專利名稱：具有甲?；?thf-合成酶和/或甘氨酸切割活性的棒狀桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-甲硫氨酸的微生物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及顯示出甲酰 基-THF-合成酶活性和/或功能性甘氨酸切割系統(tǒng)的棒狀桿菌。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，全世界甲硫氨酸的年產(chǎn)量是大約500，000噸。甲硫氨酸是禽類家畜飼養(yǎng)的 首要限制性氨基酸，且因此主要作為飼料補(bǔ)充物使用。與其他工業(yè)氨基酸不同的是，甲硫氨酸幾乎完全以化學(xué)合成產(chǎn)生的D-和L-甲 硫氨酸的外消旋物而使用。由于動(dòng)物能夠代謝甲硫氨酸的兩種立體異構(gòu)體，因此直接飼 喂化學(xué)方法產(chǎn)生的外消旋混合物是可行的(D' Mello and Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals :Amino Acids, Rechgigl(Ed. ), CRCHandbook Series in Nutrition and Food，441-490，1978)。不過，仍然需要以僅產(chǎn)生L_甲硫氨酸的生物技術(shù)方法來替代現(xiàn)有的化學(xué)生產(chǎn)方 法。這是因?yàn)榈退窖a(bǔ)充的L-甲硫氨酸相對于D-甲硫氨酸而言是更好的含硫氨基酸來源 (Katz and Baker (1975) Poult. Sci. 545 :1667-74)。此外，化學(xué)方法使用更加危險(xiǎn)的化合物 且產(chǎn)生大量廢液。而高效的生物技術(shù)方法可完全避免化學(xué)生產(chǎn)的這些缺點(diǎn)?，F(xiàn)在，發(fā)酵生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品例如氨基酸、芳香族化合物、維生素和輔因子通常是在 微生物中進(jìn)行，例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯 草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyceslactis)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)或氧化葡萄糖菌 (Gluconobacter oxydans)。因此采用發(fā)酵方法制備氨基酸例如谷氨酸。為此，已經(jīng)證實(shí)某些微生物非常適合， 如大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。通過發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸還有一個(gè)特別的優(yōu)勢，即僅產(chǎn)生L-氨基 酸，并避免了使用化學(xué)合成法中常用的對環(huán)境不利的化合物如溶劑等。不過，通過微生物發(fā) 酵生產(chǎn)甲硫氨酸若要成為化學(xué)合成方法的替代方法，其必須滿足能夠以與化學(xué)方法生產(chǎn)相 當(dāng)?shù)某杀緦?shí)現(xiàn)商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)甲硫氨酸的要求。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有了在微生物例如大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中 通過例如提高相應(yīng)的精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑中涉及的基因的表達(dá)生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品例 如氨基酸、脂質(zhì)、維生素或碳水化合物的嘗試。W0 02/10209、W0 2006008097、W02005059093 或 Cremer et al. (Appl. Environ. Microbiol, (1991), 57 (6), 1746-1752)公開了試圖通過上調(diào)產(chǎn)生賴氨酸的生物合成途徑中 所涉及的基因的表達(dá)而提高例如賴氨酸的產(chǎn)生。不過，仍然亟需鑒定代謝途徑中那些可對微生物例如谷氨酸棒桿菌內(nèi)甲硫氨酸的產(chǎn)生具有有益影響的基因。發(fā)明目的和內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供在微生物中產(chǎn)生L-甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)生L-甲硫氨酸的微生物。根據(jù)隨后的說明書的內(nèi)容，本發(fā)明的這些以及其他的目的將是顯而易見的，這些 以及其他的目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的技術(shù)方案而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的其他實(shí)施方式由從屬權(quán)利要求限定。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了優(yōu)選地在微生物中產(chǎn)生L-甲硫氨酸的方法，其包 括培養(yǎng)微生物的步驟，所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與所述起始 生物體相比，所述微生物產(chǎn)生更多的N5，N1Q-亞甲基-四氫葉酸(THF)。所述方法使用的微生物選自包括腸桿菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬的 微生物的組。特別優(yōu)選地使用谷氨酸棒桿菌。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括培養(yǎng)微生物的步驟，所述微生物 通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與所述起始生物體相比，甲?；?THF-合成酶 的量和/或活性是升高的。本發(fā)明的后一種實(shí)施方式的優(yōu)選的方面涉及培養(yǎng)如下微生物，其中與所述起始生 物體相比，所述微生物中的甲酰基-THF-脫甲?；傅牧亢?或活性額外地是降低的，和 /或其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的N5，N1(l-次甲基-THF-環(huán)化合成酶(N5， N10-methenyl-THF-cyclosynthetase)、N5，N10-次甲基 _THF_ 還原酶和 / 或 N5，N10-亞甲 基-THF-還原酶的量和/或活性是額外地升高的。本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方式之一涉及如下方法，其中培養(yǎng)一種微生物，所述微 生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與所述起始生物體相比，甘氨酸切割系統(tǒng) (GCS)的酶活性是升高的。為實(shí)現(xiàn)這一目的，可對起始生物體進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，使得與所述起始生物體相比， PLP-依賴性甘氨酸脫羧酶(gcvP，P-蛋白)、含硫辛酰胺的氨基甲基轉(zhuǎn)移酶(gcvH，H-蛋白) 和合成 N5，N1CI-亞甲基-THF 的酶(N5，N10-methylene-THF-synthesizing enzyme) (gcvT, T_蛋白)的量和/或活性是升高的。這些遺傳學(xué)修飾保證累積的甘氨酸被轉(zhuǎn)化為NH4+、C02 和N5，N1(l-亞甲基-THF。在本發(fā)明這一方面的更加具體的實(shí)施方式中，在存在硫辛酸和/或 硫辛酰胺的情況下培養(yǎng)所述微生物?？蛇x地或額外地，微生物可被進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾，使得它們表現(xiàn)為硫辛酸合酶 (lipA)、硫辛酰轉(zhuǎn)移酶(lipB)、和/或硫辛酸合成酶(lplA)的量和/或生物學(xué)活性升高。培養(yǎng)的微生物可額外地或可選地被遺傳學(xué)修飾以表現(xiàn)為NAD+-依賴性的需FAD的 硫辛酰胺脫氫酶(lpd)的量和/或活性升高。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法允許通過培養(yǎng)微生物而產(chǎn)生L-甲硫氨 酸，所述微生物已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾，使得甲?；?THF-合成酶的量和/或生物學(xué)活性升高， 且因此建立了功能性甘氨酸切割系統(tǒng)。此類微生物將典型地表現(xiàn)為甲酰基-THF-合成酶、 gCVH、gCVP和gCVT(gCVHPT)的量和/或生物學(xué)活性升高。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將在存在 硫辛酸和/或硫辛酰胺的情況下培養(yǎng)這些微生物。可選地或額外地，微生物可被進(jìn)一步遺 傳學(xué)修飾以表現(xiàn)為lipA、lipB和/或lplA的量和/或活性升高。微生物也可表現(xiàn)為lpd
6的量和/或生物學(xué)活性升高。 優(yōu)選地，通過培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌微生物而實(shí)施本發(fā)明的方法的上述實(shí)施方式。可 將上述遺傳學(xué)修飾引入谷氨酸棒桿菌野生菌株。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將這些遺傳學(xué)改造 引入已經(jīng)被認(rèn)為是產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株的谷氨酸棒桿菌菌株。上述甲酰基-THF-合成酶、gcvP、gcvT、gcvH、lplA、IipA和IipB的編碼序列優(yōu)選 地來自杰氏棒桿菌(Corynebacterium jeikeium)或大腸桿菌。如果是通過培養(yǎng)谷氨酸棒 桿菌菌株進(jìn)行所述方法，則特別要考慮杰氏棒桿菌的序列。在另一方面，本發(fā)明涉及微生物，所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始微生 物，以便與所述起始生物體相比產(chǎn)生更多的N5，Nltl-亞甲基-THF。所述微生物同樣可選自包 括腸桿菌屬、棒狀桿菌、芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬的組，其中棒狀桿菌且特別是谷氨酸棒桿菌 是優(yōu)選的。在本發(fā)明的這一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起 始生物體，使得與所述起始生物體相比，甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是升高的。本 發(fā)明這一方面的更加具體的實(shí)施方式包含如下微生物，其甲酰基-THF-脫甲?；噶亢? 或活性降低和/或N5，N10-次甲基-THF-環(huán)化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-還原酶和/或 N5, Nlt1-亞甲基-THF-還原酶的活性升高。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及如下微生物，所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起 始生物體，使得與所述起始生物體相比，所述生物體的甘氨酸切割系統(tǒng)的酶活性是升高的。為此，可對所述微生物進(jìn)行遺傳學(xué)改造以使之表現(xiàn)為gCVP、gCVT和gcvH的量和/ 或活性升高。此外，所述微生物可被進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾，以使之表現(xiàn)為對外部提供的硫辛酸 和/或硫辛酰胺的攝取能力提高和/或內(nèi)源性合成硫辛酸的能力提高。為此，可提高所述 微生物中的IplAUipA和/或IipB的量和/或活性。與所述起始生物體相比，Ipd的量和 /或活性也可升高。所述微生物優(yōu)選地衍生自谷氨酸棒桿菌?？蓪⑦z傳學(xué)改造引入谷氨酸棒桿菌的野 生菌株或引入已經(jīng)被認(rèn)為是產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株的菌株。本發(fā)明的優(yōu)選的方面涉及如下微生物，其與所述起始生物體相比，甲酰 基-THF-合成酶、gCVP、gCVT和gcvH的量和/或生物學(xué)活性是升高的。在本發(fā)明這一方面 的更加具體的實(shí)施方式中，與所述起始生物體相比，可升高lplA、IipA和/或IipB的量和 /或活性?？蛇x地和/或額外地，可升高Ipd的量和/或活性。所述優(yōu)選地衍生自谷氨酸棒桿菌?？蓪⑦z傳學(xué)改造引入谷氨酸棒桿菌的野生菌株 或引入已經(jīng)被認(rèn)為是產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株的菌株。


圖1顯示了杰氏棒桿菌與谷氨酸棒桿菌的Ipd氨基酸序列的序列比對。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法，其步驟包括培養(yǎng)遺傳學(xué)修飾的微生物和任 選地分離甲硫氨酸。本發(fā)明還涉及遺傳學(xué)修飾的微生物，其能夠產(chǎn)生L-甲硫氨酸。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，S卩如果一種生物體是通過遺傳學(xué)修飾而來自起始生物體， 且與所述起始生物體相比，所得微生物產(chǎn)生更多的N5，N10-亞甲基-四氫葉酸(THF)，則可在此類微生物中高效產(chǎn)生L-甲硫氨酸(也稱作甲硫氨酸)。在詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方式之前，先給出以下定義。
本文中的基因名稱或蛋白質(zhì)名稱，例如但不限于甲?；?THF-合成酶、gcvPTH、 lipA、lipB、lplA、Ipd和任何其他基因或蛋白質(zhì)名稱，根據(jù)該名稱所使用的語境，可指基因 和/或該基因編碼的蛋白質(zhì)或酶之一或兩者。術(shù)語“大約”在本文中表示精確性的區(qū)間，本領(lǐng)域人員能夠理解該精確性的區(qū)間對 于所討論的特征而言是常規(guī)的。該術(shù)語典型地表示與所指定的數(shù)值的差異為+/-10%，優(yōu)選 地為+/-5%。術(shù)語“微生物”在本發(fā)明中指的是原核生物和低等真核生物。本發(fā)明的生物體因此包括微生物，因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知它們可用于生產(chǎn)例如氨基 酸、維生素、酶輔因子等精細(xì)化學(xué)品。它們可選自棒桿菌屬特別是谷氨酸棒桿菌、腸桿 菌屬特別是大腸桿菌、芽孢桿菌屬特別是枯草芽孢桿菌、放線菌屬、藍(lán)細(xì)屬菌、蛋白菌屬 (proteobacteria)、嗜鹽菌屬、甲烷球菌屬、分枝桿菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬和鏈霉菌 屬。術(shù)語“微生物”也包括酵母例如粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、馬克思克魯 維酵母、棉阿舒囊霉和巴斯德畢赤氏酵母。如下文所詳述，本發(fā)明主要涉及經(jīng)遺傳學(xué)修飾而表現(xiàn)為特定的酶的量和/或活性 升高的微生物。在本發(fā)明中，術(shù)語"遺傳學(xué)修飾"和"遺傳學(xué)改造"及其各種語法上的變體指的 是微生物已經(jīng)通過基因技術(shù)的手段而被修飾，以使之表達(dá)改變量的在相應(yīng)的微生物中能夠 天然產(chǎn)生的一或多種蛋白質(zhì)，或表達(dá)在相應(yīng)的微生物中不天然產(chǎn)生的一或多種蛋白質(zhì)，或 與相應(yīng)的未修飾微生物的蛋白質(zhì)相比表達(dá)活性改變的一或多種蛋白質(zhì)。未修飾的微生物被 認(rèn)為是"起始生物體"，對其進(jìn)行遺傳學(xué)改造產(chǎn)生了本發(fā)明的微生物。術(shù)語"起始生物體"因此指的是生物體的野生型。對于谷氨酸棒桿菌，可以是例 如ATCC13032。不過，在本發(fā)明中，術(shù)語〃起始生物體〃也可以指這樣的生物體，其與相應(yīng)物 種的野生型生物體相比已經(jīng)已經(jīng)攜帶遺傳學(xué)改造，但隨后被進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾以便產(chǎn)生本 發(fā)明的生物體。對于谷氨酸棒桿菌，起始生物體因此可以是野生型谷氨酸棒桿菌菌株，例如 ATCC13032。不過，起始生物體優(yōu)選地也可以是例如已經(jīng)被遺傳工程化用于產(chǎn)生甲硫氨酸的 谷氨酸棒桿菌菌株。此類產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體例如可以衍生自野生型棒狀桿菌，且優(yōu)選地衍生 自野生型谷氨酸棒桿菌，該細(xì)菌在至少一種如下基因中含有遺傳學(xué)改造askfto、Komfbr和 metH，其中所述遺傳學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，由此導(dǎo)致與缺乏所述遺傳學(xué)改造的情況 下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該產(chǎn)生甲硫氨酸的起 始生物體在aSkfto、homfto和metH中將同時(shí)含有遺傳學(xué)改造，由此導(dǎo)致與缺乏所述遺傳學(xué)改 造的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在這些起始生物體中，ask和hom的內(nèi)源性拷貝典型地被改造為反饋抗性等位基 因，它們不再受到賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或這些氨基酸的組合的反饋抑制?？赏ㄟ^突變 或篩選實(shí)現(xiàn)這一目的，或是通過以編碼反饋抑制被降低或消除的蛋白質(zhì)的突變的等位基因 對這些基因進(jìn)行確定的基因置換。包括這些遺傳學(xué)改造的谷氨酸棒桿菌菌株例如為谷氨酸棒桿菌DSM17322。本領(lǐng)域人員知曉也可以采用下述用來產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌DSM17322的遺 傳學(xué)改造的替代性遺傳學(xué)改造來實(shí)現(xiàn)askfto、homfbr和metH的過表達(dá)。 就本發(fā)明的目的而言，askfto代表反饋抗性天冬氨酸激酶。Homfto代表反饋抗性高 絲氨酸脫氫酶。MetH代表維生素B12-依賴性甲硫氨酸合酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體可以衍生自野生型棒狀桿 菌，且優(yōu)選地衍生自野生型谷氨酸棒桿菌，該細(xì)菌在至少一種如下基因中含有遺傳學(xué)改造 Bskfbr, homfto、metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為 metZ)、和 hskmutated，其中所述遺傳 學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，由此導(dǎo)致與缺乏所述遺傳學(xué)改造的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相 比，甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體在ask*、 1ιοπΛ、πιθ Η、πιθ Α(也稱為metX)、metY(也稱為metZ)、和hskmutated中將同時(shí)含有遺傳學(xué)改 造，由此導(dǎo)致與缺乏所述遺傳學(xué)改造的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在這些起始生物體中，aSk、hom和hsk的內(nèi)源性拷貝典型地如上述ask "和Iiomfto 那樣被Mkfta^homfto和hskmutatral置換。包括這些遺傳學(xué)改造的谷氨酸棒桿菌菌株例如為谷 氨酸棒桿菌M2014。本領(lǐng)域人員知曉也可以采用下述用來產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌M2014的遺傳 學(xué)改造的替代性遺傳學(xué)改造來實(shí)現(xiàn)askfto、homfbr, metH、metA (也稱為metX)、metY (也稱為 metZ)、和 hskmutated 的過表達(dá)。 就本發(fā)明的目的而言，metA代表高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，其例如來自大腸桿菌。 MetY代表0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶。Hskmutated代表經(jīng)突變而表現(xiàn)出降低的酶活性的高 絲氨酸激酶。可通過在相應(yīng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13032的hsk (Genbank登錄號Cgl 1184) 的T190的位置以絲氨酸或丙氨酸替換蘇氨酸而實(shí)現(xiàn)這一目的?？蛇x地或額外地，可將ATG 起始密碼子替換為TTG起始密碼子。此類突變導(dǎo)致所得到的hsk蛋白與未突變的hsk基因 相比具有降低的酶活性。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體例如可以衍生自野生型棒 狀桿菌，且優(yōu)選地衍生自野生型谷氨酸棒桿菌，該細(xì)菌在至少一種如下基因中含有遺傳學(xué) 改造askfto、homfto、metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為 metZ) ^hskmutated 和 metF，其中 所述遺傳學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，且上述遺傳學(xué)改造與如下基因之一的遺傳學(xué)改造相 組合serA，其中serA的遺傳學(xué)改造降低該基因的表達(dá)，其中所述組合導(dǎo)致與缺乏所述組 合的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在這些起始生物體中，ask、hom、hsk的內(nèi)源性拷貝如上述那樣被置換，而serA的 內(nèi)源性拷貝典型地被功能性破壞。包括這些遺傳學(xué)改造的谷氨酸棒桿菌菌株例如是谷氨酸 棒桿菌0M264C。本領(lǐng)域人員知曉也可以采用下述具體用來產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌0M264C的遺 傳學(xué)改造的替代性遺傳學(xué)改造來實(shí)現(xiàn)askfto、homfbr, metH、metA (也稱為metX)、metY (也稱 為metZ)、hskmutated和metF的過表達(dá)以及降低serA的表達(dá)。就本發(fā)明的目的而言，serA代表3_磷酸甘油酸脫氫酶(見表1)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體例如可以衍生自野生型棒 狀桿菌，且優(yōu)選地衍生自野生型谷氨酸棒桿菌，該細(xì)菌在至少一種如下基因中含有遺傳學(xué) 改造askfto、homfto、metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為 metZ) ^hskmutated 和 metF，其中 所述遺傳學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，且上述遺傳學(xué)改造與至少一種如下基因的遺傳學(xué)改 造相組合mcbR和metQ，其中mcbR和metQ的遺傳學(xué)改造降低這些基因的表達(dá)，其中所述組合導(dǎo)致與缺乏所述組合的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的產(chǎn)生增 力口。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體在aSkfto、h0mfto、metH、metA(也稱 為metX)、metY(也稱為metZ)、hskmutated和metF中將同時(shí)含有遺傳學(xué)改造，其中所述遺傳 學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，且上述遺傳學(xué)改造與mcbR和metQ的遺傳學(xué)改造相組合，其中mcbR和metQ的遺傳學(xué)改造降低這些基因的表達(dá)，其中所述組合導(dǎo)致與缺乏所述組合的情 況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在這些起始生物體中，ask、hom和hsk的內(nèi)源性拷貝典型地如上述那樣被置換， 而mcbR和metQ的內(nèi)源性拷貝典型地被功能性破壞。包括這些遺傳學(xué)改造的谷氨酸棒桿 菌菌株例如是谷氨酸棒桿菌0M469。本領(lǐng)域人員知曉也可以采用下述具體用來產(chǎn)生谷氨酸 棒桿菌0M469的遺傳學(xué)改造的替代性遺傳學(xué)改造來實(shí)現(xiàn)ask "、hom^, metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為metZ)、hskmutated和metF的過表達(dá)以及降低mcbR和metQ的表達(dá)。就本發(fā)明的目的而言，metF代表N5，10_亞甲基-四氫葉酸還原酶(EC1. 5. 1.20)。 McbR代表硫代謝的TetR-型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(Genbank登錄號AAP45010)。MetQ代表D-甲硫 氨酸結(jié)合脂蛋白，其在甲硫氨酸輸入中起作用。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體例如可以衍生自野生型棒 狀桿菌，且優(yōu)選地衍生自野生型谷氨酸棒桿菌，該細(xì)菌在至少一種如下基因中含有遺傳學(xué) 改造askfbr、homfbr、metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為 metZ)、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl，其中所述遺傳學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，且上述遺傳學(xué)改造與至少一 種如下基因的遺傳學(xué)改造相組合mCbR、metQ和sda，其中mCbR、metQ和sda的遺傳學(xué)改造 降低這些基因的表達(dá)，其中所述組合導(dǎo)致與缺乏所述組合的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相比， 所述微生物的甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該產(chǎn)生甲硫氨酸的起始生物體 在 askfbr、homfbr、metH、metA(也稱為 metX)、metY(也稱為 metZ)、hskmutated、metF、tkt、tal、 zwf和6pgl中將同時(shí)含有遺傳學(xué)改造，其中所述遺傳學(xué)改造導(dǎo)致這些基因過表達(dá)，且上述 遺傳學(xué)改造與mcbR、metQ和sda的遺傳學(xué)改造相組合，其中mcbR、metQ和sda的遺傳學(xué) 改造降低這些基因的表達(dá)，其中所述組合導(dǎo)致與缺乏所述組合的情況下產(chǎn)生的甲硫氨酸相 比，所述微生物的甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。包括這些遺傳學(xué)改造的谷氨酸棒桿菌菌株例如是谷氨酸棒桿菌GK1259。本領(lǐng)域人 員知曉也可以采用下述具體用來產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌GK1259的遺傳學(xué)改造的替代性遺傳學(xué) 改造來實(shí)現(xiàn) askfbr、homfbr、metH、metA (也稱為 metX)、metY (也稱為 metZ)、hskmutated、metF、 tkt、tal、zwf和6pgl的過表達(dá)以及降低mcbR、metQ和sda的表達(dá)。就本發(fā)明的目的而言，tkt代表轉(zhuǎn)酮醇酶，tal代表轉(zhuǎn)醛醇酶，zwf代表葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶，6pgl代表6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，而sda代表絲氨酸脫氨酶(見表1)。 本領(lǐng)域人員明白，為了提高zwf的量和/或活性，也可升高opca的量和/或活性，opca充 當(dāng)了 zwf的結(jié)構(gòu)支架蛋白。在GK1259中，可通過使用同時(shí)增加包含tkt、tal、zwf和6pgl 的磷酸戊糖操縱子的轉(zhuǎn)錄的PSOD啟動(dòng)子。如上所述，本發(fā)明的遺傳學(xué)修飾的微生物的特征在于N5，Nltl-亞甲基-THF的量是 升高的。典型地，本發(fā)明的微生物與相應(yīng)的起始生物體相比，N5，N10-亞甲基-THF的量將升 高至少大約2%、至少大約5%、至少大約10%、或至少大約20%。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，N5, Nlt1-亞甲基-THF的量將升高至少大約30%、至少大約50%或至少大約75%。更加 優(yōu)選的實(shí)施方式涉及的微生物中的N5，Nltl-亞甲基-THF的量升高至少大約2倍、至少大約 5倍或至少大約10倍。與培養(yǎng)未經(jīng)過下文所述的遺傳學(xué)修飾的相應(yīng)起始生物體相比，本發(fā)明的方法和微 生物可用于產(chǎn)生更多的甲硫氨酸。本發(fā)明的微生物個(gè)方法還可用于提高甲硫氨酸合成的效 率。術(shù)語"甲硫氨酸合成效率"描述的是甲硫氨酸的碳產(chǎn)率(carbon yield ofmethionine)。這種效率以碳底物形式進(jìn)入系統(tǒng)的能量輸入的百分比進(jìn)行計(jì)算。在本發(fā) 明中，該值以百分?jǐn)?shù)表示((甲硫氨酸摩爾數(shù))(碳底物摩爾數(shù))-、100)。術(shù)語"甲硫氨酸 合成效率升高"因此涉及起始生物體與實(shí)際的棒狀桿菌之間的比較，其中實(shí)際的棒狀桿菌 中至少一種下文所述的酶的量和/或活性已經(jīng)被升高。本發(fā)明的優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。例如，選自如下一組的糖可作 為特別優(yōu)選的碳源葡萄糖、果糖、hanose、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子 糖、淀粉或纖維素。與所述起始生物體相比，本發(fā)明的方法和棒狀桿菌還可用于產(chǎn)生更多的甲硫氨酸。與所述起始生物體相比，本發(fā)明的方法和棒狀桿菌還可用于以更高的速率產(chǎn)生甲 硫氨酸。例如，如果以典型的生產(chǎn)周期為參考，所述方法和棒狀桿菌將允許以更快的速率產(chǎn) 生甲硫氨酸，即與所述起始生物體相比，將在更早的時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生相同量的甲硫氨酸。這特別 適用于對數(shù)生長期。如果菌株在搖瓶中培養(yǎng)，本發(fā)明的方法和棒狀桿菌允許產(chǎn)生至少大約3g甲硫氨 酸/L培養(yǎng)體積。如果菌株在搖瓶中培養(yǎng)，滴度優(yōu)選地為至少大約4g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積、 至少大約5g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積或至少大約7g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積。如果菌株在搖瓶 中培養(yǎng)，更加優(yōu)選的值達(dá)到至少大約IOg甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積，且更加優(yōu)選地達(dá)到至少大 約20g甲硫氨酸/L細(xì)胞群(cell mass)。如果在采用攪動(dòng)和補(bǔ)料碳源的發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)菌株，本發(fā)明的方法和棒 狀桿菌允許產(chǎn)生至少大約25g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積。如果在采用攪動(dòng)和補(bǔ)料碳源的發(fā)酵 罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)菌株，滴度優(yōu)選地為至少大約30g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積、至少大約35g 甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積或至少大約40g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積。如果在采用攪動(dòng)和補(bǔ)料碳源 的發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)菌株，更加優(yōu)選的值達(dá)到至少大約50g甲硫氨酸/L培養(yǎng)體積， 且更加優(yōu)選地達(dá)到至少大約60g甲硫氨酸/L細(xì)胞量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與起始生物體相比，本發(fā)明的方法和微生物允許甲硫氨酸 合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或甲硫氨酸合成的滴度和/或速率升高至少大約2%、 至少大約5%、至少大約10%或至少大約20%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與起始生物體相比， 甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或滴度和/或速率升高至少大約30%、至少 大約40%、或至少大約50%。更加優(yōu)選地，升高至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約5 倍和至少大約10倍。術(shù)語"代謝物"指的是在生物體代謝途徑中用作前體、中間物和/或終產(chǎn)物的化 合物。此類代謝物不僅可作為化學(xué)構(gòu)建單元，還可對酶或其代謝活性發(fā)揮調(diào)節(jié)活性。從文獻(xiàn)可知，此類代謝物可抑制或剌激酶的活性(Stryer，Biochemistry (2002)W. H. Freeman & Company, New York，New York)0術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)條件"指的是在不富含特定化合物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。培養(yǎng) 的溫度、PH和時(shí)間可以變化，詳情見下文。各種微生物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件可參考文獻(xiàn)，包括教科書，例如“Sambr00k& Russell, Molecular Cloning-Α Laboratory Manual“ ， Cold Spring HarborLaboratory Press,3rd edition(2001)。
“基本培養(yǎng)基"是僅含有供野生型細(xì)胞或突變細(xì)胞生長的基本必需品的培養(yǎng)基， 如無機(jī)鹽、碳源和水。對于突變細(xì)胞，基本培養(yǎng)基可含有一或多種基本上純的化合物添加 物，以允許不能產(chǎn)生此類化合物的突變細(xì)胞能夠生長。與之不同的是，“富集培養(yǎng)基"用于滿足特定生物體的所有生長需求，即除了基 本培養(yǎng)基的內(nèi)容以外，還含有例如氨基酸、生長因子、酶輔因子等等。在本發(fā)明中，與起始生物體相比，術(shù)語"升高(至少一種蛋白質(zhì)(例如甲酰 基-THF-合成酶))的量"指的是起始微生物被遺傳學(xué)修飾以表達(dá)更高量的例如上述酶之 一。應(yīng)該理解，升高例如一種酶的量指的是功能性酶的量被升高的情況。在本發(fā)明中，如果 一種酶，例如甲?；?THF-合成酶，能夠催化相應(yīng)的反應(yīng)，則認(rèn)為它是有功能的。本領(lǐng)域人員知曉有多種不同方式可以升高微生物例如棒狀桿菌內(nèi)的蛋白質(zhì)的量。 這些方式包括增加編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸序列的拷貝數(shù)，增加此類核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或 翻譯或它們的組合。下文將詳細(xì)討論這些不同方式。術(shù)語"升高(至少一種蛋白質(zhì))的活性"指的是在該蛋白質(zhì)的相應(yīng)的野生型序列 中引入至少一種突變，與表達(dá)相同量的野生型蛋白質(zhì)的情況相比，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生更多 的甲硫氨酸?？衫脭y帶特定突變的酶來實(shí)現(xiàn)這一目的，其中所述突變使得所述酶的活性 升高。此類突變可以，例如，滅活酶中負(fù)責(zé)反饋抑制的那部分。通過例如在這些酶中引入非 保守性點(diǎn)突變，酶不再受到反饋調(diào)節(jié)，且因此在產(chǎn)生較多產(chǎn)物分子的時(shí)候酶的活性仍不被 下調(diào)。此外，可通過引入增加酶的催化周轉(zhuǎn)的突變而升高酶的活性?？梢詫⑼蛔円刖幋a相 應(yīng)的酶的內(nèi)源性基因拷貝中，或可以從編碼所述酶的外源性核酸序列過量表達(dá)相應(yīng)的突變 體。此類突變可包括點(diǎn)突變、缺失或插入。點(diǎn)突變可以是保守性的(一種氨基酸被具有類 似生物化學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)的另一種氨基酸置換)或非保守性的(一種氨基酸被生物化學(xué) 和物理化學(xué)性質(zhì)不相似的另一種氨基酸置換)。此外，缺失部分可包括僅僅兩或三個(gè)氨基酸 直至相應(yīng)蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)域。例如，對于谷氨酸棒桿菌ATCC13032的轉(zhuǎn)酮醇酶(Genbank 登錄號Cgl 1574)，相應(yīng)于A293位置處的丙氨酸被替換為R和/或相應(yīng)于A327位置處的丙 氨酸被替換為T的突變產(chǎn)生了酶活性提高的酶。基于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域人員能夠開發(fā) 出其他的或替代性的突變。因此，術(shù)語"升高(至少一種酶)的活性"指的是將突變引入相應(yīng)的野生型序列 以降低負(fù)調(diào)控機(jī)制例如反饋抑制和/或提高酶的催化周轉(zhuǎn)。因此，可通過不同的途徑來增加蛋白質(zhì)例如酶的量和/或活性，例如通過關(guān)閉轉(zhuǎn) 錄、翻譯或蛋白水平的抑制調(diào)節(jié)機(jī)制，和/或通過使得編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá) 比起始生物體增加，例如通過誘導(dǎo)內(nèi)源性基因或者通過引入編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列。當(dāng)然，可組合使用升高蛋白質(zhì)例如酶的量和/或活性的方法。因此，例如，可以使用突變體替換棒狀桿菌的內(nèi)源性酶，該突變體編碼該酶的反饋不敏感形式。如果該突變拷 貝的轉(zhuǎn)錄置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下，則相應(yīng)的酶的量和活性可升高。可以理解，在這種情況 中，該酶必須仍然能夠催化其通常所參與的反應(yīng)。
編碼蛋白質(zhì)例如酶的核酸序列可以是內(nèi)源性的或外源性的。因此，例如，通過升高 相應(yīng)的起始微生物內(nèi)天然存在的核酸序列的表達(dá)(例如通過染色體整合額外的核酸序列) 或通過在該內(nèi)源性基因前面使用強(qiáng)啟動(dòng)子，可增加蛋白質(zhì)例如酶的量?？蛇x地或額外地，也 可通過表達(dá)編碼來自另一種生物體的該酶的同源物的核酸序列而增加蛋白質(zhì)例如酶的量。 后一種情況的實(shí)例將在下文給出。因此，例如，可通過過表達(dá)來自自主復(fù)制型載體或額外插入的染色體拷貝(見下) 的相應(yīng)的谷氨酸棒桿菌序列而增加谷氨酸棒桿菌內(nèi)Ipd的量，或可使用來自例如枯草芽孢 桿菌或大腸桿菌的相應(yīng)的酶并例如使用自主復(fù)制型載體過表達(dá)所述酶。在某些情況中，使用內(nèi)源性酶是優(yōu)選的，因?yàn)槔绻劝彼岚魲U菌的內(nèi)源性編碼序 列就其密碼子使用而言對于在谷氨酸棒桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)是優(yōu)化的。在下文中，如果提及蛋白質(zhì)例如特定的酶的量和/或活性與起始生物體相比應(yīng)該 是降低的，則上述定義經(jīng)必要的修改后也是適用的。要降低蛋白質(zhì)例如酶的量和/或活性，可使編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)的核酸序列部分或 完全缺失，抑制轉(zhuǎn)錄(例如通過引入弱啟動(dòng)子)，可通過相應(yīng)地修改密碼子的使用而抑制翻 譯，可在編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸序列引入造成蛋白質(zhì)無功能的突變，和/或它們的組合。在下文中將提到術(shù)語"功能性同源物"。術(shù)語"功能性同源物"在本發(fā)明中指的 是這樣一種情況，即特定的酶活性不僅可由具有確定氨基酸序列的特定蛋白質(zhì)來提供，也 可由具有來自其他有關(guān)或無關(guān)的生物體的類似序列的蛋白質(zhì)來提供。例如，可通過表達(dá)編碼杰氏棒桿菌甲?；?THF-合成酶的核酸序列(SEQID NO=I 核酸序列，SEQ ID NO: 2 氨基酸序列，Genbank登錄號(NP_939608))或其功能性同源物而 在谷氨酸棒桿菌中建立甲?；?THF-合成酶的活性。本領(lǐng)域人員可通過同源性分析而容易地鑒定來自其他生物體的蛋白質(zhì)同源物。為 此可確定推定的同源物的氨基酸或核酸序列與所述基因的序列(例如，甲?；?THF-合成 _、gCVH、gCVP、gCVT、lpd、lplA、lipA、lipA的核酸序列)或所述基因編碼的蛋白質(zhì)的序列 之間的相似性，即百分比相同性。例如，可通過觀察或通過使用基于算法的同源性分析而確定百分比相同性。例如，為了確定兩個(gè)氨基酸序列的百分比相同性，算法將以最佳比較為目的將序 列對齊(例如，為了與一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行最佳比對，可在另一蛋白質(zhì)的氨基酸 序列內(nèi)引入缺口)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸殘基。如果一條序列的一個(gè)位置 與另一序列的相應(yīng)位置均被同一種氨基酸殘基占據(jù)，則兩種分子在該位置處是相同的。兩 個(gè)序列之間的百分比相同性是序列之間共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，相同性％=相 同位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量xlOO)。用于此類目的的各種計(jì)算機(jī)程序是已知的。例如，可使用Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res. , 12 :387 所描述的且可自 University of WisconsinGenetics Computer Group(UffGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程序通過比較序列信息而確定兩個(gè)核酸序列或氨基酸序 列的百分比相同性。也可使用Basic LocalAlignment Search Tool (BLAST )程序(參見Tatusova et al. (1999)FEMSMicrobiol. Lett.，174 :247)通過比對兩個(gè)核酸序列或氨基酸 序列而確定百分比相同性。在本申請的申請日，提供BLAST程序的標(biāo)準(zhǔn)軟件包可從NCBI的BLAST網(wǎng)頁 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)獲得。例如，使用上述任一 SEQ ID 號，本領(lǐng)域人 員可進(jìn)行基于核酸序列或基于氨基酸序列的BLAST搜索以及相應(yīng)的酶在例如大腸桿菌、釀 酒酵母、枯草芽孢桿菌等中的密切相關(guān)的同源物的相同性。例如，對于使用BLAST 程序的 核酸序列比對，默認(rèn)設(shè)置為匹配得分為2，錯(cuò)配罰分為-2，開放缺口和延伸缺口分別罰分5 和 2，gap. times, dropoff 為 50，預(yù)期為 10，word size 為 11，filter 為 OFF。
可在 EMBL 數(shù)據(jù)庫(http //www, embl. orR)或 Expasy 主頁(http //www, expasy. org/)進(jìn)行類似的序列搜索和分析。所以上述序列搜索均可典型地使用本申請申請日前的 數(shù)據(jù)庫提供者預(yù)設(shè)的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。也可常規(guī)使用軟件程序例如DNA Star, Inc. ,Madison, ffinconsin, USA的激光基因軟件進(jìn)行同源性搜索，后者使用CLUSTAL方法(Higgins et al. (1989)，Comput. Appl. Biosci.，5 (2) 151)。本領(lǐng)域人員理解，如果兩種蛋白質(zhì)具有如上所述的一定程度的相同性，則它們很 可能具有相同的功能(例如提供相同的酶活性)。氨基酸水平的典型的下限典型地是至少 大約25%的相同性。對于核酸水平，下限典型地為至少50%。兩種類型的序列的優(yōu)選的相同性等級為至少大約50%、至少大約60%或至少大 約70%。更優(yōu)選的相同性水平為至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%。這些相 同性水平被認(rèn)為是顯著的。在本發(fā)明中，術(shù)語“同源性”和“同源”不限于指具有理論上的共同遺傳學(xué)祖先的蛋 白質(zhì)，也包括遺傳學(xué)上不相關(guān)但演化為行使相似的功能和/或具有相似的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。 同源物應(yīng)該是有功能的這一要求是指本發(fā)明的同源物包括與參照蛋白質(zhì)具有基本上相同 的活性的蛋白質(zhì)，對于具有功能同源性的蛋白質(zhì)，不必要求它們具有氨基酸序列的顯著相 同性，而是指這些具有功能同源性是蛋白質(zhì)由相似或相同的活性例如酶活性所定義。優(yōu)選地，如果來自不同于宿主細(xì)胞如棒狀桿菌的另一種生物體的酶與其在棒狀桿 菌中的對應(yīng)物至少顯示出顯著的相似性，即氨基酸水平大約50%的序列相同性，并催化相 同的反應(yīng)，則認(rèn)為該酶是功能性同源物。如果功能性同源物提供相同的酶活性并在氨基酸 水平具有更高程度的相同性，例如至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%或至少大 約90%的序列相同性，便是更加優(yōu)選的功能性同源物。本領(lǐng)域人員知曉也可以使用來自棒狀桿菌的上述酶的片段或突變形式以及所述 酶在其他生物體中的功能性同源物的片段或突變形式，條件是這些片段或突變形式展現(xiàn)出 相同類型的功能活性。典型的具有功能活性的片段將表現(xiàn)為N-末端和/或C-末端缺失， 而突變形式典型地包含缺失、插入或點(diǎn)突變。例如，如果大腸桿菌的序列在氨基酸水平與SEQ ID NO 2展現(xiàn)出上述相同性水平 并表現(xiàn)出與杰氏棒桿菌甲?；?THF-合成酶相同的酶活性，則認(rèn)為該序列編碼杰氏棒桿菌 甲?；?THF-合成酶的功能性同源物。實(shí)例可取自表1。也可以使用這些序列的片段或例 如點(diǎn)突變體，條件是所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)仍與全長的酶催化同樣類型的反應(yīng)。下文將以甲?；?THF-合成酶、gcvTHP、lplA、IipA和IipB為例給出升高酶的量 的實(shí)例。還將以絲氨酸脫氨酶為例給出降低酶的量的實(shí)例。
升高微牛物內(nèi)的甲酉feS-THF-合成_的量禾Π /或活十牛
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面涉及一種微生物，其中對起始生物體盡興遺傳學(xué)操作， 使得與所述起始生物體相比，所得到的微生物中甲?；?THF-合成酶的量和/或活性是升 高的。本發(fā)明還涉及在微生物中產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括培養(yǎng)上述微生物的步驟。在微生物例如大腸桿菌和杰氏棒桿菌中，甲?；?THF-合成酶的序列是已知的。 在此類微生物中，升高甲?；?THF-合成酶的量和/或活性需要將該酶的量和/或活性升 高至相應(yīng)的起始生物體的水平以上，例如通過過表達(dá)編碼酶活性的核酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選的宿主生物體谷氨酸棒桿菌中，甲?；?THF-合成酶是未知的。 下文描述了如何在谷氨酸棒桿菌中建立甲?；?THF-合成酶活性。不過，本領(lǐng)域人員知曉 如何在其他微生物例如杰氏棒桿菌和大腸桿菌中升高甲?；?THF-合成酶的量和/或活 性。本發(fā)明還涉及谷氨酸棒桿菌微生物，其中甲?；?THF-合成酶的量和/或活性是 升高的，并涉及該微生物在生產(chǎn)甲硫氨酸中的用途?？赏ㄟ^例如增加編碼甲?；?THF-合 成酶的核酸序列的拷貝數(shù)、提高的編碼甲?；?THF-合成酶的序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯或其 組合而實(shí)現(xiàn)這一目的。就本發(fā)明的目的而言，可使用來自杰氏棒桿菌的甲?；?THF-合成酶。該甲酰 基-THF-合成酶的核酸序列為SEQ ID NO :1，其氨基酸序列為SEQ IDNO :2。Genbank登錄號 為ΥΡ_250663. 1。該序列來源于杰氏棒桿菌NCTCK11915，后者也稱為Κ411。甲?；?THF-合 成酶也可獲自菌株DSMZ7171，其中核酸序列為SEQ ID NO 51，氨基酸序列為SEQ ID NO :52。當(dāng)然也可以使用SEQ ID NO :1和2所示的甲酰基-THF-合成酶的功能性片段或其 功能性同源物。表1給出了可通過標(biāo)準(zhǔn)的同源性搜索而鑒定的一些同源物?？赏ㄟ^例如從自主復(fù)制型質(zhì)粒表達(dá)所述序列，或?qū)㈩~外拷貝的相應(yīng)核酸序列整合 至微生物的基因組且優(yōu)選地為谷氨酸棒桿菌的基因組內(nèi)，由此增加微生物內(nèi)且優(yōu)選地谷氨 酸棒桿菌內(nèi)的編碼甲?；?THF-合成酶的核酸序列的拷貝數(shù)。對于自主復(fù)制型載體，他們可穩(wěn)定保留在棒狀桿菌內(nèi)。用于在谷氨酸棒桿菌中 表達(dá)多肽和酶例如甲酰基-THF-合成酶的典型的載體包括pCliK、pB和ρΕΚΟ，參見Bott， Μ. and Eggeling,L. ,eds. Handbook of Corynebacteriumglutamicum. CRC Press LLC,Boca Raton,FL ；Deb,J.K.et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999)，175 (1)，11-20)、Kirchner 0. et al. (J. Biotechnol. (2003)，104(1-3)，287-299)、W02006069711 和 W02007012078。在增加棒狀桿菌中編碼多肽的核酸序列的拷貝數(shù)的另一方法中，可將額外拷貝的 編碼此類多肽的核酸序列整合到谷氨酸棒桿菌的染色體內(nèi)。染色體整合例如可發(fā)生在相應(yīng) 多肽的內(nèi)源性拷貝所位于的基因座。額外地和/或可選地，編碼多肽的核酸序列的染色體 重復(fù)可發(fā)生在棒狀桿菌基因組內(nèi)的其他基因座上。對于谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域人員已知有各種方法通過染色體整合來增加基因拷 貝數(shù)。此類方法之一借助于載體PK19 sacB，詳情見Schafer A，et al. JBacteriol. 1994 176(23) :7309-7319。用于染色體整合編碼多肽的核酸序列的其他載體包括pCLIK int sacB，詳情見 W02005059093 和 W02007011845。升高微生物且特別是谷氨酸棒桿菌內(nèi)的甲?；?THF-合成酶的量和/或活性的另 一優(yōu)選的方法是使用強(qiáng)啟動(dòng)子來增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
如果使用強(qiáng)啟動(dòng)子升高內(nèi)源性甲?；?THF-合成酶的活性，則術(shù)語"強(qiáng)啟動(dòng)子" 指的是由新引入的啟動(dòng)子引起的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)于天然存在的內(nèi)源性啟動(dòng)子。不過，如果是在其中該類型的酶是未知的谷氨酸棒桿菌內(nèi)表達(dá)甲?；?THF-合成酶，則可使用已知可引起谷氨酸棒桿菌的內(nèi)源性基因強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子。這種情況下優(yōu)選的啟動(dòng)子是啟動(dòng)子Psqd(SEQ ID N0:3), PgroES(SEQ IDNO 4)、 Peftu(SEQ ID NO :5)、噬菌體 SPOl 啟動(dòng)子 P15 (SEQ ID NO 42)、禾口 APe(SEQ ID N0:6)，后者 有時(shí)稱為lambdaPK。在谷氨酸棒桿菌中，λ Pk啟動(dòng)子可強(qiáng)于Psrai啟動(dòng)子。Psffll啟動(dòng)子可強(qiáng)于 Pgr0ES啟動(dòng)子，而PgraES啟動(dòng)子可弱于Peftu啟動(dòng)子或P15啟動(dòng)子。Peftu啟動(dòng)子可強(qiáng)于Psrai啟動(dòng) 子。不過，啟動(dòng)子在任何生物體內(nèi)的強(qiáng)度不一定是啟動(dòng)子的固有屬性，這是因?yàn)楦鶕?jù)啟動(dòng)子 通過遺傳工程化而被放置的位置，啟動(dòng)子的強(qiáng)度可以有很大的變化。微生物且特別是谷氨酸棒桿菌的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性升高將允 許所述微生物生長在含有甲酸鹽作為碳源的培養(yǎng)基中。此外，甲酸鹽還在多種生物合成途 徑中作為代謝物，因此利用甲酸鹽也將允許升高N5，Nltl-亞甲基-THF的產(chǎn)量。N5，Nltl-亞甲 基-THF的水平升高將導(dǎo)致甲基-THF的產(chǎn)生增加和甲硫氨酸的產(chǎn)生增加。因此本發(fā)明還涉及一種方法，其包括培養(yǎng)上述微生物和任選地分量甲硫氨酸。在本發(fā)明的升高微生物且優(yōu)選地谷氨酸棒桿菌內(nèi)的甲?；?THF-合成酶的量和/ 或活性的上述實(shí)施方式的更加具體的情況中，可通過降低甲酰基-THF-脫甲?；傅牧亢?/或活性而進(jìn)一步增加N5，Niq-亞甲基-THF的量。甲?；?THF-脫甲?；傅暮怂嵝蛄袨?SEQ ID NO :7，氨基酸序列為SEQ IDNO :8。表1給出該酶活性的Genbank登錄號。可選地或額外地，與所述起始生物體相比，N5, N10-次甲基-THF-環(huán)化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-還原酶和/或N5，N10-亞甲基-THF-還原酶的量和/或活性是升高的。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，與所述起始生物體相比，甲?；?THF-合成酶的量和/或活性是升高 的，甲?；?THF-脫甲酰基酶的量和/或活性是降低的，且N5，N10-次甲基-THF-環(huán)化合成 酶、N5，N10-次甲基-THF-還原酶和N5，N10-次甲基-還原酶的量和/或活性是升高的。由 于所有這些上述酶活性在微生物以及谷氨酸棒桿菌中均存在(甲?；?THF-合成酶除外)， 因此優(yōu)選地可使用內(nèi)源性核酸序列來升高和/或降低本發(fā)明的微生物內(nèi)且優(yōu)選地谷氨酸 棒桿菌內(nèi)的相應(yīng)的酶活性的量和/或活性。下文將詳述升高蛋白質(zhì)的量和/或活性的方法。這些方法當(dāng)然也適用于甲酰 基-THF-合成酶。下文將詳述降低微生物內(nèi)的蛋白質(zhì)的量和/或活性的方法。這些方法當(dāng) 然也適用于下調(diào)甲酰基-THF-脫甲?；?。當(dāng)然，也可以使用杰氏棒桿菌的甲?；?THF-合成酶的功能性同源物或其他上述 酶的功能性同源物。這些功能性同源物將展現(xiàn)出與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有上述 相同性程度，并提供相同類型的酶活性。表1給出了來自不同于杰氏棒桿菌的其他生物體 的甲?；?THF-合成酶的登錄號。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及表達(dá)甲?；鵗HF-合成酶的谷氨酸棒桿菌微生物。本發(fā)明優(yōu) 選地還涉及這些谷氨酸棒桿菌生物體在生產(chǎn)甲硫氨酸中的用途。這些菌株可額外地顯示出 針對以下酶所討論過的上述遺傳學(xué)改造甲?；?THF-脫甲?；?、N5，N1Q-次甲基-THF-環(huán) 化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-還原酶和/或N5，Nlt1-亞甲基-THF-還原酶?？捎米髌鹗忌矬w的典型的谷氨酸棒桿菌菌株可以是野生菌株例如ATCC13032。不過，優(yōu)選地可使用已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾過以保證甲硫氨酸產(chǎn)生增加的起始生物體。所述生 物體可展現(xiàn)出DSM17323的特征，因此表現(xiàn)為Mkfb^homfto和metH的量和/或活性升高。優(yōu) 選的起始菌株也可具有M2014的特征，并表現(xiàn)為ask^^homf^met^metAietY、和hskmutated 的量和/或活性升高。其他優(yōu)選的起始生物體可具有0M469的特征，并表現(xiàn)為ask^^hom*、 metH、metA、metY、hskmutated和metF的量和/或活性升高和mcbR和metQ的量和/或活性降 低。再其他優(yōu)選的起始生物體可具有GK1259的特征，并表現(xiàn)為ask*、hon^、metH、metA、 metY、hskmutated、tkt (和任選地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性升高和mcbR、 metQ和sda的量和/或活性降低，或可具有M2616的特征，并表現(xiàn)為ask "、homfbr, metH、 metA、metY、hskmutated、tkt (和任選地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性升高和 mcbR、metQ和serA的量和/或活性降低。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，如果將表現(xiàn)為甲?；?THF-合成酶的量和/或活性升高的上述 微生物培養(yǎng)在含有升高量的甲酸鹽的培養(yǎng)基中，可進(jìn)一步刺激甲硫氨酸的產(chǎn)生。在本發(fā)明的方法的這一實(shí)施方式中甲酸鹽是有意添加至培養(yǎng)基至的，這一實(shí)施方 式特別優(yōu)選地使用如下所述的谷氨酸棒桿菌菌株進(jìn)行，所述菌株已經(jīng)經(jīng)遺傳學(xué)修飾以表現(xiàn) 出甲?；?THF-合成酶的上述活性以及其他遺傳學(xué)改造。同樣，優(yōu)選地通過在谷氨酸棒桿 菌中表達(dá)杰氏棒桿菌的相應(yīng)序列或其功能性同源物和片段來增加甲?；?THF-合成酶的 活性。甘氨酸切割系統(tǒng)的量和/或活件升高的微牛物本發(fā)明在一個(gè)方面涉及微生物且優(yōu)選地為谷氨酸棒桿菌，其表現(xiàn)出甘氨酸切割系 統(tǒng)的酶活性升高。本發(fā)明還涉及利用這些微生物通過培養(yǎng)所述微生物和任選地分離甲硫氨 酸來生產(chǎn)甲硫氨酸的方法。在一些工業(yè)用途中，微生物例如大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌可產(chǎn)生作為副產(chǎn)品的甘 氨酸。本發(fā)明通過提供表現(xiàn)出甘氨酸切割系統(tǒng)活性升高的微生物而利用所述副產(chǎn)品。微生物的甘氨酸切割系統(tǒng)典型地包含4至5個(gè)亞基。第一亞基是PLP-依賴性甘氨酸脫羧酶(GcvP，也簡稱為P-蛋白)。第二亞基是含 硫辛酰胺的氨基甲基轉(zhuǎn)移酶(GcvH，也稱為H-蛋白)。第三亞基是合成N5，Niq-亞甲基-THF 的酶(GcvT)。這三個(gè)因子有時(shí)被稱為gcvPTH。第四亞基是NAD+-依賴性的、需FAD的硫辛 酰胺脫氫酶(lpd，也簡稱為L-蛋白)。相應(yīng)的基因名稱分別為gCVP、gCVT、gCVH和lpd。在 大腸桿菌和杰氏棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了此類GCS的實(shí)例。通常，至少兩種其他的多亞基酶也具有 Ipd亞基，這兩種酶是丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶。如果GCS系統(tǒng)的酶活性升高，超過細(xì)胞群所需的過量甘氨酸將優(yōu)選地被代謝為 ΝΗ4+、CO2和N5，Nltl-亞甲基-THF，后者可用于例如增加甲硫氨酸合成。不過，某些微生物例 如谷氨酸棒桿菌缺乏天然的GCS系統(tǒng)。不過，此類生物體通常具有Ipd基因，其編碼用于上 述兩種酶系統(tǒng)的亞基。如下文所述，谷氨酸棒桿菌的天然Lpd蛋白能夠與非天然共同起作用GCS，這樣僅 需添加并表達(dá)gcvP、gcvT和gcvH基因即可在谷氨酸棒桿菌中獲得活性GCS功能。然而優(yōu) 選地，非天然Ipd基因也要過表達(dá)，引物該基因更能夠特異性地和高效地與gcvP、gcvT和 gcvH相互作用。此外，應(yīng)該注意到某些生物體的甘氨酸切割系統(tǒng)由5個(gè)亞基組成。例如，在枯草芽孢桿菌中，ρ-亞基例如被分為兩個(gè)多肽，有時(shí)稱為Pl和P2，它們被兩種基因編碼，有時(shí)稱為 gcvPl 禾口 gcvP2。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾而表現(xiàn)為甘氨酸 切割系統(tǒng)活性升高的微生物。可通過升高由gcvP、gCvH和gcvT編碼的酶活性的量和/或活 性而獲得所述升高的甘氨酸切割系統(tǒng)活性。下文將提及如何在谷氨酸棒桿菌中建立升高的 甘氨酸切割系統(tǒng)活性，而這是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式。不過，本領(lǐng)域人員會(huì)清楚地認(rèn) 識(shí)到如何在其他生物體例如大腸桿菌或杰氏棒桿菌中也獲得升高的甘氨酸切割系統(tǒng)活性。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及微生物，且特別是谷氨酸棒桿菌，其中與所述起始生物體 相比，通過遺傳學(xué)改造而提高由gcvP、gcvH和gcvT (統(tǒng)稱gcvPHT)編碼的酶活性的量和/ 或活性。
可通過升高杰氏棒桿菌的相應(yīng)的酶的量和/或活性而實(shí)現(xiàn)這一目的。gcvP的核酸 序列為SEQ ID NO :9，氨基酸序列為SEQ ID NO :10。Genbank登錄號是CAI36361. 1。杰氏棒桿菌gcvH的核酸序列為SEQ ID NO :11，氨基酸序列為SEQ IDNO :12。 Genbank 登錄號是 CAI36363. 1。杰氏棒桿菌gcvT的核酸序列為SEQ ID NO 13，氨基酸序列為SEQ IDNO :14。 Genbank 登錄號是 CAI36362. 1。就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選地可使用來自杰氏棒桿菌的上述序列?？赏ㄟ^單獨(dú)或組合表達(dá)、特別是過表達(dá)上述序列而升高微生物特別是谷氨酸棒桿 菌內(nèi)的甘氨酸切割系統(tǒng)的活性，其中組合是本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，本發(fā)明特 別涉及其中g(shù)cvPHT酶活性同時(shí)升高的谷氨酸棒桿菌微生物?？赏ㄟ^過表達(dá)如SEQ ID NO 9-14所示的gCVP、gCVH和gcvT的序列或其功能性片段或其功能性同源物而實(shí)現(xiàn)這一目的。 通過在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性搜索即可容易地鑒定到gcvP、gcvH和gcvT的上述序 列的功能性同源物，并可得到其他生物體例如大腸桿菌的序列。表1給出了來自其他生物 體的這些酶的登錄號。優(yōu)選地使用杰氏棒桿菌的gcvP、gcvH和gcvT序列，特別是在谷氨 酸棒桿菌中使用，因?yàn)檫@些基因集中在一個(gè)操縱子內(nèi)(Tauch et al. (2005) J. Bacteriol., 187,4671-4682)。此外，杰氏棒桿菌和谷氨酸棒桿菌的Ipd基因顯示出高度的序列相同性 (見圖1)。有理由認(rèn)為gcvP、gcvH和gcvT因子順利地且高效地與谷氨酸棒桿菌的Ipd相 互作用。可通過在討論甲?；?THF-合成酶時(shí)所提及的方法來升高微生物特別是谷氨酸棒 桿菌中的gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性。因此，可構(gòu)建例如包含gcvP、gcvH和gcvT 的編碼序列的功能單元，并通過使用例如可整合至微生物的基因組中、特別是谷氨酸棒桿 菌的基因組中的自主復(fù)制型質(zhì)?；蛸|(zhì)粒而增加包含這種單元的核酸序列的拷貝數(shù)?？蛇x地或額外地，可以在該操縱子前面添加保證gCVP、gCVH和gcvT的編碼序列進(jìn) 行強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可優(yōu)選地選自PEFTu、PgroES> Psod> P15和λ ΡΕ啟動(dòng)子。原則上，不必升高Ipd因子的量和/或活性。在經(jīng)遺傳學(xué)操縱以升高gcvP、gcvH 和gcvT的量和/或活性的宿主微生物中，通常存在足夠豐富量的該因子。不過，在本發(fā)明 的某些實(shí)施方式中，優(yōu)選地也升高Ipd的量和/或活性。為此，可通過任何上述方法過表達(dá) Ipd的內(nèi)源性序列，下文將對這些方法加以詳述。根據(jù)起始生物體的Ipd與從中獲得gcvP、 gcvH和gcvT因子的生物體內(nèi)的Ipd之間的相似性，優(yōu)選地可通過增加內(nèi)源性或外源性Ipd 的表達(dá)來升高Ipd的量和/或活性。為此，可優(yōu)選地選擇從中獲得甘氨酸切割系統(tǒng)的其他因子的生物體內(nèi)的Ipd。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及微生物，所述微生物衍生自起始生物體，使得所 得到的微生物表現(xiàn)出gcvP、gcvH和gcvT因子的量和/或活性升高。本發(fā)明還涉及使用這 些微生物通過培養(yǎng)所述微生物和任選地分離甲硫氨酸而產(chǎn)生甲硫氨酸的方法。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及谷氨酸棒桿菌微生物，其表達(dá)如SEQ ID NO :9_14所示的杰氏 棒桿菌的gCVP、gCVH和gcvT因子或其功能性同源物和功能性片段。優(yōu)選地，本發(fā)明還涉及 這些谷氨酸棒桿菌生物體在生產(chǎn)甲硫氨酸中的用途。可用作起始生物體的典型的谷氨酸棒桿菌菌株可以是野生菌株例如ATCC13032。 不過，優(yōu)選地可使用已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾過以保證甲硫氨酸產(chǎn)生增加的起始生物體。所述生 物體可展現(xiàn)出DSM17323的特征，因此表現(xiàn)為Mkfb^homfto和metH的量和/或活性升高。優(yōu) 選的起始菌株也可具有M2014的特征，并表現(xiàn)為ask^^homf^met^metAietY、和hskmutatea 的量和/或活性升高。其他優(yōu)選的起始生物體可具有0M469的特征，并表現(xiàn)為ask^^hom*、 metH、metA、metY、hskmutated和metF的量和/或活性升高和mcbR和metQ的量和/或活性降 低。本領(lǐng)域人員還可清楚地認(rèn)識(shí)到，在涉及增加甘氨酸切割系統(tǒng)的所有上述實(shí)施方式 中，起始微生物，優(yōu)選地上述谷氨酸棒桿菌菌株之一，進(jìn)一步展現(xiàn)出與參與絲氨酸生物合成 途徑的酶有關(guān)的遺傳學(xué)修飾。術(shù)語"絲氨酸生物合成途徑"是本領(lǐng)域所熟知的，其描述的是發(fā)生在野生型生物 體中并導(dǎo)致絲氨酸生物合成的一系列反應(yīng)。該途徑在不同生物體之間可有變化。有關(guān)生物 體特異性途徑的詳情可參考教科書和以下網(wǎng)頁所列科技文獻(xiàn):http://www. Renome. ip。絲氨酸是從糖酵解的中間體3-磷酸甘油酯合成而來的，后者首先被3-磷酸甘油 酸脫氫酶(SerA)的作用氧化為磷酸羥基丙酮酸。在第二個(gè)步驟中，磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (SerC)催化磷酸羥基丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用，導(dǎo)致形成磷酸絲氨酸，后者隨后被磷酸絲氨 酸磷酸酶(SerB)脫磷酸，產(chǎn)生L-絲氨酸。L-絲氨酸可被絲氨酸脫水酶(sdaA)轉(zhuǎn)化為丙酮 酸以及被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT或glyA)轉(zhuǎn)化為甘氨酸和亞甲基四氫葉酸。就本發(fā)明的目的而言，起始生物體除了目的在于引入改善的甘氨酸切割系統(tǒng)并保 證硫辛酸和/或硫辛酰胺的利用得以改善的上述遺傳學(xué)修飾之外，其選自如下一組的酶的 量和/或活性是升高的D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)、磷酸 絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)?？蛇x地或額外地，絲氨酸脫氨 酶(SdaA)的量和/或活性可以是降低的。表1給出了絲氨酸生物合成途徑的上述酶的序 列的實(shí)例。因此，優(yōu)選的起始菌株例如可具有0M264C的特征，并表現(xiàn)為ask "、homfbr, metH、 metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一種用于產(chǎn) 生甲硫氨酸的優(yōu)選的起始菌株可具有GK1259的特征，并表現(xiàn)為ask*、hom^, metH、metA、 metY、hskmutated、metF、tkt、tal、zwf 和 6pgl 的量和 / 或活性升高和 mcbR、metQ 和 sda 的量 和/或活性降低。當(dāng)然，這些微生物可特別優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法中，以生產(chǎn)甲硫氨酸。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，可在表現(xiàn)為甘氨酸切割系統(tǒng)活性升高的上述微生物中增加N5， Niq-亞甲基-THF和甲硫氨酸的生產(chǎn)，條件是所述微生物(i)被提供了外來的硫辛酸和/或硫辛酰胺和/或(ii)進(jìn)一步被遺傳學(xué)修飾使得與起始生物體相比產(chǎn)生更多的硫辛酸和/ 或硫辛酰胺。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及如下方法，該方法利用上述微生物，所述微生物表現(xiàn) 為甘氨酸切割系統(tǒng)的gcvP、gCvH和gcvT因子(和任選地Ipd因子)的量和/或活性升高， 并被培養(yǎng)在含有增加量的硫辛酸和/或硫辛酰胺的培養(yǎng)基中。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這一方面的 目的，添加至培養(yǎng)基中的硫辛酸和/或硫辛酰胺的終濃度可達(dá)到至少大約0. lmg/L,至少大 約lmg/ml，和優(yōu)選地至少大約10mg/L。
本領(lǐng)域人員已知，在某些生物體中，硫辛酰胺，有時(shí)稱為硫辛酰胺(lipoic acid amide)，可替代硫辛酸用于酶的硫辛?；?Reed, L. J. et al. (1958) J. Biol. Chem. 232， 143-158)。因此，在本發(fā)明中，可采用硫辛酰胺補(bǔ)料來替代在此所述的硫辛酸補(bǔ)料。換言 之，可從硫辛酸的提供商處購得各種形式的硫辛酰胺(例如，Sigma-Aldrich產(chǎn)品目錄號T 5875、T 5625、T 1395、T8260)，它們也可用于本發(fā)明的方法的生物體中以刺激或增加甘氨 酸切割活性?？梢允褂眠@兩類化合物的氧化形式和還原形式及其各種鹽和酯。因此，硫辛 ?；捎胁煌瑏碓础１景l(fā)明的方法的這一實(shí)施方式有意地在培養(yǎng)基中添加硫辛酸和/或硫辛酰胺，特 別優(yōu)選地使用經(jīng)遺傳學(xué)修飾后展現(xiàn)出甘氨酸切割系統(tǒng)的gcvP、gcvH和gcvT因子活性的谷 氨酸棒桿菌菌株進(jìn)行這一實(shí)施方式。同樣，優(yōu)選地通過在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)杰氏棒桿菌 的相應(yīng)的序列或其功能性同源物和片段而升高甘氨酸切割系統(tǒng)的活性。在本發(fā)明這一方面 的進(jìn)一步具體情況中，可通過使用內(nèi)源性谷氨酸棒桿菌序列或外源性序列(見表1)來升高 Ipd因子的量和/或活性。同樣，在谷氨酸棒桿菌中，培養(yǎng)基中的硫辛酸和/或硫辛酰胺的終濃度為至少大 約0. lmg/L，至少大約lmg/L，和優(yōu)選地至少大約10mg/L。本發(fā)明的微生物因gcvP、gcvH和gcvT因子的量和/或活性升高而表現(xiàn)出甘氨酸 切割系統(tǒng)的活性升高，可進(jìn)一步對所述微生物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾以升高其內(nèi)部合成的硫辛酸 和/或硫辛酰胺的量。有兩種不同途徑來利用硫辛酸并將其連接于靶蛋白。在大腸桿菌中，這兩種途徑 被稱為 IplA 依賴性途徑和 IipB 依賴性途徑(Morris et al. (1995) J. Bacteriol.，177， 1-10)。IplA基因編碼硫辛酰合成酶(LplA蛋白)。該酶利用ATP活化硫辛酸，隨后將硫 辛酰-AMP附著于gcvH。IipB 依賴性途徑包含兩種酶(Morris et al. (1995) J. Bacteriol.，177，1-10)。 LipA編碼硫辛酸合酶(LipA蛋白)。IipB基因編碼硫辛酰轉(zhuǎn)移酶(LipB蛋白)。LipA將辛 酰-ACP轉(zhuǎn)化為硫辛酰-ACP。第二步，IipB將硫辛酰部分附著于gcvH和其他硫辛?；鞍?質(zhì)的硫辛酰結(jié)構(gòu)域。因此，IplA的量和/或活性升高允許外源添加的硫辛酸更好地?fù)饺?，而IipA和/ 或IipB的量、類型和/或活性增加可升高轉(zhuǎn)移至GcvH的內(nèi)部合成的硫辛酸的量。大腸桿菌的IplA的核酸序列為SEQ ID NO 15，氨基酸序列為SEQ IDNO :16， Genbank 登錄號是 EGl 1796。杰氏棒桿菌的IipA的編碼序列為SEQ ID NO :17，氨基酸序列為SEQ IDNO :18，Genbank 登錄號是 GeneID :3433570。杰氏棒桿菌的IipB的核酸序列為SEQ ID NO :19，氨基酸序列為SEQ IDNO :20， Genbank 登錄號是 GeneID :3433571。就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選地使用來自杰氏棒桿菌的上述序列。
因此，可通過升高IplA的量和/或活性，使得表現(xiàn)為甘氨酸切割系統(tǒng)因子gcvP、 gcvH和gcvT的量和/或活性升高的本發(fā)明的微生物在N5，Niq-亞甲基-THF和甲硫氨酸合 成方面被進(jìn)一步優(yōu)化。為此，可通過利用SEQ IDNO 15或其功能性同源物和片段而增加IplA的表達(dá)。所述微生物將顯示出外部 添加的硫辛酸和/或硫辛酰胺被更好地?fù)饺?，因此特別適合于本發(fā)明的那些將所述微生物 培養(yǎng)在補(bǔ)充了硫辛酸和/或硫辛酰胺的培養(yǎng)基中的方法。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如下微生物，所述微生物除了甘氨酸切割 系統(tǒng)因子gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性升高之外，還表現(xiàn)出1 ipA、1 ipB或1 ipA和1 ipB 的量和/或活性升高。除了 gCVP、gCVH和gcvT的量和/或活性升高之外還表現(xiàn)出IipA和 IipB的量和/或活性升高的微生物是特別優(yōu)選的。這些微生物可更好地形成和適應(yīng)內(nèi)源性 合成的硫辛酸和/或硫辛酰胺，因此有助于產(chǎn)生N5，Nltl-亞甲基-THF和甲硫氨酸。當(dāng)然，這些微生物也可用于本發(fā)明的方法，所述方法涉及在補(bǔ)充了硫辛酸和/或 硫辛酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有升高的甘氨酸切割系統(tǒng)活性的遺傳學(xué)修飾的生物體。在這一 方面的進(jìn)一步的情況中，可產(chǎn)生和使用如下微生物，所述微生物除了 gcvP、gcvH和gcvT的 量和/或活性升高之外還顯示出lplA、IipA和IipB的量和/或活性升高。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式同樣也涉及谷氨酸棒桿菌微生物，其中通過對 起始谷氨酸棒桿菌生物體進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，該微生物通過被遺傳學(xué)修飾以便表現(xiàn)出lplA、 IipA和/或IipB的量和/或活性升高而表現(xiàn)出甘氨酸切割系統(tǒng)因子gcvP、gcvH和gcvT 的量和/或活性升高，并表現(xiàn)出對外部提供的硫辛酸和/或硫辛酰胺的改善的適應(yīng)性，和/ 或表現(xiàn)出對內(nèi)部產(chǎn)生的硫辛酸和/或硫辛酰胺的改善的形成和適應(yīng)性。因此，本發(fā)明的優(yōu) 選的實(shí)施方式涉及谷氨酸棒桿菌微生物，其與所述起始生物體相比，gcvP、gcvH和gcvT和 IplA的量和/或活性是升高的。在另一個(gè)同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述谷氨酸棒桿菌微生 物表現(xiàn)為gcvP、gcvH和gcvT和IipA或IipB的量和/或活性升高。更加優(yōu)選的谷氨酸棒 桿菌微生物表現(xiàn)為gcvP、gcvH和gcvT、IipA和IipB的量和/或活性升高。特別優(yōu)選的谷 氨酸棒桿菌微生物表現(xiàn)為gcvP、gcvH和gcvT、lpl、IipA和IipB的量和/或活性升高。本領(lǐng)域人員理解用于引入上述遺傳學(xué)修飾的谷氨酸棒桿菌起始生物體可以是野 生菌株例如ATCC13032。不過，優(yōu)選地可使用已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾以保證起始甲硫氨酸產(chǎn)生增 加的生物體。該生物體可表現(xiàn)出DSM17323的特征，因此表現(xiàn)為ask·、homfbr和metH的量 和/或活性升高。優(yōu)選的起始菌株還可表現(xiàn)出M2014的特征，并表現(xiàn)為ask^^hon/^metH、 metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高。其他優(yōu)選的起始生物體可表現(xiàn)出0M469的特 征，并表現(xiàn)為 askfto、homfto、metH、metA、metY、hskmutated 和 metF 的量和 / 或活性升高和 mcbR 和metQ的量和/或活性降低。本領(lǐng)域人員還清楚地知曉，在涉及甘氨酸切割系統(tǒng)增強(qiáng)和硫辛酸和/或硫辛酰胺 的攝取、形成和適應(yīng)性得以改善的所有上述實(shí)施方式中，起始微生物，其優(yōu)選地是上述谷氨 酸棒桿菌菌株，具有對參與上述絲氨酸生物合成途徑的酶的進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾。
因此，優(yōu)選的起始菌株可具有0M264C的特征，并表現(xiàn)為ask^^homf^metlmetA、 metY、和hsk—d的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一種優(yōu)選的起始 菌株可具有 GK1259 的特征，并表現(xiàn)為 askfbr、homfto、metH、metA、metY、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl的量和/或活性升高和mcbR、metQ和sda的量和/或活性降低。
-THF-/ 細(xì)牛本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式涉及如下微生物，其組合了上述生物體的特征，即 升高的甲?；?THF-合成酶的量和/或活性和升高的甘氨酸切割系統(tǒng)活性。應(yīng)該理解，上 述特別優(yōu)選的實(shí)施方式也被組合用于本發(fā)明的這一方面。因此，本發(fā)明的微生物將被遺傳學(xué)修飾，使得其表現(xiàn)為甲?；?THF-合成酶、 gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性升高。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物將被進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾以表現(xiàn)為IplA的量和/ 或活性升高。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式還涉及表現(xiàn)為甲酰基-THF-合成酶、gCVP、gCVH和gcvT和 IipA或IipB的活性升高的微生物。更加優(yōu)選的是表現(xiàn)為甲?；?THF-合成酶、gCVP、gCVH 和gcvT、IipA和IipB的量和/或活性升高的微生物。另一優(yōu)選的實(shí)施方式涉及表現(xiàn)為甲?；?THF-合成酶、gCVP、gCVH和gcvT、lplA、 IipA和IipB的量和/或活性升高的微生物。所述微生物當(dāng)然還可以表現(xiàn)為Ipd的量和/或活性升高?？梢岳斫馍鲜鰧?shí)施方式優(yōu)先在谷氨酸棒桿菌微生物上實(shí)現(xiàn)。該谷氨酸棒桿菌菌株 可以是野生菌株例如ATCC13032。不過，優(yōu)選地可使用已經(jīng)被遺傳學(xué)修飾過以保證甲硫氨酸 產(chǎn)生增加的起始生物體。所述生物體可展現(xiàn)出DSM17323的特征，因此表現(xiàn)為ask*、Komfbr 和metH的量和/或活性升高。優(yōu)選的起始菌株也可具有M2014的特征，并表現(xiàn)為ask*、 hon^、metH、metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高。其他優(yōu)選的起始生物體可具有 0M469 的特征，并表現(xiàn)為 ask^^hom^^metHietA，、metY、hskmutated 和 metF 的量和 / 或活性 升高和mcbR和metQ的量和/或活性降低，或所述起始生物體可具有M2616的特征，并表現(xiàn) 為 askfbr、homftr、metH、metA、metY、hskmutated、tkt (和任選地 g6pdh、zwfa 和 6pgl)和 metF 的量和/或活性升高和mcbR、metQ和serA的量和/或活性降低。本領(lǐng)域人員還清楚地知曉，在涉及甘氨酸切割系統(tǒng)增強(qiáng)和硫辛酸和/或硫辛酰胺 的攝取、形成和適應(yīng)性得以改善的所有上述實(shí)施方式中，起始微生物，其優(yōu)選地是上述谷氨 酸棒桿菌菌株，具有對參與上述絲氨酸生物合成途徑的酶和/或參與甲酰基代謝的酶例如 甲?；?THF-脫甲酰基酶、N5, N10-次甲基-THF-環(huán)化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-還原酶 和/或N5，Nltl-亞甲基-THF-還原酶的進(jìn)一步遺傳學(xué)修飾。因此，優(yōu)選的起始菌株可具有0M264C的特征，并表現(xiàn)為ask^^hon^、metH、metA、 metY、和hsk—d的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一種優(yōu)選的起始 菌株可具有 GK1259 的特征，并表現(xiàn)為 askfbr、homfto、metH、metA、metY、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl的量和/或活性升高和mcbR、metQ和sda的量和/或活性降低。為了升高上述酶的量和/或活性，可根據(jù)相應(yīng)的起始微生物是否提供所需的活性 而決定是依賴編碼這些酶的內(nèi)源性核酸序列還是使用外源性序列。對于谷氨酸棒桿菌微生物，優(yōu)選地使用杰氏棒桿菌的編碼序列來升高甲?；?THF-合成酶、gcvP、gcvH和gcvT、lplA、lipA、IipA和/或Ipd的量和/或活性。這些 酶的序列見SEQ ID NO :1和2以及9至20。本領(lǐng)域人員當(dāng)然知曉也可使用編碼上述序列號 (SEQ ID NO)的功能性同源物或片段的序列。此類功能性同源物可包括其他來源的序列，例 如大腸桿菌的序列。表1通過引用Genbank登錄號的方式給出了可以使用的序列的總體情
況。 本發(fā)明的微生物且特別是谷氨酸棒桿菌微生物可用于通過培養(yǎng)和任選地分離甲 硫氨酸而生產(chǎn)甲硫氨酸。如上所述，修飾的生物體可培養(yǎng)在補(bǔ)充了增加量的甲酸鹽和硫辛 酸和/或硫辛酰胺的培養(yǎng)基中。下表給出了前面詳細(xì)討論過的一些酶的總體情況。所引用的Genbank登錄號可參 見一下網(wǎng)頁:http//www, ncbi. nlm. nih. rov/。


上述登錄號是Genbank的官方登錄號或等同于具有Genbank交叉引用號的登錄 號?？稍趆ttp: //www, ncbi. nlm. nih. gov/捭索到這勝編號。下文從總體上描述如何升高和降低谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的多肽和基因的量 和/或活性。不過，本領(lǐng)域人員知曉其他的技術(shù)和方法可用于通過進(jìn)行合適的數(shù)據(jù)庫搜索 來鑒定表1的酶的新的同源物和/或用于改變這些酶在棒狀桿菌或埃希氏菌屬的細(xì)菌之外 的生物體中的表達(dá)。量和/或活件的升高或引入就升高量而言，可區(qū)分兩種基本的情況。在第一種情況中，通過表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)的 外源性形式而升高酶的量。在另一情況中，通過影響例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子元件的活性， 和/或通過影響在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性的其他調(diào)節(jié)活性，而升 高內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，可通過不同途徑升高蛋白質(zhì)的活性和量，例如，通過在轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì) 水平關(guān)閉抑制性調(diào)節(jié)機(jī)制，或通過與起始生物體相比，升高編碼這些蛋白質(zhì)的核酸的基因 表達(dá)，后者例如可通過強(qiáng)啟動(dòng)子誘導(dǎo)內(nèi)源性轉(zhuǎn)酮醇酶和/或通過引入編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的核酸 而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過將編碼表1的酶的核酸引入微生物例如谷氨酸棒桿菌和 大腸桿菌而升高表1的酶的量和/或活性。原則上，可使用任何具有表1所列蛋白質(zhì)酶活性的不同生物體的蛋白質(zhì)。對于含 有內(nèi)含子的真核生物來源的此類酶的基因組核酸序列，如果宿主生物體不能剪接相應(yīng)的 mRNA或無法使之能夠剪接相應(yīng)的mRNA，則可使用已經(jīng)加工過的核酸序列例如相應(yīng)的cDNA。 本說明書所提及的所有核酸可以是例如RNA、DNA或cDNA序列。根據(jù)本發(fā)明，升高或引入蛋白質(zhì)的量通常包括如下步驟a)產(chǎn)生載體，其從5' -3'方向包含如下核酸序列，優(yōu)選為DNA序列
_在本發(fā)明的生物體中有功能的啟動(dòng)子序列-與所述啟動(dòng)子可操縱地連接的編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，所述蛋白質(zhì)例如為表1的 蛋白質(zhì)、其功能性同源物、功能性片段或功能性突變體_任選地，在本發(fā)明的生物體中有功能的終止序列b)將步驟a)的載體轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的生物體內(nèi)，例如谷氨酸棒桿菌，且任選地，整合至相應(yīng)基因組內(nèi)。
如上所述，功能性片段涉及編碼例如表1的酶的核酸序列的片段，其表達(dá)仍然產(chǎn) 生具有與相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)基本上相似的酶活性的蛋白質(zhì)。上述方法可用于增加編碼例如表1的酶或其功能性片段的DNA序列的表達(dá)。此類 包含調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和終止序列的載體的使用是本領(lǐng)域人員已知的。此外，本領(lǐng)域人員 知曉如何將來自步驟a)的載體轉(zhuǎn)移至生物體例如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌，以及載體需 要具有何種特性才能整合至所述生物體的基因組中。如果是通過轉(zhuǎn)移編碼來自一種生物體如大腸桿菌的酶的核酸來升高另一種生物 體例如谷氨酸棒桿菌內(nèi)的酶含量，在轉(zhuǎn)移例如由來自大腸桿菌的核酸序列所編碼的氨基酸 序列時(shí)，建議通過將多肽序列根據(jù)遺傳密碼子逆翻譯為主要包含因生物體特異性密碼子使 用而更多使用的密碼子的核酸序列?？赏ㄟ^使用計(jì)算機(jī)分析有關(guān)生物體的其他已知的基因 而確定其密碼子使用。根據(jù)本發(fā)明，升高編碼表1的酶的核酸的基因表達(dá)也被理解為是操縱生物體特別 是谷氨酸棒桿菌內(nèi)的相應(yīng)的內(nèi)源性酶的表達(dá)。例如，可通過改變編碼這些酶的基因的啟動(dòng) 子DNA序列而實(shí)現(xiàn)這一目的?？赏ㄟ^強(qiáng)啟動(dòng)子置換和通過DNA序列缺失和/或插入而實(shí)現(xiàn) 這種改變，并引起這些酶的表達(dá)率發(fā)生改變，優(yōu)選地為升高。內(nèi)源性基因的啟動(dòng)子序列的改變通常引起基因表達(dá)量的改變，因此細(xì)胞或生物體 內(nèi)可檢測到的活性也發(fā)生改變。此外，可通過調(diào)節(jié)蛋白實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性基因表達(dá)的改變和升高，所述調(diào)節(jié)蛋白在轉(zhuǎn) 化的生物體內(nèi)不存在或已經(jīng)被缺失，且所述調(diào)節(jié)蛋白與這些基因的啟動(dòng)子相互作用。所 述調(diào)節(jié)物可以是由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活物結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白，例如參見WO 96/06166。升高內(nèi)源性基因的活性和含量的其他可能性是上調(diào)參與內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn) 錄因子，例如通過過表達(dá)。過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的措施是本領(lǐng)域人員已知的?？赏ㄟ^表達(dá)與這些基因的啟動(dòng)子序列特異性結(jié)合的適體而調(diào)節(jié)內(nèi)源性酶例如表1 所述的那些酶的表達(dá)。根據(jù)適體結(jié)合刺激性或阻抑性啟動(dòng)子區(qū)域，可例如增加表1的酶的量。此外，通過對內(nèi)源性基因拷貝進(jìn)行定點(diǎn)誘變可改變內(nèi)源性基因的活性。還可通過影響酶的翻譯后修飾來改變編碼例如表1的酶的內(nèi)源性基因。例如，可 通過相應(yīng)的措施例如過表達(dá)或基因沉默，通過調(diào)節(jié)參與酶的翻譯后修飾的酶例如激酶或磷 酸酶的活性而實(shí)現(xiàn)這一目的。在另一實(shí)施方式中，可以改進(jìn)酶的功效或破壞其別構(gòu)調(diào)節(jié)區(qū)域，以便阻止對化合 物產(chǎn)生的反饋抑制。類似地，可使降解酶缺失或通過取代、缺失或添加對其進(jìn)行修飾，使得 其對表1中的所需酶的降解活性降低，而不損害細(xì)胞的活力。在各種情況中，可以提高甲硫 氨酸的總體產(chǎn)率、產(chǎn)生速度或量。上述這些用于升高或引入表1的酶的量和/或活性的策略并非是限制性的；對這 些策略加以改動(dòng)對本領(lǐng)域人員而言將是顯而易見的。降低酶的量和/或活件前面已經(jīng)闡述了可優(yōu)選地使用已經(jīng)為產(chǎn)生甲硫氨酸而被遺傳工程化的起始生物體。例如，對于谷氨酸棒桿菌，可下調(diào)metQ的活性。
對于降低酶的量和/或活性，也有各種不同的策略。對于內(nèi)源性酶例如表1的那些酶，例如可通過表達(dá)特異性結(jié)合這些基因的啟動(dòng)子 序列的適體而調(diào)節(jié)其表達(dá)。根據(jù)適體結(jié)合刺激性或阻抑性啟動(dòng)子區(qū)域，可降低表1的酶的 量以及活性。適體也可被設(shè)計(jì)為能夠特異性結(jié)合酶本身，并例如通過結(jié)合相應(yīng)的酶的催化中心 而降低酶的活性。適體的表達(dá)通常是通過基于載體的過表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的(見上)，這一點(diǎn)以及 適體的設(shè)計(jì)和選擇均是本領(lǐng)域人員所熟知的(Famuloket al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol. ，243，123—36)。此外，可通過本領(lǐng)域人員熟知的各種實(shí)驗(yàn)方法來降低表1的內(nèi)源性酶的量和活 性。這些方法通常被稱為"基因沉默"。例如，可通過將前述的含有反義順序的編碼所述 酶或其部分的DNA序列的載體轉(zhuǎn)移至生物體如谷氨酸棒桿菌中而使得內(nèi)源性基因的表達(dá) 沉默。這是基于如下事實(shí)，即這種載體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生能夠與從內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄而 來的mRNA相雜交的RNA，并由此阻止其翻譯。原則上，反義策略可與核酶方法聯(lián)合。核酶是具有催化活性的RNA序列，當(dāng)與 反義序列聯(lián)合時(shí)，其催化切割靶序列(Tanner et al. (1999)FEMSMicrobiol Rev. 23(3) 257-75)。這可增強(qiáng)反義策略的效力。為了產(chǎn)生同源重組微生物，制備含有編碼表1的酶的基因的至少一部分的載體， 其中已經(jīng)引入了缺失、添加或取代，由此改變(例如功能性破壞)所述內(nèi)源性基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體被設(shè)計(jì)為使得在同源重組后，所述內(nèi)源性基因被功 能性破壞(即不再編碼功能性的蛋白質(zhì))?；蛘?，所述載體被設(shè)計(jì)為使得在同源重組后，所 述內(nèi)源性基因被突變或被改變，但仍然編碼功能性的蛋白質(zhì)，例如可改變上游調(diào)節(jié)區(qū)域以 便改變表1的內(nèi)源性酶的表達(dá)。該方法的優(yōu)勢在于酶的表達(dá)不被完全消除，而是降低至所 需的最低水平。本領(lǐng)域人員知曉哪些載體可用于置換或缺失內(nèi)源性序列。下文給出了破壞 谷氨酸棒桿菌的染色體序列的詳細(xì)說明。此外，通過降低轉(zhuǎn)錄因子的量可實(shí)現(xiàn)基因阻抑。也可向細(xì)胞中引入抑制靶蛋白本身的因子。蛋白質(zhì)結(jié)合因子可以是例如前述的適 體(Famulok et al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol. 243，123-36)?？煽紤]將酶特異性抗體作為蛋白質(zhì)結(jié)合因子，其表達(dá)可降低表1的酶的量和/ 或活性。重組的酶特異性抗體例如單鏈抗體是本領(lǐng)域已知的。文獻(xiàn)也描述了抗體的表達(dá) (Fiedler et al.，(1997)Immunotechnology 3，205-216 ；Maynardand Georgiou(2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2，339-76)。本領(lǐng)域人員熟知上述技術(shù)。因此，本領(lǐng)域人員也熟知用于例如反義方法的核酸構(gòu) 建體必須具有的大小，以及相應(yīng)的核酸序列必須具有怎樣的互補(bǔ)性、同源性或相同性。術(shù)語 互補(bǔ)性、同源性和相同性是本領(lǐng)域人員已知的。術(shù)語互補(bǔ)性描述的是核酸分子與另一核酸分子通過兩種互補(bǔ)堿基之間的氫鍵而 雜交的能力。本領(lǐng)域人員已知兩種核酸分子為了能夠彼此雜交并不需要一定具有100%的 互補(bǔ)性。能夠與另一種核酸序列雜交的核酸序列與所述另一種核酸序列的互補(bǔ)性分別為優(yōu) 選地至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、優(yōu)選地至少70%、特別優(yōu)選地至少80%、更特別優(yōu)選地至少90%、尤其優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少98或100%。反義序列與內(nèi)源性mRNA序列的雜交典型地在體內(nèi)細(xì)胞條件下發(fā)生或在體外發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，雜交在足以保證發(fā)生特異性雜交的嚴(yán)格性條件下在體內(nèi)或體外進(jìn)行。嚴(yán)格性體外雜交條件是本領(lǐng)域人員已知的，并可自文獻(xiàn)獲知(見例如Sambrook et al. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001))。術(shù)語〃特異性雜交〃指的 是如下情況，即在嚴(yán)格性條件下，分子優(yōu)先與特定核酸序列結(jié)合，而該核酸序列是復(fù)雜的混 合物如DNA或RNA分子的混合物的一部分。因此，術(shù)語"嚴(yán)格性條件"指的是，在該條件下，核酸序列優(yōu)先與靶序列結(jié)合，而 與其他序列不結(jié)合或至少結(jié)合程度明顯降低。嚴(yán)格性條件取決于一些條件。較長的序列在更高溫度發(fā)生雜交。通常，選擇的嚴(yán)格 性條件能夠使得在給定的離子強(qiáng)度和給定PH值時(shí)，雜交溫度比解鏈溫度(Tm)低大約5°C。 Tm是(在給定pH值、離子強(qiáng)度和給定核酸濃度條件下)與靶序列互補(bǔ)的分子中的50%與 所述靶序列雜交時(shí)的溫度。典型地，嚴(yán)格性條件包括0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽的離 子)之間的鹽濃度以及PH值在7. 0至8. 3之間。對于短分子(例如對于包含10至50個(gè) 核苷酸之間的分子)，該溫度為至少30°C。此外，嚴(yán)格性條件可包括加入去穩(wěn)定劑，如甲酰 胺。典型的雜交和洗滌緩沖液具有如下組成。預(yù)雜交溶液0.5% SDS5x SSC50mM NaPO4, pH 6. 80.1% Na-焦磷酸鹽5x 登哈特試劑(Denhardt' s reagent)100 μ g 鮭精雜交溶液預(yù)雜交溶液lxl06cpm/mL 探針(5-10 分鐘 95°C )20x SSC 3M NaCl0. 3M檸檬酸鈉以 HCl 調(diào)至 pH750x 登哈特試劑5g Ficoll5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白加蒸餾水至500mL典型的雜交程序如下任選以 Ix SSC/0. 1 % SDS 洗滌膜 30 分鐘，65°C預(yù)雜交至少2h，50_55°C雜交55_60°C過夜洗滌5 分鐘 2x SSC/0. 1 % SDS雜交溫度30 分鐘 2x SSC/0. SDS
雜交溫度30 分鐘 Ix SSC/0. SDS雜交溫度 45 分鐘 0. 2x SSC/0. SDS 65 °C5 分鐘 0. Ix SSC室溫以反義為目的，互補(bǔ)性序列長度超過100個(gè)核苷酸、80個(gè)核苷酸、60個(gè)核苷酸、40
個(gè)核苷酸、和20個(gè)核苷酸即可以是足夠的。更長的核苷酸長度當(dāng)然也是足夠的。上述方法 的組合應(yīng)用也是可以的。根據(jù)本發(fā)明，如果使用以5' -3'-方向可操縱地連接于在生物體內(nèi)有活性的啟 動(dòng)子的DNA序列，則通常所構(gòu)建的載體在轉(zhuǎn)移到所述生物體的細(xì)胞內(nèi)之后，可實(shí)現(xiàn)編碼序 列的過表達(dá)，或分別引起內(nèi)源性核酸序列的抑制或競爭和阻斷由其表達(dá)的蛋白質(zhì)。也可通過在生物體內(nèi)過表達(dá)其非功能性突變體而降低特定酶的活性。因此，不能 催化有關(guān)反應(yīng)、但能夠結(jié)合例如底物或輔因子的非功能性突變體，在過表達(dá)后，可與內(nèi)源性 酶競爭并抑制反應(yīng)。降低宿主細(xì)胞內(nèi)酶的量和/或活性的其他方法是本領(lǐng)域人員已知的。根據(jù)本發(fā)明，非功能性酶分別具有與功能性酶及其功能性片段基本上相同的核酸 序列和氨基酸序列，但在一些位置具有核酸或氨基酸的點(diǎn)突變、插入或缺失，其效果是所述 非功能性酶不能或僅能非常有限地催化相應(yīng)的反應(yīng)。不能將這些非功能性酶與那些仍然能 夠催化相應(yīng)的反應(yīng)但不再受到反饋調(diào)節(jié)的酶相混。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“非功能性酶"不包括 那些分別在氨基酸水平和核酸水平與相應(yīng)的功能性酶不具有明顯序列同源性的蛋白質(zhì)。因 此，根據(jù)定義，不能催化相應(yīng)的反應(yīng)且與相應(yīng)的酶不具有明顯序列同源性的蛋白質(zhì)不是本 發(fā)明的術(shù)語“非功能性酶”。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，非功能性酶也被稱為失活的或無活性的酶。因此，例如表1的攜帶上述點(diǎn)突變、插入和/或缺失的本發(fā)明的非功能性酶的特征 在于其與例如表1的本發(fā)明的野生型酶或其功能性等價(jià)部分具有明顯的序列同源性。為了 確定明顯的序列同源性，可適用前述的相同性等級。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的一個(gè)方面涉及載體，優(yōu)選地是表達(dá)載體，其含有如上所述的修飾的核酸 序列。在本發(fā)明中，術(shù)語"載體"指的是核酸分子，其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其相連接的其他核酸。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，其指的是一種環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可連接額外的 DNA區(qū)段。另一種類型的載體是病毒載體，其中可將額外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體在所引入的宿主細(xì)胞中能夠自我復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)的細(xì) 菌載體和附加型哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體)在引 入宿主細(xì)胞后整合到宿主基因組中，并隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo) 與其可操縱地連接的基因的表達(dá)。此類載體在此稱為〃表達(dá)載體〃。通常，重組DNA技術(shù)所用的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)粒" 和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最為常用的載體形式。不過，本發(fā)明也包括其他形式的 表達(dá)載體，例如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們可發(fā)揮 相同的功能。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可包含如上所述的修飾的核酸，其形式適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的核酸，這意味著所述重組表達(dá)載體包括可操縱地連接于待表達(dá)核酸序列的一 或多個(gè)基于進(jìn)行表達(dá)所用的宿主細(xì)胞而選擇的調(diào)節(jié)序列。在重組表達(dá)載體中，“可操縱地連接"指的是感興趣的核酸序列與調(diào)節(jié)序列連 接的方式允許所述核酸序列被表達(dá)(例如在體外的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或在載體所引入到的 宿主細(xì)胞內(nèi))。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意欲包括啟動(dòng)子、阻抑物結(jié)合位點(diǎn)、活化物結(jié)合位點(diǎn)、增 強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如終止子、腺苷酸化信號、或mRNA 二級結(jié)構(gòu)的其他元件)。此 類調(diào)節(jié)序列例如可參見 Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185，Academic Press, SanDiego, CA (1990)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多宿主細(xì)胞類型中指導(dǎo) 核酸序列組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列以及那些僅在特定宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié) 序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列例如為，啟動(dòng)子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、Ipp-, lac-、 lpp-lac-> lacIq-> I7_、T5_、T3_、gal_、trc_、ara-> SP6_、arny>λ λ Pl、噬菌體 SPOl P15、噬菌體 SPOl P26, pSOD、EFTu, EFTs, GroEL, metZ (最后 5 種來自谷 氨酸棒桿菌)，它們優(yōu)選地在細(xì)菌中使用。額外的調(diào)節(jié)序列例如為，來自于酵母和真菌的啟 動(dòng)子，如 ADCl、MFa、AC、P-60、CYCU GAPDH, TEF, rp28、ADH，ΕΝ02、來自于植物的啟動(dòng)子，如 CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白-或菜豆蛋白-啟動(dòng)子。也可 以使用人工啟動(dòng)子。本領(lǐng)域人員能夠理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于一些因素，例如所選擇的 待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、蛋白質(zhì)的期望表達(dá)水平等等。本發(fā)明的表達(dá)載體可被引入到宿主細(xì)胞 中以便產(chǎn)生由上述修飾的核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或融合肽。在原核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)最常見地是使用含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白的表 達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子而進(jìn)行。融合載體給其中所編碼的蛋白質(zhì)添加一些氨基酸，通常是在重組蛋白質(zhì)的氨基 端，但也可以在C端或融合于蛋白質(zhì)內(nèi)部的合適區(qū)域。此類融合載體典型地用于4個(gè)目的 1)增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)增加重組蛋白質(zhì)的可溶性；3)通過在親和純化中作為配體而 有助于重組蛋白質(zhì)的純化；和4)提供“標(biāo)簽”用于蛋白質(zhì)的后續(xù)檢測。在融合表達(dá)載體中， 通常在融合部分與重組蛋白質(zhì)的連接處引入蛋白酶切割位點(diǎn)，以便在融合蛋白被純化后使 重組蛋白質(zhì)與融合部分分離。此類酶及其同種識(shí)別序列(cognate recognitionsequences) 包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D.B.andjohnson, K.S. (1988)Gene 67:31_40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 和pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，它們分別融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E 結(jié)合蛋白、或蛋白A。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc (Amarm et al. (1988) Gene 69 :301_315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pHS2、 pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-111113-Bl、egtll、pBdCl、和 pET lld(Studier et al. , GeneExpression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990)60-89 ；Pouwels et al. , eds. (1985)Cloning Vectors. Elsevier :New York ISBN 0444904018)。來自pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于宿主RNA聚 合酶自雜交trp-lac融合啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。來自pET Ild載體的靶基因表達(dá)依賴于由共表達(dá)的 病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的自T7gnl0-laC融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)從攜帶置于IacUV 5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl基因的常駐 X原噬菌體提供。對于其他種類細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，可選擇合適的載體。例如，已知質(zhì)粒PIJ101、 PIJ364、pIJ702和pIJ361可用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌，而質(zhì)粒pUBllO、pC194、或pBD214適合用于 轉(zhuǎn)化芽孢桿菌。一些用于將遺傳信息轉(zhuǎn)移至棒桿菌內(nèi)的質(zhì)粒包括PHM1519、pBLl、pSA77、 ^pAJ667(Pouwels et al. , eds. (1985) CloningVectors. Elsevier :New York IBSN O 444 904018)。 合適的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌穿梭載體的實(shí)例例如為 pClik5aMCS (W02005059093)或可參見 Eikmanns et al (Gene. (1991) 102,93-8)。用于操作棒狀桿菌的合適的載體的實(shí)例可參見Handbook ofCorynebacterium(Eggeling 和 Bott 編輯，ISBN 0-8493-1821-1，2005)。其中可找到一 系列大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體(表23. 1)、一系列大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表 達(dá)載體(表23. 2)、一系列可用于將DNA整合至谷氨酸棒桿菌染色體內(nèi)的載體(表23. 3)、 一系列用于整合至谷氨酸棒桿菌染色體內(nèi)的表達(dá)載體(表23. 4.)、以及一系列用于定點(diǎn)整 合至谷氨酸棒桿菌染色體內(nèi)的載體(表23. 6)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在酵母(釀酒酵 母)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括 pY印Secl(Baldari，et al. (1987) Embo J. 6 :229_234)、2i、 pAG-1、Y印6、Y印 13、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan andHerskowitz (1982) Cell 30 :933_943)、 pJRY88(Schultz et al. (1987)Gene 54 :113—123)、禾口 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego，CA)。用于構(gòu)建適合用于其他真菌例如絲狀真菌中的載體的載體和方法可詳見， 例如 van denHondel, C. Α· Μ· J. J. & Punt, P. J. (1991) in :Applied Molecular Genetics ofFungi,J. F. Peberdy,et al. ,eds. ,p. 1-28,Cambridge University Press :Cambridge禾口 Pouwels et al.，eds. (1985)Cloning Vectors. Elsevier :New York(ISBN O 444904018)。就本發(fā)明的目的而言，可操縱的連接應(yīng)理解為啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和任選地 其他調(diào)節(jié)元件被依次排列，使得在表達(dá)編碼序列時(shí)，每一元件根據(jù)其目的可實(shí)現(xiàn)其功能。既用于原核細(xì)胞也用于真核細(xì)胞的其他合適的表達(dá)系統(tǒng)可參見Sambrook，J. et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 3rd ed. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003 的 16 和 17 章?？赏ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語" 轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"、“接合(conjugation)“和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"指的是用于將外來核酸(例 如線性DNA或RNA，例如線性化的載體或無載體的基因構(gòu)建體本身)或載體形式的核 酸(例如質(zhì)粒、噬菌體、噬粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子或其他DNA)引入宿主細(xì)胞內(nèi)的多種現(xiàn)有 技術(shù)中已知的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染、天 然感受態(tài)、化合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、或電穿孔。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法可參見 Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY, 2003)以及其他實(shí)驗(yàn)室手冊。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼選擇標(biāo)記物(如抗生素抗性)的基因隨 感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記物包括那些賦予藥物抗性的標(biāo)記物，所 述藥物例如，但不限于，G418、潮霉素、卡那霉素、四環(huán)素、新霉素、氨芐青霉素(和其他青霉素)、頭孢菌素、氟喹諾酮、萘啶酸、氯霉素、壯觀霉素、紅霉素、鏈霉素和甲氨蝶呤。其他選 擇性標(biāo)記物包括可對宿主或起始菌株內(nèi)的突變形式的相應(yīng)基因構(gòu)成互補(bǔ)的野生型基因。例 如，可突變或缺失如上所述的本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌起始或宿主菌株的基因組中的對于在 基本培養(yǎng)基中生長所必需的基因，例如serA，以產(chǎn)生絲氨酸營養(yǎng)缺陷體。然后可使用含有野 生型或其他功能性拷貝的serA基因的載體來篩選轉(zhuǎn)化體或整合體?？墒褂镁幋a上述修飾 的核酸序列的同一載體或使用分開的載體將編碼選擇性標(biāo)記物的核酸引入宿主細(xì)胞。穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染了引入的核酸的細(xì)胞可通過藥物篩選得以鑒定(例如，已經(jīng)引入了選擇性標(biāo)記物基因 的細(xì)胞能夠存活，但其他細(xì)胞則會(huì)死亡)。
當(dāng)使用無復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒和兩種不同的標(biāo)記物基因(例如pClik int sacB)時(shí)， 也可產(chǎn)生無標(biāo)記物的菌株，其中插入體的一部分被插入至基因組內(nèi)。為此可采用兩個(gè)連 ^Μ^ΗΜΜ^ ^- ^ ( iii#jAL Becker et al. , Applied andEnvironmental Microbilogy, 71 (12)，p. 8587-8596)。質(zhì)粒 pClik int sacB 的序列見 W02005059093 ;SEQ ID 24 ；該質(zhì)粒 在該文獻(xiàn)中稱為PCIS。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可產(chǎn)生含有如下的選定系統(tǒng)的重組微生物，所述選定系統(tǒng) 能夠允許所引入的基因的受控表達(dá)。例如，將載體中的上述核酸序列之一置于Iac操縱子 的控制下，這允許僅當(dāng)存在IPTG的情況下基因發(fā)生表達(dá)。此類調(diào)控系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的另一方面涉及生物體或宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)引入了本發(fā)明的重組表達(dá)載 體。術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"可在本文中互換使用。要理解這些術(shù)語不僅指 特定的所研究的細(xì)胞，也指這種細(xì)胞的子代或者潛在的子代。由于在傳代過程中因突變或 者環(huán)境影響會(huì)出現(xiàn)某些改變，因此子代實(shí)際上可以與親代細(xì)胞不完全相同，但其仍包括在 這里所用術(shù)語的范圍內(nèi)。大腸桿If禾Π谷氨,IlilffIf的牛長-培養(yǎng)基禾時(shí)吝養(yǎng)K牛本領(lǐng)域人員熟悉普通微生物例如谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的培養(yǎng)。因此，以下就 谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)給出一般性的教導(dǎo)?？稍跇?biāo)準(zhǔn)教科書中找到用于大腸桿菌培養(yǎng)的相應(yīng) 的信息。大腸桿菌菌株分別常規(guī)生長在MB和LB肉湯中(Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175，4096-4103)。本領(lǐng)域熟知一些用于包括大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌在內(nèi) 的細(xì)菌的基本培養(yǎng)基。大腸桿菌的基本培養(yǎng)基包括但不限于E培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基和改良的 MCGC (Yoshihama et al. (1985) J. Bacteriol. 162，591-507)。添加葡萄糖的終濃度在大約 0.2%和之間?？砂凑找韵铝刻砑涌股?微克/毫升)氨卡青霉素，5至1000;卡那 霉素，25 ；萘啶酸，25 ；氯霉素，5至120，壯觀霉素50至100，四環(huán)素5至120。可添加氨基 酸、維生素和其他補(bǔ)充物，例如，以如下量添加甲硫氨酸，9. 3mM ；精氨酸，9. 3mM ；組氨酸， 9. 3mM ；硫胺素，0. 05mM。根據(jù)所進(jìn)行的特定的實(shí)驗(yàn)或進(jìn)程，分別將大腸桿菌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在 18 至 37 440C ο遺傳學(xué)修飾的棒狀桿菌通常培養(yǎng)在合成的或天然的生長培養(yǎng)基中。用于棒狀 桿菌的多種不同的生長培養(yǎng)基是已知的且能夠容易地獲得(Lieb et al. (1989)Appl. Microbiol. Biotechnol.，32 :205_210 ；von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters，11 :11-16 ;Patent DE 4, 120,867 ；Liebl (1992) The GenusCorynebacterium, in :The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al·，eds· Springer-Verlag)。有關(guān)指導(dǎo)也Handbook of Corynebacterium(Eggeling and Bott 'ΦΜ, ISBN 0-8493-1821-1,
2005)。 這些培養(yǎng)基包括一或多種碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和微量元素。優(yōu)選的碳源是 糖，例如單糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、 麥芽糖、蔗糖、甘油、棉子糖、淀粉或纖維素可作為很好的碳源。也可以通過復(fù)雜化合物例如糖蜜或糖精制過程的其他副產(chǎn)品來提供糖。補(bǔ)充不同 碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是醇和有機(jī)酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮 源通常是有機(jī)或無機(jī)氮化合物或含有這些化合物的材料。示例性的氮源包括氨氣或氨鹽， 如NH4Cl或(NH4)2S04、NH40H、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源，如玉米浸液、大豆粉、大豆蛋 白、酵母提取物、肉提取物等等?？墒褂貌煌蛟磳?shí)現(xiàn)超量生產(chǎn)甲硫氨酸?？墒褂昧蛩猁}、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽以 及更為還原性的硫源如H2S和硫化物以及衍生物。也可使用有機(jī)硫源如甲硫醇、巰基乙酸 鹽、硫氰酸鹽、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸、以及其他含硫化合物來實(shí)現(xiàn)甲硫氨酸的高效 生產(chǎn)。甲酸鹽與其他Cl源如甲醇或甲醛也可作為補(bǔ)充物?？杉尤氲脚囵B(yǎng)基中的無機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳鋅、銅和鐵的鹽酸 鹽、磷酸鹽或硫酸鹽?？稍谂囵B(yǎng)基中加入螯合化合物以保持溶液中金屬離子。特別有用的 螯合化合物包括二羥基苯酚類如兒茶酚或原兒茶酸(protocatechuate)，或有機(jī)酸如檸檬 酸。培養(yǎng)基通常還含有其他生長因子如維生素或生長促進(jìn)劑，這些的實(shí)例包括氰鈷胺(或 其他形式的維生素B12)、生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和吡多辛。生長因子 和鹽常產(chǎn)生自復(fù)雜培養(yǎng)基組分如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等等。培養(yǎng)基化合物的確切組 成很大程度上取決于即將進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)并需要根據(jù)各種具體情況分別確定。有關(guān)培養(yǎng)基優(yōu) 化的信息可參見教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach(eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN O 19 963577 3)。也可以選 擇商品化的生長培養(yǎng)基，如標(biāo)準(zhǔn)I(Merck)或BHI (腦心浸液，DIFC0)或其他。所有培養(yǎng)基組分均應(yīng)該是滅菌的，可通過加熱(1. 5巴，121°C，20分鐘)或過濾除 菌。這些組分可一起滅菌或者在必要時(shí)分別滅菌。在開始培養(yǎng)時(shí)即可加入所有的培養(yǎng)基組分，或任選地，以連續(xù)或分批的方式添加 培養(yǎng)基組分。培養(yǎng)條件根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)分別確定。培養(yǎng)溫度通常應(yīng)該在15°C至45°C范圍內(nèi)，但對于嗜熱微生物，該范圍可以更高， 高達(dá)105°C。實(shí)驗(yàn)過程中的溫度可保持恒定或可以改變。培養(yǎng)基的pH可在5至8. 5范圍 內(nèi)，優(yōu)選地在7. O附近，并可通過向培養(yǎng)基加入緩沖液而維持pH。用于此目的的抑制示例性 緩沖液是磷酸鉀緩沖液。合成緩沖物如MOPS、HEPES、ACES等可替代使用或同時(shí)使用。也 可在生長過程中通過加入酸或堿來維持穩(wěn)定的培養(yǎng)PH值，例如乙酸、硫酸、磷酸、NaOH, KOH 或ΝΗ40Η。如果使用復(fù)雜培養(yǎng)基成分如酵母提取物，則不必使用額外的緩沖物，因?yàn)槠渲性S 多復(fù)雜化合物具有高緩沖能力。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，也可用氣態(tài)氨來控制PH。培養(yǎng)時(shí)間通常為數(shù)小時(shí)至數(shù)日。時(shí)間的選擇是為了使得最大量的產(chǎn)物積聚在肉湯 中。可在多種容器中實(shí)施所述生長實(shí)驗(yàn)，例如微滴定板、玻璃管、玻璃瓶或不同體積的玻璃 或金屬發(fā)酵罐。為了篩選大量克隆，微生物應(yīng)該培養(yǎng)在微滴定板、玻璃管、或搖瓶中，有無擋 板均可。優(yōu)選地，使用IOOmL或250搖瓶，其中加入大約10% (體積比)的所需生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶應(yīng)該在旋轉(zhuǎn)搖床上搖動(dòng)(幅度25mm)，速度在IOOrpm至300rpm?？赏ㄟ^保持濕 環(huán)境而消除蒸發(fā)損失；或者，應(yīng)該對蒸發(fā)損失進(jìn)行數(shù)學(xué)校正。如果要測試遺傳學(xué)修飾的克隆，則也應(yīng)該測試未修飾的對照克隆或者只含有基本 質(zhì)粒而無任何插入體的對照克隆。用生長于瓊脂板、例如已經(jīng)在30°C孵育過的CM板(IOg/ L葡萄糖、2. 5g/L NaCl、2g/l尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/ L (NH4) 2S04、2g/l尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/L瓊脂，以2M NaOH調(diào)節(jié)pH為6. 8至7. 2)上的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基使得0D600為0. 5-1. 5。既可通過加入 來自CM板的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的鹽水懸液也可通過加入該細(xì)菌的液體預(yù)培養(yǎng)物而實(shí)現(xiàn)培 養(yǎng)基接種過程。通用方法 通用方法的方案可參見 Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005)eds. :L. Eggeling, Μ.Bott. , Boca Raton, CRC Press, at Martin et al. (Biotechnology(1987) 5，137-146)，Guerrero et al. (Gene(1994),138, 35-41), Tsuchiya und Morinaga (Biotechnology (1988),6,428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991)，102，93-98)，EP 0 472 869，US 4，601，893，Schwarzer and Piihler (Biotechnology (1991) ,9, 84-87, Reinscheid et al. (Applied and EnvironmentalMicrobiology(1994),60,126-132), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology(1993)，175，1001-1007)， WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene(1993)， 134,15-24), inJP-A-10-229891, at Jensen und Hammer(Biotechnology and Bioengineering(1998),58,191-195), Makrides(Microbiological Reviews(1996),60, 512-538)以及熟知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書。菌株、培養(yǎng)基和質(zhì)粒可選取的菌株例如，但不限于谷氨酸棒桿菌ATCC 13032，醋谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806，嗜醋酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC 13870，^/^M^ff · (Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539,棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067，發(fā)酵乳短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869，和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020或衍生自例如谷氨酸棒 桿菌 KFCC10065、DSM 17322 的菌株，或谷氨酸棒桿菌ATCC21608Corynebacterium efficiens DSMZ44547>44548>44549重組DNA技術(shù)Tj M^ B Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, Τ. , in MolecularCloning :A Laboratory Manual, 3rd edition(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY, Vol. 1, 2, 3,禾口 Handbook on Corynebacterium glutamicum(2005) eds.L. Eggeling, M. Bott. , Boca Raton, CRC Press。
氨基酸和甲硫氨酸中間體的定量fflilHPLC(Agilent 1100， Agilent, ffaldbronn, Germany)GuardCartridge 禾口 Synergi 4μπι 柱(MAX-RP 80 A, 150*4. 6mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) 進(jìn)行分析。注射之前使用ο-酞二醛(ΟΡΑ)和還原劑巰基乙醇(2-MCE)對分析物進(jìn)行衍生 化。此外，使用碘乙酸封閉巰基。使用40mM NaH2PO4 (洗脫液A，以NaOH調(diào)整pH = 7. 8)作 為極性相，甲醇水混合物(100 1)作為非極性相(洗脫液B)，以Iml/分鐘的流速進(jìn)行分 離。使用如下梯度開始0% B ；39分鐘39% B ；70分鐘64% B ； 100% B, 3. 5分鐘；2分鐘 0% B用于平衡。如下所述在室溫自動(dòng)進(jìn)行衍生化。首先將0.5μ 1 η，η-二(羥乙基)甘氨 酸(0. 5Μ，ρΗ8. 5)中的0. 5% 2-MCE與0. 5 μ 1細(xì)胞提取物混合。隨后加入1. 5 μ 1 η，η_ 二 (羥乙基)甘氨酸(0.5Μ，ρΗ8. 5)中的50mg/ml碘乙酸，隨后加入2·5μ1 η，η-二(羥乙 基)甘氨酸緩沖液(0. 5Μ, ρΗ8· 5)。Derivatization is done by通過加入0. 5 μ 1溶解于 l/45/54v/v/v of 2-MCE/Me0H/n，n-二(羥乙基)甘氨酸(0·5Μ，ρΗ8·5)中的 10mg/ml ΟΡΑ 試劑完成衍生化。最后以32 μ 1 H2O稀釋混合物。以上各移取步驟之間均等候1分鐘。然 后將總體積37. 5μ 1注射到柱上。注意，如果在樣品制備過程中(例如在等候時(shí)間內(nèi))和樣 品制備之后定時(shí)清洗自動(dòng)采樣針，則可顯著改善分析結(jié)果。使用熒光檢測器(340nm激發(fā)， 450nm發(fā)射，Agi lent ,Waldbronn ,Germany)進(jìn)行檢測。定量時(shí)使用α -氨基丁酸(ABA)作 為內(nèi)標(biāo)。重組方案的定義下文將描述如何構(gòu)建甲硫氨酸產(chǎn)生效率升高的谷氨酸棒桿菌菌株以實(shí)現(xiàn)以上預(yù) 期的發(fā)現(xiàn)。在描述菌株構(gòu)建之前，先給出下面要使用的重組事件/方案的定義。在本發(fā)明中，"坎貝爾插入(Campbell in)“指的是初始宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，其 中通過單次同源重組事件(交換進(jìn)來事件(cross-in event))將完整的環(huán)狀雙鏈DNA分子 (例如基于pCLIK int sacB的質(zhì)粒)整合到染色體中，這有效地導(dǎo)致線性化形式的所述環(huán) 狀DNA分子插入到染色體中與所述環(huán)狀DNA分子的第一 DNA序列同源的第一 DNA序列中?！?被坎貝爾插入(Campbelled in) 〃指的是已經(jīng)被整合到〃坎貝爾插入〃轉(zhuǎn)化體的染色體中 的線性化的DNA序列?！翱藏悹柌迦?含有雙份的第一同源DNA序列，其中每一拷貝包括 并跨越一個(gè)拷貝的同源重組交換點(diǎn)。該名稱來自阿蘭 坎貝爾教授(Alan Campbell)，其最 先提出了這種重組方式。在本發(fā)明中，丨‘坎貝爾刪除(Campbell out)“指的是來自〃坎貝爾插入〃轉(zhuǎn)化 體的子代細(xì)胞，其中在"被坎貝爾插入"DNA的線性化插入體DNA中所含的第二 DNA序列 與染色體中與所述線性化插入體的第二 DNA序列同源的第二 DNA序列之間發(fā)生了第二同源 重組事件(交換出去事件(cross-out event))，該第二重組事件導(dǎo)致所整合的DNA序列的 一部分發(fā)生缺失(丟棄)，但重要的是，這還導(dǎo)致所整合的"被坎貝爾插入"DNA的一部分 (其可以甚至僅僅為一個(gè)堿基)留在染色體中，這樣一來，與初始宿主細(xì)胞相比，所述"坎 貝爾刪除"細(xì)胞在染色體中便含有一或多個(gè)故意的變化(例如，單堿基取代、多堿基取代、 插入異源基因或DNA序列、插入額外一或多拷貝的同源基因或修飾的同源基因、或插入包 含一種以上的如上所述的實(shí)例的DNA序列)?！翱藏悹杽h除"細(xì)胞或菌株通常(但并非必然)是通過針對"被坎貝爾插 入"DNA序列的一部分(希望丟棄的那部分)中所含的基因進(jìn)行反選擇而獲得的，例如枯草芽孢桿菌sacB基因，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于存在5%至10%的蔗糖條件下時(shí)，該基因的表達(dá)對細(xì) 胞是致死性的。無論是否進(jìn)行反選擇，均可使用任何可篩選表型通過篩選而獲得或鑒定出 所需的"坎貝爾刪除"細(xì)胞，所述可篩選表型例如但不限于，集落形態(tài)、集落顏色、是否存 在抗生素抗性、通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測是否存在給定的DNA序列、是否存在營養(yǎng)缺陷型、是 否存在某種酶、集落核酸雜交、抗體篩選等等。術(shù)語"坎貝爾插入"和"坎貝爾刪除"也可 用作不同時(shí)態(tài)的動(dòng)詞來指代上述的方法或過程。 要理解導(dǎo)致〃坎貝爾插入〃或〃坎貝爾刪除〃的同源重組事件可出現(xiàn)在同源DNA 序列內(nèi)的一系列DNA堿基上，且由于同源序列在該一系列DNA堿基的至少一部分上彼此相 同，因此通常不可能精確地指出交換事件的發(fā)生之處。換言之，不可能精確地指出哪一序列 最初是來自插入的DNA的，而哪一序列最初是來自染色體DNA的。此外，所述第一同源DNA 序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源性區(qū)域間隔開，而正是該非同源性區(qū)域仍然留 在"坎貝爾刪除"細(xì)胞的染色體中。實(shí)踐中，在谷氨酸棒桿菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的長度通常為至少 約200個(gè)堿基對，并可多達(dá)數(shù)千堿基對。不過，更短或者更長的序列也可用于該過程。例如， 第一和第二同源序列的長度可在約500至2000個(gè)堿基的范圍，并且將第一和第二同源序列 設(shè)置為大致相同的長度，優(yōu)選地使它們的差異小于200個(gè)堿基對，且最優(yōu)選地使兩者中較 短者的堿基對長度至少是較長者長度的70%，將有利于自"坎貝爾插入"獲得"坎貝爾刪 除〃。“坎貝爾插入和坎貝爾刪除方法〃可參見W02007012078。
實(shí)施例以下實(shí)驗(yàn)說明了杰氏棒桿菌甲?；?THF-合成酶和gcvHTP以及IipB或Ipl過表 達(dá)如何導(dǎo)致甲硫氨酸的產(chǎn)生升高。不過這些實(shí)施例無意于以任何方式限制本發(fā)明。搖瓶實(shí)驗(yàn)和HPLC分析使用標(biāo)準(zhǔn)糖蜜培養(yǎng)基(Molasses Medium)進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，其中使用的菌株均 一式而份或一式四份。每升糖蜜培養(yǎng)基含有40g葡萄糖；60g糖蜜；20g(NH4)2S04 ；0. 4g MgS04*7H20 ；0. 6g KH2PO4 ；IOg 酵母提取物(DIFCO) ；5mlof 400mM 蘇氨酸；2mgFeS04. 7H20 ； 2mg MnSO4. H2O ；禾口 50g CaCO3 (Riedel-de Haen)，以 ddH20 補(bǔ)足體積。使用 20% NH4OH 將 pH 調(diào)節(jié)至7. 8。將20ml持續(xù)攪動(dòng)的培養(yǎng)基(以便保持CaCO3懸浮)加入至250ml的帶擋板的 Bellco搖瓶并高壓滅菌20分鐘。高壓滅菌后，每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入4ml的“4B溶液”(或 8(^1/瓶)。每升“4B溶液”含有0.25g鹽酸硫胺素(維生素Bl)，50mg氰鈷胺(維生素 B12)，25mg生物素，1. 25g鹽酸吡多辛(維生素B6)，并以12. 5mM KPO4, ρΗ7· 0緩沖，以溶解 生物素，并過濾除菌。培養(yǎng)物在置于NewBrunswick Scientific地板搖床(200或300rpm) 上的有擋板的瓶中生長大約48小時(shí)，溫度大約28°C或30°C，所述的瓶覆蓋Bioshield紙并 以膠帶密封。典型地在大約24小時(shí)和/或大約48小時(shí)時(shí)取樣。離心去除細(xì)胞，隨后使用 等體積的60%乙腈或60%乙醇稀釋上清液，然后使用Centricon 0. 45 μ m的離心柱對溶液 混合物進(jìn)行膜過濾。使用HPLC來分析過濾物中甲硫氨酸、甘氨酸加高絲氨酸、0-乙酰高絲 氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、和其他指定氨基酸的濃度。對于HPLC分析，將過濾的上清液按1 100稀釋于經(jīng)0. 45 μ m過濾的ImM Na2EDTA,將1 μ 1的這種溶液以硼酸緩沖液(80mM NaBO3, 2. 5mMEDTA, pH 10. 2)中的OPA試劑(AGILENT)進(jìn)行衍生化，并注射至200x4. Imm Hypersil 5 μ AA-ODS柱上進(jìn)行Agilent IlOOSeries HPLC，該系統(tǒng)裝配了 G1321A熒光檢測器(AGILENT)。激發(fā)波長是338nn，檢測 的發(fā)射波長是425nm。對氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行層析并用于確定各種氨基酸的滯留時(shí)間和標(biāo) 準(zhǔn)峰面積。使用Agilent提供的隨帶軟件包Chem Station用于設(shè)備控制、數(shù)據(jù)獲取和數(shù) 據(jù)處理。硬件為HP Pentium 4計(jì)算機(jī)，其支持以Microsoft ServicePack(SP6a)升級的 Microsoft Windows NT 4.0。
實(shí)驗(yàn)1 產(chǎn)生M2014菌株谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032以DNA A(也稱為pH273) (SEQ IDNO :21)轉(zhuǎn)化 并“被坎貝爾插入”以產(chǎn)生“坎貝爾插入”菌株。“坎貝爾插入”菌株隨后“被坎貝爾刪除 (Campbelled out) ”以產(chǎn)生“坎貝爾刪除”菌株M440，后者含有編碼反饋抗性高絲氨酸脫 氫酶(homfto)的基因。產(chǎn)生的高絲氨酸脫氫酶蛋白質(zhì)包括如下氨基酸改變，即S393改變?yōu)?F393 (稱為 Hsdh S393F)。菌株M440隨后以DNA B(也稱為pH373) (SEQ ID NO 22)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生“坎貝爾插 入”菌株?！翱藏悹柌迦搿本耆缓蟆氨豢藏悹杽h除”以產(chǎn)生“坎貝爾刪除”菌株M603，后者 含有編碼反饋抗性天冬氨酸激酶(Askfto)(由IysC編碼)的基因。得到的天冬氨酸激酶蛋 白質(zhì)中，T311變?yōu)?311(稱為LysCT311I)。發(fā)現(xiàn)菌株M603產(chǎn)生大約17. 4mM的賴氨酸，而ATCC13032菌株沒有產(chǎn)生可檢測量 的賴氨酸。此外，M603菌株產(chǎn)生大約0. 5mM高絲氨酸，而ATCC13032菌株沒有產(chǎn)生可測量 到的高絲氨酸，結(jié)果見表2。表2 菌株ATCC13032和M603產(chǎn)生的高絲氨酸、0-乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨 酸的量 菌株Μ603以DNA C(也稱為pH304) (SEQ ID NO 23)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生“坎貝爾插入”菌 株，后者隨后“被坎貝爾刪除”以產(chǎn)生“坎貝爾刪除”菌株M690。M690菌株含有位于metH基 因(稱為P497HietH)上游的PgroES啟動(dòng)子。P497啟動(dòng)子的序列為SEQ ID NO :4。M690菌株 產(chǎn)生大約77. 2mM賴氨酸和大約41. 6mM高絲氨酸，見表3。表3 菌株M603和M690產(chǎn)生的高絲氨酸、0_乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的 M690菌株隨后如下進(jìn)行誘變將生長在BHI培養(yǎng)基(BECT0NDICKINS0N)中的M603 過夜培養(yǎng)物在50mM檸檬酸緩沖液pH5. 5中洗滌，以N-甲基-N-亞硝基胍(10mg/ml，溶于 50mM檸檬酸緩沖液pH5. 5)處理20分鐘，30°C。處理后，細(xì)胞再以50mM檸檬酸緩沖液pH5. 5 中洗滌并鋪板，培養(yǎng)基含有如下成分(所有提及的量均以500ml培養(yǎng)基計(jì))IOg(NH4)2SO4 ； 0. 5g KH2PO4 ；0. 5g K2HPO4 ；0. 125g MgSO4JH2O ；2Ig MOPS ；50mgCaCl2 ； 15mg 原兒茶酸；0. 5mg 生物素；Img 硫胺素；和 5g/L D，L-乙硫氨酸(ethionine) (SIGMA CHEMICALS, CATALOG #E5139),以KOH調(diào)至pH7.0。此外，培養(yǎng)基含有0. 5ml的微量金屬溶液，包括10g/L FeSO4JH2O ； lg/L MnS04*H20 ；0. lg/L ZnS04*7H20 ；0. 02g/L CuSO4 ；和 0. 002g/LNiCl2*6H20，均 溶于0. 1 M HCl0最終的培養(yǎng)基經(jīng)過濾除菌，并向培養(yǎng)基中加入40ml的無菌50%葡萄糖溶 液(40ml)和終濃度為1. 5%的無菌瓊脂。將最終的含瓊脂培養(yǎng)基倒在瓊脂板上并標(biāo)記為基 本乙硫氨酸培養(yǎng)基。將誘變的菌株分布于板上(基本乙硫氨酸)并溫育3-7天，30°C。分 離再培養(yǎng)基上生長的克隆，并再次劃線培養(yǎng)于相同的基本乙硫氨酸培養(yǎng)基上。選擇若干克 隆用于分析甲硫氨酸的產(chǎn)生。
如下分析甲硫氨酸的產(chǎn)生。菌株在CM-瓊脂培養(yǎng)基上生長2天，300C，所述培養(yǎng)基 含有:10g/L D-葡萄糖，2. 5g/L NaCl ；2g/L 尿素；10g/L BactoP印tone (DIFCO) ；5g/L 酵母 提取物(DIFCO) ；5g/L牛肉提取物(DIFCO) ；22g/L瓊脂(DIFCO)；該培養(yǎng)基在121°C高溫滅 菌20分鐘。菌株生長后，刮下細(xì)胞并重懸于0. 15M NaCl中。對于主要培養(yǎng)物，將刮下細(xì)胞的 懸浮液加至IOml培養(yǎng)基II (見下文)中，在600nm處的起始OD為大約1. 5，其中還有0. 5g 高溫滅菌的固體CaCO3 (RIEDEL DE HAEN)，然后細(xì)胞在置于200rpm軌道搖床的100ml無擋 板搖瓶中溫育72小時(shí)，30°C。培養(yǎng)基II含有40g/L蔗糖；60g/L來自糖蜜的總糖(以糖含 量計(jì))；10g/L (NH4)2SO4 ；0. 4g/L MgS04*7H20 ；0. 6g/L KH2PO4 ；0. 3mg/L 硫胺素 *HC1 ； lmg/L 生 物素；2mg/L FeSO4 ；和2mg/L MnS04。以NH4OH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH7. 8，在大約121°C高溫滅菌 20分鐘。高溫滅菌并冷卻后，加入來自過濾除菌的儲(chǔ)存液(200yg/ml)的維生素B12(氰鈷 胺)(SIGMA CHEMICALS)至終濃度為 100μ g/L。從培養(yǎng)基取樣并分析氨基酸含量。使用Agilent氨基酸方法在AgilentllOO Series LC System HPLC(AGILENT)上測定產(chǎn)生的氨基酸，包括甲硫氨酸。以正鄰苯二 醛(ortho-pthalaldehyde)進(jìn)行樣品的預(yù)先柱衍生化允許所產(chǎn)生的氨基酸經(jīng)Hypersil AA-柱(AGILENT)分離后被定量。分離顯示甲硫氨酸滴度至少為M690的兩倍的克隆。一種這樣的克隆被用于進(jìn)一 步的實(shí)驗(yàn)中，該克隆命名為Ml 197，于2005年5月18日保藏于DSMZ菌株保藏中心，菌株保 藏號為DSM 17322。將該菌株的氨基酸產(chǎn)生情況與菌株M690相比，結(jié)果概括于表4。表4 菌株M690和Ml 197產(chǎn)生的高絲氨酸、0-乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的 菌株Μ1197以DNA F(也稱為pH399，SEQ ID NO :24)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生“坎貝爾插 入”菌株，后者隨后“被坎貝爾刪除”以產(chǎn)生菌株Μ1494，該菌株在高絲氨酸激酶的基因中 含有突變，其導(dǎo)致所產(chǎn)生的高絲氨酸激酶中出現(xiàn)氨基酸改變，即Τ190改變?yōu)棣?90(稱為 HskT190A)。將菌株M1494的氨基酸產(chǎn)生情況與菌株Ml 197相比，結(jié)果概括于表5。表5 菌株M1197和M1494產(chǎn)生的高絲氨酸、0-乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸 的量 菌株Μ1494以DNA D(也稱為pH484，SEQ ID NO 25)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生“坎貝爾插入”菌 株，后者隨后“被坎貝爾刪除”以產(chǎn)生M1990菌株。M1990菌株使用groES啟動(dòng)子和EFTU(延 伸因子Tu)啟動(dòng)子過表達(dá)metY等位基因(稱為P497P1284HietY)。P497P1284啟動(dòng)子的序列見SEQ ID NO :26。將菌株M1494的氨基酸產(chǎn)生情況與菌株M1990相比，結(jié)果概括于表6。表6 菌株M1494和M1990產(chǎn)生的高絲氨酸、0_乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸 的量 菌株Μ1990以DNA Ε(也稱為ρΗ 491，SEQ ID NO 27)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生“坎貝爾插入” 菌株，后者隨后“被坎貝爾刪除”以產(chǎn)生“坎貝爾刪除”菌株Μ2014。Μ2014菌株使用超氧化 物岐化酶啟動(dòng)子過表達(dá)metA等位基因(稱為P3119HietA)。P3119啟動(dòng)子的序列見SEQ ID NO 3。將菌株Μ2014的氨基酸產(chǎn)生情況與菌株Μ1990相比，結(jié)果概括于表7。表7 菌株Μ1494和Μ1990產(chǎn)生的高絲氨酸、0_乙酰高絲氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸 的量 實(shí)驗(yàn)2 自 M2014 缺失 mcbR使用含有RXA00655缺失的質(zhì)粒pH429(SEQ ID NO :28)通過整合和切割將mcbR缺 失引入谷氨酸棒桿菌(見WO 2004/050694A1)。將質(zhì)粒pH429轉(zhuǎn)化至具有卡那霉素抗性(坎貝爾插入)選擇性的M2014菌株內(nèi)。 使用sacB反選擇，分離到轉(zhuǎn)化菌株的卡那霉素敏感型衍生菌，推測其已經(jīng)通過切割(坎貝 爾刪除)而丟失了所整合的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化的菌株產(chǎn)生了形成小菌落的卡那霉素敏感型衍生菌 以及更大的菌落。通過PCR篩選兩種大小的菌落以檢測是否存在mcbR缺失。較大菌落中 無一含有所述缺失，而較小菌落中的60-70%含有預(yù)期的mcbR缺失。當(dāng)在BHI板上劃線培養(yǎng)原始分離物以便形成菌落時(shí)，出現(xiàn)了微菌落和小菌落。當(dāng) 在BHI上再次劃線培養(yǎng)所述微菌落時(shí)，再次出現(xiàn)了微菌落和小菌落。當(dāng)在BHI上再次劃線 培養(yǎng)所述小菌落時(shí)，菌落大小通常是小而均一的。選擇兩個(gè)單個(gè)小菌落分離物，分別稱為 0M403-4和0M403-8，用于進(jìn)一步研究。搖瓶實(shí)驗(yàn)(表8)顯示0M403-8產(chǎn)生的甲硫氨酸的量是親代M2014的至少兩倍。該 菌株還產(chǎn)生賴氨酸，其量不足M2014的五分之一，提示碳從天冬氨酸半醛轉(zhuǎn)而流向高絲氨 酸。第三個(gè)顯著的不同在于，0M403積聚的異亮氨酸比M2014升高10倍以上。培養(yǎng)物均在 標(biāo)準(zhǔn)糖蜜培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。表8 在接種新鮮生長的細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)物中由0M403菌株分離物產(chǎn)生的氨基酸 再看表9，0M403積聚的0_乙酰高絲氨酸比M2014降低15倍以上。對這一結(jié)果最 合理的解釋是，在M2014中積聚的絕大多數(shù)0-乙酰高絲氨酸在0M403中已被轉(zhuǎn)化為甲硫氨 酸、同型半胱氨酸和異亮氨酸。培養(yǎng)物均在標(biāo)準(zhǔn)糖蜜培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。表9 在接種新鮮生長的細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)物中由兩種0M403分離物產(chǎn)生的氨基酸 實(shí)驗(yàn)3 降低metQ表達(dá)為了降低0M403-8的甲硫氨酸輸入，缺失了 metQ基因的啟動(dòng)子和5’部分。metQ 基因編碼甲硫氨酸輸入復(fù)合體的亞基，該亞基是所述復(fù)合體的功能所必需的?？墒褂觅|(zhì)粒 pH449(SEQ ID NO 29)通過標(biāo)準(zhǔn)的坎貝爾插入和坎貝爾刪除技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目的。在搖瓶分 析中測定0M403-8和0M456-2的甲硫氨酸產(chǎn)生情況。結(jié)果(表10)顯示0M456-2比0M403-8 產(chǎn)生了更多的甲硫氨酸。培養(yǎng)物均在標(biāo)準(zhǔn)糖蜜培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。表10 :0M456-2的搖瓶分析 實(shí)驗(yàn)4:構(gòu)建 0M469構(gòu)建稱為0M469的菌株，其包括metQ缺失，同時(shí)通過將0M456-2中的metF啟動(dòng)子 替換為噬菌體入？1；啟動(dòng)子而過表達(dá)111討？?？墒褂觅|(zhì)粒p0M427(SEQ ID NO 30)通過標(biāo)準(zhǔn)的 坎貝爾插入和坎貝爾刪除技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目的。在搖瓶培養(yǎng)分析中測定0M469的四種分離物 的甲硫氨酸產(chǎn)生情況，如表11所示，它們均比0M456-2產(chǎn)生了更多的甲硫氨酸。培養(yǎng)物均 在含2mM蘇氨酸的標(biāo)準(zhǔn)糖蜜培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。表11 :0M469的搖瓶分析，0M469是0M456-2的衍生物，其中用噬菌體λ Pe啟動(dòng)子 替換了 metF啟動(dòng)子 實(shí)驗(yàn)5:構(gòu)建 M 2543
使用SEQ ID NO :31所示的質(zhì)粒pCLIK5A PSOD TKT通過電穿孔轉(zhuǎn)化菌株0M469-2。 可使用標(biāo)準(zhǔn)的坎貝爾插入和坎貝爾刪除技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目的。在搖瓶培養(yǎng)分析中測定OM 469PS0D TKT的分離物(標(biāo)記為M2543)的甲硫氨酸產(chǎn) 生情況，它們均比0M469-2產(chǎn)生了更多的甲硫氨酸。菌株M2543的結(jié)果見表12。表12 :0M469和M2543的搖瓶分析 實(shí)驗(yàn)6:構(gòu)建 GK1259為了降低絲氨酸脫氨酶(sda)的表達(dá)，缺失了一部分sda基因?？墒褂觅|(zhì)粒ρΗ626 int SacB delta sdaA(SEQ ID NO :32)通過標(biāo)準(zhǔn)的坎貝爾插入和坎貝爾刪除技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一 目的。為此，使用質(zhì)粒PH626 int SacB delta sdaA通過電穿孔轉(zhuǎn)化菌株M2543。得到的菌 株命名為GK1259。實(shí)驗(yàn)7:構(gòu)建 0M264C質(zhì)粒p0M253(SEQ ID NO 33)被用于缺失谷氨酸棒桿菌菌株M2014的serA并將其 替換為壯觀霉素抗性。得到的“被坎貝爾刪除”菌株M2014 AserA: spec命名為0M264C。 0M264C是絲氨酸營養(yǎng)缺陷體。由于還缺乏功能性GCS，因此0M264C不能在缺乏絲氨酸但含 有甘氨酸的基本培養(yǎng)基上生長。但是，如果將功能性GCS系統(tǒng)加入到0M264C中，它將獲得 在含有甘氨酸的基本培養(yǎng)基上生長的能力?；?化學(xué)限定)培養(yǎng)板的配方如下 所用儲(chǔ)存液均過濾除菌。對于瓊脂陪替培養(yǎng)皿，將15g瓊脂溶于800ml蒸餾水中，
高溫滅菌。10 X Spizizen 鹽20g硫酸銨174g磷酸氫二鉀(三水化物)60g磷酸二氫鉀(無水)IOg檸檬酸鈉(二水化物)2g硫酸鎂(七水化物)加蒸餾水至1升加入3. 5ml 過濾除菌的 0. 4% FeCl3 · 6H20Iml微量營養(yǎng)素溶液(見下文)。最終PH應(yīng)該為大約7. 2過濾除菌。微量營養(yǎng)素溶液(1升)0. 15g Na2MoO4 · 2H202. 5g H3BO30. 7g CoCl2 · 6H200. 25g CuSO4 · 5H201. 6g MnCl2 · 4H200. 3g ZnSO4 · 7H20
加蒸餾水至1升過濾除菌。4B 溶液(1 升)
0. 25g鹽酸硫胺素(維生素B1)50mg氰鈷胺(維生素B12)25 to 28mg 生物素1. 25g吡多辛HCl (維生素B6)溶于50mM 磷酸鉀，pH7. 0過濾除菌，避光保存。實(shí)驗(yàn)8 在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH基因的菌株與谷氨酸棒桿菌不同，其近親杰氏棒桿菌不含有GCS。在杰氏棒桿菌染色體中， gcvP、gcvT 禾口 gcvH 基因成簇位于一操縱子內(nèi)(Tauch et al.，2005，J. Bacteriol.，vol 187，pp4671-4682)。使用杰氏棒桿菌菌株K411染色體DNA作為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)，將該基因簇克隆在四個(gè)重疊的亞片段中。通過將序列分為4個(gè)較小的區(qū)域并獲得4個(gè)獨(dú)立的較小的PCR片段而獲得必要的 DNA。使用4組引物擴(kuò)增這4個(gè)片段。在相應(yīng)的有義引物中的gcvP起始密碼子的立即上游 處遺傳工程化引入人工XbaI位點(diǎn)和人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并在相應(yīng)的反義引物中的gcvH 終止密碼子的立即下游處遺傳工程化引入人工BamHI位點(diǎn)。如此在XbaI至BamHI的片段 上重建gcvPTH基因簇的編碼序列。所得到的XbaI至BamHI的片段含有重建的gcvPTH基因簇，然后將其克隆入谷氨 酸棒桿菌復(fù)制型質(zhì)粒，該質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為從谷氨酸棒桿菌groESL啟動(dòng)子(稱為P497)或從枯 草芽孢桿菌噬菌體SPOl啟動(dòng)子(稱為P15) (SEQ IDNO 42)表達(dá)基因。所得質(zhì)粒分別命名為 p0M615(SEQ ID NO 34)和 p0M616(SEQ ID NO :35)。使用 P497 和 P15 啟動(dòng)子是因?yàn)樗鼈兛纱?進(jìn)位于下游的基因的組成型表達(dá)。具體而言，這些啟動(dòng)子不受任何甘氨酸相關(guān)代謝物例如 甘氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、胸苷、嘌呤等的顯著調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)9 杰氏棒桿菌gcvPTH基因在谷氨酸棒桿菌中起作用將質(zhì)粒p0M615、p0M616和空載體pCLIK各自分別地轉(zhuǎn)化至測試菌株谷氨酸棒桿 菌菌株0M264C和甲硫氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌菌株GK1259內(nèi)，在含有硫酸卡那霉素 (25mg/L)的腦心浸液(原Difco JllBectonDickenson)瓊脂板上進(jìn)行選擇。將0M264C轉(zhuǎn) 化體劃線接種在缺乏絲氨酸但含有甘氨酸的基本板上。將硫辛酸加入至培養(yǎng)基中至終濃度 為lmg/L，以保證存在足量的GcvH的這種輔因子。p0M615 與 p0M616 衍生菌、0M264C(p0M615)與 0M264C (p0M616)、以及 GK1259(p0M615)和 GK1259 (p0M616)均生長，但 pCLIK 轉(zhuǎn)化體 0M264C (pCLIK)不生長。實(shí)驗(yàn)10 來自杰氏棒桿菌的IipBA基因在谷氨酸棒桿菌中起作用谷氨酸棒桿菌是硫辛酸原養(yǎng)型，且推測谷氨酸棒桿菌具有硫辛酰合成酶，因?yàn)楸?酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶具有活性。大腸桿菌內(nèi)存在兩種不同途徑用于將硫辛酸附著(連接)至靶蛋白，即用于內(nèi)源 性合成的硫辛酸的LipB依賴性途徑和用于補(bǔ)料的硫辛酸的LplA途徑(Morris et al., 1995, J. Bacteriol. Vol 177，pp 1-10)
經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒桿菌似乎對LipB和IplA均具有很高的同源物。因此， 通過PCR從作為模板的杰氏棒桿菌菌株K411染色體DNA克隆了 IipB基因及其天然啟動(dòng)子 以及IipA基因。將所得平端PCR片段連接至p0M615或p0M616的唯一的SwaI位點(diǎn)，分別 產(chǎn)生 p0M620AF(SEQ IDNO 36)禾口 p0M621AR(SEQ ID NO :37)。
質(zhì)粒p0M620AF和p0M621AR各自轉(zhuǎn)化至菌株0M264C內(nèi)，分別產(chǎn)生 0M264C (p0M620AF)和0M264C (p0M621AR)，和各自轉(zhuǎn)化至產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株GK1259，分別 產(chǎn)生GK1259(p0M620AF)和GK1259 (p0M621AR)。將0M264C轉(zhuǎn)化體劃線接種在如上所述的基 本甘氨酸板上(但不含硫辛酸)，兩種轉(zhuǎn)化體均生長，但0M264C(pCLIK)不生長，說明當(dāng)兩者 在谷氨酸棒桿菌中一起表達(dá)時(shí)，杰氏棒桿菌LipB途徑能夠硫辛?；苁习魲U菌GcvH蛋白。在搖瓶中測試了p0M615、p0M616、p0M620AF、p0M621AR 和 pCLIK 的 GK1259 轉(zhuǎn)化體 中甲硫氨酸和甘氨酸產(chǎn)生的情況，其中使用不含硫辛酸或含有硫辛酸終濃度為大約IOmg/ ml的糖蜜培養(yǎng)基。結(jié)果見下文的表13和14。表13 被設(shè)計(jì)為用于表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH與IipBA的不同質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化并生長 于糖蜜培養(yǎng)基搖瓶中的GK1259的甲硫氨酸和甘氨酸的產(chǎn)生情況 表14 被設(shè)計(jì)為用于表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH與IipBA的不同質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化并生長 于糖蜜培養(yǎng)基搖瓶中的0264C的甲硫氨酸和甘氨酸的產(chǎn)生情況 *除p0M616加硫辛酸的樣品是單份樣品外，其他甲硫氨酸和甘氨酸的滴度均是一 式二份的樣品的平均值。從這些結(jié)果顯然可以看出，通過表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH操縱子，過量的甘氨酸副 產(chǎn)品被消耗，而甲硫氨酸滴度被升高。通過從同一質(zhì)粒表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH操縱子和杰 氏棒桿菌IipBA操縱子可實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的改善。實(shí)驗(yàn)11 從整合盒(integrated cassette)表達(dá) gcvPTH 和 IipBA在前面的實(shí)施例中，gcv和Iip基因是在能夠在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒上引 入的。不過，也可通過整合型載體引入這些基因。例如，將從啟動(dòng)子P15表達(dá)的杰氏棒桿菌gcvPTH操縱子連接至整合型載體內(nèi)產(chǎn)生pOM627(SEQ ID NO :38)，后者被設(shè)計(jì)為用于整合至 谷氨酸棒桿菌的bioB基因座。p0M627可被“被坎貝爾插入，，菌株0M469和GK1259內(nèi)并可自菌株0M469禾口 GK1259 “被坎貝爾刪除”。如同上述實(shí)施例中那樣，觀察到甲硫氨酸產(chǎn)生的改善和降低的甘 氨酸積聚，見表15。表15 在含或不含10mg/L硫辛酸的糖蜜培養(yǎng)基內(nèi)在搖瓶中生長的、使用p0M627 得到的0M469和GK1259轉(zhuǎn)化體的甲硫氨酸和甘氨酸的產(chǎn)生情況，p0M627被設(shè)計(jì)為當(dāng)其整 合至bioB后從P15表達(dá)杰氏棒桿菌gcvPTH 可通過引入多個(gè)拷貝或通過升高啟動(dòng)子的強(qiáng)度而改善整合型質(zhì)粒p0M627對甘氨 酸和甲硫氨酸產(chǎn)生的影響。還可添加杰氏棒桿菌IipBA操縱子(在復(fù)制型或整合型載體上)。在整合至谷氨 酸棒桿菌bioAD基因座后可從啟動(dòng)子P497表達(dá)IipBA的整合型質(zhì)粒的實(shí)例是p0M180 (SEQ ID NO 39)。實(shí)驗(yàn)12 大腸桿菌GCS系統(tǒng)也在谷氨酸棒桿菌內(nèi)起作用PCR擴(kuò)增大腸桿菌Ipd基因并置于整合型質(zhì)粒內(nèi)產(chǎn)生p0M331 (SEQ IDNO 40)。整 合位置是在此稱為metE2的基因，該基因與metE的一部分同源，但在谷氨酸棒桿菌中似乎 不是生長或產(chǎn)生甲硫氨酸所必需的。在p0M331中，從P497啟動(dòng)子表達(dá)大腸桿菌Ipd基因。p0M331被轉(zhuǎn)化入0M264C并 從0M264C被坎貝爾刪除，產(chǎn)生菌株0M197，后者經(jīng)合適的診斷性PCR確認(rèn)其含有整合的P497 Ipd盒。此外，通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌gcvTHP操縱子并連接至復(fù)制型載體的P497啟動(dòng)子的 立即下游，產(chǎn)生p0M344(SEQ ID NO :41)。將p0M344和pCLIK各自分別地轉(zhuǎn)化至菌株0M197 內(nèi)，所得菌株在含有甘氨酸和硫辛酸但缺乏絲氨酸的基本甘氨酸板(見上文)上劃線培養(yǎng)。30°C生長數(shù)天后，0M197/p0M344已經(jīng)生長，但0M197/pCLIK沒有生長，說明大腸桿 菌GCS系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌內(nèi)起作用。上述實(shí)施例顯示，編碼GCS亞基P、T和H的基因以及編碼催化硫辛酸連接或合成 的酶的基因(其克隆自兩種“供體”生物體(它們彼此相互無關(guān)聯(lián))之一)能夠在谷氨酸 棒桿菌中產(chǎn)生可檢測量的GCS活性，這表現(xiàn)為含有甘氨酸但不含絲氨酸的板上對絲氨酸營 養(yǎng)缺陷型提供互補(bǔ)，或是表現(xiàn)為與作為對照的以空載體轉(zhuǎn)化的相關(guān)親代或前體菌株產(chǎn)生的 甘氨酸相比，產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株的甘氨酸產(chǎn)生降低。
進(jìn)一步而言，似乎可以合理地認(rèn)為，本領(lǐng)域人員能夠遵循在此所披露的實(shí)施例并 在谷氨酸棒桿菌中重建其他GCS系統(tǒng)，并可通過從相同的供體生物體(即大腸桿菌和杰氏 棒桿菌)或其他供體生物體中克隆相關(guān)的基因而建立和/或升高GCS活性。改善也可通過 補(bǔ)料硫辛酸，例如以大約0. 1至10mg/L，而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)13:構(gòu)建 M2616 構(gòu)建谷氨酸棒桿菌M2616。該菌株顯示出缺失的serA活性，其允許測試甲?；鵗HF 合成酶的功能。質(zhì)粒pHF96(SEQ ID 43)是整合型質(zhì)粒，其被設(shè)計(jì)為用于在與谷氨酸棒桿菌ATCC 13032相關(guān)的谷氨酸棒桿菌菌株的serA基因中產(chǎn)生缺失-取代。使用質(zhì)粒pHF96 int sacB delta serA來造成M2543中的sera缺失。通過電穿孔將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌M2543 內(nèi)并分離卡那霉素抗性克隆。經(jīng)PCR確定這些卡那霉素抗性菌株是成功的"被坎貝爾插 入"菌株后，將菌株在液體CM培養(yǎng)基中生長過夜，并接種在含蔗糖(10%濃度)的CM培養(yǎng) 基中。所得“被坎貝爾刪除”菌株M2543 delta serA被命名為M2616。如預(yù)期的那樣，在 基本培養(yǎng)基中進(jìn)行分析時(shí)，M2616是絲氨酸營養(yǎng)缺陷體。還如預(yù)期的那樣，由于缺乏甲?；?THF合成酶，M2616不能在缺乏絲氨酸但含有甘氨酸和甲酸鹽的基本培養(yǎng)基(見基本(化 學(xué)限定)培養(yǎng)基配方的實(shí)施例)上生長。如果在M2616中添加功能性甲?；鵗HF合成酶系 統(tǒng)，其便可獲得在含有甘氨酸的基本培養(yǎng)基上生長的能力。實(shí)驗(yàn)14 從兩種杰氏棒桿菌來源克隆兩種甲?；?THF合成酶基因與谷氨酸棒桿菌不同，其近親杰氏棒桿菌不含有登錄號為NP_939608的甲酰 基-THF合成酶蛋白和登錄號為GeneID =2649808的相應(yīng)的基因。使用了兩種來源的模板從杰氏棒桿菌克隆甲?；?THF合成酶。使用來自 NCTC(National Collection of Type Cultures London，UK)編號為 11915、菌株名稱為 K411的菌株的DNA和來自DSMZ菌株7171的DNA。按照生產(chǎn)商的方法使用Quiagen DNA Kit 制備染色體DNA。使用寡核苷酸HS1304(SEQID NO 44)和HS1305 (SEQ ID NO 45)從兩種來 源(NCTC 11915和DZMZ 7171)的基因組DNA擴(kuò)增甲酰基-THF合成酶基因的基因組序列。 使用來自RocheMannheim的Pwo聚合酶，條件如下52°C退火30”，72°C延伸120”，產(chǎn)生大約 1700bp 的 PCR 片段。此外還使用引物HS1302(SEQ ID NO :46)和HS1303 (SEQ ID NO :47)擴(kuò)增啟動(dòng)子表 達(dá)單元，其具有所述來自菌株ATCC13032的染色體DNA的序列。使用來自Roche Mannheim 的Pwo聚合酶，條件如下53°C退火30”，72°C延伸30”，產(chǎn)生大約200bp的PCR片段。將兩種片段加到第三PCR中，向其中加入引物HS13032和HS1305。在銜接引物 足量的條件下對有限量的PCR片段I和II進(jìn)行第三PCR并使用銜接引物使之融合。使用 HS1302+HS1305 擴(kuò)增得自 HS1302+HS1303 和 HS1304+HS1305 的 PCR 片段的融合產(chǎn)物。使 用來自Roche Mannheim的Pwo聚合酶，條件如下55°C退火30”，72°C延伸120”，產(chǎn)生大約 1900bp 的 PCR 片段。使用GFX PCR純化試劑盒純化片段并使用限制性酶MluI和XbaI消化。對含有甲 酰基-THF合成酶基因插入物的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序了來自杰氏棒桿菌NCTC K11915的基因。該基因的測序結(jié)果顯示序列是預(yù)期 的序列。測序了來自杰氏棒桿菌DSMZ 7171的基因。該基因的測序結(jié)果顯示其是質(zhì)粒序列PH657中所述的序列。通過電穿孔將包含來自NCTC K11915的甲?；?THF-合成酶的質(zhì)粒pH655(SEQ ID NO 48)和包含來自DSMZ7171的甲酰基-THF-合成酶的質(zhì)粒pH657 (SEQ ID NO 49)轉(zhuǎn)化至 缺乏功能性serA基因的菌株M2616中。將所得菌株M2616 (pH655)和M2616 (pH657)以及不含質(zhì)粒的菌株劃線接種于基本培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有IOmM蘇氨酸，20mM甲酸鈉和20mM甘氨酸+/-IOmM絲氨酸。含有質(zhì) 粒pH655和pH657卻不含pCLIK5a的菌株在含甲酸鹽和甘氨酸的基本培養(yǎng)基上形成菌落， 而即便延長培養(yǎng)時(shí)間，菌株M2616也沒有在這種不含絲氨酸的培養(yǎng)基上形成菌落。在添加 蘇氨酸、甲酸鈉和甘氨酸也添加絲氨酸(20mM)的同樣的基本培養(yǎng)基上，包括M2616在內(nèi)的 所有菌株均形成了菌落。結(jié)果顯示，來自杰氏棒桿菌NCTC和DSMZ 7171的甲?；鵗HF合成酶在谷氨酸棒桿 菌中成功的功能性表達(dá)產(chǎn)生了利用甲酸鹽合成絲氨酸的菌株。實(shí)驗(yàn)15 構(gòu)建表達(dá)甲?；?THF合成酶基因的甲硫氨酸超量生產(chǎn)菌株通過電穿孔將質(zhì)粒pH655和pH657轉(zhuǎn)化入菌株GK1259。在如前所述的搖瓶分析中 培養(yǎng)所得到的菌株GK1259(pH655)和GK1259 (pH657)以及不含質(zhì)粒的菌株。此外，向生長 培養(yǎng)基中加入20mM甲酸鹽。發(fā)現(xiàn)甲?；鵗HF合成酶基因的表達(dá)升高了菌株的甲硫氨酸生 產(chǎn)能力，使之超過缺乏甲酰基THF合成酶基因的菌株。結(jié)果見表16。表16 :GK1259和過表達(dá)甲酰基-THF合成酶的GK1259 (pH655)的搖瓶分析 實(shí)驗(yàn)16 在菌株M2543中缺失甲?；?THF-脫甲酰基酶通過序列比較檢測到谷氨酸棒桿菌含有一種基因，其被認(rèn)為是甲?；?THF脫甲 酰基酶(登錄號NCgl0371)。該基因被認(rèn)為是編碼具有甲?；?THF脫甲?；傅拿富钚缘?酶，甲?；?THF脫甲酰基酶從代謝物甲?；?四氫葉酸酯裂解甲酸鹽(Annual review of plant physiology and plant molecular biology(2001) 52 :119-137)。通過如下方法敲除甲酰基-THF脫甲?；?登錄號NCgl0371)克隆DNA片段， 其中編碼NCgl0371上游區(qū)域的基因(長度大約500bp)和同一基因的下游區(qū)域(長度大 約500bp)被擴(kuò)增并通過融合PCR進(jìn)行融合，并克隆至載體中產(chǎn)生pH670 int sacB delta deformylase (SEQ ID NO :50)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至菌株M2543中以產(chǎn)生第一重組體(“坎貝 爾插入步驟”)。PCR成功篩選正確的第一重組體之后，將菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜并 在含10%蔗糖的生長培養(yǎng)基中鋪板。這一處理(“坎貝爾刪除步驟”)產(chǎn)生稱為GK1546的 菌株，其中卡那霉素抗性標(biāo)記物和質(zhì)粒PH670上編碼的Ievan蔗糖基因被成功地從染色體 上交換出去，并隨后自染色體和細(xì)胞中丟失。來自坎貝爾刪除步驟的后續(xù)菌株經(jīng)使用編碼 所述甲?；?THF脫甲?；傅?’和3’區(qū)域內(nèi)的序列的引物進(jìn)行PCR篩選，被鑒定為是甲 酰基-THF脫甲?；溉笔w。陽性克隆具有的PCR片段比來自甲?；?THF脫甲酰基酶野生型菌株的PCR產(chǎn)物短大約900bp。所得菌株命名為GK1546。實(shí)驗(yàn)17 構(gòu)建缺失甲酰基-THF-脫甲?；覆⑦^表達(dá)甲?；?THF-合成酶的菌株以質(zhì)粒pH655和pH657轉(zhuǎn)化菌株GK1546。所得菌株GK1546 (pH655)和 GK1546(pH657)在含有甲酸鹽、甘氨酸和蘇氨酸但不含絲氨酸的基本培養(yǎng)基上較菌株 M2543顯示出顯著改善的生長特性。
實(shí)驗(yàn)18 表達(dá)用于產(chǎn)生甲硫氨酸的功能性甲酰基-THF-合成酶菌株M2616 以 pH655 (甲?；?THF-合成酶 NCTC 11915)和 pH657 (甲酰 基-THF-合成酶DSMZ 7171)轉(zhuǎn)化。在如前所述的搖瓶分析中分析所得菌株M2616 (pH655) 和 M2616(pH657)。除了上述常規(guī)成分之外，培養(yǎng)基中還添加了 20mM甘氨酸以及20mM甲酸鈉。搖瓶在 30°C溫育，搖動(dòng)速度為200RPM。48小時(shí)后測定甲硫氨酸。發(fā)現(xiàn)不含表達(dá)甲?；?THF合成 酶的質(zhì)粒的親代菌株M2616不能生長至出現(xiàn)可檢測到的0D，而且其不利用所提供的碳源。 通過HPLC分析上清液中的甲酸鹽。含有質(zhì)粒pH655和pH657的菌株顯示出利用所有添加 至培養(yǎng)基中的甲酸鹽。此外還觀察到可在甲酸鹽、甘氨酸上生長且表達(dá)甲酰基THF-合成酶 基因的菌株產(chǎn)生了可檢測量的甲硫氨酸，而菌株M2616根本不產(chǎn)生任何甲硫氨酸。結(jié)果見 表17。表17 :M2616和M2616的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體的甲硫氨酸產(chǎn)生情況 在另一實(shí)驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)18中所述的培養(yǎng)基中加入20mM絲氨酸。在存在絲氨酸的 情況下培養(yǎng)表達(dá)甲酰基-THF-合成酶DSMZ 7171基因的M2616和M2616并測定所產(chǎn)生的甲 硫氨酸。將表達(dá)甲酰基-THF-合成酶DSMZ基因的菌株與不含有甲?；?THF-合成酶基因 的菌株相比，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)該酶的菌株所產(chǎn)生的甲硫氨酸滴度高于菌株M2616。結(jié)果見表18。表18 在過表達(dá)甲酰基-THF合成酶的菌株中超量生產(chǎn)甲硫氨酸
權(quán)利要求
在至少一種微生物中產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括如下步驟培養(yǎng)微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物產(chǎn)生更多的N5，N10-亞甲基-THF。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物選自包括腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯菌屬、 棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、阿舒囊霉屬 (Ashbya)、曲霉菌屬、短桿菌屬和鏈霉菌屬的微生物的組。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物優(yōu)選地選自包括谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、醋谷M酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、 P譽(yù)St酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、熱產(chǎn)M棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeium)、棲糖蜜棒桿菌 (Corynebacterium melassecola)禾口 Corynebacteriumefficiens 的組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述微生物衍生自谷氨酸棒桿菌的菌株。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物 體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲?；?THF-合成酶的量和/或活性是升 高的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與 所述起始生物體相比，所述微生物中的甲?；?THF-脫甲?；傅牧亢?或活性是降低的。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使 得與所述起始生物體相比，所述微生物中的N5，N10-次甲基-THF-環(huán)化合成酶、N5，N10-次甲 基-THF-還原酶和/或N5，N1Q-亞甲基-THF-還原酶的量和/或活性是升高的。
8.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的方法，其中甲?；?THF-合成酶的編碼序列衍生自杰氏棒 桿菌或大腸桿菌。
9.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物 體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物中的甘氨酸切割系統(tǒng)(GCS)的酶活性是升高 的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使得與 所述起始生物體相比，所述微生物中的gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的lipA、lipB 或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
12.權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
13.權(quán)利要求9至12任一項(xiàng)的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的lpd 的量和/或活性是升高的。
14.權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的方法，其中g(shù)cvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的編 碼序列衍生自杰氏棒桿菌或大腸桿菌。
15.權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)的方法，其中在存在硫辛酸和/或硫辛酰胺的情況下培養(yǎng) 所述微生物。
16.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲酰 基-THF-合成酶的量和/或活性和甘氨酸切割系統(tǒng)(GCS)的酶活性是升高的。
17.權(quán)利要求16的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲?；?THF-合 成酶、gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
19.權(quán)利要求16至18任一項(xiàng)的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
20.權(quán)利要求16至19任一項(xiàng)的方法，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
21.權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)的方法，其中g(shù)cvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA和lipB的編 碼序列衍生自杰氏棒桿菌或大腸桿菌。
22.權(quán)利要求16至21任一項(xiàng)的方法，其中在存在硫辛酸和/或硫辛酰胺的情況下培養(yǎng) 所述微生物。
23.微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始微生物，使得與所述起始生 物體相比所述微生物產(chǎn)生更多的N5，N1Q-亞甲基-THF。
24.權(quán)利要求23的微生物，其中所述微生物選自包括腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯 菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、阿舒囊霉 屬、曲霉菌屬、短桿菌屬和鏈霉菌屬的微生物的組。
25.權(quán)利要求24的微生物，其中所述微生物優(yōu)選地選自包括谷氨酸棒桿菌、醋谷氨 酸棒桿菌、嗜醋酸棒桿菌、熱產(chǎn)氨棒桿菌、杰氏棒桿菌、棲糖蜜棒桿菌和Corynebacterium efficiens 的組。
26.權(quán)利要求25的微生物，其中所述微生物衍生自谷氨酸棒桿菌的菌株。
27.權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始 生物體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲?；?THF-合成酶的量和/或活性 是升高的。
28.權(quán)利要求27的微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使 得與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲?；?THF-脫甲酰基酶的量和/或活性是降 低的。
29.權(quán)利要求27或28的微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物 體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物中的N5，N1(l-次甲基-THF-環(huán)化合成酶、N5， N10-次甲基-THF-還原酶和/或N5，N1Q-亞甲基-THF-還原酶的量和/或活性是升高的。
30.權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始 生物體，使得與所述起始生物體相比，所述微生物中的甘氨酸切割系統(tǒng)(GCS)的酶活性是 升高的。
31.權(quán)利要求30的微生物，其中所述微生物通過遺傳學(xué)修飾而衍生自起始生物體，使 得與所述起始生物體相比，所述微生物中的gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
32.權(quán)利要求30或31的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
33.權(quán)利要求30至32任一項(xiàng)的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
34.權(quán)利要求30至33任一項(xiàng)的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
35.權(quán)利要求30至35任一項(xiàng)的微生物，其中g(shù)cvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的 編碼序列衍生自杰氏棒桿菌或大腸桿菌。
36.權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 甲?；?THF-合成酶的量和/或活性和甘氨酸切割系統(tǒng)(GCS)的酶活性是升高的。
37.權(quán)利要求36的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的甲酰 基-THF-合成酶、gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
38.權(quán)利要求36或37的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
39.權(quán)利要求33至38任一項(xiàng)的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
40.權(quán)利要求36至39任一項(xiàng)的微生物，其中與所述起始生物體相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
41.權(quán)利要求36至40任一項(xiàng)的微生物，其中g(shù)cvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的 編碼序列衍生自杰氏棒桿菌或大腸桿菌。
42.權(quán)利要求27至41任一項(xiàng)的微生物，其中通過增加編碼甲?；?THF-合成酶、gcvP、 gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的拷貝數(shù)、增加編碼甲酰基_THF_合成 酶、gcvP、gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、在編碼甲酰 基-THF-合成酶4(評4(^1\§(^11、1 (1、1 認(rèn)、11 4或11 8的核酸序列中引入突變或其組 合而升高甲?；?THF-合成酶40評4(^1\§(^11、1 (1、1 認(rèn)、11 4或lipB的量和/或活性。
43.權(quán)利要求42的微生物，其中通過使用包含編碼甲?；?THF-合成酶、gcvP、gcvT、 gCVH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的自主復(fù)制型載體和/或通過將額外拷貝的編碼 甲?；?THF-合成酶、gcvP、gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列染色體整合至 所述起始生物體的基因組內(nèi)而增加基因拷貝數(shù)。
44.權(quán)利要求43的微生物，其中通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子來增加轉(zhuǎn)錄，所述強(qiáng)啟動(dòng)子優(yōu)選地選自包括PEFTu、P groES、1 SOD、1 15 和的組。
45.權(quán)利要求23至44任一項(xiàng)的微生物用于生產(chǎn)甲硫氨酸的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物，特別是谷氨酸棒桿菌，其中N5，N10-亞甲基-THF的形成是提高的。本發(fā)明還涉及此類微生物用于產(chǎn)生甲硫氨酸的用途。
文檔編號C12P13/12GK101849016SQ200880005502
公開日2010年9月29日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月19日
發(fā)明者A·黑羅爾德, C·克洛普羅格, H·施羅德, J·G·佩羅, O·澤爾德, R·R·優(yōu)卡姆, S·黑夫納, T·A·帕特松 申請人:羸創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司