專利名稱：：一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，涉及一種編碼高溫強堿下具有木聚糖酶活性的改良基因、含有該改良基因的載體、基因工程菌株，該基因的制備和表達方法和菌株的制備方法。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶[EC.3.1.2.8]以內(nèi)切方式水解木聚糖分子中e-1.4-糖苷鍵，其水解產(chǎn)物主要是木二糖和木寡糖，在紙漿造紙、動物飼料、食品工業(yè)和能源工業(yè)具有很大的應(yīng)用前景。木聚糖酶在造紙工業(yè)中可作為紙漿漂白助劑，不僅可以提高紙張的白度和強度，更可以減少傳統(tǒng)漂白劑氯化物和次氯化物的排放，大大減少環(huán)境污染；在動物飼料中加入木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高非反芻類動物對飼料的利用率；木聚糖酶能分解制備酒類和飲料的原料中所含有的一些非淀粉類多糖物質(zhì)，達到澄清飲料和酒類的目的；木聚糖酶用于加工面包食品時，可以分解部分麩質(zhì)物質(zhì)，改變面包的松軟度，大大提高口感；同時，木聚糖酶分解木聚糖所產(chǎn)生的低聚木糖是很有效的雙歧因子，在人體的大腸中可以促進雙歧桿菌等益生菌的增殖，調(diào)整菌群平衡，改善腸道功能，抑制腸道腐敗，降低血脂膽固醇，增強機體的免疫功能。目前人們已經(jīng)從真菌、放線菌、細菌等多種微生物中分離克隆了大量木聚糖酶的編碼基因。這些天然來源的木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度大多在50-60。C左右，最適反應(yīng)pH值大多在4.0-6.O(劉亮偉eta丄，河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,Vol6，14-18)，其酶學(xué)特性往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的需要。例如在紙漿和造紙工業(yè)中，要求木聚糖酶在較高的溫度(60-65°C)和較高的pH值(10-11)下對木材進行處理(PickersgillR.W.eta丄，Proteins，1997，Vol29，77-86),這就對木聚糖酶的物理化學(xué)的穩(wěn)定性提出了更高的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是獲得一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因。本發(fā)明的第二個目的是獲得表達上述木聚糖酶改良基因的基因工程菌株。本發(fā)明的第三個目的是提供上述木聚糖酶改良基因和菌株的制備方法。本發(fā)明利用分子定向進化技術(shù)獲得了一種木聚糖酶改良基因(Xyn-CDBFV-G201C)，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其核苷酸編碼序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明獲得了一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因。作為改良基礎(chǔ)的木聚糖酶C(Xyn-CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)來源于牛瘤胃真菌(psWcisr咖)(Xiu"s丄，Can.J.Microbiol.1999,Vol45,970-974)，該木聚糖酶基因最適反應(yīng)溫度是62X,最適反應(yīng)pH值6.0(Chen"s丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)。本發(fā)明將原木聚糖酶(Xyn-CDBFV)的601位的核苷酸由鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?，相?yīng)的，201位的氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼?。分子動力學(xué)模擬以及定點突變實驗結(jié)果均顯示出在改良木聚糖酶中，201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵(見圖1和2)，該二硫鍵導(dǎo)致改良木聚糖酶熱穩(wěn)定性較原始木聚糖酶高。本發(fā)明提供了一種含有上述木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的質(zhì)粒。該質(zhì)粒可以是原核或者真核質(zhì)粒。將含有本發(fā)明的木聚糖酶改良基因編碼序列通過常規(guī)方法克隆至載體的多克隆位點，即可形成重組載體質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)粒可以是原核質(zhì)粒，例如大腸桿菌表達質(zhì)粒，例如PET21a，PET30a等。該質(zhì)粒也可以是真核表達質(zhì)粒，例如酵母表達質(zhì)粒。例如，該質(zhì)?？梢允钱叧嗍辖湍副磉_質(zhì)粒。比如pPIC9k,pPIC9等。本發(fā)明還提供了一種含有上述表達質(zhì)粒的酵母基因工程菌株。該菌株可以采用畢赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等，用電轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法將含有本發(fā)明的木聚糖酶改良基因編碼序列導(dǎo)入酵母菌株，通過篩選可以獲得含有目的基因的菌株。該菌株在搖瓶中發(fā)酵、分泌表達木聚糖酶，表達水平可以達到5000-10000U/ml。本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶改良基因的制備方法，即以Xyn-CDBFV基因為模板，將其核苷酸編碼序列第601位由鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?。也可以以Xyn-CDBFV基因為模板，進行隨機突變，通過篩選較高溫度(65-80°C)條件下，耐受性最佳即殘余活性最高的突變體而得。本發(fā)明還提供了基因工程菌株的制備方法，木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌即可。該菌株可以采用畢赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等。轉(zhuǎn)化可以采用常規(guī)方法，如電轉(zhuǎn)化等。本發(fā)明的實施例中，通過常規(guī)基因克隆技術(shù)將該改良木聚糖酶基因克隆至畢赤氏酵母表達載體pPIC9k(也可以是pPIC9)中，獲得含有該改良木聚糖酶基因的重組畢赤氏酵母表達質(zhì)粒和重組畢赤氏酵母工程菌株。該重組畢赤氏酵母表達質(zhì)粒為pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C，重組畢赤氏酵母工程菌株是含有pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C質(zhì)粒的GS115工程菌株。本發(fā)明獲得了一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因。改良后的木聚糖酶較原木聚糖酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在75。C處理10min后，原始木聚糖酶的殘余相對活性為15%左右，而改良木聚糖酶達到了80%。同時，改良木聚糖酶在高溫強堿的環(huán)境下的酶活是原木聚糖酶的1.5-2倍，并能在高溫下長時間分解木聚糖。本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶改良基因的表達質(zhì)粒及其酵母基因工程菌株。該工程菌株的表達產(chǎn)物分泌到胞外，有利于木聚糖酶的提取。本發(fā)明的木聚糖酶改良基因能夠在紙漿造紙、動物飼料、食品工業(yè)和能源工業(yè)中，更好的滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。圖1是木聚糖酶及其突變體經(jīng)DTT處理后殘余活性比較圖。"+"為DTT(二硫蘇糖醇，是一種還原劑，可以打開蛋白中存在的二硫鍵)存在情況，"-"為不使用DTT。圖中殘余相對活性代表了75。C處理10min后與處理前的比值，即以未進行熱處理的酶測得的活性作為100%。該圖表明，G201C突變體可以大大增加殘余相對活性。由圖判斷，改良的木聚糖酶201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵，而不是201與60位半胱氨酸形成二硫鍵，也不是50與60位半胱氨酸形成二硫鍵。其中，C60A即原始木聚糖酶氨基酸序列60位的半胱氨酸變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w蛋白；G201C是原始木聚糖酶氨基酸序列201位的甘氨酸變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔凅w蛋白，即本發(fā)明的改良木聚糖酶；C60A-G201C是原始木聚糖酶氨基酸序列60位的半胱氨酸變?yōu)楸彼岵⑶?01位的甘氨酸變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔凅w蛋白。圖2是三個可能存在的蛋白模擬結(jié)構(gòu)與各自模擬的初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)比較結(jié)果圖。條件為60°C。該圖顯示，201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵的蛋白模型的模擬結(jié)構(gòu)與其初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差值最小，表明該模型的結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。橫坐標為時間，以ps(即10—e秒)為單位。50ss201表示50位和201位半胱氨酸形成二硫鍵，其它的依次類推。圖3:在pH4.0的50mM檸檬酸緩沖液中，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67T測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以77"C測得的酶活作為100%。圖4:在pH5.0的50mM擰檬酸緩沖液中，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以67X測得的酶活作為100%。圖5:在pH6.0的50mM檸檬酸緩沖液中，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以62X測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%。圖6:在pH4.0的50mM檸檬酸緩沖液中，畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67°C測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以67T測得的酶活作為100%。后綴Y表示酵母畢赤氏分泌表達的蛋白。圖7:在pH5.0的50mM擰檬酸緩沖液中，畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以72T測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以77。C測得的酶活作為100%。后綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖8:在pH6.0的50mM檸檬酸緩沖液中，畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以72。C測得的酶活作為100%。后綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖9:60。C，在不同pH值環(huán)境中，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以在pH5.2的檸檬酸緩沖液中測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以在pH5.2的檸檬酸緩沖液中測得的酶活作為100%。圖10:65。C，不同pH值環(huán)境中，畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)的相對活性的比較結(jié)果圖。以各自最高的酶活作為100%,原始木聚糖酶以在pH6.2的磷酸鈉緩沖液中測得的酶活作為100。i，改良木聚糖酶以在pH6.2的磷酸鈉緩沖液中測得的酶活作為100%。后綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖11:75°C，在pH5.0的50mM檸檬酸緩沖液中，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)持續(xù)分解木聚糖能力的比較結(jié)果圖。以最初5分鐘所產(chǎn)生的產(chǎn)物量作為100%。圖12:80°C，在pH5.0的50mM檸檬酸緩沖液中，畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)持續(xù)分解木聚糖能力的比較結(jié)果圖。以最初5分鐘所產(chǎn)生的產(chǎn)物量作為100%。后綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。具體實施例方式所用實驗材料和相關(guān)操作方法如下(未詳述處可以參考冷泉港實驗室的《分子克隆》)1:菌株，載體和基因大腸桿菌菌株E.coliB121(DE3)和ToplO，質(zhì)粒PET21a，酵母菌株P(guān)ichiapastroisGS115,酵母表達載體pPIC9k，木聚糖酶基因(Xyn—CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)(Cheneta丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)均為本室保存，與現(xiàn)有文獻中相應(yīng)物質(zhì)的性質(zhì)相同。2:酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶，連接酶購自TaKaRa公司，隨機突變PCR試劑盒GeneMorphII購自Stratagene公司，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自博大公司(上海)。3:培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%Polyp印tone，1%NaCl,0.5%YeastExtract,pH7.0，氨芐選擇性的培養(yǎng)基中Ampicillin終濃度為100fig/mL，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂)，酵母完全培養(yǎng)基為YEPD(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，2%Glucose,固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂)，酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為MD(1.34%YNB，2%Glucose,0.4mg/L生物素，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂)酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甘油)和BMMY(1°/。YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34YNB,0.4mg/L生物素，0.5%甲醇)4:生化試劑引物購自Invitrogen公司，IPTG購自Sigma公司，TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺以及甲叉雙丙烯酰胺購自Premega公司，DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑(甲液溶解6.9克結(jié)晶酚于15.2ml10MNa0H中，用蒸餾水稀釋至69ml，再加入6.9克NaHS03;乙液255克酒石酸鉀鈉加至300ml10%Na0H中，再加入880ml1%3，5-二硝基水楊酸溶液；將甲液與乙液相混合即得到黃色DNS試劑，儲于棕色瓶中，在室溫下放置7-10天后使用)5:酶蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)的表達及純化將含有酶基因的PET21a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，涂布于LA平板，37X倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，用牙簽挑取一個單克隆轉(zhuǎn)化子接種至3mlLA(LB培養(yǎng)液+100^g/ml氨節(jié)霉素)培養(yǎng)液中，37°C,220rpm培養(yǎng)過夜，次日取0.5ml過夜菌至50mlLA+1%Glucose中，37°C，220rpm培養(yǎng),當菌密度(OD.600)達到0.4-0.6，加入終濃度為0.lmM的IPTG，22度，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)10小時。離心收集菌體，用pH7.4,50mMTris-HC1重懸菌體，超聲破碎大腸桿菌細胞，高速離心收集上清，Ni-NTA柱結(jié)合C端含有6*His標簽的酶蛋白，用梯度濃度的咪唑洗脫結(jié)合在Ni-NTA柱上的酶蛋白。實施例l通過定向進化技術(shù)獲得改良木聚糖酶基因設(shè)計PCR引物XynFl和XynRl如下XynFl:GGCGGATCCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，下劃線的序列為BamHI酶切識別序列)，即SEQIDNO3。XynRl:GCGGCGGCCGCATCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，下劃線的序列為NotI酶切識別序列，不含終止密碼子，利用載體上的終止密碼子終止表達)，即SEQIDNO4。以Xyn-CDBFV基因為模板，以上述引物用GeneMorphII隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產(chǎn)物，BamHI和Notl進行酶切處理后與經(jīng)過同樣酶切后的PET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布于LA平板(LB培養(yǎng)基+100Pg/ml氨芐霉素)，37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個挑至96孔平板的每個小孔中(其中有一個小孔挑入含有原始木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)化子)，每個小孔里加入150ul含有0.lmMIPTG的LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基+100l^g/ml氨芐霉素)，將平板于22。C,220rpm培養(yǎng)至菌密度(OD.600)達到1.0左右，離心去除上清液，用100ulpH5.0的50mM檸檬酸緩沖液重懸菌體，反復(fù)凍融，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細胞裂解液。分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔平板，其中一塊平板于75度處理10分鐘后，兩塊平板都加入30ul的2%的木聚糖溶液，于60X反應(yīng)10分鐘后，DNS法(Miller,G丄，Anal.Chem.1995，Vol31，426-428)測定生成的還原糖，對高溫處理后依然保持高活性的突變子進行DNA測序分析，獲得一株熱穩(wěn)定性高(75。C處理10min后，殘余酶活為80%，而原酶僅為15%)，但酶活卻沒有降低的改良木聚糖酶基因，即Xyn-CDBFV-G201C。該改良木聚糖酶與原木聚糖酶相比，存在一個核苷酸的差異，其601位的鳥嘌呤變?yōu)樾叵汆奏?，與之相對應(yīng)，其編碼氨基酸由原來201位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼?。實施?:改良木聚糖酶中201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵改良的木聚糖酶熱穩(wěn)定性的提高的原因是由于201位與50位半胱氨酸形成了一個新的二硫鍵。改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在SWISS-MODEL(http:〃swissmode1.expasy.org/)進行了同源建模，可以看到50，60和201位的半胱氨酸在空間上相互接近，彼此都有可能形成二硫鍵，但201位與50位半胱氨酸的空間位置使它們更容易形成二硫鍵，于是對原始和改良木聚糖酶進行了定點突變，將60位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷⒃己透牧寄揪厶敲富蛞约八鼈兊腃60A突變體基因分別克隆至PET21a中，大腸桿菌重組表達制備了這四種酶蛋白。DTT是還原劑，能夠打開這些酶蛋白中可能存在的二硫鍵。首先在不含DTT的pH5.0的檸檬酸緩沖液對這四種蛋白進行熱穩(wěn)定試驗(75度處理10min)，原始木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩(wěn)定性是一致的，殘余活性均為15%，同時改良木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩(wěn)定性也是一致的，殘余活性均為80%;其次在含有2mMDTT的pH5.0的檸檬酸緩沖液對這四種蛋白進行熱穩(wěn)定試驗，原始木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩(wěn)定性在DTT存在的情況下并沒有發(fā)生變化；而改良木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩(wěn)定性在DTT存在的情況下發(fā)生了明顯的降低，殘余活性均從80%下降到了50%(圖1)，由此可以推斷，在原始木聚糖酶中沒有二硫鍵，而在改良木聚糖酶中，201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵，而不是201與60位半胱氨酸形成二硫鍵，也不是50與60位半胱氨酸形成二硫鍵。另一方面，利用了分子動力學(xué)模擬間接證明201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵。201，50，60位的半胱氨酸彼此有可能形成二硫鍵，于是建立了三個蛋白模型，50與201位半胱氨酸形成二硫鍵(50ss201)，50與60位半胱氨酸形成二硫鍵(50ss60)，60與201位半胱氨酸形成二硫鍵(60ss201)，利用namd2程序?qū)@三個蛋白結(jié)構(gòu)在一個大氣壓單位下，60°C進行分子動力學(xué)模擬。將蛋白結(jié)構(gòu)放入一個邊長為10埃的水盒子中，離子濃度為50mM,cut-off距離為8埃，particle-meshEwald(PME)處理的周期邊界條件計算長距離電磁作用，CHARMM27力場，SHAKE運算法則限制包括氫鍵的共價鍵，Timest印為lfs，模擬時間為7ns，每5ps記錄蛋白結(jié)構(gòu)。模擬結(jié)束后，進行均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)的計算，均方根偏差的含義是比較兩個結(jié)構(gòu)的差異，均方根偏差越小，表明兩個結(jié)構(gòu)越相近。計算均方根偏差的對比結(jié)構(gòu)是三個蛋白模型結(jié)構(gòu)動力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)，由圖2可以看到，在7ns的模擬過程中，50ss201與初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差在三個可能存在二硫鍵的蛋白模型中是最小的，表明這個結(jié)構(gòu)是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，也是實際上最有可能存在的結(jié)構(gòu)。實施例3含有改良基因的重組酵母表達載體的構(gòu)建以及重組酵母基因工程菌株的獲得用于構(gòu)建酵母表達載體的質(zhì)粒是pPIC9K(帶有alpha因子分泌信號)，設(shè)計PCR引物XynF2和XynR2如下XynF2:GGCGAATTCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，劃線的序列為EcoRI酶切識別序列)，即SEQIDNO5。XynR2:GCGGCGGCCGC[^VTCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，劃線的序列為Notl酶切識別序列，方框內(nèi)的序列為終止密碼子)，即SEQIDNO6。以PET21a-Xyn-CDBFV-G201C質(zhì)粒DNA為模版，利用高保真Pfu聚合酶擴增出Xyn-CDBFV-G201C片段，克隆至pPIC9k，形成重組質(zhì)粒pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C,酶基因在A0X1啟動子下游。用同樣的方法獲得重組質(zhì)粒pPIC9k-Xyn-CDBFV。過量的pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C質(zhì)粒DNA經(jīng)BglII酶切，乙醇沉淀后，70%乙醇洗兩次，冷凍干燥后用無菌水溶解DNA，取2-3化DNA電擊轉(zhuǎn)化至畢赤氏酵母GS115中，涂布于MD平板，30X倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。受體菌GS115是組氨酸缺陷型，目的基因通過體內(nèi)同源重組將整合至酵母基因組中，重組轉(zhuǎn)化子能在不含His的MD平板上生長。用牙簽從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子劃線至含有3mg/ml的G418的YETO平板，只有目的基因高拷貝重組的轉(zhuǎn)化子能在高濃度G418下生長。挑取生長良好的重組轉(zhuǎn)化子在以甘油為碳源的培養(yǎng)基(BMGY)中，30T搖瓶培養(yǎng)至細胞密度(0.D.600)達到20，離心后棄上清，酵母細胞再轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(BMMY)(甲醇終濃度0.5%)中30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)72個小時，在外源甲醇的誘導(dǎo)下，A0X1啟動子可以啟動下游基因的表達，并且信號肽可以指導(dǎo)表達產(chǎn)物分泌至酵母細胞胞外，SDS-PAGE檢測發(fā)酵上清液，從300株重組酵母中初步篩選到28株表達木聚糖酶的重組轉(zhuǎn)化子，其中表達量最高的一株重組酵母基因工程菌株，定義為GS115/Xyn-CDBFV-G201C，按照同樣方法獲得含有原始木聚糖酶基因的重組酵母基因工程菌株，定義為GS115/Xyn-CDBFV。實施例4:改良木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析對改良和原始木聚糖酶進行酶學(xué)性質(zhì)的比較研究，其中包括酶的比活，最適反應(yīng)溫度，最適反應(yīng)pH值，持續(xù)分解木聚糖酶的能力以及酶動力學(xué)性質(zhì)。酶活測定方法如下100ul相應(yīng)pH緩沖液稀釋的酶液與100ul2%的木聚糖溶液混合，于相應(yīng)的溫度反應(yīng)10min后，加入DNS顯色液，100度沸水浴顯色10min，570nm分光光度計測定吸光度，以D-木糖作為標準物，通過測定酶促反應(yīng)所生成的還原性木糖來定量的計算酶活性。木聚糖酶活性單位(U)定義為在一定條件下，lmg(或lml發(fā)酵液)木聚糖酶每分鐘能分解木聚糖產(chǎn)生lumol的木糖。(李彩霞Wa丄，紙和造紙，2001，Vol1,60-61)以下所用原始木聚糖酶和改良木聚糖酶分別采用統(tǒng)一的發(fā)酵液。(1)改良木聚糖酶在高溫下具有更高的活性。在pH4.0、5.0、6.050mM檸檬酸緩沖液中，測定42，47，52，57,62，67，72，77，82，87T中改良和原始木聚糖酶的酶活。結(jié)果見圖3-5(大腸桿菌重組表達制備的酶蛋白)和圖6-8(畢赤氏酵母重組表達制備的酶蛋白)，在三個pH值的緩沖液中，改良木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度提高了0-10度，在低于最適反應(yīng)溫度的低溫中，兩種木聚糖酶的酶活是一致的，而在高于最適反應(yīng)溫度的高溫中，改良木聚糖酶的酶活是原始木聚糖酶1.5-2倍。在pH6.0下，大腸桿菌重組表達制備的原始木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為62°C，酶比活為3729U/mg，而改良木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為67。C，酶比活為5004U/mg，在72X中，原木聚糖酶的酶比活下降到1948U/mg，而改良木聚糖酶只下降到4446U/mg;畢赤氏酵母重組表達制備的原始木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度是67"C，比活為6872U/ml發(fā)酵液；而改良木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度是72。C，比活為9282U7ml發(fā)酵液，在77°C中，原始木聚糖酶的酶比活為3335U/ml發(fā)酵液，而改良木聚糖酶的酶比活達到了6802U/ml發(fā)酵液。由此可見，改良木聚糖酶在高溫下具有更高的活性。(2)改良木聚糖酶在強堿下具有更高的活性在65T，在3種不同pH范圍的緩沖體系(pH4.3-6.25為50mM檸檬酸緩沖液，pH5.8-7.81為50mM的磷酸鈉緩沖液，pH7.31-9.19為50mMTris-Hcl緩沖液)中測定改良和原始木聚糖酶的酶活。結(jié)果見圖9(大腸桿菌重組表達制備的酶蛋白)和圖10(畢赤氏酵母重組表達制備的酶蛋白)，兩種木聚糖酶的最適pH值是一致的，大腸桿菌重組表達制備的酶蛋白在5.2左右，畢赤氏酵母重組表達制備的酶蛋白在6.2左右。在pH4.3-6.2中，這兩種木聚糖酶的酶活是一致的，但在pH7-9.2中，改良木聚糖酶的酶活要大于原始木聚糖酶。在pH8.2的50mMTris-Hcl下，大腸桿菌重組表達制備的原木聚糖酶的酶活是最高酶活的34%，而改良木聚糖酶達到了48%;畢赤氏酵母重組表達制備的原木聚糖酶的酶活只是最高酶活的21%，而改良木聚糖酶達到了61%，由此可見，改良木聚糖酶在強堿下具有更高的活性。(3)改良木聚糖酶在高溫下能夠在較長時間內(nèi)持續(xù)分解木聚糖在75。C和80°C，pH5.0，50mM擰檬酸緩沖液中，測定5-60min內(nèi)改良和原始木聚糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖11(大腸桿菌重組表達制備的酶蛋白)和圖12(畢赤氏酵母重組表達制備的酶蛋白)。在75T下，大腸桿菌表達的改良木聚糖酶催化反應(yīng)40min后，產(chǎn)物量是5min反應(yīng)產(chǎn)物量的4倍，而原始木聚糖酶只有2倍；在8(TC下，畢赤氏酵母表達的改良木聚糖酶催化反應(yīng)35min后，產(chǎn)物量是5min反應(yīng)產(chǎn)物量的2.5倍，而原始木聚糖酶只有1.5倍，表明改良木聚糖酶能夠在35-40min內(nèi)持續(xù)分解木聚糖，而原始木聚糖酶的持續(xù)分解時間只有10min左右。(4)改良木聚糖酶的酶動力學(xué)常數(shù)在65°C，pH5.050mM檸檬酸緩沖液中，以木聚糖為底物，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法測定改良和原始木聚糖酶的i^和《^值，同時計算kcat/km值。結(jié)果見表1(大腸桿菌重組表達制備的酶蛋白)和表2(畢赤氏酵母重組表達制備的酶蛋白)。大腸桿菌重組表達制備的改良木聚糖酶和畢赤氏酵母重組表達制備的改良木聚糖酶的《/^值都為原木聚糖酶的1.5倍左右，表明改良木聚糖酶具有更高的催化效率。表1大腸桿菌表達制備的原始木聚糖酶和改良木聚糖酶的動力學(xué)常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序歹U表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>—種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株<130>51<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>675<212>DNA<213>人工合成<220><221>CDS<222>(1)…(675)<223><楊>1C33sgtGinSerttctgtagttcsgettctcacPheCysSerSerAlaSerHistctggacaaagtgtaaaggtaSerGlyGinSerValLysVal1015483ccggcThrGly33C33gAsn!Lys203ttggasetsttlieGlyThrlieggtGly25ggtGlygttValggtGlyt3CTyrgssttsGluLeu30tggT:rp96getgstagtggt33t33CagtgetaictttctsttctgatggttecttcAlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045144teatgtactttcess33tgetggggsttsctt3tgtcgtsgtggtcttSerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560192tctttcgatagtactaag3ccccatctcaaattggtcgtatgasggetSerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla657.07580240gatttc333cttgtcssscaa33tsgttecastgttggtt3ttectst288AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095gttggtValGlygtttacValTyr100ggtGlytggsetTrpThragaagtccaArgSerPro105cttgtcLeuValg33GlutscTyr110t3CTyr3ttlie336gtcgstValAsp33ttggAsnTrp115cttLeu3gtCC3SerProttcccaccsPheProPro120ggtgstGlyAsptggTrp125gttValggtGlyAsn38433g33gLysLys130catggtHisGlytctSerttcsetPheThr135attgatggtlieAspGlygetC33AlaGin140t3CTyrsetThrgttValTyr432g3333CGluAsn145setcgtThrArgsetThrggtCC3GlyPro150tct3ttgstSerlieAspggtgstGlyAsp1553CCThr3CCThrttcPhe33tAsn160480t3CGinTyrtttsgtPheSer3ttCgtC33lieArgGin165essgetcgtGinAlaArg170gattgtAspCysggtGlysecThratt工le175Asp5283tttctlieSergetC3CAlaHis180tttgatessPheAspGintgggassagcttggtstgset3tgggtTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly185190576333tt3LysLeucatgasHisGlu195gecsaggttAlaLysValttatgtgsagecggtsscgttsscggtLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly200205624ggtgecGlyAla210sgtggtSerGlysecgetgstThrAlaAsp215ttcccstacgc333ggtttscsttggtPheProTyrAlaLysValTyr工leGly220672gst675Asp225<210>2<211>225<212>PRT<213>人工合成<400>2GinSerPheCysSerSerAlaSerHisSerGlyGinSerValLysVal151015ThrGlyAsnLyslieGlyThrlieGlyGlyValGlyTyrGluLeuTrp202530AlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045SerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560SerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla65707580AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095ValGlyValTyrGlyTrpThrArgSerProLeuValGluTyrTyrlie100105110ValAspAsnTrpLeuSerProPheProProGlyAspTrpValGlyAsn115120125LysLysHisGlySerPheThrlieAspGlyAlaGinTyrThrValTyr130135140GluAsnThrArgThrGlyProSerlieAspGlyAspThrThrPheAsn145150155160GinTyrPheSerlieArgGinGinAlaArgAspCysGlyThrlieAsp165170175lieSerAlaHisPheAspGinTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly180185190LysLeuHisGluAlaLysValLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly195200205GlyAlaSerGlyThrAlaAspPheProTyrAlaLysValTyrlieGly210215220Asp225<210>3<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>3ggcggatccatgcsasgtttctgtsgttcsgcttctcsc<210>4<211>36<212>DNA<213>人工合成<400>4gcggcggccgc3tc3cc33tgtasscctttgcgtst<210>5<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>5ggcgaattcatgcaaagtttctgtagttcagcttctcac<210>6<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>6gcggcggccgctcsstcsccsaitgtssacctttgcgtst權(quán)利要求1.一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶改良基因，其特征在于，該木聚糖酶改良基因的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶改良基因，其特征在于，該木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列如SEQIDNOl所示。3.—種含有權(quán)利要求1或者2所述木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的質(zhì)粒。4.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒是原核或者真核表達質(zhì)粒。5.如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒是酵母表達質(zhì)粒。6.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒是畢赤氏酵母表達質(zhì)粒。7.—種含有權(quán)利要求5所述表達質(zhì)粒的酵母基因工程菌株。8.如權(quán)利要求7所述基因工程菌株，其特征在于，該菌株是畢赤氏酵母基因工程菌株。9.如權(quán)利要求1所述基因的制備方法，其特征在于，以Xyn-CDBFV基因為模板，將其核苷酸編碼序列第601位突變?yōu)樾叵汆奏ぁ?0.如權(quán)利要求7所述基因工程菌株的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌即可。全文摘要本發(fā)明提供了一種編碼高溫強堿下具有高活性的木聚糖酶的改良基因、其重組質(zhì)粒、含有該基因的重組酵母基因工程菌株及其制備方法。改良后的木聚糖酶和原始木聚糖酶相比，由原始木聚糖酶氨基酸序列的201位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼?。改良木聚糖酶較原始木聚糖酶具有更高的熱穩(wěn)定性，在75℃處理10分鐘后，改良木聚糖酶的殘余活性達到了80％，而原始木聚糖酶只有15％。改良木聚糖酶在高溫強堿的環(huán)境下的活性是原木聚糖酶活性的1.5-2倍，并能在高溫下長時間分解木聚糖。本發(fā)明還提供了含有該改良基因的重組畢赤氏酵母基因工程菌株。本發(fā)明的改良木聚糖酶可以廣泛應(yīng)用于造紙，飼料以及食品工業(yè)。文檔編號C12N1/19GK101392266SQ200810200060公開日2009年3月25日申請日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者紅呂,淳游,強黃申請人:復(fù)旦大學(xué);武漢新華揚生物有限責(zé)任公司