba與Katoh(1986.MicrobialecologyofBacillusthuringiensisV.Selectivemedi咖forBacillusthuringiensisvegetativecells.Appl.Entomol.Zool.21:210-215)、Travers等(1987.SelectiveprocessforefficientisolationofsoilBacillusspp.Appl.Environ.Microbiol.53:1263-1266)、Chak與Yang(1990.CharacterizationoftheBacillusthuringiensisstrainsisolatedfromTaiwan.Proc.Natl.Sci.Counc.B.ROC14:175—182)以及Chilcott與Wigley(1993.IsolationandtoxicityofBacillusthuringiensisfromsoilandinsecthabitatsinNewZealand.J.Invertebr.Pathol.61:244-247)等四種方法進(jìn)行分離。經(jīng)熱處理過的懸浮土樣品，涂布于NA(nutrientagar)平板培養(yǎng)基上，在28°C下連續(xù)培養(yǎng)五天后，進(jìn)行單菌落的篩選，在相差光學(xué)顯微鏡下，以1，500倍油鏡進(jìn)行觀察，篩選條件為含有結(jié)晶蛋白以及孢子的菌株，分別編號后保存于4t:下(Kao等，1996.Isolation,characterizationandcrygenetypingofBacillusthuringiensisisolatesfromstoredproductmaterialsamplescollectedaroundTaiwan,ppl32_151.Proceedings,TheSecondPacificRimConferenceonBiotechnologyofBacillusthuringiensisanditsImpacttotheEnvironment.November4_8，1996.ChiangMai，Thailand)。菌種培養(yǎng)將各個經(jīng)編號的菌株，分別以無菌水懸浮稀釋，在NA平板培養(yǎng)基以劃線法，再純化3次并確認(rèn)無污染后，挑單菌落，各別移到5毫升的LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基bacto-胰化蛋白胨lX、bacto-酵母提取物0.5X以及NaCll%，pH7.0)，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(28°C，250rpm)過夜培養(yǎng)，再取0.5毫升以同條件進(jìn)行繼代培養(yǎng)(5毫升)3小時。菌種鑒定對繼代培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行分析，挑選一菌株命名為A603，進(jìn)行菌種型態(tài)分析與后續(xù)實(shí)驗。DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與載體克隆本發(fā)明參照Kalman等(1993.CloningofanovelcrylC-typegenefromastrainofBacillusthuringiensissubsp.galleriae.Appl.Environ.Microbiol.59:1131-1137)所發(fā)表的各個內(nèi)毒素特異性的核苷酸引物(如下所示)的組合來確認(rèn)本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌A603中的內(nèi)毒素基因型。(l)crylAa基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylAa特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.2)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylAa基因片段的存在。[OO42](2)crylAc基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylAc特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.3)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylAc基因片段的存在。(3)crylB基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylB特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.4)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylB基因片段的存在。[OO46](4)crylC基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylC特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.5)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylC基因片段的存在。[OO48](5)crylD基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylD特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.6)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylD基因片段的存在。(6)crylE基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylE特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.7)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylE基因片段的存在。[OO52](7)crylF基因片段的擴(kuò)增以cryl特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.1)以及以crylF特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.8)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylF基因片段的存在。[OO54](8)crylAb基因片段的擴(kuò)增以crylAb正向特異性序列作為正向引物(SEQIDNO.9)以及以crylAb反向特異性序列作為反向引物(SEQIDNO.10)進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)來確認(rèn)是否有crylAb基因片段的存在。(9)crylAdl基因全長擴(kuò)增與載體克隆發(fā)明人為進(jìn)一步取得crylAb基因片段以進(jìn)行基因重組實(shí)驗，設(shè)計全長正向引物(1A29A):ttaacaccctggatccaaaattgatattt(SEQIDNO.11，下劃線處為BamHI切割位點(diǎn))與全長反向引物(1Ab37Bl):tttgcatgcatatattattcctccataagaagtaatt(SEQIDNO.12，下劃線處為Sphl切割位點(diǎn))(陳等人，2006.臺灣蘇力菌crylAc5殺蟲基因克隆及表達(dá)植保會刊48:17-30)，進(jìn)行復(fù)性與PCR放大反應(yīng)時，意外發(fā)現(xiàn)電泳圖上出現(xiàn)有別于crylAb基因片段的泳帶。因此，以蘇云金芽孢桿菌A603質(zhì)體為模板，利用SEQIDNO.11及SEQIDNO.12為引物擴(kuò)增該泳帶的全長基因，利用StrataClonePCRCloningKit(Stratagene)將該泳帶的基因片段構(gòu)建至中間載體PSC-A后，委托波仕特生物科技股份有限公司以大片段核酸測序(primerwalking)進(jìn)行全長測序。測序后的結(jié)果以電腦分析比對，發(fā)現(xiàn)該泳帶為crylAdl基因(全長為3704bp)(SEQIDNO.13)，因此，將該表達(dá)載體命名為pSC+crylAdl。(10)CrylAdl蛋白質(zhì)的表達(dá)以BamHI以及Sphl內(nèi)切酶將crylAdl從pSC-A-crylAdl載體切下來，構(gòu)建至表達(dá)載體pQE82。再將表達(dá)載體pQE82-crylAdl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(BL21)以進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)表達(dá)。蘇云佘芽拘,桿菌A603的內(nèi)毒素某閔會目合請參閱圖l，其為利用上述引物對進(jìn)行PCR的篩選結(jié)果。根據(jù)Kalman等(1993.CloningofanovelcrylC—typegenefromastrainofBacillusthuringiensissubsp.galleriae.Appl.Environ.Microbiol.59:1131-1137)，已知crylAa、crylAc、crylB、crylC、crylD、crylE、crylF以及crylAb基因的預(yù)期的特有片段長度分別為724bp、487bp、830bp、288bp、414bp、883bp、368bp以及238bp。因此，根據(jù)圖1所示的片段長度可以得知本發(fā)明蘇云金芽孢桿菌A603具有crylAa、crylAb、crylC、crylD以及crylF的內(nèi)毒素多重基因片段。圖1的M為DNA梯形帶(DNAladder)，單位為堿基對(basepair,bp)，作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品。再請參閱圖2，其為蘇云金芽孢桿菌菌株A603全蛋白的電泳分析圖。由圖2所示的結(jié)果可以得知蘇云金芽孢桿菌菌株A603確實(shí)能夠表達(dá)內(nèi)毒素蛋白，且其分子量約為130kDa。并且，經(jīng)由內(nèi)毒素活性的試管試驗(未顯示)可以得知蘇云金芽孢桿菌菌株A603所表達(dá)的內(nèi)毒素確實(shí)具有抗害蟲的活性。圖2的M為蛋白質(zhì)標(biāo)記，單位為千道爾頓(kilodalton，kDa)，作為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。請參閱圖3，其為PCR擴(kuò)增的crylAdl基因產(chǎn)物的電泳分析圖，可以得知該基因全長為3704bp。測序后的結(jié)果請參閱序列表的SEQIDNO.13。圖4則為將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，以不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后的CrylAdl表達(dá)情況。圖3的M為另一種DNA梯形帶(DNAladder)，單位為千堿基對(kilobasepair,kb)，同樣作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品。由圖4的結(jié)果可以得知，CrylAdl確實(shí)能夠大量表達(dá)。并且，經(jīng)由內(nèi)毒素活性的試管試驗(未顯示)可以得知蘇云金芽孢桿菌菌株A603所表達(dá)的CrylAdl內(nèi)毒素具有抗害蟲的活性。圖4的M為蛋白質(zhì)標(biāo)記，單位為千道爾頓(ilodalton，kDa)，作為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。蘇云金芽孢桿菌A603抗目標(biāo)害蟲的活性本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種具有殺蟲作用的組合物，其中該組合物包含有效量的蘇云金芽孢桿菌菌株A603的培養(yǎng)物以及可接受的載體。并且，該培養(yǎng)物中包含有內(nèi)毒素。采用工業(yè)上的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法及發(fā)酵方式放大本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌菌株A603或其變異株。再將發(fā)酵后的培養(yǎng)物進(jìn)行試驗以確認(rèn)其抗目標(biāo)害蟲的效果。實(shí)施例一甜菜夜蛾(Spodopteraexigim)大量發(fā)酵蘇云金芽孢桿菌A603后，取5公升的發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)稀釋后，將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法測試處理甜菜夜蛾第三齡初幼蟲連續(xù)120小時后的生物活性(每組實(shí)驗的供試蟲數(shù)為20只，有更換飼料連續(xù)觀察)，記錄以蘇云金芽孢桿菌處理前后的死亡蟲數(shù)后，計算幼蟲死亡率。請參閱表一，其為蘇云金芽孢桿菌A603對于甜菜夜蛾的死亡率測試數(shù)據(jù)。由此結(jié)果可以得知蘇云金芽孢桿菌A603確實(shí)具有害蟲致死效果。表一、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)物抗甜菜夜蛾的活性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注樣品效價(IU/mg)=[(Bta標(biāo)準(zhǔn)品LC5。)/(樣品LC5。)]XBta標(biāo)準(zhǔn)品效價(IU/mg)，測試?yán)ハx為粉紋夜蛾(Trichoplusiani)。實(shí)施例二斜紋夜蛾(Spodopteralitura)試驗處理方式同實(shí)施例一。將稀釋濃度后的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法測試處理斜紋夜蛾第三齡初幼蟲連續(xù)120小時(每組實(shí)驗的供試蟲數(shù)為20只，有更換飼料連續(xù)觀察)，記錄以蘇云金芽孢桿菌處理前后的蟲重以及死亡蟲數(shù)等生長情況。請參閱表二，其為蘇云金芽孢桿菌A603對于斜紋夜蛾的活性抑制數(shù)據(jù)。處理前斜紋夜蛾的平均蟲重為0.0025克。成長倍數(shù)為處理后平均蟲重除以處理前平均蟲重。抑制率(％)為對照組的平均蟲重減處理組的處理后平均蟲重的差值除以對照組的平均蟲重。根據(jù)表二的結(jié)果得知于相同稀釋倍數(shù)下，經(jīng)由蘇云金芽孢桿菌A603處理后的幼蟲成長倍數(shù)降低，同時抑制率也高于市售商品殊立菌(Dipel)，因此其確實(shí)具有抗斜紋夜蛾幼蟲的能力。表二、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)抗斜紋夜蛾的活性數(shù)據(jù)與市售商品殊立菌(Dipel)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>殊立菌(Dipel)稀釋倍數(shù)供試蟲數(shù)死亡率(％)活蟲重(g/重)成長倍數(shù)抑制率(％)對照組(水)3000.03313.30350(~140IU/mg)20650.0041.4889700(~70IU/mg)20500.0051.8386注樣品效價(IU/mg)=[(Bta標(biāo)準(zhǔn)品LC5。)/(樣品LC5。)]XBta標(biāo)準(zhǔn)品效價(IU/mg)，測試?yán)ハx為粉紋夜蛾(Trichoplusiani)。實(shí)施例三豆野螟(Marucavitrata)試驗處理方式同實(shí)施例一。將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法分別測試處理豆野螟第二齡與第三齡初幼蟲連續(xù)120小時(每個濃度五只幼蟲，不更換飼料連續(xù)觀察)，記錄第24至120小時間死亡蟲數(shù)的情況。由表三致死率的分布結(jié)果可以得知蘇云金芽孢桿菌A603于處理幼蟲96小時后，即使在低處理濃度下，也能達(dá)到將近50%抗豆野螟幼蟲的能力。表三、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)物抗豆野螟的活性數(shù)據(jù)死亡率(％)濃度(ppm)24小時48小時72小時96小時120小時2齡3齡2齡3齡2齡3齡2齡3齡2齡3齡600020206060100100雨畫30000204040100801008015000040206040100807.500002020604080403.750000202040408040對照組(水)0000000000實(shí)施例四粉斑螟(EphestiacautellaWalker)試驗處理方式同實(shí)施例一。將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法分別測試處理粉斑螟孵化14天的幼蟲連續(xù)120小時(每個濃度十只幼蟲，每個濃度三重復(fù)，不更換飼料連續(xù)觀察)，并且以市面上常用的殊立菌同時進(jìn)行測試，分別記錄其120小時后死亡蟲數(shù)的情況。由表四死亡率的結(jié)果可以得知蘇云金芽孢桿菌A603相對于市售商品殊立菌(Dipel)，具有較佳的抗粉斑螟幼蟲能力。9表四、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)物對于抗粉斑螟的活性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例五茶小巻葉蛾(Adoxophyessp.)試驗處理方式同實(shí)施例一。將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法分別測試處理茶小巻葉蛾第三齡初幼蟲連續(xù)120小時(每個濃度十只幼蟲，每個濃度三重復(fù)，不更換飼料連續(xù)觀察)，記錄死亡蟲數(shù)的情況后，計算幼蟲死亡率。由表五死亡率的結(jié)果可以得知蘇云金芽孢桿菌A603于144小時后，即使于低處理濃度下，也可達(dá)到50%的抗茶小巻葉蛾幼蟲的能力。表五、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)物對于抗茶小巻葉蛾的活性數(shù)據(jù)_處理后不同時間的死亡率(％)處理濃度(ppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例六小菜蛾(Plutellaxylostella)試驗處理方式同實(shí)施例一。將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法分別測試處理小菜蛾第三齡初幼蟲連續(xù)72小時(每個濃度十只幼蟲，每個濃度五重復(fù)，更換飼料連續(xù)觀察)，分別記錄其72小時后死亡蟲數(shù)的情況后，計算幼蟲死亡率。由表六死亡率的結(jié)果得知蘇云金芽孢桿菌A603確實(shí)具有抗小菜蛾幼蟲的能力。表六、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵培養(yǎng)物對于抗小菜蛾的活性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例七粉紋夜蛾(Trichoplusiani)試驗處理方式同實(shí)施例一。將不同稀釋濃度的發(fā)酵培養(yǎng)物以飼料混拌法分別測試處理粉紋夜蛾第二齡初幼蟲連續(xù)72小時(每個濃度十只幼蟲，每個濃度五重復(fù)，更換飼料連續(xù)觀察)，分別記錄其72小時后死亡蟲數(shù)的情況。由表七死亡率的結(jié)果得知蘇云金芽孢桿菌A603于不同濃度的處理下，其相對于市售商品見達(dá)立(Xentari)和殊立菌(Dipel)具有較佳的抗粉紋夜蛾幼蟲的能力。表七、蘇云金芽孢桿菌A603發(fā)酵干物對于抗粉紋夜蛾的活性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明所分離純化的蘇云金芽孢桿菌A603確實(shí)為新穎的蘇云金芽孢桿菌菌株，其含有crylAa、crylAb、crylC、crylD、crylF以及crylAdl等內(nèi)毒素基因片段。并且，本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌菌株A603能夠抗甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、豆野螟、粉斑螟、茶小巻葉蛾、小菜蛾以及粉紋夜蛾等害蟲的能力。以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。故凡依本發(fā)明申請專利范圍所述的形狀、構(gòu)造、特征及精神所做的均等變化或修飾，均應(yīng)包括于本發(fā)明的申請專利范圍內(nèi)。序列表〈110〉行政院農(nóng)業(yè)委員會農(nóng)業(yè)藥物毒物試驗所〈120〉抗害蟲的新穎蘇云金芽孢桿菌菌株〈160>13〈210>1〈212>DNA0116]〈213〉人工0117]〈220〉0118]〈223〉cryl基因的特異性序列0119]〈400>10120]atcactgagtcgcttcgcatgtttgact0121]〈210>20122]〈211>280123]〈212>DNA0124]〈213〉人工0125]〈220〉0126]〈223〉crylAa基因的特異性序列0127]〈400>20128]gagcc朋gc3gctgg3gcagtttecacc0129]〈210>30130]〈211>220131]〈212>DNA0132]〈213〉人工0133]〈220〉0134]〈223〉crylAc基因的特異性序列0135]〈400>30136]tcacttcccatcgacatctacc0137]〈210>4:0138]〈211>27:0139]〈212>DNA:0140]〈213〉人工:0141]〈220〉:0142]〈223〉crylB基因的特異性序列:0143]〈400>4:0144]gtcaaccttatgagtcacctgggcttc:0145]〈210>5:0146]〈211〉23:0147]<212>DNA:0148]〈213〉人工:0149]〈220〉:0150]〈223〉crylC基因的特異性序列:0151]〈400>5:0152]caacctctatttggtgcaggttc〈210〉6<211>25〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylD基因的特異性序列〈400>6ggtacatttagatattcacagccac〈210>7<211>22〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylE基因的特異性序列〈400>7cttagggata朋tgtegtecag〈210>8<211>25〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylF基因的特異性序列〈400>8ccggtgacccattaacattccaatc〈210>9<211>29〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylAb基因的正向特異性序列〈400>9ggtcgtggctatatccttcgtgtcacagc〈210>10〈211>23〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylAb基因的反向特異性序列〈400>1012/14頁0192:0193:0194:0195:0196:0197:0198:0199:0200:0201:0202:0203:0204:0205:0206:0207'gaattgctttcataggctccgtc〈210>11〈211>29〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylAb基因的全長正向特異性序列〈400>11ttaacaccctggatccaaaattgatattt〈210>12〈211>37〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉crylAb基因的全長反向特異性序列〈400>12tttgcatgcatatattattcctccataaga〈210>13〈211>3704〈212>DNA〈213〉蘇云金芽孢桿菌〈220〉〈223〉crylAdl基因的全長序列〈400>13ttaacaccctggatcc朋33ttgatatttagte^ttcggttgcactttg50tgtatattttC3t朋g3tg3gtcatatgtattaaactgtg100gc朋categt3t朋g朋Cttttgtatttcagaggtatttt1503tgg3gat朋tg朋t朋tC3g^tc^tgcgttccttataactgtttgaa200tgatccgacateg^ggagaactggttaca250ccccaatagatatttccttgtcgctaacgcaatttctgttgagtg^ttt300gtcccacgtgctgggtttgtattaggtttatatgggggtt350tgtgggtccctctcaatgggatgcatttcttgtgcaaatt400tt朋CC333gttcgctaggattctagatta450g朋gggct朋gcaacctttatcaaatttactteg卿gtg500gg朋gC3g3tcctactaatccagcattaac3g^gagatgcgtattcagt550tcaatgacatg朋cagtgctcttacaaccgctattcctctttttacagtt600aagtacctcttctatcagtatatgttcaagctgcaaattt650acatttatcggttttg卿gatgtttcagtcgttggggat700ttgatgtagcagtcgttataatgatttaactaggcttatt75014ggcacctatacagattatgctgtecgctgg■tgtetggggaccggattctag卿ttgggt850gagagcteacactaactgtattagatatcgtttctctgttcccgaactat■cgtatccaattcgaacagtttcccaattaa950ccagtattagtggtagttttCgtgg33tgg1000ctcagag^tcacatcttatggatctcctt1050ccatttatactgatgtgcatattattggtc1100ataacagcttctcctgtcggttttgcggggccagaattta1150cttttcctagatggg^atgctgctccacccgtactgatc1200tcaactactggtttggggatttttagaacattatcttcacctctttacag1250cttggttcaggccca^teatcagaacctgtttgtccttg1300attttcttttgcctccctaacagccgatttaccttctact1350■agggg^cggtcgattcataccgccaca1400gtgccagcacgtgcgggatttagtcatcgattaagtcatg1450ttacaatgctgagcc^gcagctggagcagtttacaccttgagagctcca1500acgttttcttggcgacatcgttctctaacctaattccttc1550atcacaaatcctttaacaaagtctattaatcttggctctg1600ggacctctgtccaggatttatattcttcga1650agaacttcacctggccagatttcaaccttaagagtgactettactgcacc1700attatcacaaagatetcgcgctacgcttct1750tacaattccatacatcaattg3Cgg33g3Cctattaatcagggg^tttt1800tcagcaactatgagtegtgggggteattteC3gtCCgg33gctttaggac1850tgcaggttttactactccgtttaacttttc■atggatca1900cgttaagtgctcatgtcttc■ttcaggca1950attgaatttgttccggcagaagtaacattt2000■gagcgc^g鄉(xiāng)cggtgaatgctctgtttacttcttcc2050■atgtgacggactatcatattgatcaagtgtccaatcta2100gtcgaatgtttatccggtgaattctgtctggatg^^ga2150cgag^agtc■acatgcga3gCg3CtC3gtgatgagcggaatttacttc2200■gaccc^acttcagaggc■ccagaccgtggctgg卿2250ggcagtecggatattaccatCC33gg3gg32300ttacgtcacactaccgggtacctttaatgagtgttatcctacgtatctgt2350卿tgagtcgcctatacccgttaccaatta2400tcaagacttagaaatctatttaattcgcta2450C3Cg^3C3gtaaatgtgcc鄉(xiāng)tecgggttccttatggc2500cgctttcagtcg^^tccaattgga^gtgCgg3g33CC■atcgatgc2550gC3CC3C^Cttg^tgg^tcctgatctagattgttcctgcag卿cgg2600gcacatcactcccatcatttctccttggacattgatattg2650■ctteggtgtetgggtgat2700atggtcacgcttctcgaaga2750gteggcg^tcgttagcacggcgg卿卿28003gtgg卿g3C^3Cg3g3gtatcgtttat2850^g^tctgtagatgctttatttgtgaactctcaatatga2900gcggateccgacatcgcgatgattcatgcggcagate^c2950gcgttcatcggcatatcttccagagttatctgtaattccg3000ggtgtc朋tgcgggcattttttttcacagc3050ctactctttagatttcaata3100atggcttatcgtg3卿ggC3150gttcggttcttgttgtcccgg^tggg卿c卿ggtgtc32003C33g3ggttcgtgtctgtccaggtcgtggctatatcctacgtgttacag3250gggatetggag卿gttgcgtaacgattca3300acg^ctg^attcagcaactgtgt卿ag3350acggteacgttactgcaaat3400acgggggtgcgtacacttctcgtaatcgtgatcttatgaa3450agtaattcttccataccagctgagtetgcgccagtttatg3500atccttgtgaggatetgggg3550attacacgccactaccagctggttetgtgaagagtacttc3600CC3g^3CCggattgagatcgggga咖gg3650catcgtggatagcgtgg^ttacttcttatggagg^teatatatgcatg3700370權(quán)利要求一種抗害蟲的蘇云金芽孢桿菌菌株，其具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D及cry1F基因片段。2.如權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其還包含crylAdl基因。3.如權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該害蟲為鱗翅目的昆蟲，該鱗翅目選自夜蛾科、螟蛾科、巻葉蛾科以及菜蛾科所組成組的其中之一。4.如權(quán)利要求3所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該夜蛾科的昆蟲包括甜菜夜蛾、斜紋夜蛾及粉紋夜蛾。5如權(quán)利要求3所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該螟蛾科的昆蟲包括豆野螟及粉斑螟。6.如權(quán)利要求3所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該巻葉蛾科的昆蟲包括茶小巻葉蛾。7.如權(quán)利要求3所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該菜蛾科的昆蟲包括小菜蛾。8.—種用于控制害蟲的組合物，其包含殺蟲有效量的內(nèi)毒素以及可接受的載體，該內(nèi)毒素得自具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF基因片段的蘇云金芽孢桿菌菌株。9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)一步包含crylAdl基因。10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中該內(nèi)毒素為S-內(nèi)毒素。11.一種控制害蟲的方法，其包括下列步驟對受害蟲侵襲區(qū)域與預(yù)防害蟲寄生區(qū)域的其中之一施加有效量的蘇云金芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)物，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF基因片段。12.—種分離的蘇云金芽孢桿菌菌株，其生物材料樣品保藏編號為DSM21764。13.如權(quán)利要求12所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該蘇云金芽孢桿菌菌株用于控制害蟲、制備抗蟲害或控制害蟲的代謝物、制備抗蟲害的組合物其中之一。14.如權(quán)利要求13所述的蘇云金芽孢桿菌菌株，其中該代謝物為內(nèi)毒素。全文摘要本發(fā)明提供一種抗害蟲的新穎蘇云金桿菌菌株，其具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF的基因片段。并且，本發(fā)明還提供一種應(yīng)用該菌株控制害蟲的方法與一種包含該菌株培養(yǎng)物與可接受載體的組合物。文檔編號C12R1/07GK101768558SQ200810189500公開日2010年7月7日申請日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者曾經(jīng)洲,高穗生申請人:行政院農(nóng)業(yè)委員會農(nóng)業(yè)藥物毒物試驗所