專利名稱：谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌得到重組 谷氨酸高產(chǎn)菌及其制備方法與利用高產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用。 在食品應(yīng)用方面，谷氨酸單鈉鹽不僅具有強(qiáng)烈的肉類鮮味，而且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因而常 被用于食品調(diào)味。在醫(yī)藥應(yīng)用方面，谷氯酸鈉和谷氨酸鉀注射液以及谷氨酸片可用于防 治肝昏迷，解氨毒，保護(hù)肝臟，這是因?yàn)楣劝彼岜蝗梭w吸收后易與血氨形成谷酞胺，從 而解除代謝過(guò)程中氨的毒害作用；此外，谷氨酸鈉與維生素B1、 B6和葡萄糖混合可制 成靜脈點(diǎn)滴注射液，谷氨酸鈣可與維生素合用，以增強(qiáng)鈣的吸收。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面，谷 氨酸銅可作為西紅柿保護(hù)性和防治性殺菌劑；谷氨酸與某些激素配合，可制成柑橘增甜 劑，因?yàn)楣劝彼峥稍黾痈涕俟麑?shí)的含糖量，降低其酸度；此外，谷氨酸與某些生理活性 物質(zhì)配合，可開(kāi)發(fā)出新的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；谷氨酸還和其它一些氨基酸一樣可作為微肥 載體。
目前谷氨酸的生產(chǎn)主要是利用谷氨酸棒桿菌Co/7"etoWm'wm g/wtom'cww發(fā)酵生產(chǎn)。 谷氨酸棒桿菌C g/wtom'c腦是Kinoshita等人1957年從自然界分離得到，這是一種好氧、 不產(chǎn)孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，基因組大小為3282 kb，它不僅能利用葡萄糖為唯一碳源 進(jìn)行生長(zhǎng)，而且能利用包括乙酸和琥珀酸在內(nèi)的其它有機(jī)酸和碳水化合物為唯一碳源或 混合碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。谷氨酸棒桿菌C. 為生物素缺陷型，需要補(bǔ)充生物素才
能生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中的生物素過(guò)量時(shí)，菌體不向細(xì)胞外分泌產(chǎn)生谷氨酸；當(dāng)生物素被限 量添加時(shí)，菌體則大量分泌產(chǎn)生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒桿菌可通過(guò)生物素限量 添加來(lái)誘導(dǎo)分泌產(chǎn)生谷氨酸。此外，在生物素過(guò)量的情況下通過(guò)添加某種表面活性劑如 Twee40或Tween60也能誘導(dǎo)谷氨酸棒桿菌過(guò)量合成谷氨酸。
盡管已有不少有關(guān)谷氨酸棒桿菌的遺傳和生理生化方面的研究，但是谷氨酸棒桿菌 C. g/wto/m'cwm過(guò)量合成并分泌產(chǎn)生谷氨酸的分子機(jī)理仍然處于研究階段。早在1965年Takbami等人提出滲漏模型，認(rèn)為谷氨酸的分泌是細(xì)胞膜物理化學(xué)特征發(fā)生變化的結(jié) 果。然而最新關(guān)于谷氨酸合成代謝流方面的研究表明，谷氨酸生物合成途徑的改變?cè)诠?氨酸生產(chǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在有關(guān)幾乎所有氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)研究中，代謝流的改變被 認(rèn)為是提高菌體生產(chǎn)強(qiáng)度最重要的因素。研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸的生物合成途徑(圖l) 中a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(ODHC)是關(guān)鍵的限速酶。生物素限量以及添加Tween40 或Tween60等谷氨酸合成誘導(dǎo)條件均可引起ODHC活性的下降，下降的ODHC活性使 代謝流在ODHC分支點(diǎn)處向谷氨酸合成方向流動(dòng)。Kimura等人1999年發(fā)現(xiàn)DtsR蛋白
(乙酰CoA羧化酶復(fù)合體e亞單位)活性的下降能引起ODHC活性的下降。DtsR蛋白 的編碼基因是ctoi i,全長(zhǎng)1632bp。
谷氨酸的高效合成還依賴于補(bǔ)缺途徑提供充足的草酰乙酸和乙酰CoA，因?yàn)椴蒗Ｒ?酸和乙酰CoA反應(yīng)可以形成谷氨酸的前體檸檬酸(圖1)。補(bǔ)缺途徑被認(rèn)為是谷氨酸棒 桿菌過(guò)量合成谷氨酸的瓶頸之一。在谷氨酸棒桿菌C. g/Wto/m'cWM中主要存在兩個(gè)補(bǔ)缺 反應(yīng) 一是由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸
(OAA); 二是丙酮酸羧化酶(PC)催化丙酮酸生成OAA。 PEPC的編碼基因?yàn)? ; c, 全長(zhǎng)2760bp; PC編碼基因?yàn)椋?少c，全長(zhǎng)3423bp。 PEPC的活性在谷氨酸棒桿菌中活性較 低，而且相對(duì)穩(wěn)定，PC的活性則相對(duì)不穩(wěn)定。代謝流分析發(fā)現(xiàn)在以葡萄糖酸鹽或丙酮 酸為碳源進(jìn)行氨基酸發(fā)酵時(shí)，PEPC和PC之間的碳流分布為10/90。研究還發(fā)現(xiàn)基因Ppc 缺失突變株與其野生型菌株相比，細(xì)胞生長(zhǎng)和氨基酸合成都未受到影響，基因;^c的缺 失能明顯降低細(xì)胞生長(zhǎng)和氨基酸合成，因而PC催化的補(bǔ)缺反應(yīng)在氨基酸生產(chǎn)中占主導(dǎo) 地位，是補(bǔ)充草酰乙酸的主要途徑。
目前尚未有利用基因敲除技術(shù)敲除^fci 7與采用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)過(guò)表達(dá)PC相結(jié)合 改造谷氨酸生產(chǎn)菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)谷氨酸的基因工程菌。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因工程菌的制備方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述基因工程菌在生產(chǎn)谷氨酸中的應(yīng)用。 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)改造谷氨酸高產(chǎn)菌，通過(guò)基因敲除和過(guò)表達(dá)谷氨酸合成相
關(guān)限速酶基因，改變代謝流使其向谷氨酸合成方向流動(dòng)，從而對(duì)菌種進(jìn)行定向改造。 本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想是在谷氨酸棒桿菌中敲除^fo/ /基因，即降低DtsR蛋白活性，
可以抑制ODHC的活性，從而使代謝流流向谷氨酸合成方向，提高谷氨酸產(chǎn)量。另外，在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)pyc基因可以提供充足的谷氨酸合成中需要的OAA,提高谷 氨酸合成產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的-
高產(chǎn)谷氨酸的基因工程菌，該菌是缺失cfc及/基因并過(guò)表達(dá)/7_yc基因的谷氨酸棒桿
菌。 -
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒桿菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步驟
a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增cfoi 7基因上下游片斷，然后將該上下游片
斷連接起來(lái)，形成^S及J基因缺失片段；
b. 將^^7基因缺失片段插入穿梭載體，構(gòu)建^^7基因敲除載體；
c. 將構(gòu)建的&^ /基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得的
克隆菌即為基因缺失的谷氨酸棒桿菌。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒桿菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步驟
a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ IDNo.l和SEQ IDNo.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增cfo^基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No.4采用overlap PCR法(重疊PCR法)將 cto/ /基因上下游片斷連接起來(lái)，形成^fc/ 7基因缺失片段；
b. 利用￡.co/〃C g/wto/m'owj穿梭載體pK19mobsacB，插入ctei 7基因缺失片段形成
基因敲除載體；
c. 將&^ 7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，
挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 cfoi 7基因的谷氨酸棒桿菌。
所述的基因工程菌，其中ttoi /基因上游片斷為Asi 7基因起始密碼上游300~500bp 片斷；ttoi 7基因下游片斷為^fci 7基因終止密碼下游300~500bp片斷。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒桿菌過(guò)表達(dá)pyc基因的方法包括下列步驟
a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增/^c基因，將/7少c基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建
/7少C基因表達(dá)載體；
b. 將構(gòu)建的;^c基因表達(dá)載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)所得抗性克隆菌 即為/ _yc基因過(guò)表達(dá)的谷氨酸棒桿菌。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒桿菌過(guò)表達(dá); ;^基因的方法包括下列步驟 a.以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQIDNo.6利用PCR法擴(kuò)增/^c基因，將/^c基因插入表達(dá)載體pVWExl，構(gòu)建； yc基因表
達(dá)載體5
b.將構(gòu)建的;^c基因表達(dá)載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培 養(yǎng)所得抗性克隆菌即為得/^c基因過(guò)表達(dá)的谷氨酸棒桿菌。
更進(jìn)一步，所述的基因工程菌，該基因工程菌是通過(guò)下列步驟制備得到的
a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增cfo及/基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法將tto"基因上下游 片斷連接起來(lái)，形成^tei /基因缺失片段；
b. 利用￡.co///C. g/wton/cwOT穿梭載體pK19mobsacB,插入cto/ 7基因缺失片段形成 基因敲除載體；
c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ ID No.6利用PCR法擴(kuò)增；7少c基因，將；;yc基因插入表達(dá)載體pVWExl,構(gòu)建pyc基因表 達(dá)載體；
d. 將cfoi 7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ^fci /基因的谷氨酸棒桿菌；然后將;y/c基因表達(dá)載體導(dǎo)入缺失cfci 7基因的谷氨酸棒桿 菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選卡那抗性克隆菌即得缺失^fo及/基因且過(guò) 表達(dá)基因的谷氨酸棒桿菌。
所述的基因工程菌的制備方法，包括下列步驟
a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增^yi 7基因上下游片斷，然后將該上下游片 斷連接起來(lái)，形成^"i 7基因缺失片段；
b. 將^^/基因缺失片段插入穿梭載體，構(gòu)建^fo/ 7基因敲除載體；
c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增pw基因，將/^c基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建
/^C基因表達(dá)載體；
d. 將構(gòu)建的^fci 7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得的 克隆菌即為^fc及7基因缺失的谷氨酸棒桿菌，再將p_yC基因表達(dá)載體導(dǎo)入cfci 7基因缺 失的谷氨酸棒桿菌，抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)所得抗性克隆菌即為cfoi 7基因缺失且過(guò)表達(dá)pyc 基因的谷氨酸棒桿菌。
更進(jìn)一步，所述的基因工程菌的制備方法，具體包括下列步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增cfo及7基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法將ctoi /基因上下游 片斷連接起來(lái)，形成^fo/ /基因缺失片段；
b. 利用Eco///C. g/wtoAm'o/w穿梭載體pK19mobsacB，插入cto/ /基因缺失片段形成 基因敲除載體
c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法擴(kuò)增/^c基因，將；^c基因插入表達(dá)載體pVWExl，構(gòu)建；7yc基因表 達(dá)載體
d. 將cfo/^基齒敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ^foi /基因的谷氨酸棒桿菌；然后將p_yc基因表達(dá)載體導(dǎo)入缺失^fc/ 7基因的谷氨酸棒桿
菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選卡那抗性克隆菌即得缺失ctoi /基因且過(guò)
表達(dá)pyc基因的谷氨酸棒桿菌。
所述的基因工程菌在生產(chǎn)谷氨酸中的應(yīng)用。 具體的篩選培養(yǎng)基的選擇可根據(jù)使用的載體或菌株的特性確定。如卡那抗性培養(yǎng)基
(含50pg/ml-10(Vg/ml卡那霉素)、含蔗糖的培養(yǎng)基(含10%-40%蔗糖)， 本發(fā)明有益效果
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一株新型谷氨酸高產(chǎn)菌株，該菌株命名為Ad-pyc。 本發(fā)明以基因敲除技術(shù)和蛋白表達(dá)技術(shù)改造谷氨酸合成代謝流，提高谷氨酸產(chǎn)量。谷氨 酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示，菌株Ad-pyc在生物素過(guò)量培養(yǎng)時(shí)就產(chǎn)生較高濃度(80.0mM)的谷氨 酸，而野生型谷氨酸棒桿菌在此條件下不合成谷氨酸。在生物素限量和Tween40添加等 誘導(dǎo)條伴又能進(jìn)--步提高谷氨酸產(chǎn)量，Ad-pyc在這兩種誘導(dǎo)條件下的產(chǎn)量比野生型在 同等條件下分別提高了 13%和18%。
本發(fā)明首次將基因敲除技術(shù)和蛋白表達(dá)技術(shù)用于谷氨酸高產(chǎn)菌的構(gòu)建，為改造谷氨 酸高產(chǎn)菌提供一種新的方法。本發(fā)明首先用基因敲除技術(shù)將抑制谷氨酸合成的DtsR蛋 白進(jìn)行敲除，再用過(guò)表達(dá)載體表達(dá)谷氨酸合成補(bǔ)缺途徑中的PC，以此來(lái)定向優(yōu)化谷氨 酸合成代謝途徑，使代謝流大量流向谷氨酸合成方向，提高谷氨酸產(chǎn)量。


圖1:谷氨酸的生物合成途徑。圖2:基因敲除載體pK19ms-Ad酶切鑒定M， DNAmarker; 1, HindIII酶切過(guò)的 陽(yáng)性克隆DNA。
圖3:基因過(guò)表達(dá)載體pVWExl-pyc酶切鑒定M, DNA marker; 1, Pstl和Sail 雙酶切過(guò)的陽(yáng)性克隆DNA。
圖4:基因缺失克隆Ad southern blot鑒定圖1，野生型的雜交信號(hào)；2，厶d的雜 交信號(hào)。
圖5:生物素過(guò)量條^l^下谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(a)野生型菌株在生物素過(guò)量條件
下的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn)；(b)谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌Ad-pyc在生物素過(guò)量 條件下的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn)；"代表菌體OD6oo; A代表谷氨酸生產(chǎn)；夸代
表葡萄糖消耗。 '
圖6:生物素限量條件下谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(a)野生型菌株在生物素限量條件
下的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn)；(b)谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌Ad-pyc在生物素限量 條件下的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn)；"代表菌體OD6oo; A代表谷氨酸生產(chǎn)；夸代
表葡萄糖消耗。
圖7: Tween40添加條件下谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(a)野生型菌株在Tween40添加 條件下的生長(zhǎng),葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn);(b)谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌Ad-pyc在Tween40 添加條件下的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和谷氨酸生產(chǎn)；"代表菌體OD^; A代表谷氨酸生產(chǎn)； 命代表葡萄糖消耗。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述
實(shí)施例1、基因敲除載體pK19ms-Ad和基因過(guò)表達(dá)載體pVWExl-pyc的構(gòu)建 1). PCR擴(kuò)增cfc/ /基因上、下游片段用基因組DNA提取試劑盒(Promega公司 產(chǎn)品)提取野生型谷氨酸棒桿菌C.g/wto加'cw/wATCC 13032 (ATCC購(gòu)買)的基因組。根 據(jù)Gene Bank中C. g/^aw/cwm ATCC13032全基因組序列(Gene Bank No: NCgl0678) 設(shè)計(jì)引物。以抽提的基因組為模板，Al (SEQIDNo.l)和A2 (SEQIDNo.2)為引物， 在Taq酶(Takara公司產(chǎn)品)作用下PCR擴(kuò)增cfo/ 7基因上游片段(血W基因起始密 碼上游400bp)， PCR參數(shù)為95°C 30s， 54。C 40s, 72°C 25s，共26個(gè)循環(huán)。以A3 (SEQ ID No.3)禾Q A4 (SEQ ID No.4)為引物，PCR擴(kuò)增基因下游片段(^fo/ 7基因終 止密碼下游400bp)， PCR參數(shù)為95°C 30s， 56。C 40s， 72°C 25s,共26個(gè)循環(huán)。上述 引物序列分別為Al: AAGCTTGCGGCTCTCTGGATCGTG (下劃線為HindIII酶切位點(diǎn)) A2: CGC4G7^CGCrCC4CCGA47^CGGTGCCGTCC (斜體為互補(bǔ)序列) A3: CCG7M7TCGGrG04GCG7^CrGCGTGATGGGTTC (斜體為互補(bǔ)序列) A4: AAGCTTCAGTGGCATGTGGCCGTGC (下劃線為HindIII酶切位點(diǎn)) 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，^s及7基因上、下游片段大小均為400bp。然后 用膠回收試劑盒(上海申能博彩產(chǎn)品)進(jìn)行割膠回收。
2) .overlapPCR連接必i /基因上、下游片段以l)擴(kuò)增的上下游片段(按1:1混合) 為模板，Al和A4為引物PCR擴(kuò)增，PCR參數(shù)為95'C 30s， 5TC 40s， 72'C 40s,共 30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，大小為800bp，并割膠回收。將回收片段和 pMD19-T (Takara公司產(chǎn)品)按5:1連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，挑取氨芐抗性克隆， 菌落PCR鑒定pMD19-T中是否插入回收的PCR片段。通過(guò)測(cè)序(Invitrogen公司測(cè)定) 鑒定插入的PCR片段確實(shí)為ifc/2/基因上、下游連接片段。
3) .基因敲除載體pK19ms-Ad的構(gòu)建:將2)中插入連接片段的pMD19-T載體用Hind III (Takara公司產(chǎn)品)酶切，37'C保溫3小時(shí)，將切出的連接片段(800bp)進(jìn)行電泳 回收。同時(shí)將載體pK19mobsacB (Eggeling L， Bott M. Handbook of C。7"e6a"e〃'wm g/wtow/cww. CRC press, Boca Raton, FL, USA 2005)用HindIII酶切，37'C保溫2小時(shí)， 電泳回收，并將回收的載體片斷用堿性磷酸酶(CIAP) (Takara公司產(chǎn)品)進(jìn)行去磷酸 化反應(yīng)，以防止載體自連。將回收的連接片段和載體片段按7:1連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)，挑取卡那抗性克隆，菌落PCR初步鑒定陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，酶切 進(jìn)一步鑒定(見(jiàn)圖2)。將構(gòu)建好的基因敲除載體命名為pK19ms-Ad。.
4) .基因過(guò)表達(dá)載體pVWExl-pyc的構(gòu)建以l)提取的基因組為模板，Bl (SEQID No.5)和B2 (SEQIDNo.6)為引物，擴(kuò)增/^c基因，PCR擴(kuò)增參數(shù)為95°C 30s， 51 。C 40s,72。C 2min,共28個(gè)循環(huán)。引物序列如下
Bl: GTTGTTCTGCAGTCTGCAGGTGGAAGC (下劃線為Pstl酶切位點(diǎn)) B2: GTTGTTGTCGACCCCTTCGTGCGGC (下劃線為Sail酶切位點(diǎn)) 擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物大小為3423bp，電泳回收后經(jīng)PstI和Sall雙酶切，與經(jīng)同樣雙 酶切的載體pVWExl (Peters-Wendisch PG, Schiel B， Wendisch VF, Katsoulidis E, Mokel B, Sahm H, Eikmanns BJ. Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production by Co，e6a"m'簡(jiǎn)g/wfamz'c訓(xùn).J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001， 3: 295-300)按7:1連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，挑取卡那抗性克隆，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，酶切鑒定(見(jiàn)圖3)。將構(gòu)建好的基因過(guò)表達(dá)載體命名為pVWExl-pyc。 實(shí)施例2、 cfoi 7基因缺失的谷氨酸棒桿菌Ad的制備
1) .谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的制備挑取新鮮平皿上谷氨酸棒桿菌ATCC13032，接種 入含0.5% (質(zhì)量體積比)葡萄糖的2ml液體LB培養(yǎng)基中，30'C, 200r/min培養(yǎng)12小 時(shí)，再按1%(接種量與培養(yǎng)基的體積百分比)接種到含3% (質(zhì)量體積比)甘氨酸和0.1%
(體積比)Tween80的50ml LB中，使起始0D6Q。達(dá)到0.3，在30'C中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 達(dá)到0.9。將菌液冰浴15分鐘，離心收集菌體，用預(yù)冷的10%(體積百分比)甘油重懸細(xì) 胞，用1.5ml離心管分裝，每管80pl。將感受態(tài)細(xì)胞放-7(TC冰箱保存或直接用于電擊轉(zhuǎn) 化。
2) .電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK19ms-Ad:將感受態(tài)細(xì)胞從冰箱中拿出并于冰水中融化，添加 l-5^質(zhì)粒pK19ms-Ad入感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至O.lcm電擊杯(BioRad 公司產(chǎn)品)中，于1.8kv,5ms條件下在電擊儀(BioRad公司產(chǎn)品)上電擊，然后立即加 入含0.5% (質(zhì)量體積比)葡萄糖的lml液體LB培養(yǎng)基，輕輕混勻。將混合液轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，46'C水浴6分鐘，3(TC水浴1小時(shí)，離心濃縮菌體至100-200^1。將菌體混 勻后涂布在含0.5%葡萄糖和25pg/ml卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，3(TC于溫箱中培養(yǎng) 36小時(shí)。
3) .^foi /基因缺失的谷氨酸棒桿菌Ad的制備首先用卡那抗性篩選，如2)所述， 將電轉(zhuǎn)后的菌體涂布在含卡那抗性的固體LB培養(yǎng)基上，挑選抗性克隆，提取克隆的基 因組，進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性克隆。以A1/A4為引物擴(kuò)增，PCR參數(shù)為95'C 30s,51'C 40s, 72'C lmin40s,共26個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為800bp片段和2600bp片段的克隆為陽(yáng)性 克隆，因?yàn)橘|(zhì)粒整合入基因組DNA后會(huì)擴(kuò)增出兩種不同大小的片段。將挑選出的陽(yáng)性 克隆接種入含卡那的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將過(guò)夜菌涂布在含10%(質(zhì)量體積比) 蔗糖的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時(shí)。由于pK19mobsacB載體上sacB基因在谷氨酸棒 桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物使其不能在含蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所以蔗糖篩選壓力就促使載體 pK19mobsacB攜帶目的基因脫離基因組DNA。將在含蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的克隆的基因 組提取出來(lái)，以A1/A4為引物PCR擴(kuò)增，參數(shù)同上。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有800bp片段的 克隆為陽(yáng)性克隆，即cfei^基因缺失克隆，命名為Ad。
4) .southem blot (southern印跡法)鑒定afoW基因缺失克隆Ad:提取3)篩選的tfc/ 7 基因缺失克隆的基因組，將基因組DNA用BamHI酶切，37'C保溫4小時(shí)，然后進(jìn)行0.8% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠(不加染色液EB)電泳。將凝膠浸泡于變性液中1小 時(shí)，接著用去離子水漂洗l次，加入中和液30分鐘。將凝膠放在鋪有濾紙的平臺(tái)上， 平臺(tái)置于盛滿轉(zhuǎn)移液的盒子中，然后將用轉(zhuǎn)移液浸泡過(guò)的尼龍膜放在凝膠上，再用濾紙 覆蓋在尼龍膜上(約5-8厘米厚)，其上再壓一重物。放置過(guò)夜，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜 上。用地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(Roche公司產(chǎn)品)標(biāo)記尼龍膜上的DNA并與探針雜交 檢測(cè)雜交信號(hào)(見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書)。缺失&^ 7基因的谷氨酸棒桿菌Ad雜交出1900bp 大小的信號(hào)，而野生型雜交出3600bp大小的信號(hào)(見(jiàn)圖4)。
變性液L5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH;
中和液lmoI/LTris-Cl， 1.5mol/LNaCl
轉(zhuǎn)移液3mol/L NaCl; 0.3mol/L梓檬酸鈉；pH7.0
實(shí)施例3、 ^fci /基因缺失且過(guò)表達(dá)PC的谷氨酸棒桿菌厶d-pyc的制備
1) .Ad-pyc的制備將構(gòu)建好的載體pVWExl-pyc電擊轉(zhuǎn)入菌株Ad中(方法見(jiàn)實(shí)施 例2)，用卡那抗性篩選陽(yáng)性克隆。將在卡那平板上長(zhǎng)出的克隆接種入含卡那抗性的液體 LB中培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果顯示其大小與電轉(zhuǎn)前質(zhì)粒大小一致，說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體pVWExl-pyc成功轉(zhuǎn)入菌株A d中，將篩選出的&^ /基因缺失且過(guò)表達(dá)PC的谷氨酸棒桿菌命名為Ad-pyc。
2) .PC活性的測(cè)定將Ad-pyc按l: 30(接種量與培養(yǎng)基的體積比)接種入含卡那的 液體LB中，3(TC震蕩培養(yǎng)至OD6(X)達(dá)到0.6 (或0.4-0.6)，加入終濃度為lmM異丙基 硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，24'C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4小時(shí)。取5ml菌液超聲破碎，離 心去上清即粗酶液。粗酶液加入100mM TES-NaOH (PH 7.6), 25mM NaHC03, 20mM丙 酮酸,4mM ATP, 2mM谷氨酸,20pM磷酸吡眵醛和2個(gè)單位豬心谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)， 混勻3(TC反應(yīng)3分鐘。反應(yīng)生成的天冬氨酸經(jīng)異硫氰酸苯酯(PITC)衍化后，再由高 效液相色譜儀分析得到PC的活性。菌株Ad-pyc中PC活性為91 U/mg，而野生型僅為 35 U/mg，與野生型相比，Ad-pyc中PC的活性提高了近3倍，說(shuō)明基因p_yc在谷氨酸 棒桿菌中得到高效地表達(dá)。
實(shí)施例4、厶d-pyc的發(fā)酵實(shí)驗(yàn) l).三種發(fā)酵培養(yǎng)基
生物素過(guò)量培養(yǎng)基GH1: 30 g/L葡萄糖，15 g/L (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04， 0.4 g/LMgS04 ' 7H20, 0.01 g/L FeS04 . 7H20， 0.01 g/L MnS04 4H20， 200pg/L維生素Bi, 300 pg/L生物素，1.4。/。(體積百分比)大豆蛋白水解物和50g/LCaCO3[單獨(dú)除菌]，調(diào)節(jié)pH 至8.0。(單獨(dú)除菌是指50g/LCaCO3部分。大豆蛋白水解物是市場(chǎng)可以買到的產(chǎn)品， 廠家上海西王淀粉糖有限公司，產(chǎn)品編號(hào)S2008092351394)
生物素限量培養(yǎng)基GH2: 50g/L葡萄糖，不含生物素，其余同GH1培養(yǎng)基。 添加Tween40培養(yǎng)基GH3: 50 g/L葡萄糖，30 g/L (NH4)2S04和60pg/L生物素，5 mg/mlTween40,其余同GH1培養(yǎng)基。
2).葡萄糖和谷氨酸含量測(cè)定將野生型谷氨酸棒桿菌ATCC13032和Ad-pyc分別在 上述三種發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時(shí)取發(fā)酵液在高效液相色譜儀上分析葡萄糖和谷氨酸含 量。谷氨酸測(cè)定前需要經(jīng)鄰苯二醛(OPA)衍化，色譜柱型號(hào)為Shim-Pack CLC-ODS 250 mmX4mm, 5pm，流動(dòng)相A為0.1 M KC2H302 (pH 5.89),流動(dòng)相B為甲醇，流速為1 m卜min"，柱溫為40'C,在210nm處測(cè)吸收值。葡萄糖測(cè)定的色譜柱型號(hào)為Aminex HPX-87H, 7.8 mmX300 mm,流動(dòng)相為0.005M H2S04，流速為0.5 ml min"，柱溫為 55°C，用示差檢測(cè)器檢測(cè)。構(gòu)建的基因工程菌Ad-pyc在生物素過(guò)量條件下就能生產(chǎn)谷 氨酸，發(fā)酵28小時(shí)后谷氨酸濃度達(dá)到80.0mM，而同等條件下野生型不產(chǎn)谷氨酸(見(jiàn)圖 5)。說(shuō)明通過(guò)改變和優(yōu)化代謝流就可以使谷氨酸棒桿菌在非誘導(dǎo)條件下生產(chǎn)谷氨酸。同 時(shí)，生物素限量和Tween40添加等誘導(dǎo)條件又能進(jìn)一步提高谷氨酸產(chǎn)量，Ad-pyc在這 兩種誘導(dǎo)條件下的產(chǎn)量比野生型在同等條件下分別提高了 13%和18% (見(jiàn)圖6和圖7)。 這就為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)谷氨酸提供了一種新菌株，同時(shí)為篩選谷氨酸高產(chǎn)菌提供一個(gè)新 方法。〈110〉中國(guó)藥科大學(xué)中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
〈120〉谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌及其應(yīng)用 <160>6
〈210〉1
〈211>14
〈212>DNA
〈213〉人工序列
<220>
<223>上游引物 <400〉1
aagcttgcgg ctctctggat cgtg 14
<210>2
〈211〉32
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<223〉下游引物 <400>2
cgcagtacgc tccaccgaat acggtgccgt cc 32
〈210>3
<211>34
<212〉陽(yáng)
<213〉人工序列
<220>
〈223〉上游引物 <400〉3
ccgtattcgg tggagcgtac tgcgtgatgg gttc 34
<210〉4
<211>25
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>下游引物 <400〉4
aagcttcagrggcatgtggc cgtgc 25 〈210>1〈211〉27 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 <220〉
<223〉上游引物 <400>1
gttgttctgc agtctgcagg tggaagc 27
<210>6
<211〉25
<212〉腿
〈213>人工序列
〈220>
〈223>下游引物 <400〉6
gttgttgtcg accccttcgt gcggc 2權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)谷氨酸的基因工程菌，其特征在于該菌是缺失dtsR1基因并過(guò)表達(dá)pyc基因的谷氨酸棒桿菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒桿菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增ctoi^基因上下游片斷，然后將該上下游片 斷連接起來(lái)，形成^^/基因缺失片段；b. 將^^7基因缺失片段插入穿梭載體，構(gòu)建^foi 7基因敲除載體；c. 將構(gòu)建的^^7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得的 克隆菌即為^foi /基因缺失的谷氨酸棒桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒桿菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增tfoi /基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法將flfe及7基屈上下游 片斷連接起來(lái)，形成itoi /基因缺失片段；b. 利用￡.co///C. g/wtow/cww穿梭載體pK19mobsacB，插入cfo^基因缺失片段形成 基因敲除載體；c. 將ctoi /基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 必M7基因的谷氨酸棒桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于cfci /基因上游片斷為cfoi 7 基因起始密碼上游300~500bp片斷；cfci 7基因下游片斷為d"及7基因終止密碼下游 300 500bp片斷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒桿菌過(guò)表達(dá);^c基因 的方法包括下列步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增pw基因，將/^c基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建 基因表達(dá)載體；b. 將構(gòu)建的; w基因表達(dá)載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)所得抗性克隆菌即為過(guò)表達(dá)p_yc基因的谷氨酸棒桿菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒桿菌過(guò)表達(dá);^c基因的方法包括下列步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法擴(kuò)增pyc基因，將基因插入表達(dá)載體pVWExl,構(gòu)建/ _yc基因表 達(dá)載體ib. 將構(gòu)建的/^c基因表達(dá)載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培 養(yǎng)所得抗性克隆菌即為過(guò)表達(dá)/^c基因的谷氨酸棒桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于該基因工程菌是通過(guò)下列步驟制備得到的a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增cfo及7基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法將cfo/ /基因上下游 片斷連接起來(lái)，形成&^ 7基因缺失片段；b. 利用￡co"/C. 穿梭載體pK19mobsacB，插入ctei /基因缺失片段形成 ^^/基因敲除載體；c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ ID No.6利用PCR法擴(kuò)增p少c基因，將/ _yc基因插入表達(dá)載體pVWExl，構(gòu)建p_yc基因表 達(dá)載體；d. 將ifci /基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 力5i 7基因的谷氨酸棒桿菌；然后將/ yc基因表達(dá)載體導(dǎo)入缺失cfo及/基因的谷氨酸棒桿 菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選卡那抗性克隆菌即得缺失^"i 7基因且過(guò) 表達(dá)/^c基因的谷氨酸棒桿菌。
8. 如權(quán)利要求l所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于包括下列步驟-a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增^^/基因上下游片斷，然后將該上下游片 斷連接起來(lái)，形成cfoW基因缺失片段；b. 將ctei 7基因缺失片段插入穿梭載體，構(gòu)建ctei /基因敲除載體；c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，擴(kuò)增;^c基因，將;^c基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建 /^c基因表達(dá)載體；d.將構(gòu)建的cfc/ 7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得的 克隆菌即為ifei /基因缺失的谷氨酸棒桿菌，再將基因表達(dá)載體導(dǎo)入力^ 7基因缺 失的谷氨酸棒桿菌，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得抗性克隆菌即為cto及7基因缺失且過(guò)表 達(dá)j^c基因的谷氨酸棒桿菌。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于包括下列步驟a. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游片斷的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片斷引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分別擴(kuò)增^fci 7基因上下游 片斷，再通過(guò)引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法將d"及/基因上下游 片斷連接起來(lái)，形成^te及7基因缺失片段；b. 利用￡.co/Z/C. g/wtow/o/w穿梭載體pK19mobsacB，插入ite及7基因缺失片段形成 ^^7基因敲除載體；c. 以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，通過(guò)上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法擴(kuò)增/7yc基因，將pyc基因插入表達(dá)載體pVWExl ，構(gòu)建p少c基因表 達(dá)載體；d. 將d"i 7基因敲除載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 挑選卡那抗性克隆菌再接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ttei /基因的谷氨酸棒桿菌；然后將;^c基因表達(dá)載體導(dǎo)入缺失ctoi /基因的谷氨酸棒桿 菌，接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選卡那抗性克隆菌即得缺失ctoi /基因且過(guò) 表達(dá)p;/c基因的谷氨酸棒桿菌。
10、 權(quán)利要求1所述的基因工程菌在生產(chǎn)谷氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了谷氨酸基因工程高產(chǎn)菌及其應(yīng)用。該菌是缺失dtsR1基因并過(guò)表達(dá)pyc基因的谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明采用載體pK19mobsacB將谷氨酸棒桿菌的基因dtsR1敲除，分別使用卡那抗性和蔗糖作為選擇壓力，獲得基因敲除菌株Δd，再利用載體pVWEx1將pyc基因?qū)毽中過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶，通過(guò)基因敲除技術(shù)和基因過(guò)表達(dá)定向改造優(yōu)化谷氨酸生物合成途徑，構(gòu)建基因工程菌Δd-pyc。該菌能提高谷氨酸產(chǎn)量，可用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)谷氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101418277SQ20081023625
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者玉 劉, 姚文娟, 云 張, 王忠燦, 鄧小昭, 輝 鐘 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué);中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所