專利名稱：：源于鏈霉菌屬的環(huán)氧化物水解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可從鏈霉菌屬的細(xì)菌中分離到的改進(jìn)的環(huán)氧化物水解酶、一種環(huán)氧化物對映體混合物的新的酶促分離方法、環(huán)氧化物水解酶活性的新的檢測方法、檢測環(huán)氧化物水解酶活性的篩選方法和鏈霉菌屬的細(xì)菌及其產(chǎn)生的環(huán)氧化物水解酶用于進(jìn)行對映選擇性環(huán)氧化物水解的用途。
背景技術(shù)：
：尤其是在制藥和農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)中，對映純的化合物變得愈來愈重要，這就需要能夠可靠和經(jīng)濟(jì)地獲得光學(xué)活性物質(zhì)。已有幾種制備對映純的二醇和環(huán)氧化物的方法。在環(huán)氧化物的不對稱性化學(xué)合成過程中，合成起始于前手性化合物。通過利用手性試劑，例如手性過酸，手性二環(huán)氧乙烷或Oxaziridins或手性硼酸酯(鹽)、手性輔劑或手性的、金屬的或非金屬的催化劑，能夠生成手性環(huán)氧化物。合成手性環(huán)氧化物的最著名途徑是在有過渡金屬催化劑存在的條件下，鏈烯醇(Alkenolen)，例如烯丙醇與氫過氧化物的Sharpless環(huán)氧化反應(yīng)。通過生物化學(xué)途徑制備對映純二醇的方法也是已知的。具有環(huán)氧化物水解酶活性的微生物催化環(huán)氧化物的區(qū)域?qū)Ｒ恍院蛯τ硨Ｒ恍运夥磻?yīng)。它們裂解環(huán)氧化物中的乙醚鍵，從而形成二醇。能夠使寬范圍的外消旋環(huán)氧化物對映選擇性水解的幾種細(xì)菌菌林已有記載。然而，迄今為止已知的環(huán)氧化物水解酶的數(shù)量及其在有機(jī)合成中的應(yīng)用仍非常有限。具有環(huán)氧化物水解酶活性的已知菌林是，例如黑曲霉LCP521，sulfurescens桿菌ATCC7159，紅球菌NCIMB11216等。然而，具有環(huán)氧化物水解酶活性的已知菌株的底物范圍通常很有限并且反應(yīng)速率通常很低。并且，4吏用這些菌林所獲得的對映選擇性通常過低[Grogan,G.等，F(xiàn)EMSMicrobiologyLett.141(1996)，239-243;Kroutil，W.，等，四面體通訊(TetrahedronLett.)(1996)，8379-8382]。所述已知菌株很難進(jìn)行遺傳操作并且有些菌林很難進(jìn)行培養(yǎng)。因此，迄今為止，在重組形式的大腸桿菌中只獲得了兩種環(huán)氧化物水解酶[棒狀桿菌C12，(Misawa，E.等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，253(1998)，173-183)和放射形土壤桿菌ADl(Rink，R.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，272(1997)，14650-14657)]。即便是由微生物得到環(huán)氧化物水解酶的純化到目前為止也只記載了紅球菌NCIMB11216[Faber，K.等，生物技術(shù)通訊(BiotechnologyLett.)17(1995)，893-898]和NorcardiaEH1[Kroutil,W.，等，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)61(1998)，143-150]這兩種情況。這兩種情況下的純化是相當(dāng)復(fù)雜的。從棒狀桿菌C12富集環(huán)氧化物水解酶已在Misawa，E.等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，253(1998)，173-183中進(jìn)行了描述。另外，由于例如在一組微生物菌林中篩選(即系統(tǒng)實(shí)驗(yàn))產(chǎn)生新型環(huán)氧化物水解酶的微生物直到目前為止都需要花費(fèi)大量的時(shí)間，所以很難尋找到含有新型環(huán)氧化物水解酶的微生物。這是由于，篩選使用的是常規(guī)方法，在這些方法中必須對單個(gè)的被篩選物進(jìn)行處理并單個(gè)進(jìn)行氣相色譜或液相色譜分析。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供底物范圍拓寬了的和/或反應(yīng)性增強(qiáng)了的和/或?qū)τ尺x擇性提高了的新型環(huán)氧化物水解酶。另外，尤其是新型環(huán)氧化物水解酶應(yīng)能夠從容易培養(yǎng)的非致病生物體中分離到，而且，任選具有良好的分子生物學(xué)可接近性(ZugSnglichkeit)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種更快捷、更簡單地檢測環(huán)氧化物水解酶的方法，該方法應(yīng)還能改進(jìn)篩選產(chǎn)生環(huán)氧化物水解酶的微生物的方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種改進(jìn)的分離環(huán)氧化物對映體混合物的生物化學(xué)方法以及一種改進(jìn)的環(huán)氧化物對映選擇性反應(yīng)的方法，該方法能夠通過簡單的途徑獲得對映純的二醇和/或環(huán)氧化物。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供新的產(chǎn)生環(huán)氧化物水解酶的微生物。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過提供源自鏈霉菌屬微生物的環(huán)氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)能夠達(dá)到上述的第一個(gè)目的。至今沒有關(guān)于該菌屬微生物環(huán)氧化物水解酶活性的記載。與已知環(huán)氧化物水解酶比較，本發(fā)明的環(huán)氧化物水解酶至少具有一種下列有益特性-在裂解對映體環(huán)氧化物的反應(yīng)中，對映選擇性高；-底物范圍寬；-反應(yīng)性強(qiáng)-分子生物學(xué)可接近性高；-由于微生物容易培養(yǎng)，生物化學(xué)可接近性高。針對本發(fā)明的含義，"高對映選擇性"是指對于基本相同的轉(zhuǎn)化率，能夠獲得較高的對映體過量。針對本發(fā)明的含義，"拓寬的底物范圍"是指使多種環(huán)氧化物的外消旋混合物反應(yīng)。針對本發(fā)明的含義，"反應(yīng)性強(qiáng)，，是指以較高的時(shí)-空產(chǎn)率進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明特別涉及那些來源于鏈霉菌的環(huán)氧化物水解酶，該酶具有至少一種下列特性a)苯乙烯氧化物的環(huán)氧化物水解裂解，例如苯乙烯氧化物或其一種在苯環(huán)或環(huán)氧環(huán)上被單取代了的或多取代了的衍生物，尤其諸如一種在間位或?qū)ξ簧媳幌趸蜇账?，尤其被氯或溴單取代了的苯乙烯氧化物，以及其它至少一種選自下列物質(zhì)的化合物3-苯基-乙基縮水甘油酸酯、正己烷-l，2氧化物、正癸烷-l，2氧化物和茚氧化物，所述化合物可以任選被取代基單取代或多取代，所述取代基優(yōu)選按照上述所定義；b)按照下面給出的反應(yīng)式(A),具有對映選擇性E^2，例如210，例如從10至100的苯乙烯氧化物的外消旋物，轉(zhuǎn)化生成(S)-苯基-l，2-乙醇，其中該反應(yīng)可利用完整細(xì)胞或一種細(xì)胞勻漿或一種富集的或純化的酶制劑進(jìn)行，并且優(yōu)選地在有助溶劑，例如5至10%(v/v)DMS0，存在的條件下進(jìn)行。根據(jù)優(yōu)選的技術(shù)方案，所提供的環(huán)氧化物水解酶是能夠從鏈霉菌屬的細(xì)菌中分離到的環(huán)氧化物水解酶，尤其是從灰色鏈霉菌(S.griseus)菌種、熱普通鏈霉菌(S.themovulgaris)菌種、抗生鏈霉菌(S.antibioticus)菌種、沙場鏈霉菌(S.arenae)菌種和弗氏鏈霉菌(S.fradiae)菌種，優(yōu)選地是從灰色鏈霉菌的菌林(DSM40236和DSM13447)、熱普通鏈霉菌的菌林(DSM40444和DSM13448)、沙場鏈霉菌Tti495菌林(DSM40737和DSM12134)、抗生鏈霉菌Tti4菌林(DSM12925)或弗氏鏈霉菌Tii27菌林(DSM12131)中分離到的環(huán)氧化物水解酶。特別優(yōu)選的是從抗生鏈霉菌Tti4菌林(DSM12925)中分離到的環(huán)氧化物水解酶。這種酶的特征在于按照下面反應(yīng)式(A)，該酶將(R/S)苯乙烯氧化物(I)轉(zhuǎn)化為(S)-苯基-1，2-乙二醇(ni)和非水解的(R)-苯乙烯氧化物(II)的對映選擇性;f艮高。反應(yīng)式(A):(i>(ii)(in)因此該酶在含10%(v/v)加溶劑DMS0的反應(yīng)介質(zhì)中以E-13的對映選擇性和(II)的ee[9/。]=99以及(III)的ee=14的對映體過量催化上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)。在實(shí)施例中對該酶的分離進(jìn)行了更加詳盡的描述。除非另有說明，利用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法富集該酶，如T.G.Cooper在生物化學(xué)方法(BiochemischeArbeitsmethoden)，VerlagWalterdeGruyter，柏林，紐約，(1981)中描述的。合適的方法例如是純化方法如沉淀法，例如利用硫酸銨的沉淀法、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜如免疫親和色譜、等電聚焦以及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明還涉及一種被命名為抗生鏈霉菌Ttt4的新型鏈審菌菌林，該菌林被保藏在DSMZ,保藏號為DSM12925，以及該菌林的變異體和突變體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明制備的酶的功能類似物，如變異體、等位基因和突變體，所述類似物具有環(huán)氧化物水解酶活性而且優(yōu)選地具有至少一種上述的有益特性。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)通過提供一種檢測環(huán)氧化物水解酶地光學(xué)方法，能夠達(dá)到上述的第二個(gè)目的，所述光學(xué)方法包括以下步驟a)在反應(yīng)條件下，溫育估計(jì)有環(huán)氧化物水解酶活性的被分析物，例如微生物培養(yǎng)物，與一種該環(huán)氧化物水解酶的含環(huán)氧化物的底物；b)使未反應(yīng)的環(huán)氧化物與4-硝基千基吡啶(NBP)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成一種在560nm下具有吸光值的色素；和c)相對不含環(huán)氧化物水解酶對照液，分析由b)步驟得到的溶液的色素濃度的降低值。本發(fā)明的檢測方法可以進(jìn)行定性分析，例如作為點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)，或可以進(jìn)行定量分析。在定量分析方法中，首先定量測定色素濃度的相對降低值，例如通過測定在560nffl下的吸光值進(jìn)4亍光度測定，因而可以測定出被分析物中的環(huán)氧化物水解酶的活性。原則上合適的被分析物是微生物本身，例如來源于細(xì)菌新鮮的培養(yǎng)物、其細(xì)胞勻漿或這些細(xì)胞勻漿經(jīng)純化后的級分。優(yōu)選地，采用完整細(xì)胞或所述細(xì)胞經(jīng)消化后來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如利用超聲波或溶菌酶。例如，所述方法可用于檢測鏈霉菌屬細(xì)菌中的環(huán)氧化物水解酶。優(yōu)選地，所述檢測方法以這樣的方式進(jìn)行從微生物的新鮮培養(yǎng)物中取樣，裂解，除去細(xì)胞碎片并加入含有待測酶的底物的環(huán)氧化物并進(jìn)行混合。如果需要，通過常規(guī)方法，例如通過加入緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度等使得溶液中的反應(yīng)條件達(dá)到最佳化。優(yōu)選地，為了改進(jìn)環(huán)氧化物在含水反應(yīng)介質(zhì)中的溶解性，可以使用助溶劑。合適的助溶劑是，例如二曱亞砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，乙醇或丙酮。源于鏈霉菌的環(huán)氧化物水解酶的最佳反應(yīng)條件包括反應(yīng)介質(zhì)磷酸鈉緩沖液pH8.0，0.1M，10%(v/v)DMSOpH范圍6-8溫度30-37*C反應(yīng)時(shí)間2-20小時(shí)底物濃度0.1至0.8M優(yōu)選使用的底物是對映純形式的或?qū)τ丑w混合物形式的苯乙烯氧化物、3-苯基縮水甘油酸酯、己烷-l，2-氧化物、癸烷-1，2-氧化物和/或茚氧化物。為了進(jìn)行顏色反應(yīng)，通過緊接著加入堿，例如三乙胺，進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。然后以在甲氧乙醇中例如大約3至10%的濃度，優(yōu)選大約5%(w/v)的濃度加入NBP。作為形成色素的加溶劑，例如足量加入三甘醇二甲醚。最后在大約35至45X:的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在39X:下溫育所述溶液，然后在560nm下測定吸光值，優(yōu)選地在650nm下相對對照液進(jìn)行測定。與不含酶的對照液相比，可以定量地測出吸光值的降低值并由此定量地測出環(huán)氧化物的減少量。本發(fā)明還涉及檢測具有環(huán)氧化物水解酶活性和/或具有對映選摔性水解環(huán)氧化物能力的微生物的篩選方法，該方法包括上述檢測方法。這種方法尤其適合于對保藏菌株或突變體庫的環(huán)氧化物水解酶活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，所述突變體庫通過"定向演化(directedevolution)"產(chǎn)生。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)通過提供一種分離環(huán)氧化物對映體混合物的方法能夠達(dá)到上述第三個(gè)目的，所述分離方法包括a)在反應(yīng)條件下，將含有環(huán)氧化物水解酶底物的環(huán)氧化物對映體混合物與本發(fā)明的環(huán)氧化物水解酶、鏈霉菌屬的微生物、其含環(huán)氧化物水解酶的勻漿或該勻漿的級分一起進(jìn)行溫育；b)使對映體混合物發(fā)生反應(yīng)，優(yōu)選直到獲得50%的轉(zhuǎn)化率；和c)從轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中分離反應(yīng)產(chǎn)物中殘留的對映體并且純化基本對映純的反應(yīng)產(chǎn)物和/或基本對映純的原料。優(yōu)選地，將下列環(huán)氧化物的對映體混合物轉(zhuǎn)化苯乙烯氧化物、3-苯基-縮水甘油酸酯、己烷-l，2-氧化物、癸烷-l,2-氧化物和茚氧化物或這些氧化物按照上述定義被取代了的類似物.本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備環(huán)氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)的方法，該方法包括a)由鏈霉菌屬的微生物培養(yǎng)物制備細(xì)胞勻漿；b)將勻漿分級，檢測得到的級分的環(huán)氧化物水解酶活性，優(yōu)選利用基于未反應(yīng)環(huán)氧化物與NBP按照上述定義發(fā)生的顏色反應(yīng)的檢測方法；和c)合并具有環(huán)氧化物水解酶活性的級分并且任選進(jìn)一步進(jìn)行分級。本發(fā)明最后還涉及本發(fā)明的環(huán)氧化物水解酶、鏈霉菌屬微生物、其含有環(huán)氧化物水解酶的勻漿或該勻漿的級分在對映選擇性水解環(huán)氧物中的用途。通過以下實(shí)施例以及參照附圖，對本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。下列附圖中圖1表示在不同的苯乙烯氧化物濃度下，由NBP與環(huán)氧化物形成色素的測定結(jié)果。通過NBP分析法測定含有E.coliDH5a的溶液的吸光值的變化(黑圓圈)，通過NBP分析法測定不含E.coliDH5a細(xì)胞和不含NPB的溶液的吸光值的變化(黑方塊)以及含有E.coliDH5a的溶胞產(chǎn)物的溶液的吸光值的變化(黑三角)，對這些變化值進(jìn)行作圖，每一變化是在給定苯乙烯氧化物濃度下反應(yīng)45分鐘后測定的。圖2表示通過源于抗生鏈霉菌Tii4菌林(DSM12925)的環(huán)氧化物水解酶拆分苯乙烯氧化物的外消旋物的時(shí)間曲線。ee[%](R)-苯乙烯氧化物(黑方塊)；ee[%](S)-苯基-1，2-乙二醇(黑圓圈)；轉(zhuǎn)化率[%](黑三角)。圖3表示不同助溶劑對源于抗生鏈霉菌Ttt4菌林(DSM12925)的環(huán)氧化物水解酶水解苯乙烯氧化物的影響；以ee[%](R)-苯乙烯氧化物對助溶劑濃度(％(v/v))作圖；丙酮(黑方塊)；DMS0(黑圓圈)；DMF(黑三角)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:環(huán)氧化物水解酶檢測系統(tǒng)的驗(yàn)證a)苯乙烯氧化物作為底物在2ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種不含環(huán)氧化物水解酶的微生物(E.coliDH5a)并進(jìn)行細(xì)胞裂解。將100^1細(xì)胞裂解物的等分樣品分別加到微滴板的4個(gè)孔中。將50pi苯乙烯氧化物含量不同的丙酮加到細(xì)胞裂解物中(1.3mol/l(原液)、0.65mo1/1、0.32mo1/1、0.16mol/l、0.08mol/l)。將所述溶液在30"C下溫育2小時(shí)。加入25pl三乙胺(TE)、50nl對-硝基千基吡啶(NBP，5%的體積濃度)和50nl三甘醇二曱醚后，再在39X:下溫育45分鐘，然后相對650nm的對照測定560nm下的吸光值。所述結(jié)果表示在圖1中。隨著苯乙烯氧化物的用量增大，吸光值呈線性增加。因此，吸光值的降低表明存在環(huán)氧化物水解酶活性。b)3-苯基縮水甘油酸酯作為底物除了使用的底物是3-苯基縮水甘油酸酯外，重復(fù)實(shí)施例la)。在這種情況下，吸光值和未水解的環(huán)氧化物的殘留量之間是線性關(guān)系。c)己烷-l，2-氧化物作為底物除了使用的底物是3-苯基縮水甘油酸酯外，重復(fù)實(shí)施例la)。在這種情況下，吸光值和未水解的環(huán)氧化物的殘留量之間是線性關(guān)系。d)茚氧化物作為底物除了使用的底物是茚氧化物外，重復(fù)實(shí)施例la)。在這種情況下，吸光值和未水解的環(huán)氧化物的殘留量之間也是線性關(guān)系。實(shí)施例2:以苯乙烯氧化物為底物篩選具有環(huán)氧化物水解酶活性的不同鏈霉菌菌林以與實(shí)施例l類似的方式，檢測保藏的不同的鏈霉菌菌林，并且以紅球菌屬的菌株(NCIMB11216)作為陰性對照。含有陰性對照的微滴板孔中顯示出很強(qiáng)的顏色反應(yīng)(藍(lán)色)，而在含有抗生鏈霉菌Tii4菌林(DSM12925)或弗氏鏈霉菌Tti27菌株(DSM12131)的孔中發(fā)現(xiàn)了最高的環(huán)氧化物水解酶活性(結(jié)果未給出)。實(shí)施例3:抗生鏈霉菌Tii4菌林的培養(yǎng)在250ml的搖瓶和一個(gè)301的發(fā)酵罐中培養(yǎng)所述微生物；其中不調(diào)控pH。a)250ml的發(fā)酵培養(yǎng)以250ml的規(guī)模在30t:下的培養(yǎng)時(shí)間是48至72小時(shí)。b)301的發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)抗生鏈霉菌Tti4的孢子接種到各裝有1升麥芽培養(yǎng)基[IOg麥芽提取物，4g酵母抽提物，用自來水將總體積調(diào)到l升并進(jìn)行高壓滅菌，高壓滅菌后加入除菌過濾的葡萄糖(4g/升的終體積)]的2只搖瓶中；然后將所述培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)48小時(shí)(30X:,210rpm.)。將2升的該預(yù)培養(yǎng)物接種到20升的麥芽培養(yǎng)基(將0.5升的20%重量濃度的葡萄糖溶液加到20升的麥芽提取物/酵母抽提物溶液中)中，其中為使所述菌落生長得盡可能地分散建議預(yù)先均化(玻璃均質(zhì)器，BraunChemie)。在30升的發(fā)酵罐中于30"C下將培養(yǎng)物攪拌培養(yǎng)24小時(shí)(17升/分鐘的氧氣，200rpm),然后終止發(fā)酵培養(yǎng)。以4000rpm離心30分鐘將細(xì)胞分離出并用TE緩沖液(pH7.3,1mmol/lEDTA)洗滌細(xì)胞。濕生物量為318g。將所迷細(xì)胞再懸浮在400ml的TE緩沖液(pH7.3，1mmol/1的EDTA)中。實(shí)施例4:源于抗生鏈霉菌Tfi4的環(huán)氧化物水解酶的富集a)細(xì)胞裂解為了用裂解細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過過濾或離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞并用磷酸緩沖液(0.1mol/1的NaCl,10mmol/1的EDTA)洗滌兩次。然后用另外含有IOmg/ml溶菌酶的同樣緩沖液制備一種懸浮液(10%w/v)。將所述懸浮液在30C下溫育1小時(shí)，然后在冰浴中通過超聲波(BransonSonifierW250，輸出功率80W)裂解5次，每次兩分鐘，間隔1分鐘。將得到的溶液在32500xg下離心60分鐘并過濾(0.22mmSterivex-GP過濾器，Mi11ipore)。b)細(xì)胞提取物的分離純化用25ml的tris/HCl緩沖液(pH8.1)平衡一根填裝了陰離子交換劑的色譜柱(SuperQ650M,TosoHaas，60ml體積)，然后將15ml的粗提取物加載到柱上。所述色譜柱采用具有下列梯度的2mol/1NaCl溶液洗脫第一梯度30mlNaCl溶液(0-12%(重量百分比濃度))，第二梯度60mlNaCl溶液(12-35%(重量百分比濃度))，用25mlNaCl溶液(100%(重量百分比濃度))沖洗，用60ml的tris/HCl緩沖液進(jìn)行再平衡。流速4ml/分鐘，分級收集液體積4ml。在280nm下測定蛋白質(zhì)。采用NBP分析方法測定每一級分收集液的活性。對此，從每一級分收集液中取150)Lil加到96-孔微滴板的孔中并且采用Biomek2000自動移液管(Biomek2000pipettingrobot)如上所述進(jìn)行NBP分析。由于丙酮的加入量太大從而降低了酶活性，所以使用50pi含有苯乙烯氧化物的丙酮溶液(2.6mol/1)來降低丙酮的含量。其余的實(shí)驗(yàn)步驟以與上文所述類似的方式進(jìn)行。在富集過程中，測定一個(gè)級分收集液中的全部環(huán)氧化物水解酶活性。實(shí)施例5:使用源于抗生鏈霉菌Tii4的環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行苯乙烯氧化物的轉(zhuǎn)化a)反應(yīng)步驟將500pg的苯乙烯氧化物加到實(shí)施例4中得到的含有12.5mlDMSO加溶劑的250ml細(xì)胞提取物中。在30匸下通過均勻振蕩(250rpm)溫育該混合物。24小時(shí)后，加入30ml乙酸乙酯終止反應(yīng)，提取水相。減壓濃縮有機(jī)相。氣相色譜分析的結(jié)果是底物的對映體過量(ees[%])為100而產(chǎn)物的對映體過量(eep[%])為14。手性物質(zhì)的對映體純度由參數(shù)ee(對映體過量)來表示，所迷手性物質(zhì)以(R)-和(S)-形式存在。該參數(shù)ee通過下面的公式來定義ee[%]=[(XA-XB)/(XA+XB)]*100其中XA和XB分別是對映體A和B的摩爾分?jǐn)?shù)。在下列條件下采用手性氣相色譜進(jìn)行對映體過量分析75X:恒溫，130kPa,采用一根FS-Cyclodexp-I/PCS-熔凝的二氧化硅毛細(xì)管色譜柱(CS-ChromatographieServiceGmbH,Langerwehe)(H2載氣，分j;危比(Split):1:100,0.25mmx50mm)。在下列條件下分析產(chǎn)物苯基-l，2-乙二醇1"1C恒溫，其它條件相同。對于每一種酶來說，酶反應(yīng)的對映選擇性E是一個(gè)常數(shù)并且不受底物濃度和轉(zhuǎn)化率的影響，對于不存在產(chǎn)物抑制的不可逆反應(yīng)來說，使用下列公式可以計(jì)算對映選擇性EE=(Vmax/Km)(10_對映體/(Vmax/Km)(s)-對映體=Un[(l-U)(l-ees)]WUn[(l-U)(1+ees)〗}=(ln[(l-U)(1+eep)]}/{ln[(l-U)(1-eep)〗}其中ee,是底物的對映體過量而eep是產(chǎn)物的對映體過量，轉(zhuǎn)化率U可以由公式U-ees/(ees+eep)來計(jì)算。按照Chen，C.S.等在美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)104,7294(1982)中描述的方法進(jìn)行評價(jià)。b)對映選擇性的測定按照下列程序進(jìn)行反應(yīng)，在2ml的可密封反應(yīng)容器中將1.5ml批量的細(xì)胞提取物與75ml的DMSO和7ml的苯乙烯氧化物在30"C下振蕩，然后采用300ml的乙酸乙酯在預(yù)定的時(shí)間進(jìn)行提取。結(jié)果列于表l中表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>附圖2中表示反應(yīng)的時(shí)間過程。實(shí)施例6:通過弗氏鏈霉菌Tti27和沙場鏈霉菌Tii495對苯乙烯氧化物進(jìn)行的水解將250ml所述微生物培養(yǎng)物的完整細(xì)胞重懸浮在200ml的磷酸鈉緩沖液(O.IM，pH8)中。再將500nl苯乙烯氧化物和10%(v/v)的DMSO加到該緩沖液中。在一個(gè)密封的錐形燒瓶中于30r下以210rpm振蕩該反應(yīng)溶液。為了監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，在不同的時(shí)間間隔取樣(1.5m1),以14000rpm離心3分鐘并用300pl的乙醚進(jìn)行提取。采用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相并通過氣相色譜按照上述方法分析測定對映體過量、轉(zhuǎn)化率和對映選擇性。結(jié)果列于下面的表2中表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(R)-苯乙烯氧化物b(S)-苯基-1，2-乙二醇實(shí)施例7:助溶劑對苯乙烯氧化物水解的影響除了以抗生鏈霉菌Tti4作為微生物使用，和將不同量的DMSO、DMF或丙酮加到反應(yīng)溶液中以外，重復(fù)實(shí)施例6。結(jié)果由附圖3所示。10%DMSO、5%丙酮和1-3%DMF引起對映體過量的增加，因而引起對映選擇性的增加。實(shí)施例7:通過源于抗生鏈霉菌Tti4的環(huán)氧化物水解酶水解3-苯基乙基縮水甘油酸酯(3-PEG)和正癸烷-l，2-氧化物除了用3-PEG或正癸烷-1，2-氧化物代替苯乙烯氧化物作為底物外，重復(fù)實(shí)施例5。a)3-PEG的轉(zhuǎn)化與實(shí)施例5不同，在60kPa，130t:(60分鐘)，180t:(5分鐘)，10匸/分鐘的條件下，采用氣相色譜分析3-PEG。b)癸烷-l，2-氧化物的轉(zhuǎn)化在乙酸乙酯中以丙酮和對-甲苯磺酸為催化劑衍生形成的癸烷-l，2-二醇。在實(shí)施例5中指定的條件下和在1201C下分析異亞丙基癸權(quán)利要求1.環(huán)氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)，它是從鏈霉菌屬微生物中分離得到的，其中所述鏈霉菌屬微生物是灰色鏈霉菌菌株DSM40236、灰色鏈霉菌菌株DSM13447、熱普通鏈霉菌菌株DSM40444、熱普通鏈霉菌菌株DSM13448、抗生鏈霉菌Tü4菌株DSM12925、沙場鏈霉菌Tü495菌株DSM40737、沙場鏈霉菌Tü495菌株DSM12134或弗氏鏈霉菌Tü27菌株DSM12131。2.抗生鏈霉菌Tti4，它被保藏在DSMZ，保藏號為DSM12925。3.—種分離環(huán)氧化物對映體混合物的方法，該方法包括a)將含有環(huán)氧化物水解酶底物的環(huán)氧化物對映體混合物與如權(quán)利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶、鏈霉菌屬的微生物、鏈霉菌屬微生物的含環(huán)氧化物水解酶的勻漿或該勻漿的級分一起進(jìn)行溫育；b)轉(zhuǎn)化該對映體混合物；和c)分離該反應(yīng)混合物。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于(b)中對映體混合物的轉(zhuǎn)化直到達(dá)到平衡。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是將環(huán)氧化物的對映體混合物轉(zhuǎn)化，該混合物選自苯乙烯氧化物、3-苯基縮水甘油酸酯、己烷-1，2-氧化物、癸烷-1，2-氧化物和茚氧化物。6.—種檢測環(huán)氧化物水解酶的方法，其包括a)在反應(yīng)條件下，溫育估計(jì)有環(huán)氧化物水解酶活性的被分析物與該環(huán)氧化物水解酶的含環(huán)氧化物的底物，其中的被分析物是鏈霉菌屬的細(xì)菌、鏈霉菌屬細(xì)菌的勻漿或該勻漿的級分；b)在4-硝基千基吡啶存在的條件下，與未反應(yīng)的環(huán)氧化物發(fā)生顏色反應(yīng)；和c)相對不含環(huán)氧化物水解酶的對照液，分析由b)步驟得到的溶液的色素濃度的降低值。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是定量測定所述色素濃度的相對降低值，從而測定被分析物中的環(huán)氧化物水解酶活性。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征是含環(huán)氧化物的底物是對映體純形式或?qū)τ丑w混合物形式的苯乙烯氧化物、3-苯基縮水甘油酸酯、己烷-1，2-氧化物和/或茚氧化物。9.用于檢測具有環(huán)氧化物水解酶活性和/或能夠?qū)τ尺x擇性水解環(huán)氧化物的微生物的篩選方法，包括如權(quán)利要求6-8中的任一項(xiàng)所述的檢測方法。10.權(quán)利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶、鏈霉菌屬的微生物、含有環(huán)氧化物水解酶的該微生物的勻漿或該勻漿的級分用于對映選擇性水解環(huán)氧化物的用途。11.權(quán)利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶、鏈霉菌屬的微生物、含有環(huán)氧化物水解酶的該微生物的勻漿或該勻漿的級分用于由相應(yīng)的環(huán)氧化物對映選擇性制備二醇的用途。12.制備權(quán)利要求1的環(huán)氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)的方法，其特征是a)由鏈霉菌屬的微生物培養(yǎng)物制備細(xì)胞勻漿；b)將勻漿分級，任選利用權(quán)利要求6至8中的任一項(xiàng)所述的檢測方法檢測得到的級分的環(huán)氧化物水解酶活性；和c)合并具有環(huán)氧化物水解酶活性的級分并且任選進(jìn)一步進(jìn)行分級。13.權(quán)利要求1的鏈霉菌屬的微生物在環(huán)氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)制備中的用途。14.如權(quán)利要求13的用途，其中的環(huán)氧化物水解酶具有至少一種下列特性a)苯乙烯氧化物以及至少一種選自3-苯基-乙基縮水甘油酸酯、正己烷-1，2-氧化物、正癸烷-1，2-氧化物和茚氧化物的其它化合物的水解環(huán)氧裂解；b)具有對映選擇性E22的苯乙烯氧化物的外消旋物轉(zhuǎn)化生成(S)-苯基-l，2-乙二醇。全文摘要本發(fā)明涉及源于鏈霉菌屬細(xì)菌的環(huán)氧化物水解酶、環(huán)氧化物對映體混合物酶促分離的新型方法、環(huán)氧化物水解酶活性的新型檢測方法、檢測環(huán)氧化物水解酶活性的篩選方法和鏈霉菌屬細(xì)菌及其產(chǎn)生的環(huán)氧化物水解酶用于進(jìn)行對映選擇性環(huán)氧化物水解的用途。文檔編號C12R1/465GK101363015SQ200810213640公開日2009年2月11日申請日期2000年7月26日優(yōu)先權(quán)日1999年7月27日發(fā)明者B·豪爾,F·措赫爾,M·恩策爾貝格,R·D·施米德,W·沃萊本申請人:Basf公司