專利名稱：：由茶堿調(diào)控其靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接i型核酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由茶堿調(diào)控其靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶。
背景技術(shù)：
：已做出了熱切的嘗試來開發(fā)基因治療技術(shù)作為新的治療技術(shù)來治療無法治愈的人類疾病，它通過對分子遺傳原因以及由于基因突變導(dǎo)致的不可治愈的人類疾病的因素進行研究。然而，在目前的基因治療技術(shù)中存在許多待解決的問題。正常基因轉(zhuǎn)移到患者的適當(dāng)?shù)募?xì)胞而做出的(摩根，R.A.與安德森，W.F.1993，人類基因治療.生物化學(xué)年評.62:191-217(Morgan,R.A.andAnderson,W.F.1993,Humangenetherapy.所oc/em.62:191-217))。理論上來說為了通過這種基因治療獲得治療效果，應(yīng)該在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)調(diào)控機制下產(chǎn)生所期望的基因產(chǎn)物。然而，由于在病毒顆粒中的轉(zhuǎn)運子基因的大小的限制，幾乎所有的基因治療都是通過將所期望的基因以cDNA(互補脫氧核糖核酸)的形式進4亍轉(zhuǎn)移而做出的，這種轉(zhuǎn)移在各種不同的啟動子或者在基因片段中基因自身的啟動子的調(diào)控下進行。因此，病毒顆粒不包括各種遺傳成分，這種遺傳成分可以調(diào)控在病毒顆粒中的和它們自身的轉(zhuǎn)運基因，并且不會使疾病的治療所期望的效果最大化。此外，用于基因表達的啟動子等可能不符合人們期望地激活其它類型的啟動子，并且也可能通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而增加基因所轉(zhuǎn)移到的細(xì)胞的不同基因的表達(例如，原癌基因(protooncogene))。而且，正常基因的轉(zhuǎn)移根本不會影響患者細(xì)胞內(nèi)突變基因產(chǎn)物的減少。當(dāng)突變基因產(chǎn)物確實具有占主導(dǎo)的負(fù)面效果時，通過傳統(tǒng)的方法的治療效果可能不會得到最大化。因此，需要一種新穎的治療，該治療誘導(dǎo)正?；虻牧己谜{(diào)控的表達，并同時抑制突變基因的表4達(蘭，N.、赫瑞，R.P.、李，S.W.、史密斯，C.A.和薩倫格，B.A.1998，紅細(xì)胞前體中的鐮刀狀b-珠蛋白mRNA的核酶介導(dǎo)的修復(fù).科學(xué)280:1593(Lan,N.,Howrey，R.R,Lee，S.W"Smith,C.A.，andSullenger,B.A.1998,Ribozyme-MediatedRepairofSickleb-GlobinmRNAsinErythrocytePrecursors.5We"ce280:1593);皮拉克托，L.A.、達拉，C.和伍德，M丄1998,三核苷酸重復(fù)的核酶介導(dǎo)的反式剪接.自然遺傳學(xué)18:378-381(Phylactou,L.A.,Darrah,C.,andWood,M丄1998,Ribozyme-mediatedtrans-splicingofatrinucleotiderepeat.NatGenet.18:378-381);羅杰斯，C.S.、瓦努瓦，C.G.、薩倫格，B.A.和喬治，A丄.Jr.2002,使用反式剪接核酶對突變氯通道的功能性修復(fù)，臨床研究期刊.110:1783-1789(Rogers,C.S.,Vanoye,C,G"Sullenger,B.A.，andGeorge,A丄.Jr.2002，F(xiàn)unctionalrepairofamutantchloridechannelusingatrans-splicingribozyme，J.C7/"./"組110:1783-1789);信，K.S.、薩倫格，B.A.和李,S.W.2004，在人類癌細(xì)胞中由于對突變p53RNA的靶向修復(fù)造成的并由核酶調(diào)控誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡.分子治療學(xué).10:365-372(Shin，K.S"Sullenger,B.A.，andLee,S.W.2004，Ribozyme-mediatedinductionofapoptosisinhumancancercellsbytargetedrepairofmutantp53RNA.Mo/TTzer10:365-372);宇，K丄、金姆，J.H.和李，S.W.2003,在丙型肝炎病毒內(nèi)部核糖進入位點表達細(xì)胞中核酶介導(dǎo)的通過靶向反式剪接的選擇性誘導(dǎo).分子治療學(xué).7;386-395(Ryu,K丄，Kim,J.H.,andLee,S.W.2003，Ribozyme-mediatedselectiveinductionofnewgeneactivityinhepatitisCvirusinternalribosomeentrysite-expressingcellsbytargetedtrans-splicing.^M/.7Tze廣7;386-395))。已報導(dǎo)來自嗜熱四膜蟲的I型內(nèi)含子核酶通過對細(xì)菌細(xì)胞和人類細(xì)胞內(nèi)以及在活體外條件下的獨立的轉(zhuǎn)錄物進行反式剪接來將兩種獨立的轉(zhuǎn)錄物彼此連接(冰，M.和切赫，T.1986，一個結(jié)合位點決定了四膜蟲rRNA前體自我剪接、反式剪接以及RNA酶活性的序列特異性.細(xì)胞47:207-216(Been,M.andCech，T.1986，OnebindingsitedeterminessequencespecificityofTetrahymenapre-rRNAself-splicing,trans-splicing,andRNAenzymeactivity.Cell47:207-216);薩倫格，B.A.和切赫，T.R.1994，核酶介導(dǎo)的通過靶向反式剪接對缺陷mRNA的修復(fù).自然371:619-622(Sullenger,B.A.andCech,T.R.1994，Ribozyme-mediatedrepairofdefectivemRNAbytargeted,trans-splicing.Nature371:619-622);瓊斯，J,T.、李，S.W.和薩倫才各，B.A.1996，對核酶反應(yīng)位點進行標(biāo)記以追蹤哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的反式剪接.自然.醫(yī)學(xué).2:643-648(Jones,J.T.，Lee，S.W"andSullenger，B.A.1996,Taggingribozymereactionsitestofollowtrans-splicinginmammaliancells.iVW^fed.2:643-648))。戶斤以，以I型內(nèi)含子為基礎(chǔ)的反式剪接核酶以疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本或者某些不在正常細(xì)胞中表達、只在感染細(xì)胞中特異地表達的某些RNA為靶；并隨后通過將不正常的RNA更正為正常RNA或者將與疾病有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄本取代為新的治療性基因轉(zhuǎn)錄本來誘發(fā)細(xì)胞重組。因此，反式剪接的核酶對疾病有非常的特異性并且可以用作穩(wěn)定的基因治療技術(shù)。也就是說，由于RNA的取代僅在靶基因轉(zhuǎn)錄本存在情況下進行的，所以期望的基因產(chǎn)物可能只在適當(dāng)?shù)目臻g和時間才產(chǎn)生。特別地，由于用RNA取代來靶向細(xì)胞內(nèi)表達的RNA，并隨后用期望的基因產(chǎn)物來取代該目標(biāo)RNA，所以調(diào)控待表達基因的量是可能的。而且，由于反式剪接的核酶起到除去疾病特異性RNA的功能并同時誘導(dǎo)所期望的治療性基因產(chǎn)物的表達，因此反式剪接的核酶能使療效加倍。RNA具有合適的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特性以起到人為開關(guān)或自然開關(guān)的作用(曼達爾，M.、伯澤，B.、巴瑞克，J.E.、溫克勒，\￥.(:.以及布瑞克，11.11.2003,核開關(guān)調(diào)控枯草芽孢桿菌和其他細(xì)菌內(nèi)基礎(chǔ)生化途徑.細(xì)胞113:577-586(Mandal,M.,Boese，B.，Barrick，J.E.,Winkler,W.C.，andBreaker,R.R.2003,RiboswitchescontrolfundamentalbiochemicalpathwaysinBacillussubtilisandotherbacteria.Ce〃113:577-586))。通過利用這些特性，通過對特異性地靶RNA適體結(jié)合到核酶上的小分子或者蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)活序列進行識別而得到的酶被稱為適體酶(aptazyme)，所述核酶為具有酶活性的RNA(布瑞克，R.R.2002,改造過的變構(gòu)核酶作為生物傳感器的組成.生物技術(shù)新見13:31-39(Breaker,R.R.2002,Engineeredallostericribozymesasbiosensorcomponents.Cwr.Qp/".13:31-39))。對于適體酶，核酶和適體通過il/f言才莫塊而連接。所述通信模塊具有這樣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)起到中間體的作用來將在適體中產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)移到核酶中。(科特斯堡，夂和紹庫普，0.八.2002，一種用于RNA折疊和催化的多功能通信模塊.核酸研究.30:4599-4606(Kertsburg,A.and6Soukup,G.A.2002，AversatilecommunicationmoduleforcontrollingRNAfoldingandcatalysis.iVwc/e/d'<isi^s.30:4599-4606))。當(dāng)適體感應(yīng)到配體時，這些信號通過通信模塊轉(zhuǎn)移到核酶以對無活性的核酶進行變構(gòu)修飾，從而誘發(fā)活抑制核酶的活性。也就是說，核酶的活性可以通過某些內(nèi)源性配體活外源性配體進行調(diào)控。對于目前的用于治療癌癥的方法而言，需要發(fā)展一種方法，其中僅能將癌細(xì)胞特異性地清楚。通過將RNA適體連接到核酶上來制備變構(gòu)核酶(適體酶)，這種制備利用了這樣的事實，RNA到其它的配體等的連接改變了核酶的結(jié)構(gòu)。變構(gòu)核酶利用小分子作為配體的確切的機理還未被知曉，但是人們認(rèn)為變構(gòu)核酶的機理是通過連接到配體上而進行的，以在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定核酶或破壞核酶的穩(wěn)定(科特斯堡，A.和紹庫普，G.A.2002,—種用于RNA折疊和催化的多功能通信模塊.核酸研究.30:4599-4606.(Kertsburg，A.andSoukup，G.A.2002,AversatilecommunicationmoduleforcontrollingRNAfoldingandcatalysis.泡c/e/c^c/A30:4599-4606);荷西，A.M.、紹庫普，G.A.和布瑞克，R.R.2001,效應(yīng)子通過變構(gòu)核酶的協(xié)同連接.核酸研究.29:1631.1637(Jose,A.M.,Soukup，G.A.，andBreaker,R.R.2001,Cooperativebindingofeffectorsbyanallostericribozyme.7Vwc/ez'cJc/A29:1631.1637);小泉，M.、紹庫普，G.A.、科爾，J.N.和布瑞克，R.R.1999，對第二信使cGMP和cAMP應(yīng)答的核酶的變構(gòu)選擇.自然結(jié)構(gòu)生物學(xué).6:1062.1071(Koizumi,M.,Soukup，G.A.，Kerr,J.N.，andBreaker,R.R.1999,AllostericselectionofribozymesthatrespondtothesecondmessengerscGMPandcAMRA^we所o/.6:1062.1071)。在較早階段就研究了適體酶使用小分子作為配體，但是目前對適體酶與蛋白質(zhì)或寡聚核苷酸的互相作用進行了研究。人端斗立酶反4爭錄酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)是用來調(diào)控癌細(xì)胞的永生和增殖的因素之一。在無限繁殖的生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞和癌細(xì)胞中，端粒酶具有80-90%的端粒酶活性，而在癌細(xì)胞周圍的正常細(xì)胞不具有這種活性J布萊恩，T.M.和切赫，T.R.1999，端粒酶和它對染色體末端的維持.細(xì)胞生物學(xué)新觀點.11;318-324(Bryan，T.M.andCech，T.R.1999，Telomeraseandthemaintenanceofchromosomeends.Cw/rC^/".Ce〃歷o/.11;318-324))。通過利用端粒酶的這些特性，已有熱切的研究還開發(fā)一種與細(xì)胞生長相關(guān)的端粒酶抑制劑，以抑制癌細(xì)胞的增殖(布萊恩，T.M.、恩格勒祖，A.,Gupta，J.、巴杰蒂，S.，和瑞德爾，R.R.1995，在沒有可測到的端粒酶活性的情況下永生人類細(xì)胞中端粒的延長.歐洲分子生物學(xué)學(xué)報.14;4240-4248(Biyan，T.M.,Englezou,A.,Gupta,J.，Bacchetti，S.,andReddel，R.R.1995,Telomereelongationinimmortalhumancellswithoutdetectabletelomeraseactivity.14;4240-4248);阿坦堤，S.E.和狄平候，R.A.2000,沒有端粒酶的老鼠它們所能告訴我們的有關(guān)人類癌癥.國家醫(yī)學(xué)雜質(zhì).6;852-855(Artandi，S.E.andDePinho,R.A.2000，Micewithouttelomerase:whatcantheyteachusabouthumancancer艦Met/.6;852-855))。酶通過對癌細(xì)胞特異性的人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的特異性RNA識別并將hTERT耙向的反式剪接核酶通過商業(yè)化的通信模塊連接到適體上而進行制備，其中，所述hTERT靶向的反式剪接核酶具有已經(jīng)證實的反式剪接能力，并且所述適體具有對茶堿的高度親和力。而且，使用體外反式剪接分析、熒光素酶報告分析、RT-PCR和MTT法，本發(fā)明已經(jīng)確認(rèn)這些核酶僅在茶堿存在于試管和細(xì)胞中的條件下選擇性地識別并切割hTERTRNA,并且核酶的3，端外顯子與靶位點下游區(qū)域進行退火這些變構(gòu)反式剪接核酶可以用于開發(fā)一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠以某些疾病特異性RNA為靶，并且通過使用外源性因子(例如小分子)激活核酶的功能來人為地調(diào)控向治療性基因RNA的取代。并且，可以通過針對已感染細(xì)胞特異性的方式人為地調(diào)控表達的治療性基因的表達來發(fā)展一種特異和可逆的基因治療技術(shù)的新概念(圖1)。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題而設(shè)計了本發(fā)明，并且因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種方法來選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核此外，本發(fā)明的另一個目的提供一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶及其用途，并且該核酶特異性地把向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA。進一步地，本發(fā)明的另一目的是提供一種表達載體及其用途，該表達載體對所述變構(gòu)反式剪接I型核酶進行表達。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種方法來選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種由茶石咸調(diào)控其RNA取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶及其用途，并且該核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA。根據(jù)本發(fā)明的再另一個方面，還提供了一種表達載體及其用途，該表達載體對所述變構(gòu)反式剪接I型核酶進行表達。有益效果如以上所描述地，根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶可以用來選擇性地診斷僅表達了耙hTERTRNA的癌細(xì)胞，或者誘導(dǎo)這些癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是由于所述變構(gòu)反式剪接I型核酶的活性依賴于茶堿的調(diào)控以通過反式剪接反應(yīng)對靶hTERTRNA進行更正。圖1為表示了通過變構(gòu)反式剪接核酶向RNA內(nèi)的取代的調(diào)控的示意圖。圖2表示了靶向hTERT的T/S核酶。圖3表示了依賴于茶堿的變構(gòu)T/S核酶。圖4表示了WTP9和Mu-P9的3'端序列。圖5表示了體外反式剪接反應(yīng)。圖6表示了對體外反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的實時PCR分析。圖7表示了通過具有延長的基因間區(qū)(intergenicspacer,IGS)的T/S核酶進行的體外反式剪接反應(yīng)。圖8表示了通過變構(gòu)反式剪接核酶的體外反式剪接反應(yīng)的相容性。圖9表示了通過變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因。圖IO表示了通過變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因，所述變9構(gòu)反式剪接核酶包括lOOnt的對靶RNA的反義序列。圖ll表示了hTERT細(xì)胞內(nèi)的通過變構(gòu)反式剪接核酶抑制的轉(zhuǎn)基因。圖12表示了通過變構(gòu)反式剪接核酶誘導(dǎo)的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因，所述變構(gòu)反式剪接核酶包括300nt的對靶RNA的反義序列。圖13表示了細(xì)胞內(nèi)的通過變構(gòu)核酶的依賴于茶堿的反式剪接反應(yīng)。圖14表示了表達載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)和腺病毒載體(Ad-TheoRib-TK、Ad-Theo-CRT)的基本結(jié)構(gòu)，各個上述載體編碼依賴于茶堿的反式剪接核酶進行編碼。圖15表示了在hTERT+HT-29細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴于茶》咸的細(xì)胞凋亡。圖16表示了在hTERT+HepG2細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴于茶堿的細(xì)胞凋亡。圖17表示了在hTERT+Capan-l細(xì)胞內(nèi)的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的依賴于茶^f咸的細(xì)胞凋亡。圖18表示了在hTERT-IMR90細(xì)胞內(nèi)的變構(gòu)反式剪接核酶沒有引發(fā)細(xì)胞凋亡。圖19表示了由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的HT-29細(xì)胞的反式剪接反應(yīng)。圖20表示了使用實時PCR分析的由變構(gòu)反式剪接核酶引發(fā)的HT-29細(xì)胞的反式剪接反應(yīng)。具體實施例方式本發(fā)明提供了一種方法來選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，該方法包4舌制備其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或者兩者上的適體酶、其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或者兩者的適體酶，或者其中茶堿配體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地修飾的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者的適體酶；通過茶堿和咖啡因來確認(rèn)是否發(fā)生依賴于茶堿的反式剪接反應(yīng)以比較體外制備的適體酶的變構(gòu)調(diào)控；以及通過哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性來確定在0.1-1mM的茶堿存在下依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因是否得到表達。在這種情況下，用來選擇根據(jù)本發(fā)明一種示例性實施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶的方法可以還包括在所述制備適體酶的步驟中，制備含有對hTERTRNA的100-300nt的反義片段的適體酶。此外，本發(fā)明的方法提供了一種由茶堿調(diào)控RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)RNA，并具在3'外顯子處具有得自螢火蟲(firefly-derived)的熒光素酶受體基因。在此情況下，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶可以具有選自由SEQIDNO:1中描述的AS300AP98T、SEQIDNO:2中描述的AS100Mu-P96T8T以及在SEQIDNO:3中描述的AS300W-P96T8T所組成的組中的RNA序列。而且，本發(fā)明提供編碼變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達載體。在這種情況下，所述表達載體可以包括選自由SEQIDNO:4中描述的pSEAPAS300△P98T畫Luci、SEQIDNO:5中描述的pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci和SEQIDNO:6中描述的pSEAPAS300W-P96T8T-Luci所組成的組中的載體。此外，本發(fā)明提供了一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)RNA，并在3'外顯子上具有單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)細(xì)胞凋亡基因。在這種情況下，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶可以具有SEQIDNO:7中描述的AS300W-P96T8T-TK的RNA序列。此外，本發(fā)明提供了一種表達載體，該表達栽體表達哺乳動物細(xì)胞中的變構(gòu)反式剪接I型核酶。在此情況下，所述表達載體可以包括在SEQIDNO:8中描述的pAvQ畫Theo國Rib21AS國TK(KCCM10935P)。此外，本發(fā)明提供了基因表達誘導(dǎo)物、癌癥診斷劑、或包括變構(gòu)反式剪接的I型核酶和茶堿的基因治療劑。進一步地說，本發(fā)明提供了一種包括所述表達載體和茶堿的基因表達誘導(dǎo)物、癌癥診斷劑或基因治療劑。，在下文中，將更詳細(xì)地對本發(fā)明的示例性實施方式進行描述。在下文中，根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶是指適體酶或依賴于茶堿的適體酶。本說明書中通篇所使用"茶堿適體酶"的表述表示特異性地與茶堿結(jié)合的適體酶。根據(jù)本發(fā)明一種示例性實施方式的變構(gòu)反式剪接I型核酶是一種由于核酶中結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變可以變構(gòu)地增強或抑制核酶的反式剪接活性的分子。在此，由于結(jié)合到某些配體(例如適體)的區(qū)被退火到核酶的底物結(jié)合部位和催化核心部位，當(dāng)適體結(jié)合到所述某些配體上并且該配體被感應(yīng)到以將這些信號通過通信模塊轉(zhuǎn)移到核酶時，核酶結(jié)構(gòu)可以被誘導(dǎo)而改變。本發(fā)明的發(fā)明人通過通信模塊將茶堿適體結(jié)合到hTERT靶向的反式剪接核酶上而發(fā)現(xiàn)了一種適體酶。在此，hTERT靶向的反式剪接核酶在先已基于I型內(nèi)含子建立，并且由茶堿調(diào)控反式剪接核酶的活性，并且該適體酶還能夠僅誘導(dǎo)具有hTERT的癌細(xì)胞的反式剪接。在這種情況下，所制備的為適體酶，其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者上，或者茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中的任一者或兩者的適體酶(參見圖3)。在此，使用商業(yè)程度最高的通信模塊作為適體和核酶彼此退火的位點。而且，在PCR克隆過程中獲得其中部分的P9于的DNA序列被不同的序列所取代的Mu-P96t8t，并且該結(jié)構(gòu)還用于實驗中(參見圖4)。所有是實驗都是通過比較茶堿、咖啡因以及相當(dāng)量的溶劑(dH20或PBS)的結(jié)果而進行的。在此，與茶堿相比擁有一個不同殘基的咖啡因被用來確認(rèn)對茶堿的實驗結(jié)果，而溶劑則被用來作為對照。從適體酶的變構(gòu)調(diào)控的對照和確認(rèn)的體外結(jié)果可以證實，Mu-P96t8t和AP96t通過依賴于茶堿地進行了反式剪接(參見圖5)。而且，當(dāng)Mu-P96t8t和AP9進行PCR反應(yīng)時，相比于AP96t的產(chǎn)量，Mu-P96t8t的反式剪接產(chǎn)物以40%或更多的大量而被表達。通過使用實時PCR,已確定當(dāng)茶堿存在時，在12MuP96t8t產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物是dH20存在的情況下的12倍(參見圖6)。從具有延長的IGS的適體酶的變構(gòu)調(diào)控的對照和確認(rèn)的體外結(jié)果還證實了，雖然核酶具有相同的基本骨架，核酶的活性根據(jù)反義序列的存在被不同地表達(參見圖7)。還在哺乳動物細(xì)胞中確認(rèn)了適體酶的變構(gòu)調(diào)控。考慮到適體酶的體外和細(xì)胞內(nèi)的變構(gòu)調(diào)控彼此不同，將適體酶的體外實驗結(jié)果在體內(nèi)進行試驗。在進行這些實驗之前，將細(xì)胞以依賴于濃度的方式進行處理從而確定細(xì)胞中最佳的茶堿濃度。因此，確定的茶堿的最佳濃度優(yōu)選為O.l-l.OmM的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選為0.7mM(參見圖9)。隨后，進行熒光素酶分析從而確定反式剪接產(chǎn)物是否在細(xì)胞中表達并且所表達的轉(zhuǎn)基因發(fā)揮了作用。在細(xì)胞內(nèi)實驗中，甚至在存在相當(dāng)量的PBS(溶劑)而不是茶堿或咖啡因時，熒光素酶就能得到全面的表達。這表示存在于反式剪接適體3，外顯子的熒光素酶基因在沒有反式剪接的情況下很可能被表達。因此，當(dāng)核酶被轉(zhuǎn)染并在已知沒有靶的細(xì)胞((SK-LUI)中確認(rèn)時熒光素酶很可能在不存在靶的情況下的表達被如所期望地確認(rèn)了。(參見圖11)。增加劑量反義RNA來補充該背景。在反義RNA的增加減少非特異性表達并進一步提高效率的期望下，核酶的反義RNA的用量范圍增加100-300，并且熒光素酶的表達在細(xì)胞中得到確認(rèn)。結(jié)果這反映了熒光素酶的表達速率得到了全面的增加。結(jié)果，在AS-100Mu-P96t8t、AS-300W-P96t8t和AS-300△P98t的例子中，可以觀察到在hTERT陽性細(xì)胞中熒光素酶活性以依賴于茶堿的形式被有效地誘導(dǎo)(參見圖10和圖12)。將細(xì)胞的全部RNA進行分離以核實細(xì)胞中的反式剪接，并且證實了RNA水平的反式剪接產(chǎn)物。如此一來，證實了在模擬條件下在AS300WT中觀察到反式剪接產(chǎn)物帶，并在存在茶;威時觀察到了AS300W-P96T8T(參見圖13)。通過用單純皰滲病毒胸苦激酶(HSV-TK)來取代熒光素類而改變3，外顯子。也就是說,制備了特異性地靶向hTERTRNA并在3'外顯子處具有HSV-TK凋亡基因的變構(gòu)反式剪接I型核酶，并制備了編碼核酶的表達載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)。然后，將制備的表達載體轉(zhuǎn)染到隨后將在實驗中進行使用的腺病毒中。將hTERTP日性細(xì)月包系(HT畫29、HepG2和Capan-l)和hTERT陰性細(xì)胞系(IMR90)用各種腺病毒進行處理，然后還用更昔洛韋(ganciclovir,GCV)、茶堿和咖啡因分別處理五天，以使用MTT分析觀察細(xì)胞凋亡。在這種情況下，使用Ad-TK(在CMV啟動子的調(diào)控下表達HSVtk基因的腺病毒栽體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽性對照，并使用Ad-Rib-TK(對hTERT特異并且以HSVtk標(biāo)記的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽性對照。并且，使用Ad-LacZ(在CMV啟動子的調(diào)控下對LacZ基因進行表達的腺病毒載體)作為陰性對照。作為結(jié)果地，顯示了當(dāng)用GCV處理hTERT+細(xì)胞系時，無論是否存在調(diào)節(jié)復(fù)合體時(regulatorcompound),hTERT+細(xì)胞系中的腺病毒載體Ad-TK和Ad-Rib-TK死亡，而Ad-TheoRib-TK僅在茶堿存在時才發(fā)生特異性地細(xì)胞凋亡(參見圖15-17)。還確認(rèn)了陰性對照Ad-LacZ在每一種情況下都不發(fā)生細(xì)胞凋亡。對hTERT-細(xì)胞系IMR90進行試-瞼以確定上述特異性的細(xì)胞凋亡是否由靶RNA調(diào)控。作為結(jié)果地，當(dāng)用GCV處理hTERT-細(xì)胞系時，Ad-TK發(fā)生細(xì)胞凋亡而Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，確認(rèn)了細(xì)胞凋亡是由hTERT靶向RNA調(diào)控的(參見圖18)。將含有100M.O.I的腺病毒的hTERT+細(xì)胞用100pM的化學(xué)制品處理以獲得全部RNA，并且將少量的得到的全部RNA進行實時PCR分析，所述腺病毒的凋亡在MTT分析中被高度誘導(dǎo)。結(jié)果，與用Ad-Rib-TK轉(zhuǎn)染的hTERT十細(xì)胞時相比，僅在Ad-Theo-CRT-移入的HT-29細(xì)胞中并且在茶堿的存在的情況下確認(rèn)了反式剪接產(chǎn)物，并且該反式剪接產(chǎn)物以基本相似的濃度進行表達。這反映了當(dāng)用咖啡因處理hTERT+細(xì)胞時，產(chǎn)生了顯著的濃度的反式剪接產(chǎn)物，但是與用茶堿處理hTERT+細(xì)胞時相比，它的濃度降^氐了約78%(參見圖20)。這說明了咖啡因?qū)Σ鑹A適體的親和力比茶堿低1000倍，但是對茶堿適體還具有一定程度上的顯著的親和力。從這些結(jié)果可以看出，由才艮據(jù)本發(fā)明一種示例性實施方式的變構(gòu)核酶導(dǎo)致的靶特異性細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是依賴于細(xì)胞中的茶堿的，并且是通過靶RNA特異的反式剪接反應(yīng)而啟動的。實施例下面，將參考附圖對本發(fā)明的示例性實施方式進行描述，但本發(fā)明不特別地局限于此。參考實施例1:底物(hTERT)RNA的制備為了制備靶RNA,用SEQIDNO:9中描述的引物(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGGCAGCGCTGCGTCCT-3，)和SEQIDNO:10中描述的引物(5'畫CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3，)對含有hTERT的第-1到第+218的DNA序列的pCl-neo載體(外顯子1-2)進行PCR擴增，從而制得編碼hTERTRNA的DNA片段。將按此制備的DNA片段體外轉(zhuǎn)錄到RNA中。加入DNA模板(3嗎)、10x的轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM的DTT(西格瑪公司(sigma))、0.5mM的ATP、GTP、CTP和UTP(羅氏(Roche))，80U的RNA酶抑制劑(可斯克(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安爺(Ambion)),并加入焦碳酸二乙酯水(DEPC-H20)至終體積為100pi,然后進行混合。然后將得到的混合物在37。C下反應(yīng)3小時，并進一步地用5U的DNA酶I(普洛麥格(Promega))在37°C下處理30分鐘，以完全除去DNA模板。通過苯酚提取(phenolextraction)(pH7.0)和乙醇沉淀來提純RNA，并在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離以洗提RNA帶。然后，將RNA帶提純并溶解在TE緩沖液中(10mM的三羥甲基氨基曱烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，pH7.5以及1mM的EDTA)。參考實施例2:依賴于茶堿的hTERT靶向反式剪接(T/S)適體酶的克隆作為用于發(fā)展變構(gòu)核酶的&出反式剪接核酶骨架,使用了I型內(nèi)含子核酶，所述I型內(nèi)含子核酶特異性地識別hTERT的+21核苷酸(nt)位點并具有對靶RNA的300nt的反義序列在該處進行退火的PI、P10和延長的IGS,(權(quán)，B.S.、榮格，H.S.、宋，M.S.、曹，K.S.、金，S.C.、基姆，K.、鄭，J.S.、金，I.H.和李，S.W.2005,通過核酶介導(dǎo)的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄物的靶向取代對人類癌細(xì)胞的特異性衰退.分子治療學(xué).12:824-834(Kwon，B.S.,Jung，H.S.，Song,M.S.,Cho，K.S.,Kim,S.C.,Kimm，K.,Jeong,J.S.,Kim，LH,，andLee，S.W.2005,Specificregressionofhumancancercellsbyribozyme-mediatedtargetedreplacementoftumor-specifictranscript.Mo/.77^r12:824-834);洪，S.H.、鄭，J.S.、李，Y丄、榮格,H.I.、曹，K.S,、金，C.M.、權(quán)，B.S.、薩倫格，B.A.、李，S.W，和金,I.H.*2008，15hTERT通過反式剪接核酶來靶向肺瘤細(xì)胞而在活體內(nèi)的重組.分子治療學(xué).16:74-80(Hong，S.H.，Jeong，J.S.，Lee，Y丄，Jung，H丄，Cho,K.S.，Kim，C.M.,Kwon，B.S.，Sullenger，B.A.,Lee，S.W.*，andKim，I.H,*2008，InvivoreprogrammingofhTERTbytrans-splicingribozymetotargettumorcells.Mo/7Tzer.16:74-80))。在耙向hTERT的核酶的P6和P8區(qū)中的之一或者二者上通過通信模塊的方式克隆茶堿適體。還在AP9核酶的例子中，其中P9區(qū)從該核酶中缺失，靶向hTERT的核酶的P6和P8區(qū)按照上述相同的方式進行<多飾。通過使用含有IGS的在SEQIDNO:11中描述的引物(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，)和在SEQIDNO:12中描述的引物(5，-CGAGTACTCCAAAACTAATCAA-3，)，靶向hTERT的反式剪接核酶的基因被擴增、用限制性內(nèi)切酶HindIII和NruI進行斷裂，并隨后克隆到SEAP啟動子載體上，所述SEQIDNO:11中描述的引物能從自我剪接核酶中對hTERT進行靶向，所述自我剪接核酶上茶^咸適體通過通信模塊進行退火，所述SEQIDNO:12中描述的引物能對核酶的3'外顯子的上游基因進行擴增，所述茶堿適體在所述靶向hTERT的反式剪接核酶進行退火。用在SEQIDNO:13中描述的引物(5，-CGATGATCACGAAGACGC-3，)和在SEQIDNO:14中描述的引物(5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTACAATTTGGACTTT-3，)對熒光素酶基因進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶NruI和XbaI進行斷裂，并隨后克隆到核酶的3，末端中。然而，在使用PCR的克隆過程中得到了其P9區(qū)被修飾為不期望的序列的結(jié)構(gòu)。除了所述結(jié)構(gòu)之外，兩種野生型結(jié)構(gòu)(即，野生型P96t和野生型P98t)、3種刪除的結(jié)構(gòu)(即，AP96t、AP98t和AP96t8t)和突變結(jié)構(gòu)(MuP96t8t)也被制備，并且制備含有AP9的無適體的野生型P9和8結(jié)構(gòu)作為對照。所制備的依賴于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶的DNA序列在全部為10|il的反應(yīng)混合物中進行擴增，該反應(yīng)混合物包括3^的終止子預(yù)備(ready)反應(yīng)混合物(PE應(yīng)用的生物系統(tǒng)(PEappliedBiosystems))、100ng的量化的DNA、和3.2pmol的經(jīng)過25個循環(huán)(96°C-10秒，50°C-5秒和60°C-4秒)后的在SEQIDNO:15中描述的引物(5，-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3，)。為了對這種依賴于茶堿的靶向hTERT的T>S適體酶的擴增的基因進行純化，隨后加入40pi的dH20，并向擴增的反應(yīng)混合物中加入3M的NaoAC(1/10體積)和100%的EtOH(2體積)。將得到的反應(yīng)混合物攪拌，在4°C下離心分離30分鐘，轉(zhuǎn)速為13,000rpm以獲得DNA小球(DNApellet)。將該DNA小球用70%的乙醇(EtOH)(400^)進行洗滌，并在高速真空干燥器中進行干燥以除去EtOH。將干燥的DNA小球溶解在15pi的模板抑制劑(templatesuppressionreagent)中。接著，將得到的DNA溶液進行攪拌并慢慢減速，并轉(zhuǎn)移到測序管(sequencingtube),在自動序列分析儀(ABI310遺傳分析儀(ABI310GeneticAnalyzer))上進行測序。參考實施例3:依賴于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶的制備用含有T7聚合酶啟動子的SEQIDNO:16中描述的引物(5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，)和用核酶的3'外顯子的中間位點進行退火的在SEQIDNO:17中描述的引物(5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA誦3，)對參考實施例2在這種情況下，DNA模板(3嗎)和NTP(1.5mM)的增加的量用于盡可能地防止自我剪接反應(yīng)。然后，加入lx的剪接緩沖液(40mM的Tris-HCl，pH7.5、5mM的MgCl2,10mM的二疏蘇糖醇(DTT)和4mM的亞精胺)、0.5mM的ATP、GTP、CTP、UTP(Roche))、80U的RNA酶抑制劑(Kosco))、200U的T7RNA聚合酶(安拜昂(Ambion)),并加入DEPC-H20至終體積為100pl，然后進行混合。然后將得到的混合物在37。C下轉(zhuǎn)錄3小時，并進一步地用5U的DNA酶I(普洛麥格(Promega))在37°C下處理30分鐘以完全除去DNA模板。通過苯酚提取(pH7.0)和乙醇沉淀來提純RNA，并在4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離以洗提RNA帶。然后，將RNA帶提純并溶解在TE緩沖液中(10mM的三羥曱基氨基曱烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，pH7.5以及1mM的EDTA)。參考實施例4:體外反式剪接反應(yīng)存在茶堿(500|iM)或者具有不同的來自茶堿的殘基的咖啡因(500),或者相當(dāng)量的dH20時，在剪接條件下(50mM的羥乙基旅、秦乙磺酸(HEPES)，pH7.0/150mM的NaCl/5mM的MgCl2/100piM的鳥嘌呤),將核酶(50nM)反應(yīng)產(chǎn)物在RT-PCR反應(yīng)中進行分析。在這種情況下，用焚光素酶識別位點(5'國CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA-3'，SEQIDNO:18)作為反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT)的引物，并4吏用識別hTERTRNA的5，末端的位點(5，-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3，，SEQIDNO:19)和識別熒光素酶基因的位點(5，-CCCAAGCTTTCACTGCATACGACGATT-3，，SEQIDNO:20)分別作為聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)的5，和3，端引物。參考實施例5:半定量PCR在體外反式剪接反應(yīng)之后，將反式剪接產(chǎn)物進行實時PCT,然后進行半定量PCR。將各個DNA樣品測試三次以計算平均值并確定其熔點，然后在瓊脂糖膠中觀察DNA樣品。在這種情況下，用綠色熒光染料(SYBRGreen)來檢測DNA樣品，并將由RT反應(yīng)量化的標(biāo)準(zhǔn)對照用于半定量地與DNA樣品進行比較。為了校準(zhǔn)的目的，在RT反應(yīng)中向各個樣品中加入相等量的任何RNA(rasRNA)，并將RT引物設(shè)計成使得反式剪接產(chǎn)物和內(nèi)對照rasRNA能夠被一種引物反轉(zhuǎn)錄。在此，將SEQIDNO:21中描述的引物(5，-GCCCAACACCGGCATAAAGTTACATAATTACACACTT-3，)制備為RT引物。因此，用來定量比較反轉(zhuǎn)錄樣品的rascDNA的濃度來校準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄樣品的濃度。'PCR反應(yīng)在PCR條件下進行在96。C下預(yù)熱10分鐘，在96。C下變性5分鐘，在60。C下退火15秒，并且在72。C下延伸30秒。在這種情況下，使用hTERT識別位點(5，-CCCGAATTCTGCGTCCTGCTCGA,SEQIDNO:22)作為5'引物，并使用熒光素酶識別位點(5，-CCCAAGCTTTCACTGCATACACGATT，SEQIDNO:23)作為3'引物。作為內(nèi)對照，使用mscNDA的PCR引物如下5，引物(5'-ATGACTGAATATAAACTT，SEQIDNO:24)和3，引物(5，-CCCAAGCTTTACATAATTACACACTT，SEQIDNO:25)。參考實施例6:具有提高的特異性的特異性T/S適體酶的制備用SEQIDNO:26中描述的引物(5，-AATTCAAGCTTCGTTTTGCGGCAGCAGGAAAAGTTATCAGGCATG-3，)和SEQIDNO:27中描述的引物(5，誦CCTGATAACTTTTCCTGCCGCAAAACGAAGCTTG國3，)來對朝向被基因間區(qū)(IGS)在hTRET上識別的hTRET序列的3，末端的互補的100nt反義鏈進行PCR擴增，并用SEQIDNO:28中描述的引物(5，-GGGAAGCTTGGGAAGCCCTGGCCC-3，)和SEQIDNO:29中描述的引物(5，-GGGAAGCTTAAGGCCAGCACGTTCTT-3，)進行PCR擴增300nt反義鏈。隨后，將擴增的反義鏈克隆到預(yù)先制備的核酶結(jié)構(gòu)上游的HindIII限制酶切位點。參考實施例7:細(xì)胞培養(yǎng)將hTERT陽性細(xì)胞系在5。/。C02的恒溫箱中在37。C下進行培養(yǎng)，以293(人腎臟/正常)、HT-29(結(jié)腸/結(jié)腸腺癌)、Capan-1(胰腺/腺癌)和HepG2(肝/肝細(xì)胞癌)作為參考，并將hTERT陰性細(xì)胞系在5。/。C02的培養(yǎng)箱中在37。C下進行培養(yǎng)，以IMR-90(肺/成纖維細(xì)胞/正常)和SK-LU1(肺/腺癌)美國典型物保藏中心(ATCC)作為參考。參考實施例8:對細(xì)胞系中反式剪接適體酶的特異性和效率的證實1)茶堿最佳濃度的試驗在35mm的皿中將293細(xì)胞以3xl05的濃度進行接種，并生長到大約80%的匯合。在這種情況下，用脂質(zhì)體LipofectAMINE(英杰(Invitrogen))使生長的293細(xì)胞轉(zhuǎn)染1|ig的MuP96t8t。將轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞分別置于遞增濃度的茶堿或咖啡因中(0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM)培養(yǎng)18小時，然后進行熒光素酶分析。使用相同量的PBS作為對照。2)雙熒光素酶分析將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基從35mm的皿中除去，并用lxPBS進行洗滌。然后，向各個轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入200^的lx被動裂解緩沖液，并使轉(zhuǎn)染細(xì)胞在室溫下裂解15分鐘以獲得細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞裂解液以13,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離1分鐘，并將得到的上清液分別轉(zhuǎn)移到新管中。向光度計管中放入100^的LARII(焚光素酶檢測試劑II),還加入20]al的細(xì)胞裂解液并混合。然后，將得到的混合物用光度計進行讀數(shù)。再向光度計試管中加入100pil的斯達普和格婁(Stop&Glo)混合試劑(Stop&Glo20+Stop&Glo緩沖液1ml)，并進行混合。隨后，在將得到的混合物用光度計(TD+20/20)進行讀數(shù)。將延遲時間設(shè)定為3秒，將積分時間設(shè)定為12秒，并且將靈敏度設(shè)定為45%以適用于各個待測細(xì)胞。對于轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞用溶解于PBS的茶堿和咖啡因進行處理。此外，當(dāng)所使用的MEM培養(yǎng)基在細(xì)胞感染后用新的MEM培養(yǎng)基更換時，用各種化學(xué)制品處理細(xì)胞培養(yǎng)物，培養(yǎng)18個小時并隨后進行焚光素酶分析。3)細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)使用4pl的lipofectamine使293細(xì)胞短暫地轉(zhuǎn)染1fig的核酶載體。轉(zhuǎn)染之后5個小時，用添加有0.7mM的茶vf成或咖啡因的新鮮培養(yǎng)基更換所使用過的培養(yǎng)基，并保持18小時以獲得細(xì)胞裂解液。然后，從細(xì)胞裂解液中提純?nèi)縍NA。在這種情況下，使用補充有20mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的鳥噪呤異氰酸鹽細(xì)胞裂解溶液來提取RNA，從而最小化體外反式剪接反應(yīng)的可能。用識別熒光素酶的引物(5，-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA,SEQIDNO:30)對所提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA。用作為3，引物的巢氏熒光素酶引物(5'-CCCAAGCTTGCCCAACACCGGCATAAAG，SEQIDNO:31)，和作為5，引物的識別hTERT的5'末端的識別位點(5，-AGCGCTGCGTCCTGCT,SEQIDNO:32)對所述cDNA進行PCR擴增。在PCR條件下進行40循環(huán)的PCR反應(yīng)在96°C下預(yù)熱10分鐘、在96°C下變性5分鐘、在58。C下退火30秒，在72。C下延伸20秒。在這種情況下，所提取的作為對反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)對照的RNA用寡聚脫氧胸苷酸(oligodT)進行反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)5，引物(5'誦TGACATCAAGAAGGTGGTGA，SEQIDNO:33)和GAPDH3'引物(5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA,SEQIDNO:34)進行擴增，以觀察到用作內(nèi)部對照的GAPDHRNA的表達水平。4)腺病毒的制備，該腺病毒表達依賴于茶堿的靶向hTERT的T/S適體酶將pAvQ穿梭載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和BstBI斷裂，并將DNA片段WTP9-TK和AS300W-P96T8T-TK克隆到該pAvQ穿梭載體內(nèi)以制備載體，該載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)在CMV啟動子的調(diào)控下對核酶進行表達。用限制性內(nèi)切酶PmeI對所制備的載體進行線性化，并使用電穿孔法與5型腺病毒基因組DNA質(zhì)粒、AE1/E3pAdeno載體(pAdenovector)(求必精(Qbiogene))—起共轉(zhuǎn)染到BJ5183細(xì)菌內(nèi)。對通過同源重組在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獲得的重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)進行分離、提純并通過小量制備進行檢查。然后，用限制性內(nèi)切酶Pacl將重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)進行線性化，并轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系(packagingcellline)293細(xì)胞中。得到通過病毒增殖(viralproliferation)形成的蝕斑克隆(plaqueclones),并除去細(xì)胞殘渣以獲得病毒上清液。用該病毒上清液對感染的293細(xì)胞進行感染，以證實是否發(fā)生細(xì)胞溶解。在CMV啟動子調(diào)控下表達AS300WTP9-TK(原始T/S核酶)和AS300W-P96T8T-TK(變構(gòu)T/S核酶)的腺病毒載體襪分別命名為Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib國TK。為了確定重組腺病毒(Ad-Rib-TK和Ad-TheoRib-TK)已經(jīng)被順利的制備，用獲得自重組病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清液感染293細(xì)胞，并且通過細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)證實重組的腺病毒。此外，通過從病毒上清液獲得DNA并在DNA上進行PCR實驗(TK和病毒ITR位點)來證實重組的腺病毒，所述病毒上清液獲自誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的蝕斑克隆。從感染了病毒的細(xì)胞的裂解液中提取RNA，并且在該RNA(TKRNA)上進行RT-PCR以證實是否重組病毒構(gòu)建體被成功地制備，以及來自該病毒的轉(zhuǎn)基因是否被表達。用獲得自用各種重組腺病毒克隆感染的293細(xì)胞的上清液的重組病毒對293細(xì)胞進行數(shù)次感染，從而對重組病毒進行擴增。然后，使用(維瓦純⑧愛迪樂派克TM(VivapureAdenoPACKTM))將重組腺病毒載體分離并提純。將得到的重組病毒連續(xù)稀釋，并隨后進行半數(shù)組織培養(yǎng)感染量分析(TCID50assay)以確定提純的病毒栽體的蝕斑形成單位滴度(PFUtiter)。5)MTT分析將細(xì)胞種在96孔板(TPP)內(nèi)一天，并隨后分別用Ad-TK(在CMV啟動子調(diào)控下表達TK基因的腺病毒載體)、Ad-Rib-TK、Ad-TheoRib-TK和Ad-LacZ(在CMV啟動子調(diào)控下表達LacZ基因的腺病毒載體)病毒進行感染。從病毒感染那天起，每兩天到五天就用相同的新的培養(yǎng)基來更換使用過的添力口有GCV和化學(xué)制品(茶堿或咖啡因)的培養(yǎng)基。將HT-29抹系以細(xì)胞數(shù)為3xl03/孔進行接種，將HepG2抹系以細(xì)胞數(shù)為3xl0V孔進行接種，將Capan-l抹系以細(xì)胞數(shù)為5xl0"孔進行接種，并將IMR90抹系以細(xì)胞數(shù)為5xl0"孔進行接種。在這些抹系接種的5天后，向各個細(xì)胞培養(yǎng)基中加入細(xì)胞滴度96⑧液相唯一溶液型細(xì)胞繁殖測定(CellTiter96AQueousONESolutionCellProliferationAssay)(Promega)從而使其達到全部培養(yǎng)基的20°/。，對96孔用100pi的得到的細(xì)胞培養(yǎng)基每孔進行培養(yǎng)，并使用微板讀數(shù)模型550(Microplatereadermodel550)(伯樂(BioRad))在490nm波長下進行測量，以觀察細(xì)胞的細(xì)胞存活率。6)半定量PCR用腺病毒感染35mm的皿，并在感染后的24小時用同樣的新的培養(yǎng)基替換補充有化學(xué)制品(茶堿或咖啡因)的使用的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基更換24小時候后，使用TriZol反應(yīng)劑(Invitrogen)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提純RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，并使用實時PCR將其在反式剪接產(chǎn)物上進行半定量PCR。用GAPDHPCR產(chǎn)物的濃度對T/SPCR產(chǎn)品的濃度進行校準(zhǔn)。用寡居核苷酸(dT)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并通過4吏用實時PCR將得到的cDNA用作為3，引物的TK引物(5，-CCCATGCACGTCTTTATCCTGGAT-3，，SEQIDNO:35)和作為5，引物的識另'JhTERT5，末端的位點(5，-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3，，SEQIDNO:36)進行擴增。所提取的作為對反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)對照的RNA用寡聚脫氧胸苷酸(oligodT)進行反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)5，引物(5,-TGACATCAAGAAGGTGGTGA，SEQIDNO:37)和GAPDH3,引物(5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA，SEQIDNO:38)進行擴增，以觀察到用作內(nèi)部對照的GAPDHRNA的表達水平。實施例1:反式剪接核酶的制備，該核酶具有附著其上的茶堿適體并特異性地靶向hTERTRNA作為用于發(fā)展變構(gòu)核酶的1^出反式剪接核酶骨架,使用了I型內(nèi)含子核酶，所述I型內(nèi)含子核酶特異性地識別hTERT的+21nt位點并具有對靶RNA的300nt的反義序列在該處進行退火的Pl、P10和延長的IGS(圖2)。觀察到這種核酶通過在細(xì)胞和動物模型(animalmodel)中特異性地表達hTERTRNA來誘導(dǎo)了表達hTERT的癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡(Mo/.772^.2005;12:824,Mo/2008;16:74)為了制備依賴于茶堿的變構(gòu)核酶，用作為茶堿的受體區(qū)的茶堿RNA適體22(Science1994;263:1425)被同時附著到P6或/和P8區(qū)中的任一者或二者上，這在用于由本申請的研究小組所研發(fā)的hTERT特異性T/S核酶的催化功能的RNA折疊中扮演著重要的角色。而且，通過將茶堿適體連接到P9區(qū)被最小化的AP9區(qū)所取代或被修飾的核酶的P6、P8或P6+P8區(qū)而制備了T/S核酶。圖3表示了I型內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和RNA序列，該I型內(nèi)含子與反式剪接核酶、茶堿適體、和其中茶堿適體與核酶退火的通信模塊結(jié)構(gòu)等同源(核酸研究方法.2002;30:4599(NucleicAcisRes.2002;30:4599))。所制備的反式剪接核酶結(jié)構(gòu)列出如下國hTERT特異性反式剪接核酶(WT)_其中適體附著到野生型(WT)的P6或P8區(qū)的核酶(W-P96t，WT-P98t)誦其中適體附著到突變P9的P6和P8區(qū)的核酶(Mu-P96t8t)-其中WT核酶的P9區(qū)被AP9取代的核酶(AP9)_其中適體附著到AP9核酶的P6、P8、P6+P8區(qū)的核酶(AP96t、AP98t、△P96t8t)其中附著有對hTERT的反義的300nt序列的WT核酶(AS-300WT)-具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核瞰IGSW畫P96t8t)-使反義的300nt序列附著其上的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核酶(AS-300W-P96t8t)畫使反義的300nt序列附著其上的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的MU-P9核酶(AS-300Mu-P96t8t)在制備核酶載體的PCR程序中通知制備了突變P9的結(jié)構(gòu)，并且這反映了在用靶RNA(hTERTRNA)進行體外反式剪接反應(yīng)時，突變P9的結(jié)構(gòu)不影響核酶的活性。因此，作為一種制備根據(jù)本發(fā)明的變構(gòu)核酶的參與者，還制備了基于突變P9的核酶結(jié)構(gòu)，并確定了其功能。圖4表示了野生型P9序列和突變P9(Mu-P9)。另一個序列區(qū)域用粗體和下劃線的字母示出。實施例2:對具有取代依賴于茶堿的RNA的能力的核酶的定量分析按此制備的核酶和作為底物RNA的hTERTRNA在37'C的剪接條件下反應(yīng)3小時，并將得到的剪接產(chǎn)物通過RT-PCR反應(yīng)進行分析。在剪接反應(yīng)中，水或0.5mM的咖啡因(茶>威結(jié)構(gòu)類似物、用于變構(gòu)效應(yīng)的特異性的陰性對照)或0.5mM的茶堿一起反應(yīng)以觀察反式剪接反應(yīng)是否以茶堿特異性的方式變構(gòu)地發(fā)生。圖5表示了RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。參見圖5，它反映了WT和AP9核酶如所預(yù)期的總是無關(guān)于咖啡因、茶堿和水地誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)，并且W-P96t也無關(guān)于這些化合物地誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)。而且，這還反映了W-P98t以茶堿特異性的方式誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)，并且，在AP98t和AP96t8t的情況下反式剪4妄反應(yīng)可能#:無效地誘導(dǎo)。同時，它還反映了在Mu-P96t8t和AP96t核酶的情況下具有319bp大小的反式剪接產(chǎn)物以茶堿特異性的方式在體外被制備。因此，它反映了根據(jù)核酶的P9序列或結(jié)構(gòu)特性，I型內(nèi)含子的P6或P8區(qū)是能夠以依賴于茶堿的方式變構(gòu)地調(diào)控核酶活性的主要區(qū)。為了比較并分析由變構(gòu)核酶產(chǎn)生的依賴于茶堿的反式剪接反應(yīng)的誘導(dǎo)的調(diào)控程度，進行了對反式剪接產(chǎn)物的實時PCR分析(分析設(shè)備擴貝特研究RG6(CorbettResearchRG6))。用hTERTRNA對Mu-P96t8t核酶或WT核酶進行剪接，然后進行RT反應(yīng)，所述Mu-P96t8t核酶的酶活性通過茶堿依賴方式的反式剪接反應(yīng)進行調(diào)控，所述WT核酶具有無關(guān)于小分子化合物的結(jié)構(gòu)酶活性。對于反轉(zhuǎn)錄樣品的定量分析，使用rascDNA的濃度來校準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄樣品的濃度。結(jié)果示于圖6。參見圖6,它反映了在WT核酶的情況下無論是否存在水、茶堿和咖啡因，相同濃度的反式剪接產(chǎn)品在剪接緩沖液中產(chǎn)生。從反應(yīng)產(chǎn)物的實時定量分析來看，還反映了依賴于茶堿的反式剪接反應(yīng)不會在AP96t核酶中發(fā)生。然而，在Mu-P96t8t核酶的情況中，反映了當(dāng)用內(nèi)部調(diào)控來對分別的RT樣品中的反式剪接產(chǎn)物的濃度進行校準(zhǔn)時，在茶堿的存在下產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物的濃度比存在咖啡因的情況要高4.3倍，并且比存在相同體積的dH20時濃度要高12.16倍，所述Mu-P96t8t的活性如以上的實驗所描述地以依賴于茶堿的形式在體外被調(diào)控。因此，這表示了Mu-P96t8t核酶為變構(gòu)核酶，其反式剪接活性可以以依賴于茶堿的方式在體外進行調(diào)控。由于被分析的核酶的基因間區(qū)(IGS)僅具有6nt序列，應(yīng)該將具有延長的IGS組的核酶用于進行細(xì)胞內(nèi)的靶RNA特異性的反式剪接反應(yīng)(Ato.所otec/2"o/.1996;15:902,/Mo/.所o/.1999;185:1935，Mo/.772eK2003;7:386，Mo/.772en2004;10:365;Mo/.77^.2005;12:824)。具有延長的IGS的核酶通過體外轉(zhuǎn)錄而被制備，并隨后用hTERTRNA進行體外反式剪接反應(yīng)。在這種情況下，無論反式剪接是否以依賴于茶堿的形式進行，都可以觀察到上述現(xiàn)象。所制備的核酶對其上附著有對hTERT的反義300nt序列的WT核酶(AS-300WT);具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)并含有附著到P6+P8區(qū)上的適體的WT核酶(IGSW-P96t8t);其上附著有翻譯300nt序列的并含有附著到P6+P8區(qū)的適體的WT核酶(AS-300W-P96t8t);以及其上附著有反義30nt序列并含有附著到P6+P8區(qū)上的適體的Mu-P9核酶(AS-300Mu-P96t8t)進行誘導(dǎo)，并且它們的反式剪接反應(yīng)結(jié)果(反式剪接產(chǎn)物的RT-PCR產(chǎn)物)示于圖7。在圖7中，反映了AS-300WT誘導(dǎo)的剪接反應(yīng)如所預(yù)期地與茶堿無關(guān)。同時，還反映了AS300W-P96t8t誘導(dǎo)的體外剪接反應(yīng)與茶堿無關(guān)，但是與不含AS-300核酶不同地，AS300Mu-P96t8t不能輕易地誘導(dǎo)剪接反應(yīng)。同時，還反映了不含有反義序列并具有Pl和P10螺旋結(jié)構(gòu)的IGSW-P96t8t僅在茶堿的存在下才誘導(dǎo)反式剪接反應(yīng)。這些結(jié)果說明了，雖然具有6ntlGS序列的核酶和具有延長的IGS序列的核酶據(jù)喲相同的勤出骨架結(jié)構(gòu)，它們可能具有結(jié)構(gòu)上的差別，其中，它們根據(jù)反義序列的存在而表現(xiàn)出不同的活性。因此，這反應(yīng)了具有延長的IGS序列的核酶的剪接活性應(yīng)該在體外和/或體內(nèi)被觀察到。從以上的結(jié)果可以看出，在一些附著有茶堿適體的核酶中，反式剪接活性在體外以依賴于茶堿的方式被變構(gòu)地調(diào)控。為了證實是否反式剪接產(chǎn)物在嚴(yán)格的反式剪接反應(yīng)中產(chǎn)生，將制備的反式剪接RT-PCR產(chǎn)物克隆到pUC19載體中并進行測序。如圖8所示地，從反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的測序數(shù)據(jù)可以確定，附著到核酶的3'外顯子的螢火蟲焚光素酶RNA被嚴(yán)格地退火到作為靶RNA的第+21個nt位點的下游位點。該結(jié)果意味著非常精確地發(fā)生了變構(gòu)反式剪接核酶的反式剪接反應(yīng)。實施例3:使報告基因附著到3，外顯子的變構(gòu)反式剪接核酶的制備為了制備農(nóng)賴于茶堿的變構(gòu)核酶的表達載體，用作為茶堿的受體區(qū)的茶堿RNA適體(Science1994;263:1425)被同時附著到P6或/和P8區(qū)中的任一者或二者上，這在用于由本發(fā)明的研究小組所研發(fā)的hTERT特異性T/S核酶的催化功能的RNA折疊中扮演著重要的角色(NucleicAcisRes.2002;30:4599)。而且，通過將茶堿適體連接到P9區(qū)被最小化的AP9取代所取代或被修飾的核酶的P6、P8或P6+P8區(qū)而制備了反式剪接核酶。作為用來誘導(dǎo)核酶表達的轉(zhuǎn)基因，螢火蟲熒光素酶基因被嵌入到核酶的3，外顯子中，并且使用SV40啟動子系統(tǒng)以促進核酶的細(xì)胞內(nèi)表達。所制備的反式剪接核酶結(jié)構(gòu)列舉如下。通過從為了體外剪接反應(yīng)而制備的變構(gòu)核酶結(jié)構(gòu)的核酶區(qū)域到熒光素酶基因的3'末端的序列進行PCR擴增、將擴增的DNA嵌入到含有SV40啟動子的pSEAP載體(克隆科技(Clontech))的HindIII和XbaI限制酶切位點，并將對hTERTRNA的反義序列嵌入到HindIII限制酶切位點而進行載體的構(gòu)建。在這種情況下，用于擴增核酶的5'引物含有PI和PIO螺旋結(jié)構(gòu)和識別hTERTRNA(5，-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3，，SEQIDNO:39)的IGS序列。①含有對hTERTRNA的100nt反義序列的載體；-hTERT特異性核酶(AS-100WT)的表達載體-其中適體附著到WT核酶的P6和P8區(qū)的核敏AS-100W-P96t,AS-100WT-P98t)的表達載體_其中適體附著到突變P9的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-100Mu-P96t8t)的表達載體(pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci，SEQIDNO:5)-其中適體附著到AP9核酶的P6、P9和P6+P8區(qū)上的核酶(AS-100AP96t，AS-100AP98t，AS-100AP96t8t)的表達載體②含有對hTERTRNA的300nt反義序列的載體-hTERT特異性核酶(AS-300WT)的表達載體一其中適體附著到WT核酶的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-300W-P96t8t)的表達載體(pSEAPAS300W-P96T8T-Luci，SEQIDNO:6)-其中適體附著到突變P9的P6+P8區(qū)上的核酶(AS-300Mu-P96t8t)的表達載體-其中適體附著到AP9核酶的P6區(qū)上的核酶(AS-300AP96t)的表達載體-其中適體附著到AP9核酶的P8區(qū)上的核酶(AS-300AP98t)的表達載體(pSEAPAS300DeltaP98T-Luci,SEQIDNO:4)實施例4:對細(xì)胞內(nèi)核酶的依賴于化合物的hTERTRNA的特異性取代的觀察1)依賴于茶堿的反式剪接轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)條件的建立首先，按以上所制備的使熒光素酶基因附著到3'外顯子的變構(gòu)核酶的誘導(dǎo)條件通過確定在什么樣的細(xì)胞內(nèi)茶堿濃度下轉(zhuǎn)基因得到最變構(gòu)化的誘導(dǎo)而建立。293細(xì)胞用Mu-P96t8t核酶表達載體進行瞬時轉(zhuǎn)染，所述Mu-P96t8t核酶表達載體以依賴于茶堿的方式誘導(dǎo)了反式剪接反應(yīng)，伴隨著脂質(zhì)體lipofectamine穿過體外反式剪接反應(yīng)。在這種情況下，為了測量轉(zhuǎn)染效率并對被表達的產(chǎn)物的活性進行標(biāo)準(zhǔn)化，293細(xì)胞與在CMV啟動子的調(diào)控下能夠表達海腎熒光素酶(renillarluciferase)的載體被共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4個小時，用新鮮培養(yǎng)基更換使用過的培養(yǎng)基。在這種情況下，向新鮮的培養(yǎng)基中加入0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1mM的咖啡因或茶石威，以i正實咖啡因或茶堿的濃度能最大地誘導(dǎo)依賴于茶堿的形式的焚光素酶的活性。更換培養(yǎng)基后18個小時，得到細(xì)胞裂解液，并隨后用光度計TD-20/20(特納設(shè)計儀器(TurnerDesignsInstrument))測量標(biāo)準(zhǔn)化到海腎熒光素酶活性的螢火蟲熒光素酶活性。在此情況下，作為載體(SV40-Luci)轉(zhuǎn)染后而制備的熒光素酶濃度的相對值(%)的所測量的熒光素酶活性如圖9所示地，被表示為能夠在SV40啟動子的調(diào)控下表達熒光素酶基因。參考圖9,它反映了在存在0.7mM的茶堿時，相比于存在0.7mM的咖啡因的情況，茶堿特異性熒光素酶活性在細(xì)胞中被最大地誘導(dǎo)。因此，以誘導(dǎo)依賴于茶堿的基因從各種核酶表達載體中被表達的最佳的茶堿濃度條件設(shè)定為0.7mM，并在該濃度下進行隨后的實驗。2)對來自含有100nt的翻譯序列的核酶表達載體的依賴于茶堿的基因的表達的誘導(dǎo)通過熒光素酶分析還觀察到通過含有100nt的對hTERTRNA的反義序列并使茶堿適體附著其上的核酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因活性的誘導(dǎo)。在這種情況下，所測量的焚光素酶活性通過從PBS處理過的細(xì)胞裂解液中觀察到的熒光素酶的濃度的相對值(％)來表示。該結(jié)果示于圖10。參見圖10,它反映了與體外數(shù)據(jù)一致，AS-100Mu-P96t8t核酶最大地誘導(dǎo)了依賴于茶堿形式的熒光素酶活性。然而，反映了AS-lOOAP98t核酶以比AS-lOOAP96t核酶更具有茶堿特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因的表達，這與體外數(shù)據(jù)是不同的。在這種情況下，考慮將上述的結(jié)果本身歸因于可能由于進一步向IGS上游區(qū)域加入100nt的反義序列而導(dǎo)致的核酶中結(jié)構(gòu)的改變，并且還歸因于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境確實與體外環(huán)境不同這一因素。同時，可以考慮到WT核酶、W-P96t核酶、W-P98t核酶和AP9核酶，以及AP96t8t核酶在細(xì)胞中以茶堿特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因的活性。3)hTERT陰性細(xì)胞中的變構(gòu)酶活性為了從上述結(jié)果中測定被觀察到以依賴于茶堿的方式在細(xì)胞中變構(gòu)地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因活性的AS-100Mu-P96t8t核酶和在細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出變構(gòu)活性的AS-100AP96t是否以hTERT靶RNA特異性的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因活性，用德牧依-C(DMRIE-C)將hTERT陰性細(xì)胞SK-Lu-l細(xì)胞用各種核酶載體進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4小時，用新鮮的添加有茶堿的培養(yǎng)基替換使用過的培養(yǎng)基。在用新鮮的培養(yǎng)基進行替換后的18個小時，獲得細(xì)胞裂解液，并且隨后測量熒光素酶活性。在這種情況下，所測得的作為來自SV40-Luci載體的熒光素酶的表達水平的相對值(％)的熒光素酶活性示于圖11中。參見圖11,可以看出，與AS-100WT相似地，當(dāng)靶RNA不存在于核酶中時，無論是否存在茶堿，AS-100Mu-P96t8t核酶和AS-100AP96t核酶抑制了轉(zhuǎn)基因表達的誘導(dǎo)。也就是說，這反映了依賴于茶堿的變構(gòu)反式剪接核酶可能以輩巴RNA特異性的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達。4)來自含有300nt的反義序列的核酶表達載體的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因表達的誘導(dǎo)為了觀察到反式剪接核酶的變構(gòu)轉(zhuǎn)基因表達是否可能隨著反義序列的長度的增加而被增強，制備含有300nt的對hTERTRNA的反義序列核酶載體，并比較并觀察依賴于核酶的熒光素酶活性的誘導(dǎo)。在該實驗中，使用AS-300WT核酶作為依賴于茶堿對照，并將hTERT陽性細(xì)胞、293細(xì)胞與核酶(AS-300Mu-P96t8t)、核酶(AS-300AP96t)、核酶(AS-300AP98t)和核酶(AS-300W-P96t8t)中的每一種的表達載體進行共轉(zhuǎn)染，所述核酶(AS-300Mu-P96t8t)的Mu-P96t8tbasic基礎(chǔ)骨架含有300nt的反義序列的核酶(AS-300Mu-P96t8t)，當(dāng)核酶含有AS-100序列時，它以依賴于茶堿的方式誘導(dǎo)了體外的反式剪接反應(yīng)，并還誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性；所述核酶(AS-300AP96t)的AP96tJ^5出骨架含有300nt的翻譯序列，它以依賴于茶堿的方式誘導(dǎo)了體外反式剪接反應(yīng)；所述核酶(AS-300AP98t)的AP98t基礎(chǔ)骨架含有300nt的翻譯序列，當(dāng)核酶含有AS-100序列時，它誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性；所述核酶有延長的IGS序列(P1+P10螺旋結(jié)構(gòu))，它以依賴于核酶的方式誘導(dǎo)了體外反式剪接反應(yīng)。然后，對熒光素酶活性進行測量，并且還比較和觀察了依賴于茶堿的基因活性的誘導(dǎo)。在這種情況下，所測量的萸光素酶活性作為能在SV40啟動子的調(diào)控下表達熒光素酶基因的載體(SV40-Luci)的轉(zhuǎn)染后所制得的熒光素酶的濃度的相對值而示于圖12。參見圖12，它反映了如所預(yù)期地?zé)o論是否存在茶堿，AS-300WT核酶有效地誘導(dǎo)了焚光素酶表達。在含有300nt的反義序列的核酶中，可以看出AS-300Mu-P96t8t和AS-300AP96t核酶不誘導(dǎo)依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因活性。同時，可以看出AS-300W-P96t8t和AS-300AP98t核酶以依賴于茶堿的方式有效地誘導(dǎo)了熒光素酶活性，還觀察到轉(zhuǎn)基因的表達在其中嵌入了300nt的反義序列的核酶中比在其中嵌入了100nt的反義序列的核酶中被更有效地誘導(dǎo)。5)通過變構(gòu)核酶的細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)在上述實驗中對能夠在細(xì)胞內(nèi)以依賴于茶堿方式來誘導(dǎo)并增強轉(zhuǎn)基因活性的核酶結(jié)構(gòu)進行研究。為了證實依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)是否被細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的變構(gòu)效應(yīng)所誘導(dǎo)，用其上附著有茶堿適體的核酶的表達載體對293細(xì)胞進行短時轉(zhuǎn)染，并且在細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物。觀察到GAPDHRNA的表達水平，并且用作內(nèi)部對照。在瓊脂糖凝膠上對RT-PCR產(chǎn)物進行分析。并且結(jié)果示于圖13中。參見圖13,反應(yīng)了如所預(yù)期地(泳道3)，在陽性對照WT核酶(AS-300WT)中產(chǎn)生了hTERT特異性反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物。對于附著有茶堿適體的核酶，觀察到無論是否存在茶石威、咖啡因和PBS的存在從AS-300Mu-P96t8t核酶載體產(chǎn)生了反式剪接產(chǎn)物，這符合熒光素酶活性誘導(dǎo)結(jié)果(泳道7-9)，但是僅在用茶堿處理過的細(xì)胞中產(chǎn)生了311bp的反式剪接產(chǎn)物，這符合熒光素酶活性誘導(dǎo)結(jié)果(泳道4)。這些結(jié)果與AS-300W-P96t8t核酶的體外反式剪接結(jié)果不同，但是考慮到這種差異是源于體外和細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不同。為了證實反式剪接產(chǎn)物在RNA抽提過程中是由細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)而不是由誘導(dǎo)的體外反式剪接反應(yīng)而產(chǎn)生的，將用AS-300W-P96t8t核酶轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和SK-Lu-l細(xì)胞(hTERT陰性)混合，并且將RNA從細(xì)胞中抽提出來，并進行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果，如圖13所示地，由于沒有觀察到反式剪接產(chǎn)物(泳道10)，轉(zhuǎn)染有AS-300W-P96t8t核酶的293細(xì)胞中存在茶堿下所測量的反式剪制備。如以上所描述地，AS-300W-P96t8t和AS-300AP98核酶被研發(fā)為用于能夠在表達hTERTRNA的細(xì)胞中特異性地以依賴于核酶的方式調(diào)控變構(gòu)核酶的參與者，也就是說，能夠在細(xì)胞中以依賴于茶堿的方式人為地調(diào)控RNA取代反應(yīng)。此外，IGSW-P96t8t被開發(fā)為能夠最有效地在體外產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物變構(gòu)核酶。實施例5:對由腺病毒載體來調(diào)控表達hTERT癌癥細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡的功能的觀察1)在HT-29細(xì)胞(hTERT+)中依賴于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)通過向所制備的變構(gòu)核酶(AS300W-P96T8T-TK)的3'外顯子和重組的腺病毒載體嵌入細(xì)胞凋亡基因、HSV胸腺激酶來制備能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的CMV啟動子的調(diào)控下表達核酶的載體(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK，SEQIDNO:8)(圖14)。用2008年3月21日在韓國微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms，KCCM)的登記號KCCM10935P來保藏pAvQ-Theo-Rib21AS-TK。為了觀察到是否腺病毒載體(Ad-TheoRib-TK)含有HSVtk基因作為3，式的轉(zhuǎn)基因表達，結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞用該腺病毒載體進行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進行處理，并隨后進行MTT分析以觀察HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率。在這種情況下，使用Ad-TK(在CMV啟動子的調(diào)控下對HSVtk基因近習(xí)慣表達的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽性對照，并使用Ad-Rib-TK(對hTERT特異并且以HSVtk標(biāo)記的腺病毒載體)作為hTERT+細(xì)胞中的陽性對照。使用Ad-LacZ(在CMV啟動子的調(diào)控下對LacZ基因進行表達的腺病毒載體)作為陰性對照。當(dāng)用Ad-TheoRib-TK處理HT-29細(xì)胞時，將用茶堿或咖啡因處理后的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率與用Ad-TheoRib-TK處理的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞存活率進^f亍比較。結(jié)果示于圖15中。參見圖15,觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理HT-29細(xì)胞時，細(xì)胞存活率隨著GCV濃度和腺病毒濃度的增加而降低，但是，細(xì)胞存活率不受到化學(xué)物質(zhì)濃度的影響。同時，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在HT-29感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理HT-29細(xì)胞時，細(xì)胞存活率不受到GCV、病毒和化學(xué)物的濃度則增加的影響，但是當(dāng)該HT-29細(xì)胞用茶堿處理時，如在陽性對照中地，細(xì)胞存活率與病毒和GCV濃度成比例地降低。而且，觀察到當(dāng)茶堿的濃度增加時，細(xì)胞存活率也隨著茶堿濃度的增加而降低。這說明了由于核酶活性被茶堿變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因表達僅當(dāng)用茶堿處理時才被誘導(dǎo)，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了癌癥細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。其中基因表達被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將HT-29細(xì)胞用100moi的腺病毒、100pM的茶堿和100pM的GCV處理。2)在HepG2細(xì)胞中依賴于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(hTERT十)為了觀察是否Ad-TheoRib-TK以靶特異性和依賴于茶堿的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因表達，將肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞用腺病毒載體進行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進行處理，隨后進行MTT分析以觀察在HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。在這種情況下，使用Ad-TK作為陽性對照，并使用Ad-Rib-TK作為hTERT+細(xì)胞中的陽性對照。并將Ad-LacZ用作陰性對照。當(dāng)用Ad-TheoRib-TK處理HepG2細(xì)胞時，將用茶堿或咖啡因處理后的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞存活率與用Ad-TheoRib-TK處理的HepG2細(xì)胞進行比較。結(jié)果示于圖16中。參見圖16,觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理HepG2細(xì)胞時，如在HT-29細(xì)胞中所觀察到地，細(xì)胞存活率隨著GCV和腺病毒濃度的增加而降低，但是化學(xué)制品的濃度不會影響細(xì)胞存活率。同時，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在HepG2細(xì)胞感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理HepG2細(xì)胞時，細(xì)胞存活率不會由于GCV、病毒和化學(xué)品的濃度的增加而受到影響，但是如在陽性對照中當(dāng)用茶^f威處理HepG2細(xì)胞時，所述細(xì)胞存活率會與病毒和GCV的濃度成比例的降低。還觀察到，當(dāng)茶堿的濃度增加，細(xì)胞存活率也會隨著茶堿的濃度增加而降低。這說明了除hTERT+HT-29細(xì)胞之外，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞中的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是因為核酶活性被茶堿變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因僅當(dāng)用茶堿進行處理時被誘導(dǎo)。其中基因表達被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將HepG2細(xì)胞用10moi的腺病毒、10pM的茶堿和100|iM的GCV處理。3)在Capan-l細(xì)胞(hTERT+)中依賴于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)為了觀察是否Ad-TheoRib-TK以靶特異性和依賴于茶堿的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因表達，將結(jié)腸癌細(xì)胞(Capan-1細(xì)胞)用腺病毒載體進行處理，用GCV和調(diào)節(jié)復(fù)合體進行處理，隨后進行MTT分析以觀察在Capan-l細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。結(jié)果示于圖17中。參見圖17，觀察到當(dāng)用Ad-TK和Ad-Rib-TK處理Capan-l細(xì)胞時，如在HT-29和HepG2細(xì)胞中所觀察到，細(xì)胞存活率隨著GCV和腺病毒濃度的增加而降低，但是化學(xué)制品的濃度不會影響細(xì)胞存活率。同時，觀察到Ad-LacZ完全不影響細(xì)胞存活率。注意到，在Capan-l細(xì)胞感染有變構(gòu)核酶Ad-TheoRib-TK的情況下，當(dāng)用咖啡因處理Capan-l細(xì)胞時，細(xì)胞存活率不會由于GCV、病毒和化學(xué)品的濃度的增加而受到影響，但是如在陽性對照中當(dāng)用茶堿處理Capan-l細(xì)胞時，所述細(xì)胞存活率會與病毒和GCV的濃度成比例的P爭低。還觀察到，當(dāng)茶堿的濃度增加，細(xì)胞存活率也會隨著茶堿的濃度增加而降低。這說明了除hTERT+HT-29和H印G2細(xì)胞之外，Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)了Capan-l細(xì)胞中的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這是因為核酶活性被茶堿變構(gòu)地調(diào)控，并且轉(zhuǎn)基因僅當(dāng)用茶堿進行處理時被誘導(dǎo)。其中基因表達被變構(gòu)地誘導(dǎo)的最佳條件為將Capan-l細(xì)胞用100moi的腺病毒、500的茶堿和50的GCV處理4)對在IMR90細(xì)胞(hTERT-)中依賴于茶堿的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)的觀察為了觀察在hTERT+細(xì)胞中的Ad-TheoRib-TK活性的依賴于茶堿的調(diào)控是否對靶RNA特異，將hTERT-的IMR90細(xì)胞用腺病毒載體感染，然后觀察hTERT-的IMR90細(xì)胞中的細(xì)胞存活率。結(jié)果示于圖18中。參見圖18，觀察到當(dāng)用Ad-TK處理hTERT-的IMR90細(xì)胞時，細(xì)胞存活率無關(guān)于腺病毒和GCV的濃度而降低。這說明了該結(jié)果與化學(xué)物濃度無關(guān)。然而，甚至在Ad-Rib-TK和變構(gòu)Ad-TheoRib-TK的濃度增加時，對核酶進行表達的Ad-Rib-TK和變構(gòu)Ad-TheoRib-TK可以無關(guān)于病毒、GCV和化學(xué)品的濃度而不影響細(xì)胞存活率。這說明了Ad-TheoRib-TK可以在存在外源性化合物的情況下人為地調(diào)控核酶的活性，并且也以高度的靶特異性的方式誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因。實施例6:對通過表達變構(gòu)核酶的腺病毒載體的依賴于茶堿的細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的調(diào)控為了證實依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)是否被細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)的變構(gòu)效應(yīng)所誘導(dǎo)，將HT-29細(xì)胞用對附著茶堿適體的核酶進行表達的腺病毒載體(100moi)感染，并然后用O.lmM的茶堿或相同濃度的咖啡因進行處理，這是在該實驗中所建立的用來觀察是否細(xì)胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)廠商的最佳條件。觀察到GAPDHRNA的表達水平，并且用作內(nèi)部對照。在瓊脂糖凝膠上對RT-PCR產(chǎn)物進行分析。并且結(jié)果示于圖19中參見圖19，觀察到如所預(yù)期地，在陰性對照Ad-LacZ的情況中無論用小分子化合物進行處理，不產(chǎn)生任何反式剪接產(chǎn)物。同時，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK(Ad-Theo-Rib2AS-TK)S1入表達hTERT的癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞中時，并用咖啡因進行處理，基本上不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，但是當(dāng)用0.1mM的茶堿處理HT-29細(xì)胞時，產(chǎn)生預(yù)期的429nt反式剪接產(chǎn)物，這與在MTT分析中觀察到的結(jié)果一致。當(dāng)將對反式剪接產(chǎn)物進行克隆和測序時，觀察到hTER的第+21個位點在反式剪接產(chǎn)物中被剪接。同時，在如上描述的相同條件下不表達hTERT的IMR90細(xì)胞中不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，這說明了根據(jù)本發(fā)明的核酶僅在靶RNA的存在下才表現(xiàn)出其反式剪接的功能。為了證實依賴于茶堿的反式胞內(nèi)反式剪接反應(yīng)，將模擬感染的HT-29細(xì)胞和用Ad-TheoRib-TK轉(zhuǎn)染并用茶堿進行處理的IMR90細(xì)胞(hTERT陰性)進行混合，并且隨后從細(xì)胞混合物中抽提RNA，并進行RTOPCR反應(yīng)(混合)。結(jié)果，在細(xì)胞混合物中沒有發(fā)現(xiàn)預(yù)期的反式剪接產(chǎn)品，這說明了反式剪接產(chǎn)物和測量的僅茶堿存在下在Ad-TheoRib-TK誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞中細(xì)胞凋亡是由依賴于茶堿和耙RNA特異性反式剪接反應(yīng)所誘導(dǎo)的。為了比較在HT-29細(xì)胞中的反式剪接反應(yīng)產(chǎn)物的相對濃度，將變構(gòu)反式剪接核酶進行反轉(zhuǎn)錄，隨后進行實時PCR。用GAPDHPCR產(chǎn)物的濃度對T/SPCR產(chǎn)物的濃度進^^史準(zhǔn)，并在描繪于圖中(圖20)。參見圖20，觀察到，在陰性對照Ad-LacZ的情況中無論用小分子化合物進行處理，不產(chǎn)生任何反式剪接產(chǎn)物。同時，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK引入細(xì)胞中時，并隨后用PBS進行處理，基本上不產(chǎn)生反式剪接產(chǎn)物，并且，當(dāng)用咖啡因處理Ad-TheoRib-TK時，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度比當(dāng)用PBS處理Ad-TheoRib-TK時的濃度要稍微地增加，但是比當(dāng)用茶堿處理Ad-TheoRib-TK時的濃度要顯著地降低了78%。同時，當(dāng)將Ad-TheoRib-TK引入細(xì)胞中時，并隨后用茶堿進行處理，反式剪接反應(yīng)被有效地誘導(dǎo)至與由Ad-Rib-TK所產(chǎn)生的反式剪接產(chǎn)物一樣多的濃度。該結(jié)果說明了由變構(gòu)核酶誘導(dǎo)的依賴于茶堿且靶特異性的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是由于茶堿造成的靶特異性反式剪接反應(yīng)的激活所產(chǎn)生的。工業(yè)實用性如以上所描述地，本發(fā)明基于在非常特異的基因治療與反式剪接核酶的結(jié)合，所述反式剪接核酶能以疾病特異性RNA為靶，并通過建立、作為模型系統(tǒng)的其活性能由茶堿進行調(diào)控的反式剪接核酶和可以由反式剪接核酶和外源性因素來調(diào)控基因表達的可逆基因技術(shù)來誘導(dǎo)基因表達。根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實施方式的別構(gòu)反式剪接I型核酶可以用作普通的基因治療治劑來治療各種不可治愈的疾病，還可以用作開發(fā)診斷劑的工具，或者作為探尋核酶活性機理的機制。權(quán)利要求1.一種選擇由茶堿調(diào)控其活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶的方法，該方法包括制備其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶、其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地除去的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶、或者其中茶堿適體和通信模塊結(jié)合到P9區(qū)被部分地修飾的反式剪接核酶的P6區(qū)和P8區(qū)中任一者或兩者上的適體酶；通過使用茶堿和咖啡因來確定是否發(fā)生依賴于茶堿的反式剪接反應(yīng)以比較體外制備的適體酶的變構(gòu)調(diào)控；以及通過哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性來確定依賴于茶堿的轉(zhuǎn)基因在0.1-1mM的茶堿存在下是否被表達。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇變構(gòu)反式剪接I型酶的方法，該方法還包括在所述制備適體酶的步驟中，制備含有對人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA反義的100-300核苷酸片^R的適體酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇變構(gòu)反式剪接I型酶的方法，其中，所述反式剪接核酶的被修飾的P9區(qū)具有'CGAAAGGGAG'的DNA序列。4.一種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA,并在3'外顯子處具有得自螢火蟲的熒光素酶受體基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中，所述核酶具有選自由在SEQIDNO:1中描述的AS300AP98T、在SEQIDNO:2中描述的AS100Mu-P96T8T和在SEQIDNO:3描述中的AS300W-P96T8T所組成的組中的RNA序列。6.—種編碼權(quán)利要求4所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體，其中，所述表達載體包括選自由在SEQIDNO:4中描述的pSEAPAS300AP98T國Luci、在SEQIDNO:5中描述的pSEAPAS100Mu-P96T8T-Luci和在SEQIDNO:6中描述的pSEAPAS300W-P96T8T-Luci所組成的組中的載體。8.—種由茶堿調(diào)控其RNA的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其特征在于，所述變構(gòu)反式剪接I型核酶特異性地靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的RNA,并在3，外顯子上具有單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)細(xì)胞凋亡基因。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中，所述核酶具有在SEQIDNO:7中描述的AS300W-P96T8T-TK的RNA序列。10.—種在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達權(quán)利要求8所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶的表達載體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達載體，其中，所述表達載體包括在SEQIDNO:8中描述的pAvQ-Theo-Rib21AS-TK(KCCM10935P)。12.—種基因表達誘導(dǎo)物，該基因表達誘導(dǎo)物包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。13.—種基因表達誘導(dǎo)物，該基因表達誘導(dǎo)物包括茶堿和權(quán)利要求6或10中所限定的表達載體。14.一種癌癥診斷劑，該癌癥診斷劑包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。15.—種癌癥診斷劑，該癌癥診斷劑包括茶堿和權(quán)利要求6或10中所限定的表達載體。16.—種基因治療劑，該基因治療劑包括茶堿和權(quán)利要求4或8中所限定的變構(gòu)反式剪接I型核酶。17.—種基因治療劑，該基因治療劑包括茶4^和權(quán)利要求6或10中所限定的表達載體。全文摘要提供了由茶堿調(diào)控靶特異性核糖核酸的取代活性的變構(gòu)反式剪接I型核酶，其中靶向hTERT的反式剪接核酶識別人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的mRNA作為癌癥特異性RNA轉(zhuǎn)錄物以通過通信模塊將茶堿適體連接到hTERT靶反式剪接核酶上，所述hTERT靶反式剪接核酶具有被證實的反式剪接的能力。變構(gòu)反式剪接I型核酶可以有利地選擇性僅診斷表達靶hTERTRNA的細(xì)胞，或者誘導(dǎo)它們的細(xì)胞凋亡，這是由于變構(gòu)反式剪接I型核酶的活性依賴性地受到茶堿的調(diào)控以通過反式剪接來更正靶hTERTRNA。文檔編號C12Q1/00GK101688231SQ200880000802公開日2010年3月31日申請日期2008年12月16日優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日發(fā)明者張善英,李城旭,金朱玄申請人:檀國大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團