專利名稱：尿毒癥長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型及其構(gòu)建方法
尿毒癥長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型及其構(gòu)建
方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尿毒癥核糖核酸差異性表達(dá)模型，尤其涉及一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
尿毒癥是指急性或慢性腎功能不全發(fā)展到嚴(yán)重階段時機體出現(xiàn)的一系列自體中毒的癥狀。尿毒癥一般與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān)，但這些因素并不能完全闡明尿毒癥發(fā)生的機制。由急性腎損傷引起的炎性細(xì)胞因子，可能導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生。一些研究發(fā)現(xiàn)鐵，鐵蛋白，C反應(yīng)蛋白(CRP)，腫瘤壞死因子(INF)，白細(xì)胞介素IO(IL-IO)和白細(xì)胞介素 6(IL-6)等與尿毒癥有關(guān)。在無腎實質(zhì)損害的情況下，尋找影響尿毒癥的潛在的細(xì)胞因子 mRNAs。目前研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥環(huán)境抑制HK-2細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子mRNAs水平，同時影響 microRNA的表達(dá)水平。有可能參與基因轉(zhuǎn)錄的改變和轉(zhuǎn)錄后修飾，基因轉(zhuǎn)錄的改變?nèi)缇酆厦窱I招募，轉(zhuǎn)錄后修飾如由microRNA誘導(dǎo)等。研究人員已經(jīng)從DNA，mRNA以及蛋白質(zhì)等方面對尿毒癥進(jìn)行研究，希望通過此來闡明尿毒癥機制，以便找到理想的生物標(biāo)志物，有利于尿毒癥的早期診斷和預(yù)防，但離成功仍有一定的距離。目前主要依靠維持透析和腎移植等替代治療尿毒癥，但是尿毒癥患者心血管疾病 (Cardiovascular disease,CVD)的發(fā)生率和死亡率在持續(xù)增加，是患者在治療時需要關(guān)切的問題。至今為止，對于尿毒癥發(fā)病機制的研究仍有許多爭議，目前臨床上仍以水溶性小分子物質(zhì)作為尿毒癥判定及腎臟替代治療療效的指標(biāo)，但尿毒癥患者的預(yù)后水平不佳，即預(yù)測疾病的可能病程和結(jié)局不準(zhǔn)確。因此為使尿毒癥患者的臨床管理得到改善，目前仍缺乏一個快速，有效，可靠的生物標(biāo)記物來監(jiān)測疾病的發(fā)生與發(fā)展。核糖核酸(Ribonucleicacid, RNA)中的長鏈非編碼 RNA (long non-codingRNA， IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，起初被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA具有重要的生物學(xué)功能，可以同時上調(diào)或下調(diào)真核生物和原核生物中的基因表達(dá)，參與了基因組印記，X染色體沉默，應(yīng)激反應(yīng)等多種重要的調(diào)控過程。此外，近來有關(guān)胚胎干細(xì)胞，成人大腦，CD8+T細(xì)胞和其他一些疾病的全基因組的研究表明，IncRNA功能多樣化并在特定細(xì)胞類型中表達(dá)或位于特定亞細(xì)胞層。但是，如何結(jié)合IncRNA方法對尿毒癥進(jìn)行綜合分析，目前尚未有具體的研究結(jié)果和技術(shù)信息。因此，現(xiàn)有技術(shù)需要改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，有必要提出一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的一個技術(shù)方案是，一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:Al、獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，對各所述測試外周血樣本，分別獲取基因芯片數(shù)據(jù)；A2、將各所述測試外周血樣本的基因芯片數(shù)據(jù)上傳到基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件，并設(shè)置歸一化基準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)濾過的比值倍數(shù)，獲取差異表達(dá)基因，得到尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型。其中，應(yīng)用于上述方案，所述步驟Al中，獲取基因芯片數(shù)據(jù)具體執(zhí)行以下步驟 All、采用生理鹽水對倍稀釋全血，緩慢疊加于等體積的淋巴細(xì)胞緩沖液；A12、以SOOXg水平離心30分鐘后，吸取單個核細(xì)胞，用生理鹽水清洗兩次，用槍頭吸除管底沉淀細(xì)胞上的液體，加入ImL總RNA提取試劑吹打混勻后置于零下80°C冰箱保存；A13、采用總RNA提取試劑抽提RNA，通過硅膠膜純化法獲得純化的RNA ；A14、使用超微量核酸蛋白測定儀分別測定RNA在230nm、260nm、280nm波長下的吸收值，計算RNA濃度以評估RNA純度，并使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性；A15、使用雙鏈互補DNA合成試劑盒，將獲得的RNA合成雙鏈互補DNA，使用單色DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記；A16、使用芯片雜交系統(tǒng)對標(biāo)記后的雙鏈互補DNA進(jìn)行排列雜交，得到雜交芯片，采用匹配的清洗試劑盒清洗雜交芯片； A17、使用芯片掃描儀掃描清洗后的雜交芯片的熒光強度，使用635nm激發(fā)，獲得芯片掃描圖像后，使用生物芯片掃描分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，導(dǎo)出格式化微陣列文本數(shù)據(jù)作為所述基因芯片數(shù)據(jù)。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟Al中，獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，執(zhí)行以下步驟A10:用肝素鈉管獲取已經(jīng)脫離人體的外周血5mL作為所述測試外周血樣本。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟A2之后，執(zhí)行以下步驟A3:挑選若干個差異表達(dá)的IncRNA進(jìn)行實時定量PCR的相對定量測試，其中，采用PCR引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，實時定量PCR時各樣品加樣量均為2 μ L，并使用β肌動蛋白作為內(nèi)參，95°C預(yù)變性IOmin后，進(jìn)行40個PCR循環(huán)，其中，95°C變性15秒鐘，60°C退火60秒并收集熒光數(shù)據(jù)；擴增反應(yīng)后，按95°C變性15秒鐘，60°C退火20秒，從60°C緩慢加熱到99°C熔解15秒， 建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線；其中，執(zhí)行PCR熱循環(huán)文件時的加熱/冷卻速度為2%。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，采用2_ΔΔετ法進(jìn)行分析實時定量PCR的相對定量測試結(jié)果。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟Α13中，所述硅膠膜純化法采用 Qiagen公司的RNeasy試劑盒完成。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟Α15中，采用分光光度計檢測熒光標(biāo)記效率。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟Α17中，所述芯片掃描圖像按 TIF圖像格式進(jìn)行存儲，所述基因芯片數(shù)據(jù)按Excel文件格式進(jìn)行存儲。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟A17中，采用數(shù)據(jù)原始值減去掃描儀的背景值得到修正值，然后采用中值標(biāo)準(zhǔn)化方法對得到的修正值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)，使用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件對標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用于上述各方案，所述的構(gòu)建方法中，所述步驟A2中，設(shè)置所述比值倍數(shù)大于 2，并且，所述分析結(jié)果按Excel文件格式進(jìn)行存儲。
本發(fā)明的又一個技術(shù)方案是，一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，其采用任一上述的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。應(yīng)用于上述各方案，所述尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型包括以下 6 個 IncRNA,分別為uc001boe，uc002flc, uc003obo, AY555145, BC041951 以及 U79273。上述方案，采用IncRNA芯片技術(shù)檢測離體的尿毒癥外周血單核細(xì)胞中IncRNA表達(dá)的差異，初步篩選出與尿毒癥相關(guān)的IncRNA，然后再通過實時定量PCR技術(shù)驗證芯片結(jié)果的可靠性，從而建立了尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，為研究尿毒癥提供了作為中間結(jié)果的信息，并且為進(jìn)一步揭示尿毒癥的病理機制提供了新思路，但由于IncRNA表達(dá)對于尿毒癥的診斷支持還不夠完整，因此還需要進(jìn)一步的驗證才能實現(xiàn)對尿毒癥的診斷。

圖1是本發(fā)明一個實施例的示意圖。
具體實施方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式
進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明通過采用IncRNA芯片技術(shù)檢測健康人、尿毒癥患者外周血單核細(xì)胞中 IncRNA表達(dá)譜的差異，篩選出差異表達(dá)的IncRNA，利用實時定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗證芯片結(jié)果，獲取尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，協(xié)助研究尿毒癥。如圖1所示，本發(fā)明的一個實施例是，一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟Al、獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，對各所述測試外周血樣本，分別獲取基因芯片數(shù)據(jù)；例如，所述步驟Al中，獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，執(zhí)行以下步驟AlO 用肝素鈉管獲取已經(jīng)脫離人體的外周血5mL 作為所述測試外周血樣本，或者，獲取已經(jīng)脫離人體的外周血7. 5mL作為所述測試外周血樣本。步驟Al中，分別獲取離體的并且具有統(tǒng)計學(xué)意義的尿毒癥患者組與正常對照組的測試外周血樣本，例如，選取25名尿毒癥患者作為尿毒癥患者組，以及選取25名健康人作為正常對照組，分別獲取這些組的成員的外周血，作為測試外周血樣本。也就是說，基因芯片數(shù)據(jù)的來源是離體的測試外周血樣本。A2、將各所述測試外周血樣本的基因芯片數(shù)據(jù)上傳到基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件，并設(shè)置歸一化基準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)濾過的比值倍數(shù)，獲取差異表達(dá)基因，得到尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型。優(yōu)選的，設(shè)置所述比值倍數(shù)大于2，并且，所述分析結(jié)果按Excel文件格式進(jìn)行存儲。應(yīng)用于上述各例及其組合，又一個實施例是，所述步驟A2之后，還執(zhí)行以下步驟 A3:挑選若干個差異表達(dá)的IncRNA進(jìn)行實時定量PCR的相對定量測試，其中，采用PCR引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，實時定量PCR時各樣品加樣量均為2μ 1，并使用β肌動蛋白作為內(nèi)參， 95°C預(yù)變性IOmin后，進(jìn)行40個PCR循環(huán)，其中，95度變性15秒鐘，60度退火60秒并收集熒光數(shù)據(jù)；擴增反應(yīng)后，按95度變性15秒鐘，60度退火20秒，從60°C緩慢加熱到99°C熔解15秒，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線；其中，執(zhí)行PCR熱循環(huán)文件時的加熱/冷卻速度為2%。 優(yōu)選的，采用2_Δ Δετ法進(jìn)行分析實時定量PCR的相對定量測試結(jié)果。應(yīng)用于上述各例及其組合，所述步驟Al中，獲取基因芯片數(shù)據(jù)具體執(zhí)行以下步驟All、采用生理鹽水對倍稀釋全血，緩慢疊加于等體積的淋巴細(xì)胞緩沖液；通常采用等體積乃至1. 5倍體積于全血的生理鹽水，例如1. 2倍體積于全血的生理鹽水，全血即上述的離體的測試外周血樣本，例如，取5mL全血，然后緩慢用6mL生理鹽水稀釋，再緩慢疊加于IlmL淋巴細(xì)胞緩沖液；稀釋與疊加過程優(yōu)選沿壁逐滴加入。A12、以800 Xg水平離心30分鐘后，吸取單個核細(xì)胞，用生理鹽水清洗兩次，用槍頭吸除管底沉淀細(xì)胞上的液體，加入ImL總RNA提取試劑吹打混勻后置于零下80°C冰箱保存；然后，可以繼續(xù)執(zhí)行后續(xù)步驟。A13、采用總RNA提取試劑抽提RNA，通過硅膠膜純化法獲得純化的RNA ；例如，所述硅膠膜純化法采用Qiagen公司的RNeasy試劑盒完成。A14、使用超微量核酸蛋白測定儀分別測定純化得到的RNA在230nm、260nm、280nm 波長下的吸收值，計算RNA濃度以評估RNA純度，并使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度和完整性；例如，使用NanoDropNDIOOOC超微量分光光度計作為所述超微量核酸蛋白測定儀，分別測定RNA在230nm、260nm、280nm波長下的吸收值。A15、使用雙鏈互補DNA合成試劑盒，將獲得的RNA合成雙鏈互補DNA，使用單色 DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記；例如，還采用分光光度計檢測熒光標(biāo)記效率。A16、使用芯片雜交系統(tǒng)對標(biāo)記后的雙鏈互補DNA進(jìn)行排列雜交，得到雜交芯片， 采用匹配的清洗試劑盒清洗雜交芯片；例如，使用羅氏NimbleGen芯片雜交系統(tǒng)對標(biāo)記后的雙鏈互補DNA進(jìn)行排列雜交，并采用羅氏NimbleGen芯片雜交系統(tǒng)相匹配的清洗試劑盒清洗雜交芯片。A17、使用芯片掃描儀掃描清洗后的雜交芯片的熒光強度，使用635nm激發(fā)，獲得芯片掃描圖像后，使用生物芯片掃描分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，導(dǎo)出格式化微陣列文本數(shù)據(jù)作為所述基因芯片數(shù)據(jù)。優(yōu)選的，所述芯片掃描圖像按TIF圖像格式進(jìn)行存儲，所述基因芯片數(shù)據(jù)按Excel文件格式進(jìn)行存儲。優(yōu)選的，應(yīng)用于上述各例及其組合，還采用數(shù)據(jù)原始值減去掃描儀的背景值得到修正值，然后采用中值標(biāo)準(zhǔn)化方法對得到的修正值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 得到標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)，使用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件對標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用于上述各例及其組合，本發(fā)明的又一個實施例是，一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，其采用任一上述的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。優(yōu)選的，所述尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型包括以下6個 IncRNA,分別為:uc001boe, uc002flc, uc003obo, AY555145, BC041951 以及 U79273。本發(fā)明上述各實施例，通過應(yīng)用芯片技術(shù)高通量分析技術(shù)檢測尿毒癥患者PBMC 中IncRNA表達(dá)圖譜的變化，發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比IncRNA表達(dá)圖譜發(fā)生了顯著變化，結(jié)合基因芯片數(shù)據(jù)分析方法構(gòu)建尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，為通過IncRNA整體地、系統(tǒng)地研究尿毒癥提供作為中間結(jié)果的信息。應(yīng)用于上述各例及其組合，下面再繼續(xù)給出一個具體的實例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。標(biāo)本收集20例尿毒癥患者來自于桂林解放軍第一八一醫(yī)院腎臟移植與血液凈化透析中心住院部，腎功能衰竭的原因是慢性腎炎，無感染，糖尿病和自身免疫性疾病等， 所有病例均未接受免疫抑制治療，降脂藥和非留體抗炎藥。20例健康志愿者來自體檢正常人群，其性別、年齡、種族與選取的尿毒癥患者相匹配，各組性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。外周血單個核細(xì)胞的分離血液標(biāo)本尿毒癥患者(n = 20)和正常健康組(n = 20)。用肝素鈉管取外周血5mL，生理鹽水對倍稀釋全血。緩慢疊加于等體積(5mL)的淋巴細(xì)胞緩沖液上，800 X g，30分鐘水平離心。吸取單個核細(xì)胞，用生理鹽水清洗細(xì)胞兩次，用槍頭盡量吸掉管底沉淀細(xì)胞上的液體，加入ImL總RNA提取試劑(TRIZ0L試劑)吹打混勻后置于-80°C冰箱保存。RNA抽提與質(zhì)量檢測抽提總的RNA，用Trizol試劑Qnvitrogen公司)和RNeasy 試劑盒(Qiagen)，按照試劑使用說明，分別從尿毒癥患者和健康人外周血單個核細(xì)胞中提取總RNA。使用Nanodrop ND-1000測定RNA在230，260, 280nm波長下的吸收值，以計算濃度評估RNA純度。使用甲醛變性瓊脂糖電泳檢測RNA純度和完整性。本例中，TRIZOL試劑根據(jù)酚-異硫氫酸胍抽提法設(shè)計，主要由苯酚和異硫氫酸胍組成。對任何生物材料的RNA 提取，首先研磨組織或細(xì)胞，或使之裂解；加入該試劑后，可保持RNA的完整，同時進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分；加入氯仿抽提，離心，水相和有機相分離；收集含RNA的水相；通過異丙醇沉淀，可獲得RNA樣品。硅膠膜純化法所使用的RNeasy試劑盒是由Qiagen公司設(shè)計，其設(shè)計思路是含有目標(biāo)核酸的細(xì)胞破碎液通過硅膠膜時，核酸吸附在硅膠膜上，從而與其它細(xì)胞成分分開，然后在低鹽濃度下核酸可從硅膠膜上洗脫出來。cDNA樣品合成，標(biāo)記及芯片雜交使用ds-cDNA合成試劑盒Gnvitrogen公司)合成雙鏈(double strand, ds)互補DNA，然后使用單色DNA標(biāo)記試劑盒(Nimblegen公司)標(biāo)記ds-cDNA，分光光度計檢測熒光標(biāo)記效率。所采用的芯片為Arraystar公司12 X 13 的 IncRNA芯片，該芯片覆蓋所有權(quán)威數(shù)據(jù)庫如NCBI，Refseq, UCSC Known Gene, NRED, RNAdb 等多個數(shù)據(jù)庫的IncRNA。使用MmbleGen公司提供的雜化系統(tǒng)進(jìn)行排列雜交，然后采用 Nimblegen清洗試劑盒清洗雜交芯片。芯片表達(dá)分析使用Gen印ix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，使用635nm 激發(fā)，圖像存成TIF文件；然后使用Gen印ix Pro 6. O分析數(shù)據(jù)，分析結(jié)果導(dǎo)出，最終用 EXCEL文件表示。數(shù)據(jù)原始值通過減去掃描儀得到的背景值做修正，再用中值標(biāo)準(zhǔn)化修正值，即標(biāo)準(zhǔn)值；其中，修正值采用數(shù)據(jù)原始值減去掃描儀的背景值得到，然后對得到的修正值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即將數(shù)據(jù)調(diào)整到同一水平，方法為中值標(biāo)準(zhǔn)化，最后得到的數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)值。 把掃描獲得的格式化微陣列文本數(shù)據(jù)上傳到Agilent GeneSpring軟件(versionll. 0)中進(jìn)一步進(jìn)行分析，設(shè)置歸一化基準(zhǔn)，數(shù)據(jù)濾過的比值倍數(shù)等，獲取差異表達(dá)基因，實驗結(jié)果用EXCEL數(shù)據(jù)表示出來。根據(jù)fold-change >2判定差異表達(dá)基因。一般來說，樣本標(biāo)準(zhǔn)值比對照標(biāo)準(zhǔn)值，比值大于2時，差異表達(dá)上調(diào)；比值小于0.5時，差異表達(dá)下調(diào)；比值0. 5-2， 則認(rèn)為差異表達(dá)不顯著。實時定量PCR 挑選6個差異表達(dá)的IncRNA進(jìn)行實時定量PCR的相對定量研究， 驗證芯片實驗的可靠性。6 個 IncRNA 分別為 ucOOlboe，uc002flc, uc003obo, AY555145, BC041951和U79273，采用I^rimer 5. 0軟件設(shè)計引物，見表1。實時定量PCR時各樣品加樣量均為2 μ L，為校正差異，使用β-actin作為內(nèi)參，因為β-actin在不同樣品間表達(dá)量基本恒定。各指標(biāo)均按以下程序進(jìn)行95°C預(yù)變性lOmin，然后執(zhí)行40個PCR循環(huán)95°C變性15秒；60°C退火60秒并收集熒光。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，按 95°C變性15秒；60°C退火20秒；99°C熔解15秒；并從60°C緩慢加熱到99°C，儀器自動進(jìn)行-Ramp Rate為2%。其中，得到的數(shù)據(jù)采用2_Δ 法進(jìn)行分析。即，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體如表3所示，其中，CT值指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，則CT值越小。熔解曲線呈單峰，說明沒有非特異性熒光產(chǎn)生，表示定量準(zhǔn)確。
實時定量PCR引物序列如下表1所示
權(quán)利要求
1.一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型的構(gòu)建方法， 其特征在于，包括以下步驟Al、獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，對各所述測試外周血樣本，分別獲取基因芯片數(shù)據(jù)，具體執(zhí)行以下步驟All、采用生理鹽水對倍稀釋全血，再緩慢加入至等體積的淋巴細(xì)胞緩沖液；A12、以SOOXg水平離心30分鐘后，吸取單個核細(xì)胞，用生理鹽水清洗兩次，吸除管底沉淀細(xì)胞上的液體，加入ImL總RNA提取試劑吹打混勻后置于零下80攝氏度保存；A13、采用總RNA提取試劑抽提RNA，通過硅膠膜純化法獲得純化的RNA ；A14、使用超微量核酸蛋白測定儀分別測定RNA在230nm、260nm、280nm波長下的吸收值，計算RNA濃度以評估RNA純度，并使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性；A15、使用雙鏈互補DNA合成試劑盒，將獲得的RNA合成雙鏈互補DNA，使用單色DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記；A16、使用芯片雜交系統(tǒng)對標(biāo)記后的雙鏈互補DNA進(jìn)行排列雜交，得到雜交芯片，采用匹配的清洗試劑盒清洗雜交芯片；A17、使用芯片掃描儀掃描清洗后的雜交芯片的熒光強度，使用635nm激發(fā)，獲得芯片掃描圖像后，使用生物芯片掃描分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，導(dǎo)出格式化微陣列文本數(shù)據(jù)作為所述基因芯片數(shù)據(jù)；A2、將各所述測試外周血樣本的基因芯片數(shù)據(jù)上傳到基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件，并設(shè)置歸一化基準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)濾過的比值倍數(shù)，獲取差異表達(dá)基因，得到尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Al中，獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，執(zhí)行以下步驟A10:用肝素鈉管獲取已經(jīng)脫離人體的外周血5mL作為所述測試外周血樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A2之后，執(zhí)行以下步驟A3 挑選若干個差異表達(dá)的長鏈非編碼RNA進(jìn)行實時定量PCR的相對定量測試，其中，采用PCR 引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，實時定量PCR時各樣品加樣量均為2 μ L，并使用β肌動蛋白作為內(nèi)參，95攝氏度預(yù)變性10分鐘后，進(jìn)行40個PCR循環(huán)，其中，95攝氏度變性15秒，60攝氏度退火60秒并收集熒光數(shù)據(jù)；擴增反應(yīng)后，按95攝氏度變性15秒，60攝氏度退火20秒， 從60攝氏度緩慢加熱到99攝氏度熔解15秒，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線；其中，執(zhí)行PCR熱循環(huán)文件時的加熱/冷卻速度為2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用2-ΔACT法進(jìn)行分析實時定量 PCR的相對定量測試結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A13中，所述硅膠膜純化法采用Qiagen公司的RNeasy試劑盒完成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A15中，采用分光光度計檢測熒光標(biāo)記效率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A17中，所述芯片掃描圖像按TIF圖像格式進(jìn)行存儲，所述基因芯片數(shù)據(jù)按Excel文件格式進(jìn)行存儲；并且，采用數(shù)據(jù)原始值減去掃描儀的背景值得到修正值，然后采用中值標(biāo)準(zhǔn)化方法對得到的修正值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)，使用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件對標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A2中，設(shè)置所述比值倍數(shù)大于2，并且，所述分析結(jié)果按Excel文件格式進(jìn)行存儲。
9.一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，其特征在于，其采用如權(quán)利要求1至8任一所述的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型，其特征在于，所述尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型包括以下6個長鏈非編碼RNA，分別為uc001boe，uc002flc, uc003obo, AY555145, BC041951 以及 U79273。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟A1、獲取尿毒癥患者組與正常對照組的離體的測試外周血樣本，對各所述測試外周血樣本，分別獲取基因芯片數(shù)據(jù)；A2、將各所述測試外周血樣本的基因芯片數(shù)據(jù)上傳到基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件，并設(shè)置歸一化基準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)濾過的比值倍數(shù)，獲取差異表達(dá)基因，得到尿毒癥外周血單核細(xì)胞長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型。上述方案，為研究尿毒癥提供了作為中間結(jié)果的信息，并且為進(jìn)一步揭示尿毒癥的病理機制提供了新思路。此外，本發(fā)明還涉及一種尿毒癥長鏈非編碼核糖核酸差異性表達(dá)圖譜模型。
文檔編號C12N15/10GK102286464SQ20111018172
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者劉娟, 戴勇, 眭維國 申請人:眭維國