專利名稱：：對于有機介質(zhì)中的親水性底物具有高耐受性的改性的固定化酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及固定于固體載體上的改性的界面酶，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此可避免在親水性試劑、底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集。本發(fā)明的改性的界面酶可以通過被覆有共價結合的脂質(zhì)基團而得到保護。所述載體可以通過吸附于官能團上或通過與官能團共價結合而能夠結合所述酶。更具體而言，所述載體可以是有機的，也可以是無機的，并且優(yōu)選地選自由如二氧化硅類或氧化鋁類載體等無機載體和如聚合物類載體等有機載體組成的組，其中所述載體可以含有離子基團和如環(huán)氧基或醛基等活性官能團，或者所述載體為離子交換樹脂。所述脂質(zhì)環(huán)氧化物可選自脂肪酸、脂肪酸烷基酯、糖脂肪酸酯、中鏈和長鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。在另一實施方式中，本發(fā)明的改性的界面酶通過固定在提供疏水性微環(huán)境的疏水性固體載體上或埋入所述載體中而得到保護。所述酶可以是脂肪酶、酯酶或磷脂酶。更具體而言，所述酶可以是南極假絲酵母(Candidaantarctica)、芻皮褶假絲酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡門禾白青霉(Penicilliumcamembertii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶中的任何一種。另一方面，本發(fā)明涉及制備固定于不溶性載體上的改性的界面酶的方法，所述酶可避免在親水性試劑、底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步驟(a)提供由水性緩沖溶液和至少一種含有脂質(zhì)環(huán)氧化物的有機溶劑組成的體系；(b)將所述界面酶與步驟(a)所提供的雙溶劑體系混合；(c)將所述載體加入到步驟(b)的混合物中并進行混合；(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定于所述載體上的界面酶。在一個實施方式中，所述載體為多孔載體，其可以是有機或無機的，優(yōu)選地選自由多孔無機載體(如二氧化硅類或氧化鋁類載體)和有機載體(如聚合物類載體)組成的組，其中所述載體可以可選地含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團，或者離子基團。在另一實施方式中，所述有機溶劑選自烷類(如辛烷)、醚類(如二異丙醚)、醇類(如正辛醇)、醛類(如癸醛)和酮類(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。在又一實施方式中，所述脂質(zhì)環(huán)氧化物選自脂肪酸、脂肪酸甲酯、糖脂肪酸酯、中鏈和長鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。另一方面，本發(fā)明提供了制備固定于固體載體上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此可避免在親水性底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步驟(a)提供由水性緩沖溶液和至少一種含有脂質(zhì)環(huán)氧化物，特別是脂肪酸環(huán)氧化物或甘油三酯環(huán)氧化物的有機溶劑組成的雙相體系；(b)將所述界面酶與步驟(a)所提供的具有大量過量的環(huán)氧化物的雙相體系混合，以使酶的親核性表面反應基，特別是氨基，與環(huán)氧基反應，制造共價地被覆有脂肪酸或被覆有甘油三酯的酶(圖1);(c)將所述載體加入到步驟(b)的混合物中并進行混合；(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定于所述載體上的脂質(zhì)_界面酶復合物。在與酶雙相溶液混合之前，可選地洗滌所述載體以除去鹽和有機物。在本發(fā)明的此方法中，不溶性載體通過物理吸附或通過共價結合于官能團上而能夠結合界面酶。載體優(yōu)選為多孔載體，其可以是有機或無機的，優(yōu)選地選自由多孔無機載體(如二氧化硅類或氧化鋁類載體)和有機載體(如聚合物類載體)組成的組，其中所述載體可以可選地含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團，或者離子基團。據(jù)稱，本發(fā)明的環(huán)氧化方法的步驟(a)中所用的有機溶劑可以為但不限于烷類(如辛烷)、醇類(如正辛醇)、醛類(如癸醛)、醚類(如二異丙醚)或酮類(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。通過本發(fā)明的方法制備的界面酶優(yōu)選為脂肪酶、酯酶或磷脂酶。具體的非限制性實例為源自南極假絲酵母(Candidaantarctica)、皺褶假絲酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲毒(Aspergillusniger)、卡門禾白青毒(Penicilliumcamembertii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜禾子禾口姨酶的酶。固定于固體多孔載體上的本發(fā)明的界面酶鎖定在其活性構象，通過共價地被覆有大量所述脂質(zhì)的分子(通過其初始的環(huán)氧基團與酶的表面官能團結合)而被改性，并且特征在于對于如短鏈醇和短鏈脂肪酸等親水性底物的高耐受性。本發(fā)明的環(huán)氧化方法中所用的載體通過物理吸附于官能團上或通過共價結合于官能團而能夠結合所述脂質(zhì)被覆的酶，并可以是有機載體或無機載體，優(yōu)選地選自如二氧化硅類或氧化鋁類載體等無機載體和如聚合物類載體等有機載體，并且所述載體可以含有離子基團和如環(huán)氧基或醛基等活性官能團，或者所述載體可以為離子交換樹脂。在本發(fā)明的此脂質(zhì)被覆的酶的制備中，脂質(zhì)優(yōu)選但不限于游離脂肪酸或脂肪酸烷基酯環(huán)氧化物、糖脂肪酸酯環(huán)氧化物、中鏈和長鏈烷基糖苷、磷脂環(huán)氧化物、聚乙二醇環(huán)氧化物衍生物或季銨鹽環(huán)氧化物。不飽和脂質(zhì)底物的環(huán)氧化物通常如下獲得通過化學或生化催化(例如在過氧化氫存在下利用脂肪酶)將至少一個雙鍵氧化為環(huán)氧基團。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及一種制備固定于固體載體上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此可以避免在親水性底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集，所述方法包括以下步驟(a)提供(i)由水性緩沖劑組成的體系或(ii)由水性緩沖劑和有機溶劑組成的雙相體系；(b)向任一所述體系(i)或(ii)中加入疏水性聚合物載體；(c)向步驟(b)所獲得的混合物中加入所述界面酶并進行混合；和(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定在所述疏水性載體上的界面酶。在此方法中，所述有機溶劑可以為但不限于正辛烷、異辛烷、正己烷、正辛醇二異丙基醚和油類甘油三酯。疏水性聚合物載體可以為但不限于疏水性脂肪族丙烯酸類交聯(lián)聚合物或疏水性芳香族交聯(lián)聚合物，其實例分別為AmberliteKXAD7HP和AmberliteKXAD1600。在本發(fā)明的所有方法中，酶可以是脂肪酶、酯酶或磷脂酶，例如南極假絲酵母(Candidaantarctica)、芻皮褶假絲酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡門禾白青霉(Penicilliumcamembertii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜禾子禾口胰酶。本發(fā)明的改性的固定化疏水化酶或通過本發(fā)明的方法制備的改性的固定化疏水化酶可以有利地用于制造脂肪酸烷基酯，所述脂肪酸烷基酯可用作生物柴油或用作表面活性成分制備用中間體。由此，本文提供了制備結構化的脂質(zhì)的酶促方法，所述方法包括以下步驟在本發(fā)明的改性的固定化酶或通過本發(fā)明的方法制備的改性的固定化酶存在下，將如游離脂肪酸、甘油三酯、脂肪酸酯、偏甘油酯、磷脂或其它脂肪酸衍生物等脂肪酸源與如甲醇等醇反應。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及制備脂肪酸短鏈烷基酯、優(yōu)選為脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括逐步將甲醇加入到由含有本發(fā)明的脂肪酶或者通過本發(fā)明的方法制備的脂肪酶的植物油、動物油、海藻油或魚油或者至少兩種上述油的混合物所獲得的脂肪酸源中，并使反應在適當條件下進行，直到所述脂肪?；蛑舅岜晦D化為脂肪酸甲酯。在此方法中，植物油可以為但不限于大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、麻瘋果油、廢烹調(diào)油或源自非食用植物源的任何油類甘油三酯。下面將參照以下附圖更詳細地描述本發(fā)明。圖1:使用脂肪酸環(huán)氧化物共價被覆酶的方法的示意性說明。圖2A:在緩沖溶液中，本發(fā)明的固定化米黑毛霉(M.miehei)脂肪酶的水解活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖2B:在緩沖溶液中，本發(fā)明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖3A:在丙酮中，本發(fā)明的固定化M.miehei脂肪酶的水解活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖3B:在丙酮中，本發(fā)明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖4A:在正己烷中，本發(fā)明的固定化M.miehei脂肪酶的水解活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖4B:在正己烷中，本發(fā)明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性與固定化及表面活性劑或脂質(zhì)非共價被覆的同樣的酶的水解活性的對比。圖5:在連續(xù)型酯交換反應中，利用固定于使用同一批生物催化劑的各種基質(zhì)上的疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶時轉化為脂肪酸甲酯的反應轉化8率(％)。反應條件將大豆油(2.5g)、甲醇(0.3g，分為三份間隔1小時加入)和固定化脂肪酶(250mg)在3(TC于恒溫搖動器中混合4小時。圖6:在連續(xù)型酯交換反應中，利用固定于使用同一批生物催化劑的各種基質(zhì)上的南極假絲酵母B(CandidaAntarcticaB)脂肪酶時轉化為脂肪酸甲酯的反應轉化率(%)。反應條件如圖5中所示。圖7:在連續(xù)型酯交換反應中，利用固定于使用同一批生物催化劑的各種基質(zhì)上的洋蔥假單胞菌(Pseudomonasc印acia)脂肪酶時轉化為脂肪酸甲酯的反應轉化率(％)。反應條件如圖5中所示。圖8:在連續(xù)型酯交換反應中，利用固定于使用同一批生物催化劑的各種基質(zhì)上的產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)脂肪酶時轉化為脂肪酸甲酯的反應轉化率(％)。反應條件如圖5中所示。具體實施例方式為了搜尋一種用于制備高度活性并且穩(wěn)定的固定化界面酶、特別是對于親水性底物(如短鏈醇和短鏈脂肪酸)具有高耐受性的脂肪酶和磷脂酶的新方法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，酶的活性部位附近的酯交換反應介質(zhì)的疏水性微環(huán)境可作為增強脂肪酶的活性和提高其對親水性短鏈醇和酸以及反應混合物中可能存在的其它親水性試劑的耐受性的手段。由此本發(fā)明人開發(fā)出不同的酶制品，其中酶固定于不溶性基質(zhì)上并被賦予了疏水性。如下所示，所述酶既可以例如通過附著親脂性殘基(例如用脂質(zhì)環(huán)氧化物環(huán)氧化)而直接被賦予疏水性，也可以通過固定于疏水性基質(zhì)上而被賦予疏水性，所述疏水性基質(zhì)提供包圍酶或埋入酶的疏水性微環(huán)境。本發(fā)明證明，酶的活性部位附近的疏水性微環(huán)境起到了緩沖區(qū)的作用，所述緩沖區(qū)能夠防止酶暴露于抑制濃度的具有親水性部分的底物和產(chǎn)物。為酶提供的疏水性微環(huán)境負責控制非抑制濃度范圍的短鏈醇進入酶的活性部位，并負責將酶的活性部位附近形成的親水性反應產(chǎn)物除至反應介質(zhì)中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，疏水性固定化酶可通過兩步技術制備，所述技術基本上如下步驟1:通過將界面酶分子與由水相和含有脂質(zhì)環(huán)氧化物的有機相組成的雙相體系的脂質(zhì)環(huán)氧化物反應，強迫所有界面酶分子采用其活性構象(參見圖1)。脂質(zhì)環(huán)氧化物大量過量地存在，因此每個酶分子都共價地被覆有大量的脂質(zhì)分子。步驟2:將合適的載體加入到已經(jīng)含有所述共價被覆的酶的雙相體系中。在這些條件下，位于雙相界面處的共價地被覆有脂質(zhì)殘基或復合物的酶分子，通過簡單物理吸附、與含有官能團(如環(huán)氧基或醛基等)的活化樹脂共價結合或通過在離子交換樹脂上的吸附，可以輕易地固定到所述載體上。在本發(fā)明的活性改性的固定化界面酶的制備中采用了該兩步技術。根據(jù)這一方面，本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定、高度活性的改性的固定化界面酶、特別是脂肪酶、酯酶和磷脂酶的方法，其中，提供由水性緩沖溶液和至少一種含有脂質(zhì)環(huán)氧化物的有機溶劑組成的雙相體系；將所述界面酶與大量過量的所述雙相體系混合；將固體載體加入到所述混合物中；并且分離出固定于所述載體上的脂質(zhì)共價被覆的界面酶。固體載體優(yōu)選為多孔載體，其可以是有機或無機的，特別是選自由多孔無機載體9(如二氧化硅類或氧化鋁類載體)和有機載體(如聚合物類載體)組成的組，其中所述載體可以可選地含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團，或者離子基團。下面的實施例、特別是表1中給出了一些具體載體。雙相體系由適當?shù)乃跃彌_劑和有機溶劑制備。有機溶劑可以為但不限于烷類(如辛烷)、醚類(如二異丙基醚)、醇類(如正辛醇)、醛類(如癸醛)、酮類(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。本發(fā)明的固定化酶或通過本發(fā)明的上述環(huán)氧化方法制備的固定化酶非常具有活性、特別穩(wěn)定并對如短鏈醇和短鏈脂肪酸等親水性底物具有高耐受性。即使在10次反應循環(huán)后仍保留有約90%的活性。該穩(wěn)定性具有重大的經(jīng)濟意義。另一方面，本發(fā)明涉及脂肪酶疏水化的備選方法，所述方法避免了對環(huán)氧化和使用脂質(zhì)部分被覆酶的需要。物理附著于疏水性微環(huán)境的固定化酶通過將疏水性多孔聚合物基質(zhì)與水溶液或與含有不同脂肪酶的水-有機溶劑雙層[亦稱為雙相]體系接觸而制得。在用于制造生物柴油和甘油的油類甘油三酯與甲醇之間的酯交換反應中測試如此制造的固定化酶，該酯交換反應用作本發(fā)明中的反應模型。不受任何理論的限制，結果表明，微環(huán)境的疏水性可造成酶分子附近的親水性物質(zhì)的濃度降低。這些親水性物質(zhì)可能是反應中所使用的底物，也可能是反應所形成的產(chǎn)物。這種"疏水化"生物催化劑確保了到達酶附近的親水性短鏈醇和酸反應物的濃度受到控制，和/或可迅速除去酶分子附近形成的任何親水性物質(zhì)。作為主要結果，通過控制到達固定化酶附近的反應物的濃度及快速除去一旦反應形成的親水性產(chǎn)物，酶分子得以免受疏水性底物和產(chǎn)物的影響。使用四種不同的脂肪酶對上述說法進行測試，其中，每種脂肪酶均獨立地固定于四種疏水性不同的載體上，如實施例5所示。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及制備脂肪酸短鏈烷基酯、特別是脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法。一般而言，在該方法中，首先逐步將甲醇加入到如植物油、動物油、海藻油、魚油或源自真菌的任何油或者至少兩種上述油的混合物等脂肪酸源中。將固定于共價地被覆有脂質(zhì)的固體載體上的改性的脂肪酶(通過例如本發(fā)明的方法而制備)或本發(fā)明的固定于疏水性基質(zhì)上的脂肪酶加入到甲醇/脂肪酸源混合物中，并使反應進行，直至脂肪酸源轉化為脂肪酸甲酯。在本申請的上下文中，術語"載體"、"基質(zhì)"、"吸附劑"同義，可互換使用。如本文所公開和說明，應該理解本發(fā)明不限于本文所公開的特定的實例、方法步驟和材料，因為這些方法步驟和材料在某種程度上可以變化。還應該理解本文所用的術語僅僅是用于說明具體實施方式的目的而不是意在限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權利要求及其等同物的限制。必須注意的是，如本說明書和所附權利要求所用，"a"、"an"和"the"等單數(shù)形式包括復數(shù)的指代物，除非內(nèi)容中另有明確說明。在整個本說明書和后附權利要求書中，除非上下文另有規(guī)定，否則詞語"包括"和"包含"將被理解為意味著包含所說明的整體或步驟或者多個整體或多個步驟的組，但不排除任何其它的整體或步驟或者多個整體或多個步驟的組。下列實施例是本發(fā)明人在實施本發(fā)明的各方面時采用的技術的代表。應該理解的是，盡管這些技術是用于本發(fā)明的實施的優(yōu)選實施方式的示例，然而本領域技術人員根據(jù)本公開內(nèi)容將會意識到可以在不背離本發(fā)明的預期范圍的情況下進行各種修改。實施例實施例1固定化脂肪酶(LipozymeTL)的制備將源自疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)的脂肪酶(lml的LipozymeTLlOOL，Novozymes，丹麥)混合到由lml磷酸鹽緩沖劑(0.05M，pH6.5)和10ml含有脂質(zhì)環(huán)氧化物的正己烷組成的雙溶劑體系中。攪拌該混合物48小時。將載體(lg)加入該體系中并攪拌該混合物8小時。濾出含有改性的固定化酶的載體并在干燥器中干燥過夜，從而得到高度活性的脂質(zhì)共價被覆的固定化脂肪酶。表l顯示了固定于不同載體上的LipozymeTL100L的相對酯交換活性。反應通過將固定化脂肪酶(0.2g)加入到大豆油(2.5g)和甲醇(0.3g)中來進行。將反應體系在3(TC磁力攪拌或通過振搖而混合。通過測量在上述條件下反應1小時后生成的脂肪酸甲酯來確定反應速率。表1:將不同的脂肪酸環(huán)氧化物改性的Lipozyme用于大豆油甘油三酯的酯交換以獲得脂肪酸甲酯(FAME)時的反應速率。反應條件將橄欖油(2.5g)和甲醇(0.2g)與改性的固定于不同載體上的脂肪酶TL100L(0.2g)混合1小時。將反應混合物以300rpm在30。C振搖。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>載體類型反應速率(微摩爾FAME/分鐘克生物催化劑)DuoliteC467(Rohm&Haas)6AmberlystA-21(RohmMfeas)10Dowexmonosphere77(DOW，USA)13Do腦optiporeL493歸，USA;i12DowstyreneDVB歸，USA)18MTODo腦optiporeSD-2歸，USA)10Do腦MAC-39AmberliteFPA53(Rohm組aas)11AmberliteFPC22H(Rohm&Haas)10AmberliteFPA40C1(Rohm組aas)2AmberlitelRC50(Rohm&Haas)7PurolireA109(Purolite，USA)12實施例2固定化脂肪酶的制備使用不同的脂肪酶(lOOmg)和使用甘油三酯環(huán)氧化物重復實施例1的固定化程序。上述條件下生成脂肪酸甲酯的反應速率如表2中所示。表2:將不同的脂肪酸環(huán)氧化物改性的脂肪酶用于大豆油甘油三酯的酯交換以獲得脂肪酸甲酯(FAME)時的反應速率。反應條件將大豆油(2.5g)和甲醇(0.3g)與不同的共價地被覆有甘油三酯環(huán)氧化物并固定于AmberliteXAD4上的脂肪酶(0.2g)混合1小時。將反應混合物以300rpm在30°C振搖。載體類型反應速率(微摩爾FAME/分鐘克生物催化劑)南極假絲酵母(C肌dickMiterctica)9.612載體類型反應速率(微摩爾FAME/分鐘克生物催化劑)皺褶假絲酵母(Candidarugosa)7.7米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)12.5洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)16.2卡門禾白青毒(PeniciIliumcamembertii)4.2產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)12.3雪白根霉(Rhizopusniveus)3.4爪哇毛霉(Mucorjavanicus)12.3米根霉(Rhizopusoryzae)14.2黑曲霉(Aspergillusniger)6.3伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)12.1疏綿狀嗜熱絲包菌(Thermomyceslanuginosa)17.1粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)15.1實施例3用于制備脂肪酸甲酯(生物柴油)的固定化脂肪酶使用AmberliteXAD8或Celite(硅藻土，粉末)作為載體，緩沖劑(對照)正己烷或丙酮(Ac)作為有機溶劑，按照實施例1的程序制備固定化改性的M.miehei脂肪酶制PIPRo將這些制品用于脂肪酸甲酯(生物柴油)的制備。通過加入固定化脂肪酶(lOOmg)并在3(TC振搖反應介質(zhì)6小時而引發(fā)反應。將不同的酶制品[酶共價地被覆有油酸的緩沖劑_環(huán)氧化物-OA和酶共價地被覆有油(甘油三酯，例如三油酸甘油酯)的緩沖劑_環(huán)氧化物_油]的水解活性和合成活性與下述其它酶制品(未共價地被覆有脂質(zhì))的活性相比較酶簡單地固定于載體上的緩沖劑(對照)；載體固定化酶被覆有脂肪酸的緩沖劑-油酸(緩沖劑-0A);載體固定化酶被覆有脫水山梨醇單硬脂酸酯的緩沖劑-SMO。結果如圖2圖4中所示。如我們所觀察到的，本發(fā)明的共價地被覆有脂質(zhì)成分13的酶的水解活性和合成活性相當顯著地高于其它酶制品的活性。另外，即使在10次以上的反應循環(huán)后仍保留了酶的大部分活性(數(shù)據(jù)未示出)。因此，本發(fā)明的環(huán)氧化改性的酶制品表現(xiàn)出高活性和提高的穩(wěn)定性。實施例4脂肪酶在緩沖劑或雙相體系中的固定化在室溫下將脂肪酶[3000單位疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomycesla皿ginosa)脂肪酶、南極假絲酵母(Candidaantarctica)脂肪酶B(二者皆來自Novozymes，丹麥)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonasc印acia)月旨肪酶(AmanoEnzymeInc.，日本)或者產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)脂肪酶(MeitoSangyo，日本)]在含有聚合物載體(lg)的緩沖溶液(10ml，pH=7)中混合8小時。濾出固定化酶并在干燥器中于二氧化硅上干燥。在由相同體積的緩沖溶液和有機溶劑(例如異辛烷)組成的雙相體系中執(zhí)行相同的程序。使用了全部由美國Rohm&Haas制造的以下載體-AmberliteXAD1600，定義為疏水性吸附劑；-AmberliteXAD761，定義為親水性吸附劑；-AmberliteXAD7HP，定義為極性和非極性吸附劑；禾口-AmberliteIRA_958，定義為極性陰離子交換樹脂。實施例5實施例4的固定化脂肪酶在生物柴油制造中的應用利用油類甘油三酯和甲醇的酯交換來評價實施例4中制備的固定化脂肪酶在生物柴油及作為副產(chǎn)物的甘油的制造中的活性。通過向磁力攪拌的含有甲醇(0.3g，分為3份在4小時內(nèi)每間隔1小時加入1份)的大豆油(2.5g)中加入10重量％的固定化脂肪酶來引發(fā)反應。圖58中顯示了在使用同一批生物催化劑同時于4小時后交換反應介質(zhì)時，固定于不同基質(zhì)的不同脂肪酶的將油類轉化為脂肪酸甲酯的轉化率(％)。與其它相同但固定于其它類型載體上的酶相比，固定于如AmberliteKXAD1600等疏水性載體(吸附劑)上的脂肪酶在多得多的批數(shù)的反復應用中保持了其酯交換活性。此外，還可以清楚地看到，對于這類反應，所有固定于親水性載體上的脂肪酶表現(xiàn)出了較差的酯交換活性并且連續(xù)批次的反復應用性較差。還注意到，固定于如AmberliteKXAD761和AmberliteKIRA-958等親水性載體上的脂肪酶形成了生物催化劑的聚集體，其上具有飽和的反應所形成的親水性產(chǎn)物，即甘油。由于形成的產(chǎn)物的累積，同時由于在固定化酶附近的高濃度的甲醇，生物催化劑表現(xiàn)出較低的活性和較少的反復應用次數(shù)。相反，固定于如AmberliteKXAD1600和AmberliteKXAD7HP等疏水性載體上的脂肪酶、特別是疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶和洋蔥假單胞菌(Pseudomonasc印acia)脂肪酶獲得了較高的酯交換活性，并且在使用同一批生物催化劑時于超過50次的反復循環(huán)中保持了其酯交換活性。1權利要求一種固定于固體載體上的改性的界面酶，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此避免在親水性試劑、底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集。2.如權利要求1所述的改性的界面酶，其中，所述酶共價地被覆有脂質(zhì)基團。3.如權利要求2所述的改性的界面酶，其中，所述載體通過吸附或通過共價結合于官能團上而能夠結合所述酶。4.如權利要求2和3的任一項所述的改性的界面酶，其中，所述載體為有機的或無機的，優(yōu)選地選自由如二氧化硅類或氧化鋁類載體這樣的無機載體和如聚合物類載體這樣的有機載體組成的組，其中所述載體可以含有離子基團和如環(huán)氧基或醛基這樣的活性官能團，或者所述載體為離子交換樹脂。5.如權利要求24的任一項所述的改性的界面酶，其中，所述脂質(zhì)環(huán)氧化物選自脂肪酸、脂肪酸烷基酯、糖脂肪酸酯、中鏈和長鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。6.如權利要求1所述的改性的界面酶，其中，所述固體載體為疏水性固體載體。7.如權利要求16的任一項所述的酶，所述酶為脂肪酶、酯酶或磷脂酶。8.如權利要求7所述的酶，其中，所述酶選自由南極假絲酵母(Candidaantarctica)、皺褶假絲酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡門禾白青毒(Penicilliumcamembertii)、產(chǎn)減桿菌(Alcaligenessp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶組成的組。9.一種用于制備固定于不溶性載體上的改性的界面酶的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供由水性緩沖溶液和至少一種含有脂質(zhì)環(huán)氧化物的有機溶劑組成的體系；(b)將所述界面酶與步驟(a)所提供的雙溶劑體系混合；(c)將所述載體加入到步驟(b)的混合物中并進行混合；(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定于所述載體上的所述界面酶。10.如權利要求9所述的方法，其中，所述載體為有機多孔載體或無機多孔載體，優(yōu)選地選自由如二氧化硅類或氧化鋁類載體這樣的多孔無機載體和如聚合物類載體這樣的有機載體組成的組，其中所述載體可選地含有離子基團或者如環(huán)氧基或醛基這樣的活性官能團。11.如權利要求9和10的任一項所述的方法，其中，所述有機溶劑選自烷類(如辛烷)、醚類(如二異丙醚)、醇類(如正辛醇)、醛類(如癸醛)和酮類(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。12.如權利要求911的任一項所述的方法，其中，所述脂質(zhì)環(huán)氧化物選自脂肪酸、脂肪酸甲酯、糖脂肪酸酯、中鏈和長鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。13.—種用于制備固定于固體載體上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此避免在親水性底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步驟(a)提供(i)由水性緩沖劑組成的體系或(ii)由水性緩沖劑和有機溶劑組成的雙相體系；(b)向任一所述體系(i)或(ii)中加入疏水性聚合物載體；(c)向步驟(b)所獲得的混合物中加入所述界面酶并進行混合；禾口(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定于所述疏水性載體上的所述界面酶。14.如權利要求13所述的方法，其中，所述有機溶劑選自正辛烷、異辛烷、正己烷、正辛醇二異丙基醚和油類甘油三酯。15.如權利要求13和14的任一項所述的方法，其中，所述疏水性聚合物載體選自疏水性脂肪族丙烯酸類交聯(lián)聚合物或疏水性芳香族交聯(lián)聚合物的組，二者分別為如Amberlite^XAD7HP和AmberliteKXAD1600。16.如權利要求915的任一項所述的方法，其中，所述酶為脂肪酶、酯酶或磷脂酶。17.如權利要求16所述的方法，其中，所述酶選自由南極假絲酵母(Candidaantarctica)、芻皮褶假絲酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、假單胞菌Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡門柏青霉(Penicilliumcamembertii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色桿菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶組成的組。18.如權利要求18的任一項所述的改性的固定化酶，或者通過如權利要求917的任一項所述的方法制備的改性的固定化酶，其用于制造脂肪酸烷基酯，所述脂肪酸烷基酯用作生物柴油或用作表面活性成分制備用中間體。19.一種用于制備脂肪酸短鏈烷基酯、優(yōu)選脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括以下步驟逐步將甲醇加入到植物油、動物油、海藻油或魚油或者至少兩種這些油的混合物中，所述植物油、動物油、海藻油或魚油或者至少兩種這些油的混合物含有權利要求18的任一項所述的脂肪酶或者通過權利要求917的任一項所述的方法制備的脂肪酶，并使反應在適當條件下進行，直到所述油類甘油三酯被轉化為脂肪酸甲酯。20.如權利要求19所述的方法，其中，所述植物油為大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄欖油、棕櫚油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、廢烹調(diào)油或源自非食用植物源的任何油類甘油三酯。全文摘要本發(fā)明公開了固定于固體載體上的改性的界面酶，特別是脂肪酶和磷脂酶的制備，其中，所述酶為疏水性微環(huán)境所包圍，由此避免在親水性試劑、底物和/或反應產(chǎn)物存在下失活和/或聚集。通過與被覆酶的脂質(zhì)基團共價結合或者通過固定或埋入于疏水性固體載體中，酶可以得到保護。本發(fā)明還公開了經(jīng)疏水性保護的酶的制備方法。所述酶可以有效地應用在生物柴油的制備中。文檔編號C12N9/20GK101790582SQ200880021830公開日2010年7月28日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權日2007年5月9日發(fā)明者蘇卜希·巴舍爾申請人:轉換生物柴油有限公司