專利名稱：心臟脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞群及其在心臟再生中的用途的制作方法
專利說(shuō)明心臟脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞群及其在心臟再生中的用途 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及分離和表征源自脂肪心臟組織的新成體干細(xì)胞群及其潛在的治療應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及在細(xì)胞治療方法中使用所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞群，以再生損傷的心肌組織。

背景技術(shù)：
包括心血管病理在內(nèi)的退行性疾病(degenerative disease)目前在發(fā)達(dá)國(guó)家中的巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)影響促進(jìn)了對(duì)可改進(jìn)常規(guī)療法的細(xì)胞前體的研究。
心肌梗死的主要后果是不可逆地喪失了一部分心肌，這部分心肌被瘢痕組織所替代。這種喪失導(dǎo)致提供必要心輸出量的心肌收縮能力以及泵功能的降低，這使得繼續(xù)存在的心肌負(fù)荷過(guò)重并最終導(dǎo)致心力衰竭。1998年，僅在美國(guó)就有750萬(wàn)人在心肌梗死中存活下來(lái)。在這些幸存者中，超過(guò)30％在梗死后的第一年內(nèi)死亡。梗死后的存活主要取決于缺乏血管化(vascularization)而導(dǎo)致的死亡心肌區(qū)域的大小。在人體內(nèi)，超過(guò)左心室質(zhì)量45％的梗死引起不可逆的心源性休克(cardiogenic shock)。
這種心肌的局部喪失導(dǎo)致剩余心肌的再組織(reorganization)，并伴有凋亡導(dǎo)致的更多細(xì)胞死亡，肌肉細(xì)胞肥大和繼續(xù)存在的心肌中的纖維化。這種心肌的再組織，一般稱為“重塑(remodeling)”，很經(jīng)常地導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)作。在這種情況下，心臟不能維持適當(dāng)?shù)男妮敵隽?，從而?dǎo)致個(gè)體能力的嚴(yán)重和進(jìn)行性限制。
在急性心肌梗死之后，以及在出現(xiàn)了充血性心力衰竭的那些患者中，目前的治療不能完全恢復(fù)這些患有嚴(yán)重的難治療心室機(jī)能障礙的患者的心肌。所有當(dāng)前使用的治療心肌喪失的療法旨在保留剩余心肌的功能。
所述治療的目的是保留和改善存活的心肌細(xì)胞(心臟的可收縮細(xì)胞)的功能，并防止它們由于凋亡或壞死導(dǎo)致的死亡。大部分心肌梗死治療試圖恢復(fù)向缺血區(qū)域的血流，以防止喪失更多的可收縮細(xì)胞。這種再灌注治療包括使用血栓溶解劑(其溶解在冠狀動(dòng)脈中形成的血栓)，球囊血管成形術(shù)(通過(guò)物理方法打開關(guān)閉的動(dòng)脈)，或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)，其中通過(guò)靜脈移植將阻塞的動(dòng)脈的近端和遠(yuǎn)端橋接而越過(guò)關(guān)閉的區(qū)域。在1998年，僅在美國(guó)就進(jìn)行了超過(guò)50萬(wàn)的球囊血管成形術(shù)和類似數(shù)量的搭橋手術(shù)。這些治療通常實(shí)現(xiàn)了重建流向損傷區(qū)域的冠狀動(dòng)脈血流，并在一定時(shí)間避免了心肌的額外喪失。但是，它們都未能恢復(fù)在介入時(shí)已經(jīng)死亡的組織。如果這種喪失是大量的，則長(zhǎng)期后果是出現(xiàn)發(fā)展成晚期(terminal)心力衰竭的慢性心力衰竭。
迄今為止，使得完全恢復(fù)心臟功能的晚期心力衰竭治療的唯一選擇是心臟移植。但是，器官移植呈現(xiàn)出許多難題，例如缺乏供體、排斥移植的器官的高可能性，等等。
對(duì)于心力衰竭的特定情況，由于缺乏供體，對(duì)于最多5％的需要移植的患者而言，移植是可用的選擇。假定介入的高成本是不夠充分的限制性障礙，長(zhǎng)期免疫抑制治療的高成本和大量這些患者由此產(chǎn)生的瘤形成則是這種治療模式的其它限制。
傳統(tǒng)上認(rèn)為，心肌細(xì)胞僅在胚胎-嬰兒發(fā)育期間分裂，在心肌梗死后不可逆地喪失，從而，直至前不久，心臟生物學(xué)專家還認(rèn)為心臟沒有自身再生的潛力。鑒于最近的研究，這種觀點(diǎn)已經(jīng)從根本上被改變了。
基于來(lái)自干細(xì)胞應(yīng)用的心臟再生能力原理，細(xì)胞治療或心肌成形術(shù)(cardiomyoplasty)被認(rèn)為是治療心臟疾病的有希望的治療途徑。在最近5年，已進(jìn)行了一系列的研究，這些研究清楚地顯示了心肌再生的過(guò)程，從而證實(shí)，在成體心臟中存在具有再生潛力的駐留(resident)干細(xì)胞和/或心外干細(xì)胞。在這種背景下，對(duì)移植后心臟嵌合狀態(tài)(cardiac chimerism)的觀察是對(duì)能夠定居于(colonize)心肌組織并接受心臟命運(yùn)的細(xì)胞的存在的可靠檢驗(yàn)[Bayés-Genís A.et al.，2002，Host-cell derived cardiomyocytes inSex-mismatch cardiac allografts(性別錯(cuò)配心臟同種異體移植中的宿主細(xì)胞來(lái)源心臟細(xì)胞).Cardiovasc Res 2002；404-410]。
本領(lǐng)域研究所尋求的主要目的之一是鑒定最佳類型的干細(xì)胞，該干細(xì)胞可安全有效地用在心臟再生治療中。用于心臟再生的適合類型的干細(xì)胞必須能夠有效地?cái)U(kuò)充，從而顯示出分化完全功能的心肌細(xì)胞的能力，被整合在心肌組織并與鄰近細(xì)胞建立電化學(xué)接觸，以及最后，所述適合類型的干細(xì)胞的應(yīng)用不被免疫排斥或倫理考慮的問(wèn)題所限制。
干細(xì)胞的特征在于它們的自我維持(self-maintenance)能力和它們的可塑性，后一術(shù)語(yǔ)指它們?cè)谶m合的刺激下分化為一種或多種細(xì)胞系的能力。干細(xì)胞基本上根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)分類細(xì)胞系或細(xì)胞株、器官或組織來(lái)源；特異性表面標(biāo)志物的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子和/或蛋白的表達(dá)；以及分化能力，即可以生成的特化細(xì)胞的數(shù)量和類型。
在干細(xì)胞中，稱為胚胎干細(xì)胞的，可在胚胎發(fā)育的第一階段之一期間獲得的那些干細(xì)胞(胚細(xì)胞)和稱為成體干細(xì)胞的，來(lái)自成體體細(xì)胞組織的那些干細(xì)胞之間有明顯區(qū)別。成體干細(xì)胞是在分化的組織中發(fā)現(xiàn)的未分化的細(xì)胞，并具有增殖和分化為一種或多種細(xì)胞類型的能力。成體干細(xì)胞存在于各種成體組織中，它們?cè)诠撬琛⒅窘M織、血液、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、牙髓、胃腸上皮、肝和皮膚中的存在有廣泛的描述。自體成體干細(xì)胞由于它們性質(zhì)而是免疫相容的，并且其使用無(wú)倫理問(wèn)題。
盡管已鑒定了駐留的心臟干細(xì)胞[Beltrami，A.P.et al.Adult cardiacstem cells are multipotent and support myocardial regeneration(成體心臟干細(xì)胞是多能性的并且支持心肌再生).Cell 114，763-76(2003)；Oh，H.et al.Cardiac progenitor cells from adult myocardiumhoming，differentiation，andfusion after infarction(來(lái)自成體心肌的心臟祖細(xì)胞梗死后的歸巢、分化和融合).Proc Natl Acad Sci USA 100，12313-8(2003)]，但是損傷后組織修復(fù)是不足的，并且已研究了可選的成體非心臟干細(xì)胞群[Goldstein，G.etal.Human umbilical cord blood biology，transplantation and plasticity(人臍帶血生物學(xué)、移植和可塑性).Curr Med Chem 13，1249-59(2006)；Orlic，D.et al.Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice(移植的成體骨髓細(xì)胞修復(fù)小鼠中的心肌梗死).Ann N Y Acad Sci 938，221-9；discussion(討論)229-30(2001)；Pittenger，M.F.& Martin，B.J.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics(間充質(zhì)干細(xì)胞和它們作為心臟治療物的可能性).Circ Res 95，9-20(2004)；Rangappa，S.，F(xiàn)en，C.，Lee，E.H.，Bongso，A.& Sim，E.K.Transformation of adultmesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes(將分離自脂肪組織的成體間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞).Ann Thorac Surg75，775-9(2003)；Zvaifler，N.J.et al.Mesenchymal precursor cells in theblood of normal individuals(正常個(gè)體血液中的間充質(zhì)前體細(xì)胞).ArthritisRes 2，477-88(2000)]。
已在從小鼠到人的各種損傷后哺乳動(dòng)物心臟中測(cè)試了成體干細(xì)胞。在小鼠中，極高的期望來(lái)自骨髓來(lái)源的干細(xì)胞，盡管這種期望被顯示它們用于心臟再生的潛力有限且有爭(zhēng)議的報(bào)道[Balsam，L.B.et al.Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemicmyocardium(造血干細(xì)胞在缺血心肌中接受成熟造血命運(yùn)).Nature 428，668-73(2004)；Murry，C.E.et al.Haematopoietic stem cells do nottransdifferentiate into cardiac myocytes in myocardialinfarcts(造血干細(xì)胞不在心肌梗死中轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞).Nature 428，664-8(2004)]所降低。在人體內(nèi)，盡管在初步臨床研究中顯示了心臟功能的某些改善[Assmus，B.et al.Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement inAcute Myocardial Infarction(TOPCARE-AMI)(祖細(xì)胞的移植和急性心肌梗死中的再生增強(qiáng)(TOPCARE-AMI)).Circulation 106，3009-17(2002)；Strauer，B.E.et al.Repair of infarcted myocardium by autologousintracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans(通過(guò)自體冠狀動(dòng)脈內(nèi)單核骨髓細(xì)胞移植修復(fù)人體內(nèi)的梗死心肌).Circulation106，1913-8(2002)]，但是最近的臨床研究?jī)H顯示了提供細(xì)胞后心臟功能不大的增強(qiáng)[Dohmann，H.F.et al.Multicenter Double Blind Trial ofAutologous Bone Marrow Mononuclear Cell Transplantation throughIntracoronary Injection post Acute Myocardium Infarction a MiHeart/AMIStudy(急性心肌梗死后通過(guò)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射進(jìn)行的自體骨髓單核細(xì)胞移植的多中心雙盲試驗(yàn)，MiHeart/AMI研究).Trials 9，41(2008)]。
對(duì)于治療缺血性心臟疾病所遵循的主要手段包括基于使用成肌細(xì)胞[Herreros J et al.，2003.Autologous intramyocardial injection of culturedskeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardialinfarction(在患有非急性心肌梗死的患者內(nèi)自體心肌內(nèi)注射培養(yǎng)的骨骼肌來(lái)源的干細(xì)胞).Eur Heart J.2003Nov；24(22)2012-20；Mathur A.et al.2004.Stem cells and repair of the heart(干細(xì)胞和心臟修復(fù)).Lancet 2004Jul 10-16；364(9429)183-92]或骨髓來(lái)源的干細(xì)胞[Tomita S et al.，2002.Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in acoculture system(在共培養(yǎng)系統(tǒng)中骨髓基質(zhì)細(xì)胞與心肌細(xì)胞同步收縮).Jpn J Thorac Cardiovasc Surg.2002Aug；50(8)321-4；Fernández-Avilés F etal.，2004.Experimental and clinical regenerative capability of human bonemarrow cells after myocardial infarction(心肌梗死后人骨髓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)和臨床再生能力).Circ Res.2004 Oct 1；95(7)742-8.Epub 2004Sep 9]的那些手段。然而，仍存在一系列的關(guān)鍵性障礙，使得它們難以臨床應(yīng)用。
因此，搜尋恢復(fù)心臟功能的新類型的成體干細(xì)胞仍然是重要挑戰(zhàn)。
白色脂肪組織是人體內(nèi)最豐富的組織之一，并且位于身體不同區(qū)域。所述白色脂肪組織由兩種可容易地分離的細(xì)胞群組成，一種是成熟脂肪細(xì)胞，另一種是基質(zhì)-血管部分(stromal-vascular fraction)(SVF)。如在骨髓中的情況，基質(zhì)-血管部分是異質(zhì)性的，并且可分為兩部分，即基質(zhì)部分和由造血細(xì)胞構(gòu)成的部分?；|(zhì)部分由在培養(yǎng)時(shí)附著的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞組成。所述相對(duì)同質(zhì)的細(xì)胞群具有類似的性質(zhì)，盡管與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的不同[Zuk et al.，2001.Multilineage cells from human adiposetissueimplications for cell-based therapies(來(lái)自人脂肪組織的多細(xì)胞系細(xì)胞對(duì)基于細(xì)胞的治療的影響).Tissue Eng.2001 Apr；7(2)211-28]。所述細(xì)胞，一般指脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC)，是可容易地分離并以相對(duì)低的復(fù)制時(shí)間和老化水平培養(yǎng)數(shù)月的細(xì)胞。對(duì)于皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，后者可對(duì)每種細(xì)胞系的特異性誘導(dǎo)因子做出應(yīng)答而分化為幾種細(xì)胞類型，包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，甚至分化為心肌細(xì)胞。還公開的是，ADSC可以是用于心肌修復(fù)的自體細(xì)胞的潛在來(lái)源(WO2006/127007)。
迄今為止，就心臟功能恢復(fù)而言，臨床使用成體干細(xì)胞得到了相當(dāng)有限的結(jié)果。但是，臨床試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞治療是安全的，并且是“概念證實(shí)(proof of concept)”，即心臟有能力在干細(xì)胞治療應(yīng)用后再生。
因此，盡管最近幾年對(duì)心肌再生的了解取得了重要進(jìn)展，但是還未發(fā)現(xiàn)可安全有效地用于心臟再生療法中并由此提供修復(fù)心肌組織損傷的簡(jiǎn)單且有效的方法的成體干細(xì)胞群。目前，可從有效的梗死后治療受益的患者比例不高；因此，亟需改進(jìn)現(xiàn)有療法的有效性以及探尋可恢復(fù)心臟損傷的備選方案，尤其是對(duì)于經(jīng)受了多發(fā)性梗死的那些患者。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及心臟脂肪組織來(lái)源的新成體干細(xì)胞群，優(yōu)選來(lái)自心肌的心外膜區(qū)域，其出人意料地具有某種心肌形成素質(zhì)(cardiomyogenicpredisposition)。具體地，本發(fā)明涉及在細(xì)胞治療方法中使用所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞群，以便在病理生理狀況下促進(jìn)心臟修復(fù)。
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即這種位于圍繞心臟的脂肪(心外膜和/或心包脂肪組織)中的新成體干細(xì)胞群在體外，既在信使RNA(mRNA)水平又在蛋白水平上組成型表達(dá)一系列心臟特異性標(biāo)志物，并且具有某種接近心肌細(xì)胞系的素質(zhì)。無(wú)意被任何假設(shè)所束縛，可認(rèn)為所述素質(zhì)可能是由于它們的位置與心肌組織緊密接觸以及由于圍繞它們的環(huán)境。
本發(fā)明人觀察到，這種新細(xì)胞群與已經(jīng)描述的其它干細(xì)胞群相比具有更好的心肌形成潛力，因此這種從脂肪心臟組織分離的新成體干細(xì)胞群是基于細(xì)胞的試劑，可能在心臟組織再生和在治療喪失功能性心肌組織的狀況中有用，例如在已患有一種或多種心肌梗死的患者中或在已出現(xiàn)了充血性心力衰竭的患者中有用。
本發(fā)明人尤其表征了人心臟脂肪組織來(lái)源的心外膜區(qū)域的新成體干細(xì)胞群，所述表征是通過(guò)它們的表面標(biāo)志物情況(profile of surface marker)實(shí)現(xiàn)的，并分析了心肌細(xì)胞的不同基本組分的基因(mRNA)和蛋白表達(dá)，包括心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和Nkx2.5，稱為β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、心臟肌鈣蛋白I(cTnI)和α-輔肌動(dòng)蛋白的肌節(jié)組分，以及電化學(xué)連接和細(xì)胞內(nèi)鈣分布的調(diào)節(jié)子，分別是連接蛋白-43(Cx43)和SERCA-2。組成型地分析了所有這些標(biāo)志物的表達(dá)，即無(wú)需向培養(yǎng)基添加任何類型的用于向特定細(xì)胞系分化的誘導(dǎo)因子。
已在來(lái)自人心外膜脂肪組織(epi-ADSC)和皮下脂肪組織(sub-ADSC)樣品的基本上同質(zhì)的成體干細(xì)胞群中進(jìn)行了免疫表型概況(immunophenotypic profile)以及心臟特異性標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá)的比較研究。根據(jù)以前建立的用于皮下脂肪來(lái)源干細(xì)胞的方法進(jìn)行所述細(xì)胞群的分離和擴(kuò)充。對(duì)于表面抗原的表達(dá)，沒有觀察到兩種細(xì)胞群之間的顯著差異；但是，在用于表征基線狀況的基因表達(dá)的比較測(cè)定(實(shí)施例3)中清楚地顯示，與皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)中心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和Cx43蛋白的表達(dá)相比，所述epi-ADSC細(xì)胞群出人意料地表現(xiàn)出心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和Cx43蛋白的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加的基因(mRNA)表達(dá)水平，所述Cx43蛋白負(fù)責(zé)鄰近心肌細(xì)胞之間的電化學(xué)偶聯(lián)。
通過(guò)蛋白印跡(Western Blot)和免疫熒光(實(shí)施例4)進(jìn)行的對(duì)所述心臟特異性標(biāo)志物在蛋白水平的表達(dá)的研究使得在基因表達(dá)分析中獲得的結(jié)果完整。免疫熒光測(cè)定結(jié)果顯示了心臟脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群(epi-ADSC)中核GATA-4、β-MHC、SERCA-2、Cx43和α-輔肌動(dòng)蛋白的表達(dá)以及它們?cè)诩?xì)胞水平上的分布。蛋白印跡的結(jié)果顯示了皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)相對(duì)于epi-ADSC細(xì)胞的表達(dá)譜(expressionprofile)的比較，這證實(shí)了核蛋白GATA-4和Cx43的差異表達(dá)，以及Cx43是如何被維持或隨培養(yǎng)時(shí)間增加的。還觀察到β-肌球蛋白重鏈(β-MycHC)隨培養(yǎng)時(shí)間的差異表達(dá)。
對(duì)epi-ADSC和sub-ADSC細(xì)胞群中心肌細(xì)胞系特異性基因表達(dá)的比較研究的結(jié)果證實(shí)，心外膜脂肪來(lái)源的干細(xì)胞群(epi-ADSC)比來(lái)自相同個(gè)體的皮下脂肪來(lái)源的干細(xì)胞群更定型于心臟細(xì)胞系。
基于對(duì)最初表達(dá)和體外分化實(shí)驗(yàn)的分析，本發(fā)明人以所述人心臟脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞(心臟ADSC)群進(jìn)行的其它研究證實(shí)，所述心臟ADSC具有固有的心臟類型表型，并且不能分化為脂肪細(xì)胞，盡管它們?cè)谂囵B(yǎng)中分化為內(nèi)皮細(xì)胞系。所述心臟ADSC分泌促血管生成因子(proangiogenic factor)，并且在大鼠心肌梗死模型中，當(dāng)將這些細(xì)胞移植進(jìn)損傷的心肌中時(shí)，所注射的細(xì)胞表達(dá)心臟和內(nèi)皮蛋白，增加血管化，降低梗死的大小，并由此在體內(nèi)改善心臟功能(實(shí)施例6和7)；因此，所述心臟ADSC可認(rèn)為是心肌細(xì)胞治療的有效候選者。
因此，一方面，本發(fā)明涉及源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的新成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。在具體實(shí)施方案中，所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的成體干細(xì)胞，在其體外擴(kuò)充中，以組成型和穩(wěn)定的方式表達(dá)GATA-4和/或Cx43。
另一方面，本發(fā)明涉及所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。
另一方面，本發(fā)明涉及獲得包含源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的組合物的方法，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。根據(jù)所述方法獲得的組合物是本發(fā)明另外的方面。
另一方面，本發(fā)明涉及從所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞獲得分化的細(xì)胞的方法，其包括在適合的特異性分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞。根據(jù)所述方法獲得的分化的細(xì)胞是本發(fā)明另外的方面。
另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，或包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，以及藥物可接受的媒介物(vehicle)。
另一方面，本發(fā)明涉及生物材料，其包含所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，所述包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或所述藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，或所述包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，在制備用于心臟組織再生的藥物組合物中，或在制備用于治療缺血性心臟疾病的藥物組合物中，或在制備用于心肌梗死后治療或用于治療充血性心力衰竭的藥物組合物中，或在制備刺激血管生成的藥物組合物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，或所述包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，以用于心臟組織再生，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療或用于治療充血性心力衰竭，或用于刺激血管生成。
另一方面，本發(fā)明涉及用于心臟組織再生，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療，或用于治療充血性心力衰竭，或用于刺激血管生成的方法，其包括向有需要的個(gè)體給藥治療有效量的源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，或所述包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或所述藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物，或所述包含所述分化的細(xì)胞的組合物，所述分化的細(xì)胞獲得自所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及在體外評(píng)價(jià)對(duì)生物學(xué)或藥理學(xué)試劑的細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括使所述試劑與源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，或所述包含所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的干細(xì)胞的組合物接觸，所述細(xì)胞任選地分化為特定的細(xì)胞類型，以及評(píng)價(jià)所述試劑對(duì)培養(yǎng)中的所述細(xì)胞群的影響。
另一方面，本發(fā)明涉及獲得生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的方法，其包括在適合于表達(dá)和產(chǎn)生所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的條件下，培養(yǎng)所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或所述從所述干細(xì)胞分化的細(xì)胞，以及，如果需要，分離所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子。
附圖簡(jiǎn)述

圖1(A)顯示了提取的心外膜脂肪和皮下脂肪提取部分的照片；圖1(B)顯示了顯微鏡圖像，其中可觀察到人心外膜脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞(epi-ADSC)的形態(tài)；圖1(C)顯示了顯微鏡圖像，其中可觀察到人皮下脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞(sub-ADSC)的形態(tài)。
圖2顯示了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)行的對(duì)人心外膜脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì)胞(epi-ADSC)的免疫表型表征。顯示了對(duì)應(yīng)于研究中的4名患者(P1-P4)的直方圖[圖2A epi-ADSC P1，圖2B epi-ADSC P2，圖2Cepi-ADSC P3，圖2D epi-ADSC P4]。該直方圖在y軸顯示所研究的標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度，在x軸顯示細(xì)胞的數(shù)量。每一直方圖都顯示對(duì)照標(biāo)志物(黑)和所研究的標(biāo)志物(灰)重疊的表達(dá)圖。所研究的標(biāo)志物相對(duì)于對(duì)照在x軸上的測(cè)向位移程度顯示細(xì)胞樣品對(duì)于所考慮的標(biāo)志物的陽(yáng)性程度。
圖3顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行的對(duì)成體干細(xì)胞群epi-ADSC和sub-ADSC之間心臟特異性標(biāo)志物的組成型基因表達(dá)的比較分析。觀察到轉(zhuǎn)錄因子GATA4的差異表達(dá)(第2代和第5代時(shí))(圖3A、3B和3C)；在第5代時(shí)，相對(duì)于sub-ADSC干細(xì)胞，還觀察到epi-ADSC干細(xì)胞中增加的Cx43轉(zhuǎn)錄物水平(其表達(dá)可能由GATA4誘導(dǎo))(圖3B和3C)。對(duì)于剩余的所分析的心臟基因(α-輔肌動(dòng)蛋白、β-MHC、心臟肌鈣蛋白I、SERCA-2和Nkx2.5)，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)期間，對(duì)于它們的表達(dá)，未觀察到明顯的差異。
圖4顯示了通過(guò)蛋白印跡進(jìn)行的對(duì)epi-ADSC(E)和sub-ADSC(S)成體干細(xì)胞群之間心臟特異性標(biāo)志物表達(dá)的比較分析。圖4A顯示了總提取物中的比較分析。圖4B顯示了在細(xì)胞質(zhì)(C)和細(xì)胞核(N)部分中進(jìn)行的比較分析。既在第2代(p2)又在第5代(p5)，可觀察到epi-ADSC干細(xì)胞相對(duì)于sub-ADSC干細(xì)胞增加的Cx43和GATA-4蛋白表達(dá)水平。在第5代時(shí)，還在epi-ADSC干細(xì)胞中觀察到β-MHC的差異表達(dá)。
圖5通過(guò)免疫熒光顯示了epi-ADSC成體干細(xì)胞群中心臟特異性標(biāo)志物的表達(dá)。顯微照片顯示通過(guò)特異性抗體對(duì)心臟蛋白表達(dá)的檢測(cè)GATA-4、β-MHC(βMHC)、α-輔肌動(dòng)蛋白、SERCA-2和連接蛋白-43(Cx43)?？捎^察到，GATA-4主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞核中；β-MHC在結(jié)構(gòu)上被很好地組織從而形成肌原纖維；以及α-輔肌動(dòng)蛋白、SERCA-2和Cx43彌散分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。
圖6顯示了心臟ADSC的分離和表征。圖6a顯示了開心(open-heart)手術(shù)期間人心臟的圖；觀察到夾住取在鄰近近端右冠狀動(dòng)脈的心臟脂肪組織的活組織檢查的手術(shù)鉗(clamp)。(AO，主動(dòng)脈；LV，左心室)。圖6b顯示了融合之前心臟ADSC的原代培養(yǎng)物(20x放大)。圖6c是顯示心臟ADSC流式細(xì)胞免疫表型(immunophenotyping)分析結(jié)果的條形圖。
圖7顯示了在脂肪形成分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，通過(guò)心臟ADSC(圖7a)和皮下ADSC(圖7b)的茜素紅S染色進(jìn)行的脂肪形成分化分析。圖7c是顯示對(duì)于測(cè)定的不同細(xì)胞群(心臟ADSC和皮下ADSC)，3和4周處理后，脂肪細(xì)胞類型陽(yáng)性細(xì)胞百分比的條形圖。
圖8是顯示與皮下ADSC相比，心臟ADSC中心肌形成基因的實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果的條形圖。值表明一種細(xì)胞類型相對(duì)于來(lái)自相同患者的其它細(xì)胞類型表達(dá)的倍數(shù)(本例中，心臟ADSC與皮下ADSC比較)。與皮下ADSC相比，在心臟ADSC中觀察到GATA4和Cx43轉(zhuǎn)錄物統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(GATA4，p＜0.001；Cx43，p＝0.031)。
圖9顯示了經(jīng)蛋白印跡和免疫細(xì)胞熒光測(cè)定的心臟ADSC中心臟標(biāo)志物的基礎(chǔ)表達(dá)。圖9a顯示了心臟和皮下(Sub)ADSC裂解物的蛋白印跡分析結(jié)果；將成體人心臟蛋白的提取物用作對(duì)照。圖9b至9d分別顯示了β-MHC、SERCA2和肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白在心臟ADSC中的表達(dá)(紅)。圖9e顯示了GATA4(綠)和Cx43(紅)在心臟ADSC中的表達(dá)。圖9c和9d的圖版(panel)中的細(xì)胞核以Hoescht 33342染色(藍(lán))。比例尺為50μm。
圖10顯示了心臟ADSC與新生心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)。心臟eGFP+-ADSC(綠a、e、i、l和p)；cTnI(紅b、f和j)；β-MHC(藍(lán)c)；采用DAPI的細(xì)胞核復(fù)染(counterstaining)(青d)(藍(lán)g、h’和s)。(h’、k’和o’)分別是在h、k和o中的點(diǎn)線的xz模式中所觀察的。這些圖像用共焦顯微鏡拍攝，并顯示了心臟標(biāo)志物在心臟ADSC中的共定位(co-location)。Cx43(紅m)，肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(青n)，SERCA2(紅q)和GATA4(青r)。(d、h、h’、k、k’、o、o’和s)是融合圖像。比例尺為50μm(a至d和p至s)，25μm(e至h和l至o)以及10μm(i至k)。
圖11顯示了培養(yǎng)中心臟ADSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞。圖11a是條形圖，該條形圖顯示，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR確定的，與未處理對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)EGM-2處理的細(xì)胞的促血管生成標(biāo)志物的表達(dá)倍數(shù)。圖11b顯示了分化處理后，DiI-Ac-LDL對(duì)心臟ADSC的摻入(incorporation)。圖11c至11e顯示了用基質(zhì)膠涂層(Matrigel coating)培養(yǎng)心臟ADSC 2、4和7小時(shí)后小管的形成(10x放大)。圖11f和11g顯示了在具有基質(zhì)膠的涂層中形成的小管的GSLI同工凝集素B4染色。比例尺為50μm。
圖12顯示了不同的超聲波心動(dòng)描記(echocardiographic)功能參數(shù)值縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening)(FS)[圖12a]；射血分?jǐn)?shù)(EF)[圖12b]；以及前壁厚度(AWT)[圖12c]。
圖13顯示了大鼠心臟形態(tài)測(cè)量分析的結(jié)果。圖13a和13b顯示了手術(shù)后30天，穿過(guò)梗死心肌的大鼠心臟橫切片的Masson三色染色(Masson’strichrome staining)結(jié)果(e，對(duì)照；f，處理的)。圖13c和13d顯示了對(duì)照組和經(jīng)細(xì)胞處理組中，大鼠LV梗死大小百分比和LV壁厚度。
圖14顯示了將人心臟ADSC植入患有梗死的大鼠心臟的結(jié)果，其中可觀察到體內(nèi)心臟和內(nèi)皮分化。圖14a顯示了注射在心肌中的綠色心臟eGFP+-ADSC，并且顯示了對(duì)人核抗原(HNA，紅)的免疫染色結(jié)果以證實(shí)所注射的心臟eGFP+-ADSC來(lái)源于人。圖14b至14d顯示了在注射了心臟ADSC的心臟切片中的針對(duì)cTnI(b)、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(c)和CD31(d)的免疫染色結(jié)果(都為紅色)。重要的是，觀察到細(xì)胞分布在整個(gè)缺血組織中，盡管只是注射在邊界區(qū)域中。比例尺為50μm。
圖15顯示了eGFP+(ROI1)細(xì)胞和背景(ROI2)細(xì)胞的發(fā)射光譜的測(cè)量結(jié)果。
圖16顯示了梗死的心肌中毛細(xì)血管密度分析的結(jié)果，特別是以GSLI同工凝集素B4染色的，對(duì)照心肌(圖16a)和經(jīng)心臟ADSC處理的心肌(圖16b)的邊界區(qū)域內(nèi)的毛細(xì)血管。圖16c是顯示對(duì)照組和經(jīng)心臟ADSC處理的組中，梗死邊界和遠(yuǎn)端區(qū)域中每mm2的毛細(xì)血管數(shù)的條形圖。未在遠(yuǎn)端區(qū)域中觀察到明顯的差異。比例尺為50μm。
發(fā)明詳述 本發(fā)明主要涉及心臟脂肪組織來(lái)源的，存在于心外膜和/或心包區(qū)域的，基本上同質(zhì)的成體干細(xì)胞群。本發(fā)明人觀察到，所述細(xì)胞群具有某種心臟細(xì)胞系的素質(zhì)，并且與不同來(lái)源的其它干細(xì)胞相比具有更大的心肌形成潛力。因此，所述細(xì)胞群潛在地用于心臟組織再生中。具體地，本發(fā)明涉及所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞群在細(xì)胞治療方法中的用途，其在病理生理狀況下有助于心臟修復(fù)。所述細(xì)胞群可用在藥物組合物的制備中，或用在用于喪失心肌收縮能力的那些狀況中的心肌再生的生物材料中，例如用在患有心肌梗死和/或出現(xiàn)了充血性心力衰竭的患者的治療中。
定義 為了幫助理解本說(shuō)明書，以下將解釋用在本發(fā)明上下文中的一些術(shù)語(yǔ)和詞句的含義。其它的定義在必要時(shí)與說(shuō)明書一起被包括進(jìn)來(lái)。
術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括非靈長(zhǎng)類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠或小鼠)和靈長(zhǎng)類(例如，猴、人)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，個(gè)體是人。
術(shù)語(yǔ)“成體干細(xì)胞”指存在于分化的組織中，并具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞。成體干細(xì)胞是在分化的組織中發(fā)現(xiàn)的未分化的細(xì)胞，并且具有增殖和分化為一種或多種細(xì)胞類型的能力。成體干細(xì)胞存在于不同的成體組織中，它們的存在在骨髓、脂肪組織、血液、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、牙髓、胃腸上皮、肝和皮膚中有廣泛的描述。
術(shù)語(yǔ)“脂肪組織(adipose tissue)”或“脂肪組織(fatty tissue)”在本說(shuō)明書中不加區(qū)分地使用，并指通過(guò)在它們細(xì)胞質(zhì)中積累脂質(zhì)的細(xì)胞(脂肪細(xì)胞)的聯(lián)合而形成的間充質(zhì)組織。一方面，脂肪組織行使機(jī)械功能，該機(jī)械功能包括用作緩沖(buffer)，保護(hù)內(nèi)部器官以及身體的其它較外部的結(jié)構(gòu)并將它們保持在合適位置，另一方面，脂肪組織也行使代謝功能。在哺乳動(dòng)物中可辨別兩種類型的脂肪組織褐色脂肪組織或褐色脂肪和白色脂肪組織。在代謝術(shù)語(yǔ)中以及就細(xì)胞組成而言，這些組織被認(rèn)為是不同的組織。在6個(gè)月以內(nèi)的新生兒和嬰兒中，作為暴露于冷環(huán)境期間的補(bǔ)償機(jī)制，褐色脂肪與生熱作用有關(guān)；而在成人中，所述生熱作用被甲狀腺活性所介導(dǎo)(mediate)。最近發(fā)表的文章中將新生兒褐色脂肪鑒定為心肌細(xì)胞的祖(干)細(xì)胞的來(lái)源，并且鑒定了新生兒褐色脂肪在再生心臟治療中的潛在用途(Yamada et al.，2006.Cardiac progenitor cells in brownadipose tissue repaired damaged myocardium(褐色脂肪組織中的心臟祖細(xì)胞修復(fù)損傷的心肌).Biochem Biophys Res Commun.2006 Apr 7；342(2)662-70.Epub 2006 Feb 10)。在白色脂肪組織上進(jìn)行的一系列研究顯示，白色脂肪組織直接或間接地與有機(jī)體的所有主要功能有關(guān)。白色脂肪組織是非常異質(zhì)的組織，由彼此相互作用的許多細(xì)胞群組成。就此而言，有必要考慮細(xì)胞取決于它們的位置的生物學(xué)和可塑性的差異。對(duì)雄性和雌性肥胖癥的比較顯示，取決于脂肪組織的位置，脂肪組織的發(fā)育對(duì)有機(jī)體有不同的影響。細(xì)胞的分化潛力也取決于其位置。在對(duì)取決于沉積來(lái)源的脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞群的分化潛力之間的比較研究中證實(shí)，對(duì)于小鼠，具有最大分化能力的脂肪組織是皮下脂肪組織(Prnet-Marcassus et al.，2006.From heterogeneity to plasticity in adiposetissuessite-specific differences(脂肪組織中從異質(zhì)性到可塑性位點(diǎn)特異性差異).Exp Cell Res.2006Apr 1；312(6)727-36.Epub 2005Dec 28)。
術(shù)語(yǔ)“脂肪心臟組織”指心臟脂肪組織，由于其解剖學(xué)位置，可分為心外膜脂肪組織(覆蓋心肌)或心包脂肪組織(在心包區(qū)域，即鄰近心臟)。已知脂肪組織為高度復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，其生成具有局部和全身作用的分子。盡管它們?cè)诙ㄐ孕再|(zhì)上類似，但是目前已知不同類型的脂肪組織，尤其是皮下和內(nèi)臟脂肪組織沉積，具有某些蛋白的差異表達(dá)譜，這提示了在產(chǎn)生活性生物分子方面的差異特征(Dusserre E.et al.；2000.Differences in mRNA expression of the proteins secreted by the adipocytes inhuman subcutaneous and visceral adipose tissues(人皮下和內(nèi)臟脂肪組織中脂肪細(xì)胞分泌的蛋白的mRNA表達(dá)差異).Biochim Biophys Acta.2000 Jan3；1500(1)88-96)。
術(shù)語(yǔ)“組成型表達(dá)”或“基礎(chǔ)表達(dá)”指基因在缺乏誘導(dǎo)其表達(dá)的因子的情況下的表達(dá)。組成型表達(dá)基因被認(rèn)為是持續(xù)轉(zhuǎn)錄的那些基因。
當(dāng)術(shù)語(yǔ)“分離的”指細(xì)胞群時(shí)，其指從包括人在內(nèi)的動(dòng)物的器官或組織分離的細(xì)胞群，其基本上不含通常在體外或體內(nèi)與所述細(xì)胞群相關(guān)聯(lián)的其它細(xì)胞群。通常，在下述情況下獲得了“基本上不含”其它細(xì)胞群的細(xì)胞群其與至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，仍然更優(yōu)選至少90％，以及，仍然甚至更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或甚至99％的通常在體外或體內(nèi)與所述細(xì)胞群相關(guān)聯(lián)的其它細(xì)胞群分離。
術(shù)語(yǔ)“缺血性心臟疾病”指冠狀動(dòng)脈不能將必要的氧氣輸送至心肌的決定區(qū)(determined territory)，使得所述心肌難以工作而導(dǎo)致的疾病。冠狀動(dòng)脈改變的最常見原因是動(dòng)脈硬化或動(dòng)脈粥樣硬化。這兩種情況使得血液難以到達(dá)心臟細(xì)胞，而心臟細(xì)胞對(duì)血液供給的減少非常敏感。當(dāng)?shù)竭_(dá)心臟的氧的量不足時(shí)，出現(xiàn)冠心病或缺血性心臟疾病。其主要后果是心肌梗死、心絞痛、冠狀動(dòng)脈功能不全(coronary insufficiency)、心肌缺血和猝死。
術(shù)語(yǔ)“心力衰竭”、“充血性心力衰竭”或“CHF”指慢性疾病，其中心臟不能泵送足夠的含氧血來(lái)滿足身體其它器官的需要。結(jié)果是，有機(jī)體的生命器官不能接收到足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物，并且有機(jī)體的廢物清除更緩慢。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，生命系統(tǒng)會(huì)停止工作。心力衰竭通常是潛在的心臟問(wèn)題的癥狀。
術(shù)語(yǔ)“心肌梗死”或“急性心肌梗死”或“AMI”指由于一條或幾條冠狀動(dòng)脈或它們的分枝堵塞而導(dǎo)致的心肌的部分的缺血性壞死。心肌梗死的特征是功能性心肌細(xì)胞的喪失、心肌組織不可逆的損傷。當(dāng)存在晚期冠心病(coronary disease)時(shí)，心肌(myocardium)或心肌(heart muscle)遭受梗死，在具體病例中，當(dāng)位于冠狀動(dòng)脈內(nèi)的粥樣斑塊(atheromatousplaque)潰爛或破裂時(shí)，發(fā)生這種情況，從而導(dǎo)致該血管的急性堵塞。
術(shù)語(yǔ)“心臟再生”、“心臟組織再生”或“心肌再生”指通過(guò)植入能夠增殖并分化為心肌細(xì)胞，再生損傷的心肌組織和心臟功能的干細(xì)胞來(lái)修復(fù)心臟組織細(xì)胞塊(cell mass)的喪失。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、“治療(treatment)”和“治療(treating)”指改善、治愈或補(bǔ)救病理生理狀況，其產(chǎn)生于向需要所述治療的個(gè)體給藥本發(fā)明所提供的藥物組合物，其包含所述源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞群。
本發(fā)明的干細(xì)胞 本發(fā)明基于對(duì)心臟脂肪組織來(lái)源的新成體干細(xì)胞群的鑒定，該成體干細(xì)胞具有某種心肌形成素質(zhì)，因此它們可用在細(xì)胞治療方法中，尤其是用在為了在喪失了功能性心臟組織的病理生理狀況下促進(jìn)修復(fù)和/或再生心肌組織的細(xì)胞治療方法中。
因此，一方面，本發(fā)明涉及源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或連接蛋白43(Cx43)，即下文中的本發(fā)明的干細(xì)胞。
本發(fā)明的干細(xì)胞，其在本說(shuō)明書中有時(shí)也稱為“心臟ADSC”，來(lái)自心臟脂肪組織來(lái)源，例如，心外膜或心包脂肪組織，例如所述哺乳動(dòng)物心臟脂肪組織的基質(zhì)部分，該哺乳動(dòng)物例如嚙齒類，靈長(zhǎng)類等，優(yōu)選人。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞是從人心外膜脂肪組織獲得的。
本發(fā)明的干細(xì)胞可以是自體、同種異體或異種的細(xì)胞。在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自體的，并且分離自個(gè)體的心臟脂肪組織，其中要向該個(gè)體給藥所述細(xì)胞。
本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，除了它們的來(lái)源以外，還組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和Cx43。
GATA-4是鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子成員。該家族的成員識(shí)別存在于幾個(gè)基因的啟動(dòng)子中的GATA基序。所述蛋白被認(rèn)為參與了調(diào)節(jié)與胚胎發(fā)生以及心臟的分化和功能有關(guān)的基因。編碼所述GATA-4蛋白的基因的突變與心臟隔膜中的缺陷相關(guān)。
連接蛋白43(Cx43)，也稱為GJA1(間隙連接蛋白)，是連接蛋白家族的成員。所述蛋白是細(xì)胞間的間隙連接的組分，該間隙連接由一組細(xì)胞間通道構(gòu)成，為低分子量物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞到另一細(xì)胞的擴(kuò)散提供途徑。Cx43蛋白是心臟的間隙連接的主要蛋白之一，并且被認(rèn)為在心臟收縮的同步以及胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
如之前所討論的，骨骼肌被認(rèn)為是獲得用于心肌再生的細(xì)胞的潛在來(lái)源；但是，骨骼肌不表達(dá)Cx43蛋白，并且存在于心肌細(xì)胞之間的間隙連接未形成。因此，所得的肌管與鄰近的心肌之間的收縮是不同步的。電偶聯(lián)的缺乏可能解釋了一些臨床系列中惡性心律失常的發(fā)作(HerrerosJ et al.，2003.Autologous intramyocardial injection of cultured skeletalmuscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction(在患有非急性心肌梗死患者內(nèi)自體心肌內(nèi)注射培養(yǎng)的骨骼肌來(lái)源的干細(xì)胞).Eur Heart J.2003Nov；24(22)2012-20)。
在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的干細(xì)胞中GATA-4和/或Cx43的組成型表達(dá)在該干細(xì)胞的體外擴(kuò)充期間保持穩(wěn)定。
如本文所用的，細(xì)胞“在其體外擴(kuò)充期間”“穩(wěn)定”地表達(dá)基因或蛋白指細(xì)胞在體外至少兩次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)中，基因或其表達(dá)產(chǎn)物(蛋白)的表達(dá)基本上維持在相同水平；即，對(duì)于細(xì)胞的體外擴(kuò)充，在體外，將該細(xì)胞于合適條件(培養(yǎng)基、溫度、空氣、稀釋度、培養(yǎng)基更換等)下進(jìn)行培養(yǎng)，例如，如實(shí)施例1中所述，在補(bǔ)充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃下，在含5％CO2的空氣中進(jìn)行培養(yǎng)，直至融合前(pre-confluence)，每3天或4天更換培養(yǎng)基。。
本發(fā)明的干細(xì)胞可以是自體、同種異體或異種的細(xì)胞。在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自體的，并且分離自個(gè)體的心臟脂肪組織，其中要向該個(gè)體給藥所述細(xì)胞。
在具體實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的干細(xì)胞組成型表達(dá)β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)，該β-肌球蛋白重鏈不組成型地存在于其它已經(jīng)描述的干細(xì)胞群以及皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)中，該皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞獲得自從與源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞(本發(fā)明的干細(xì)胞)相同的個(gè)體。已知這種蛋白在心肌的收縮中起重要作用，原因是該蛋白形成了肌節(jié)(心肌細(xì)胞的收縮結(jié)構(gòu)(apparatus))的一部分。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞在其體外培養(yǎng)期間始終組成型表達(dá)SERCA-2蛋白。這種肌漿蛋白(SERCA-2)是Ca2+-ATP酶泵，并且負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的細(xì)胞內(nèi)分布。這種功能對(duì)于心肌的正確收縮也是基本的。
而且，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征還在于表達(dá)或不表達(dá)一系列的表面標(biāo)志物，例如CD14、CD29、CD34、CD44、CD59、CD90、CD105、CD106和CD117，以及任選的標(biāo)志物CD45、CD133、CD166和VEGFR2。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其還表達(dá)一種或多種選自CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的表面標(biāo)志物；即本發(fā)明的干細(xì)胞對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選全部下述表面標(biāo)志物是陽(yáng)性的CD29、CD44、CD59、CD90和CD105。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其還表達(dá)表面標(biāo)志物CD166。因此，在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其還表達(dá)一種或多種選自CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166的表面標(biāo)志物；即本發(fā)明的干細(xì)胞對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種、五種或優(yōu)選全部下述表面標(biāo)志物是陽(yáng)性的CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其不表達(dá)選自CD14、CD34、CD106、CD117的表面標(biāo)志物及其組合；即本發(fā)明的干細(xì)胞對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種或優(yōu)選全部下述表面標(biāo)志物是陰性的CD14、CD34、CD106和CD117。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其不表達(dá)(或非常微弱地表達(dá))表面標(biāo)志物VEGFR2。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選全部下述表面標(biāo)志物是陰性的CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，除了其來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，以及(ii)其不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106和CD117。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，除了其來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，以及(ii)其不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，除了其來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)其表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)其不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的成體干細(xì)胞是源自哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物優(yōu)選人，所述成體干細(xì)胞 a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43； b)組成型表達(dá)β-MHC； c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及 d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106和CD117。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的成體干細(xì)胞是源自哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物優(yōu)選人，所述成體干細(xì)胞 a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43； b)組成型表達(dá)β-MHC； c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166；以及 d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的成體干細(xì)胞是源自哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物優(yōu)選人，所述成體干細(xì)胞 a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43； b)組成型表達(dá)β-MHC； c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166；以及 d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的干細(xì)胞中GATA-4和/或Cx43的組成型表達(dá)在該干細(xì)胞的體外擴(kuò)充期間保持穩(wěn)定。
感興趣的基因和蛋白(例如GATA-4、Cx43、α-MHC、β-輔肌動(dòng)蛋白等)的表達(dá)可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法在核酸水平(例如mRNA水平)或在蛋白水平上確定。
在具體實(shí)施方案中，給定的基因的表達(dá)可通過(guò)在不向培養(yǎng)基添加任何能夠誘導(dǎo)分化成特定細(xì)胞系的組分情況下，即在組成型表達(dá)條件下，分析該基因的基因表達(dá)來(lái)確定。作為非限定性示例，所述基因在細(xì)胞中的表達(dá)可通過(guò)常規(guī)技術(shù)如實(shí)時(shí)RT-PCR、RNA印跡(Northern blot)或DNA微陣列來(lái)分析。實(shí)時(shí)RT-PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變體，其允許在擴(kuò)增基因時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行定量檢測(cè)。實(shí)施例3和6中采用實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)確定感興趣的心臟特異性蛋白的基因表達(dá)水平(mRNA)。通過(guò)將所有的mRNA從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜，RNA印跡技術(shù)允許鑒定、定位和定量mRNA序列。通過(guò)與合適探針雜交來(lái)檢測(cè)特定mRNA的存在。DNA微陣列技術(shù)基于使用與一系列DNA片段結(jié)合的固體表面。用于固定DNA的表面有相當(dāng)多的種類(例如，玻璃、塑料和甚至硅片)；這種技術(shù)允許確定多個(gè)基因的表達(dá)，并且可以同時(shí)監(jiān)測(cè)大量基因的表達(dá)水平。
或者，可通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)如ELISA、蛋白印跡或免疫熒光來(lái)分析蛋白的表達(dá)。蛋白印跡技術(shù)基于對(duì)預(yù)先通過(guò)電泳分離并固定在通常是硝酸纖維素膜的膜上的蛋白的檢測(cè)，并且通過(guò)與特異性抗體和諸如化學(xué)發(fā)光的顯影系統(tǒng)(developing system)一起孵育來(lái)進(jìn)行。通過(guò)免疫熒光的分析涉及使用對(duì)感興趣的蛋白特異性的抗體來(lái)分析該蛋白的表達(dá)，以及通過(guò)顯微術(shù)進(jìn)行的亞細(xì)胞定位。通常，預(yù)先將所研究的細(xì)胞以低聚甲醛固定，并用非離子除垢劑通透化(permeabilized)。實(shí)施例4和6中采用了蛋白印跡和免疫熒光技術(shù)。ELISA技術(shù)基于使用以酶標(biāo)記的抗原或抗體，從而所得的偶聯(lián)物(conjugate)既具有免疫活性又具有酶活性。由于組分之一被標(biāo)記并且在支持物上不溶解，所以抗原-抗體反應(yīng)是固定的，因而可通過(guò)添加特異性底物來(lái)容易地顯影，其產(chǎn)生可通過(guò)例如分光光度測(cè)定法定量的反應(yīng)。這種技術(shù)不能做到確切的亞細(xì)胞定位，也不能確定所研究蛋白的分子量，但是其確實(shí)允許非常特異和高度靈敏地檢測(cè)，例如在臨床上感興趣的生物液體(血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹水等)中的感興趣的蛋白。
本發(fā)明的干細(xì)胞的表型標(biāo)志物也可通過(guò)通?；陉?yáng)性/陰性選擇的任何適合技術(shù)來(lái)鑒定。在具體實(shí)施方案中，可使用抗所述表型標(biāo)志物的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，所述表型標(biāo)志物必須被證實(shí)是否存在于本發(fā)明的干細(xì)胞中，以便通過(guò)它們的免疫細(xì)胞化學(xué)概況(immunocytochemicalprofile)來(lái)另外表征本發(fā)明的干細(xì)胞，盡管也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它常規(guī)技術(shù)。因此，在具體實(shí)施方案中，使用抗至少細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的單克隆抗體，來(lái)證實(shí)所述標(biāo)志物存在于所選的細(xì)胞中，或至少一種所述標(biāo)志物并優(yōu)選全部所述標(biāo)志物的可檢測(cè)的表達(dá)水平；并且使用抗至少CD14、CD34、CD106和CD117的單克隆抗體，來(lái)證實(shí)它們的不存在。在另一具體實(shí)施方案中，使用抗至少細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166的單克隆抗體，來(lái)證實(shí)所述標(biāo)志物存在于所選的細(xì)胞中，或至少一種所述標(biāo)志物并優(yōu)選全部所述標(biāo)志物的可檢測(cè)的表達(dá)；并且使用抗至少CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2的單克隆抗體，來(lái)證實(shí)它們的不存在。同樣地，在另一具體實(shí)施方案中，使用抗至少CD14、CD29、CD34、CD44、CD59、CD90、CD105、CD106、CD117、CD166和VEGFR2的單克隆抗體，來(lái)證實(shí)所述標(biāo)志物是否存在于所選的細(xì)胞中，或至少一種所述標(biāo)志物并優(yōu)選全部所述標(biāo)志物的可檢測(cè)的表達(dá)。
所述單克隆抗體是已知的，或者任何本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)方法可獲得所述單克隆抗體。作為非限定性示例，實(shí)施例2和6中描述了進(jìn)行本發(fā)明提供的干細(xì)胞群的免疫表型表征的方式。
如果需要，本發(fā)明的干細(xì)胞可通過(guò)任何常規(guī)方法進(jìn)行遺傳修飾，作為非限定性示例，該常規(guī)方法包括轉(zhuǎn)基因方法，本發(fā)明的干細(xì)胞的基因組中的缺失或插入，這改變了對(duì)其基本性質(zhì)(增殖、遷移、轉(zhuǎn)分化等)重要的基因的表達(dá)。因此，例如已知離體擴(kuò)充或移植進(jìn)損傷的組織內(nèi)的成體干細(xì)胞，由于它們的端粒縮短而迅速老化。為了防止這種以及其它現(xiàn)象，期望利用例如，含有基因構(gòu)建體(construct)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該構(gòu)建體的表達(dá)抵消這種和其它不期望的變化的影響。
本發(fā)明的干細(xì)胞能夠增殖并自我更新，因此它們可在被分離和表征后在體外(離體)進(jìn)行擴(kuò)充。因而，一旦分離了本發(fā)明的干細(xì)胞，它們就可在適合的培養(yǎng)基中體外維持并增殖。作為非限定性示例，所述培養(yǎng)基包含α-MEM培養(yǎng)基(eagle-α改良最小必需培養(yǎng)基(Minimum EssentialMedium eagle-alpha modification)(Sigma Ref.M4526).Eagle，H.Media foranimal cell culture(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基).Tissue Culture AssociationManual(組織培養(yǎng)協(xié)會(huì)手冊(cè)).3.517-520.1976)、抗生素和谷氨酰胺，并且所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了胎牛血清(fetal bovine serum)(FBS)。改變或調(diào)節(jié)所用的細(xì)胞需要的培養(yǎng)基濃度和/或培養(yǎng)基添加物取決于每位本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)。血清通常含有細(xì)胞存活和擴(kuò)充所必需的細(xì)胞組分和因子。這類血清的說(shuō)明性、非限定性實(shí)例包括FBS、牛血清(bovine serum)(BS)、小牛血清(calfserum)(CS)、胎牛血清(fetal calfserum)(FCS)、新生小牛血清(neonatal calf serum)(NCS)、山羊血清(GS)、馬血清(HS)、豬血清、綿羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)等。如果本發(fā)明的干細(xì)胞是人源的，則還考慮向細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充人血清，優(yōu)選自體血清。應(yīng)當(dāng)理解，如果認(rèn)為有必要讓添加物的級(jí)聯(lián)組分失活，則可通過(guò)加熱來(lái)滅活血清。也可采用調(diào)節(jié)血清濃度、從培養(yǎng)基除去血清來(lái)促進(jìn)一種或多種期望的細(xì)胞類型的存活。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞可在具有確定組成的培養(yǎng)基中擴(kuò)充，其中血清由血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和重組蛋白的組合替換，該重組蛋白包括但不限于胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
很多細(xì)胞培養(yǎng)基已經(jīng)含有氨基酸；然而，仍然需要在培養(yǎng)細(xì)胞之前補(bǔ)充某些氨基酸。所述氨基酸的說(shuō)明性、非限定性實(shí)例包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等。通常也在細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗微生物劑，以減少可能的細(xì)菌、支原體和/或真菌污染。所用的抗生素或抗真菌化合物通常是青霉素和鏈霉素的混合物，盡管也可包括其它的抗生素或抗真菌化合物，例如兩性霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、博來(lái)霉素、潮霉素、卡那霉素、絲裂霉素等。也可向細(xì)胞培養(yǎng)中添加激素，該激素包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、b-雌二醇、氫化可的松、胰島素、催乳素、孕酮、生長(zhǎng)抑素/人生長(zhǎng)激素(HGH)等。
本發(fā)明的干細(xì)胞的維持可要求加入細(xì)胞因子，以使得細(xì)胞保持在未分化形式。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，必須在開始讓本發(fā)明的干細(xì)胞分化為分化的細(xì)胞之前，將所述抑制細(xì)胞分化的因子從培養(yǎng)基移除。還顯而易見的是，不是所有的細(xì)胞都需要這些因子。實(shí)際上，取決于細(xì)胞類型，這些因子可導(dǎo)致不良影響。
如果需要，可利用克隆細(xì)胞群的合適方法來(lái)克隆擴(kuò)充本發(fā)明的干細(xì)胞。作為示例，可物理收集本發(fā)明干細(xì)胞的增殖的細(xì)胞群，并將該細(xì)胞群接種在不同的板上(或接種在“多孔”板的孔內(nèi))?；蛘?，可以統(tǒng)計(jì)學(xué)比率將本發(fā)明的干細(xì)胞亞克隆進(jìn)“多孔”板內(nèi)，以協(xié)助將單個(gè)細(xì)胞放入每個(gè)孔的操作(例如，約0.1個(gè)細(xì)胞/孔至約1個(gè)細(xì)胞/孔，或甚至約0.25個(gè)細(xì)胞/孔至0.5個(gè)細(xì)胞/孔，例如0.5個(gè)細(xì)胞/孔)。當(dāng)然，可以低密度將細(xì)胞克隆(例如在皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中或其它適合的基質(zhì)中)，并利用諸如克隆環(huán)的裝置將該細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。克隆群的產(chǎn)生可在任何適合的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)充。任何情況下，都可將分離的細(xì)胞培養(yǎng)至可評(píng)價(jià)它們的發(fā)育表型的適當(dāng)點(diǎn)。如果需要，分離本發(fā)明的干細(xì)胞的任何步驟和方法都可手動(dòng)進(jìn)行；或者，可將本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的適合裝置用于協(xié)助分離細(xì)胞。
可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的誘導(dǎo)分化的常規(guī)方法來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明的干細(xì)胞分化為一種或多種細(xì)胞系或類型的能力的分析。為此，通常使干細(xì)胞經(jīng)受用于每種細(xì)胞類型或細(xì)胞系的適當(dāng)?shù)奶禺愋苑只椒?，該方法包括在適合的特異性分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞。
在分析了根據(jù)用于誘導(dǎo)特異性分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的普通方法進(jìn)行的初步分化研究中獲得的結(jié)果后，本發(fā)明人認(rèn)為，相對(duì)于也對(duì)標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105是陽(yáng)性的其它成體間充質(zhì)干細(xì)胞群，例如皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)，本發(fā)明的干細(xì)胞具有降低的(較低的)分化能力。具體地(實(shí)施例5)，使本發(fā)明的干細(xì)胞經(jīng)受之前為皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞建立的脂肪形成、成骨和軟骨形成分化方法[Zuk et al.，2002.Human adipose tissue is a source ofmultipotent stem cells(人脂肪組織是多能干細(xì)胞的來(lái)源).Mol Biol Cell.2002 Dec；13(12)4279-95]，并且觀察到，相對(duì)于皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，本發(fā)明的干細(xì)胞具有較低的分化為所述細(xì)胞系的能力。但是，不能忽視通過(guò)修改所用的特異性脂肪形成、成骨和軟骨形成細(xì)胞系分化方法來(lái)獲得更大分化能力的可能性。因此，盡管無(wú)意與任何結(jié)論相關(guān)聯(lián)，但是似乎有這樣的跡象，其使得考慮，本發(fā)明的干細(xì)胞具有不同于也對(duì)標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105是陽(yáng)性的其它成體間充質(zhì)干細(xì)胞群的，分化為間充質(zhì)細(xì)胞系的情況(profile)。實(shí)際上，本發(fā)明人進(jìn)行的其它測(cè)定似乎證實(shí)，與皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)不同，本發(fā)明的干細(xì)胞不分化為脂肪細(xì)胞(實(shí)施例6)，這顯示了較低的可塑性和較高程度的定型(commitment)，。
本發(fā)明的細(xì)胞群 另一方面，本發(fā)明涉及基本上同質(zhì)的，分離的干細(xì)胞群，以下稱為“本發(fā)明的細(xì)胞群”，其包含一組源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43(本發(fā)明的干細(xì)胞)。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和Cx43。
在另一具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含本發(fā)明的干細(xì)胞，其中在其體外擴(kuò)充期間，GATA-4和/或Cx43的組成型表達(dá)保持穩(wěn)定。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含還組成型表達(dá)β-MHC和/或SERCA-2的本發(fā)明的干細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含還表達(dá)一種或多種選自CD29、CD44、CD59、CD90和CD105的表面標(biāo)志物的本發(fā)明的干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群顯著地表達(dá)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞特征在于，其還表達(dá)表面標(biāo)志物CD166。因此，在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞顯著地表達(dá)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種、五種或優(yōu)選所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166。如本文所用的，“顯著地表達(dá)”指，在所述細(xì)胞群中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定，至少30％的細(xì)胞顯示了高于背景信號(hào)的，對(duì)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物的信號(hào)，優(yōu)選40％、50％、60％、70％，并且更優(yōu)選80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含不表達(dá)選自CD14、CD34、CD106和CD117的一種、兩種、三種或任意種表面標(biāo)志物的本發(fā)明干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群缺乏對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種或優(yōu)選所有下述表面標(biāo)志物的顯著表達(dá)CD14、CD34、CD106和CD117。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞的特征在于，其不表達(dá)(或非常微弱地表達(dá))表面標(biāo)志物VEGFR2。因此，在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的干細(xì)胞缺乏對(duì)下述表面標(biāo)志物的至少一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選所有下述表面標(biāo)志物的顯著表達(dá)CD14、CD34、CD106、CD117和VEGFR2。如本文所用的，“缺乏顯著表達(dá)”指，在所述細(xì)胞群中，在流式細(xì)胞術(shù)中，少于30％的細(xì)胞顯示高于背景信號(hào)的，對(duì)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物的信號(hào)，優(yōu)選少于20％、15％或10％，更優(yōu)選少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含本發(fā)明的干細(xì)胞，其特征在于，除了它們的來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)它們表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，以及(ii)它們不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106和CD117。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含本發(fā)明的干細(xì)胞，其特征在于，除了它們的來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)它們表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，以及(ii)它們不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含本發(fā)明的干細(xì)胞，其特征在于，除了它們的來(lái)源和組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43之外，(i)它們表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)它們不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含源自優(yōu)選人的哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，其a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；b)組成型表達(dá)βMHC；c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106或CD117。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含源自優(yōu)選人的哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，其a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；b)組成型表達(dá)β-MHC；c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166；以及d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含源自優(yōu)選人的哺乳動(dòng)物心臟脂肪(fatty)(脂肪(adipose))組織的分離的成體干細(xì)胞，其a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；b)組成型表達(dá)β-MHC；c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166；以及d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含從諸如心外膜或心包脂肪組織的哺乳動(dòng)物心臟脂肪組織獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物例如嚙齒類、靈長(zhǎng)類等，優(yōu)選人。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含從人心外膜脂肪組織獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含從心臟脂肪組織的基質(zhì)部分獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞群包含自體、同種異體或異種來(lái)源的本發(fā)明的干細(xì)胞。在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自體的，并且分離自個(gè)體的心臟脂肪組織，其中要向該個(gè)體給藥所述細(xì)胞。
如果需要，所述本發(fā)明的細(xì)胞群可在用于移植的細(xì)胞庫(kù)中找到。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞庫(kù)包含多種本發(fā)明的干細(xì)胞，它們對(duì)于至少一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵抗原的基因，即編碼組織相容性抗原的基因(例如，存在于人群中的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的等位基因)是純合的。可從所述細(xì)胞庫(kù)中選擇與需要細(xì)胞移植或植入的個(gè)體的MHC等位基因相容，且對(duì)一個(gè)或多個(gè)組織相容性抗原的等位基因純合的本發(fā)明的細(xì)胞。
如果需要，可在既不影響也不損害本發(fā)明的細(xì)胞群存活力的條件下，將其冷凍保存。
獲得包含本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物的方法 另一方面，本發(fā)明涉及獲得包含源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的組合物的方法，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43，該方法以下稱為本發(fā)明的方法，包括 a)獲得哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織樣品的細(xì)胞懸液； b)從所述細(xì)胞懸液分離細(xì)胞； c)在固體支持物上的培養(yǎng)基中，在允許所述細(xì)胞附著至所述固體支持物的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及 d)收集源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。
脂肪心臟組織樣品可從脂肪心外膜組織或從脂肪心包組織獲得，優(yōu)選從心外膜脂肪組織獲得。所述脂肪心臟組織樣品來(lái)自哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類、靈長(zhǎng)類等，優(yōu)選人。所述哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織樣品可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得。在具體實(shí)施方案中，所述脂肪心臟組織樣品提取自脂肪組織的基質(zhì)部分。脂肪心臟組織的適合來(lái)源是來(lái)自接近近端右冠狀動(dòng)脈的區(qū)域，或來(lái)自圍繞主動(dòng)脈的心臟基部(base)，從該處可在常規(guī)心臟手術(shù)情況下獲得脂肪心臟組織。實(shí)施例1詳細(xì)描述了獲得人脂肪心臟(尤其是心外膜)組織樣品的方式。
將所提取的脂肪心臟組織樣品洗滌并切成小片段，通過(guò)酶(或通過(guò)其它常規(guī)方式)將該小片段消化以獲得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液離心，將獲得的細(xì)胞團(tuán)(cell pellet)重懸浮在適合的培養(yǎng)基(例如，包含補(bǔ)充了血清、谷氨酰胺和抗生素的α-MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)基)中，并接種在固體支持物(例如，塑料、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等)上，該操作是在允許細(xì)胞附著至所述固體支持物的條件(例如，37℃和含5％CO2的空氣)下進(jìn)行的；一旦觀察到細(xì)胞附著(例如，約24小時(shí)后，取決于培養(yǎng)條件)，除去培養(yǎng)基，并在進(jìn)行細(xì)胞的體外擴(kuò)充之前，將附著的細(xì)胞洗滌。為此，在適合的培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了血清、谷氨酰胺和抗生素的α-MEM培養(yǎng)基)的存在下，于適合的條件下(例如，37℃，含5％CO2的空氣)，培養(yǎng)附著的細(xì)胞(本發(fā)明的干細(xì)胞)，并在這種條件下將該細(xì)胞維持培養(yǎng)直至融合前(例如，直至達(dá)到約80％的融合度)，并且定期地更換全部或部分培養(yǎng)基(例如，每3天或4天)?？蓪⒓?xì)胞重復(fù)轉(zhuǎn)種(傳代)，直至達(dá)到允許對(duì)細(xì)胞材料進(jìn)行分析的量的細(xì)胞材料(即最小數(shù)量的細(xì)胞)。在具體實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)種至少兩次(即將它們傳代2次)，通常3、4、5或更多次。在具體實(shí)施方案中，以適當(dāng)?shù)南♂尪?，將所述?xì)胞轉(zhuǎn)種2次(第2代)，而在另一具體實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)種5次，即高達(dá)第5代(3至4個(gè)月)。通過(guò)以這種方式操作，從固體支持物(例如，培養(yǎng)板等)剝離(peel off)后，獲得的細(xì)胞密度為5×103個(gè)本發(fā)明的干細(xì)胞/cm2至6×103個(gè)本發(fā)明的干細(xì)胞/cm2。在兩種情況下(第2代和第5代)，都分析了GATA-4和Cx43的表達(dá)，并觀察到在整個(gè)所述細(xì)胞(本發(fā)明的干細(xì)胞)的體外擴(kuò)充中，所述心臟特異性標(biāo)志物的組成型表達(dá)基本保持穩(wěn)定。實(shí)施例1和6詳細(xì)描述了從人脂肪心外膜組織獲得、鑒定、表征和分離本發(fā)明的干細(xì)胞。
根據(jù)前述本發(fā)明的方法獲得的，包含本發(fā)明的干細(xì)胞的所得組合物是本發(fā)明的另一方面。
分化的細(xì)胞 另一方面，本發(fā)明涉及獲得分化的細(xì)胞的方法，包括在適合的特異性分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述特異性分化培養(yǎng)基是用于分化為心肌形成細(xì)胞系的特異性培養(yǎng)基。在另一具體實(shí)施方案中，所述特異性分化培養(yǎng)基是用于分化為內(nèi)皮細(xì)胞系的特異性培養(yǎng)基。在另一具體實(shí)施方案中，所述特異性分化培養(yǎng)基是用于分化為心肌形成、成骨或軟骨形成的特異性培養(yǎng)基。所述特異性分化培養(yǎng)基是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
從所述細(xì)胞分化方法獲得的分化的細(xì)胞，以下稱為本發(fā)明的分化的細(xì)胞，是本發(fā)明另外的方面。在具體實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的分化的細(xì)胞是心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還涉及包含所述本發(fā)明的分化的細(xì)胞及適合的培養(yǎng)基的組合物。
藥物組合物 另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，以下稱為本發(fā)明的藥物組合物，其包含治療有效量的所述本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，以及藥物可接受的媒介物。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指存在于所述本發(fā)明的細(xì)胞群中，或存在于所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞的量，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物的量，其必須包含本發(fā)明的藥物組合物，來(lái)用于能夠產(chǎn)生期望的治療效果，；所述治療有效量通常由細(xì)胞的自身特征和所尋求的期望治療效果等因素來(lái)確定。必須給予的本發(fā)明的細(xì)胞的治療有效量通常取決于待治療疾病的級(jí)別、個(gè)體自身特征、受影響的部位等因素。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員必須僅作為指導(dǎo)原則來(lái)考慮本說(shuō)明書中所述的劑量，并且根據(jù)上述因素來(lái)調(diào)整所述劑量。作為說(shuō)明性和非限定性實(shí)例，本發(fā)明的藥物組合物可作為單次劑量來(lái)給藥，其含有約1×105至1×109，優(yōu)選1×106至1×108，更優(yōu)選1×107至5×107個(gè)本發(fā)明的干細(xì)胞，它們可以是部分或完全分化的，或者是它們的組合。取決于患者的狀況和進(jìn)展，可間隔數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月來(lái)重復(fù)劑量，專科醫(yī)生必須為每一病例進(jìn)行制定。
包含在本發(fā)明的細(xì)胞群中，或在所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞，以及包含在所述組合物中的本發(fā)明的分化的細(xì)胞可以是自體、同種異體或異種的細(xì)胞。在具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自體的，并且分離自個(gè)體的心臟脂肪組織，其中要向該個(gè)體給藥所述細(xì)胞，因此減少了與對(duì)所述細(xì)胞的抗原性和/或免疫原性應(yīng)答有關(guān)的潛在并發(fā)癥。
如果需要，如上文所述的，利用通過(guò)抗體的陽(yáng)性和/或陰性細(xì)胞的選擇來(lái)富集細(xì)胞群，可將包含在本發(fā)明的細(xì)胞群中，或在所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞純化，以增加功效、降低發(fā)病率或促進(jìn)方法。
根據(jù)本發(fā)明，不進(jìn)行另外的處理，就可向患者給藥包含在本發(fā)明的細(xì)胞群中，或在所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞，以及本發(fā)明的分化的細(xì)胞；或者在用于純化、刺激或以其它方式改變細(xì)胞的額外處理后，向患者給藥上述細(xì)胞。例如，可在獲得自個(gè)體的本發(fā)明的干細(xì)胞的給藥之前的培養(yǎng)后，向需要該干細(xì)胞的另一個(gè)體給藥該干細(xì)胞。也可將本發(fā)明的細(xì)胞群或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述本發(fā)明的分化的細(xì)胞單獨(dú)地，或與其它細(xì)胞群進(jìn)行給藥，例如與心臟脂肪組織基質(zhì)部分的剩余組分一起。在具體實(shí)施方案中，對(duì)心臟脂肪組織的收集可在患者病床邊完成。血流動(dòng)力學(xué)控制(Hemodynamic control)可用于監(jiān)測(cè)患者的臨床狀況。根據(jù)本文描述的本發(fā)明，可在心臟脂肪組織提取后立即向患者給藥本發(fā)明的藥物組合物。例如，可在處理心臟脂肪組織以分離本發(fā)明的細(xì)胞群或包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，并將所述本發(fā)明的細(xì)胞群或包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物置于藥物適合的媒介物中后，立即給藥本發(fā)明的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，遞送時(shí)間取決于患者的利用度(availability)以及處理心臟脂肪組織和分離本發(fā)明的細(xì)胞群所需的時(shí)間。
術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的媒介物”指媒介物，其在動(dòng)物，特別是在人中的用途必須被聯(lián)邦政府或國(guó)家政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或列在美國(guó)藥典或歐洲藥典或另一普遍接受藥典中。
術(shù)語(yǔ)“媒介物”指稀釋劑、共佐劑(coadjuvant)、賦形劑或載體(carrier)，本發(fā)明的細(xì)胞群或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的細(xì)胞的組合物的細(xì)胞必須與它們一起進(jìn)行給藥；顯然，所述媒介物必須與所述細(xì)胞相容。所述媒介物的說(shuō)明性、非限定性實(shí)例包括任何生理相容的媒介物，例如等滲溶液(例如無(wú)菌鹽水(0.9％NaCl)、磷酸緩沖鹽水(PBS)、林格乳酸鹽溶液(Ringer-lactate solution)等)，任選地補(bǔ)充了血清，優(yōu)選自體血清；細(xì)胞培養(yǎng)基(例如DMEM等)；或可選擇地，固體、半固體、膠狀或粘性支持物，例如膠原蛋白、膠原蛋白-葡糖胺-聚糖、纖維蛋白、聚氯乙烯、諸如聚賴氨酸或聚鳥氨酸的聚氨基酸、水凝膠、瓊脂糖、硅酮硫酸葡聚糖(silicone dextran sulfate)。如果需要，在具體實(shí)施方案中，支持物還可含有生長(zhǎng)因子或其它試劑。如果支持物為固體、半固體或膠狀的，則可將細(xì)胞導(dǎo)入媒介物的液相中，隨后對(duì)該媒介物進(jìn)行處理使得其轉(zhuǎn)變?yōu)檩^固態(tài)的相。在媒介物具有固體結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可根據(jù)損傷形狀來(lái)形成所述媒介物。
如果需要，本發(fā)明的藥物組合物在必要時(shí)還可含有增加、控制或以其它方式操縱(direct)包含在所述藥物組合物中的細(xì)胞的期望治療效果的添加劑，和/或輔助物質(zhì)或藥物可接受的物質(zhì)，例如緩沖劑、表面活性劑、共溶劑、防腐劑等。還可能添加金屬螯合劑。本發(fā)明的藥物組合物的液體介質(zhì)中細(xì)胞的穩(wěn)定性，可通過(guò)添加其它物質(zhì)如天冬氨酸、谷氨酸等來(lái)加以改善。可用在本發(fā)明的藥物組合物中的所述藥物可接受的物質(zhì)通常是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且通常用在細(xì)胞組合物的制備中。例如，在E.W.Martin的“雷明頓制藥科學(xué)(Remington′s PharmaceuticalSciences)”中描述了適合的藥物媒介物的實(shí)例。關(guān)于所述媒介物的其它信息可在任何藥物技術(shù)手冊(cè)(植物藥學(xué)(Galenic Pharmacy))中找到。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，優(yōu)選在分離并擴(kuò)充后基本上同質(zhì)的本發(fā)明的細(xì)胞群，連同合適量的適合媒介物以為個(gè)體提供適當(dāng)劑型。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)所選的劑型來(lái)配制。制劑將根據(jù)給藥模式來(lái)調(diào)整。在具體實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物制備為液體藥劑(liquid dosage)或凝膠形式，例如懸浮液形式，來(lái)用于注射或灌注至需要治療的個(gè)體。說(shuō)明性和非限定性實(shí)例包括無(wú)菌懸浮液中的本發(fā)明的藥物組合物與藥物可接受的賦形劑，例如等滲溶液，如磷酸緩沖鹽水(PBS)，或者與任何其它適合的藥物可接受媒介物的制劑，來(lái)用于向諸如人的個(gè)體胃腸外給藥，優(yōu)選靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下給藥等，盡管其它的可選給藥途徑也是可能的。
向需要本發(fā)明的藥物組合物的個(gè)體給藥本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)常規(guī)手段進(jìn)行。在具體應(yīng)用中，可利用適合的裝置向所述個(gè)體靜脈內(nèi)給藥所述藥物組合物，該合適的裝置例如注射器、導(dǎo)管、套針、插管等。在所有情況下，都利用適合于細(xì)胞組合物給藥，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的設(shè)備、儀器和裝置來(lái)給藥本發(fā)明的藥物組合物。
在具體實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)給藥本發(fā)明的藥物組合物，并且包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)裝置的靜脈內(nèi)給藥，該標(biāo)準(zhǔn)裝置例如標(biāo)準(zhǔn)外周靜脈內(nèi)導(dǎo)管、中心靜脈導(dǎo)管或肺動(dòng)脈導(dǎo)管等?？赏ㄟ^(guò)讓位于患者脈管系統(tǒng)內(nèi)的遠(yuǎn)端和近端球狀物(globe)連續(xù)充氣(inflate)或放氣(deflate)來(lái)控制細(xì)胞流量。
在另一具體實(shí)施方案中，直接向想要受益的位置給藥本發(fā)明的藥物組合物可以是有利的。因此，如果需要，將本發(fā)明的藥物組合物直接給藥(植入、移植等)至期望的器官或組織，從而通過(guò)插入適合的裝置如適合的插管、導(dǎo)管等，通過(guò)動(dòng)脈或靜脈灌注(包括逆流機(jī)制)，或通過(guò)本說(shuō)明書中所述或本領(lǐng)域中已知的其它手段，直接將本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)用(例如通過(guò)注射等)至受影響的器官或組織的外表面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)例如冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，或通過(guò)借助導(dǎo)管的跨心肌注射(transmyocardialinjection)，向心肌的損傷區(qū)域直接給藥本發(fā)明的藥物組合物。設(shè)計(jì)為特異地在心臟的受損區(qū)域、特別是梗死區(qū)域釋放活性成分的導(dǎo)管已有描述(參見，例如美國(guó)專利US6,102,926、US6,120,520、US6,251,104、US6,309,370、US6,432,119和US6,485,481)。所用的給藥系統(tǒng)可包括，例如用于可選藥物的心臟內(nèi)給藥的儀器，其包括用于心臟內(nèi)定位的傳感器和用于在該傳感器的位置給藥期望量的期望活性成分的釋放系統(tǒng)。
如果需要，可將本發(fā)明的藥物組合物保存至通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行使用的時(shí)候。這種藥物組合物也可與用于心肌梗死后治療和/或充血性心力衰竭的其它藥物，以活性形式一起保存，從而構(gòu)成(comprise)聯(lián)合治療。對(duì)于短期保存(少于6小時(shí))，本發(fā)明的藥物組合物可在室溫下，或在低于所述溫度下，于密封容器中進(jìn)行保存，并且向該藥物組合物補(bǔ)充或不補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液。中期保存(少于48小時(shí))優(yōu)選在2℃至8℃，并且本發(fā)明的藥物組合物包含等滲緩沖溶液，并處于由防止細(xì)胞附著的材料制成或涂覆有該材料的容器中。更長(zhǎng)期的保存優(yōu)選通過(guò)適當(dāng)?shù)睦鋬鲞M(jìn)行，并保存在促進(jìn)細(xì)胞功能保留的條件下。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用在聯(lián)合治療中。在具體實(shí)施方案中，所述藥物組合物與用于心肌梗死后治療和/或充血性心力衰竭的其它藥物組合物聯(lián)合給藥。因此，包含在本發(fā)明細(xì)胞群中的本發(fā)明的干細(xì)胞可作為單一治療使用，或與用于治療心血管疾病，尤其是缺血性心臟疾病的其它常規(guī)治療聯(lián)合使用，例如與進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)，血管成形術(shù)(使用或不使用支架)，給藥血管生成促進(jìn)劑(promoter)，植入心室輔助裝置，給藥血栓溶解劑、抗血小板凝集劑(乙酰水楊酸和/或氯吡格雷(clopidogrel))、抗高血壓劑(血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑(ACE抑制劑)、血管緊張肽I受體拮抗劑(ARA-II)、β受體阻斷劑、利尿劑、降血脂劑(antilipidemic agent)、地高辛、硝酸鹽和/或鈣拮抗劑聯(lián)合使用。
在具體實(shí)施方案中，將組合治療給予患有缺血性心臟疾病的個(gè)體，特別是患有心肌梗死和/或患有對(duì)常規(guī)治療無(wú)應(yīng)答的充血性心力衰竭的患者。
如上文所述，本發(fā)明的藥物組合物可用于與用在心肌梗死后治療和/或充血性心力衰竭的其它藥物的聯(lián)合治療中。所述其它藥物產(chǎn)品可形成相同藥物組合物的一部分，或者可選擇地，所述其它藥物產(chǎn)品可以分離的組合物的形式提供，來(lái)用于相對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物給藥的同時(shí)或連續(xù)(時(shí)間上順序的)的給藥。在具體實(shí)施方案中，將所述其它藥物組合物與包含本發(fā)明的細(xì)胞群的藥物組合物同時(shí)給藥，或順序給藥，并且在時(shí)間上分開，以任意的順序進(jìn)行，即可首先給藥本發(fā)明的藥物組合物，然后給藥用于治療缺血性心臟疾病的其它藥物或其它藥物組合物，或者可首先給藥用于治療缺血性心臟疾病的其它藥物或其它藥物組合物，然后給藥本發(fā)明的藥物組合物。可選擇地，可將這兩種組分的一種混合在相同組合物中并一起給藥。在另一可選實(shí)施方案中，將所述本發(fā)明的藥物組合物與用于治療缺血性心臟疾病的其它藥物或其它藥物組合物同時(shí)給藥。
可在本發(fā)明的藥物組合物的給藥之前和給藥期間監(jiān)測(cè)患者。給藥藥物組合物后，可能需要將患者監(jiān)測(cè)約24小時(shí)的時(shí)間段，以防出現(xiàn)不良反應(yīng)。建議進(jìn)行隨訪研究來(lái)評(píng)價(jià)功能性改善。包含本發(fā)明的細(xì)胞群的生物材料 另一方面，本發(fā)明涉及生物材料，以下稱為本發(fā)明的生物材料，其包含所述本發(fā)明的細(xì)胞群，所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，或所述本發(fā)明的藥物組合物。
組織工程由在損傷組織內(nèi)移植的生物材料組成，該生物材料由適合于將它們植入有機(jī)體內(nèi)的生物相容結(jié)構(gòu)組成，并且被具有附著和增殖能力的細(xì)胞所覆蓋。所述結(jié)構(gòu)可以是縫線、基質(zhì)、膜、泡沫、凝膠和陶瓷等?？捎糜跇?gòu)建基質(zhì)和其它生物相容結(jié)構(gòu)的不同材料是已知的，并包括無(wú)機(jī)材料，例如金屬；天然聚合物，例如纖維蛋白或藻酸鹽；合成聚合物，例如多羥基酸，如聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(例如，聚(乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA)等)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合物是生物可降解的，從而它們隨時(shí)間降解，并且聚合結(jié)構(gòu)完全被細(xì)胞所替換。在具體實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的生物材料包含生物相容結(jié)構(gòu)，或由其組成，所述本發(fā)明的生物材料包含一種或多種生物可降解聚合物和本發(fā)明的細(xì)胞群，或本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，或本發(fā)明的藥物組合物。
在另一具體實(shí)施方案中，所述聚合結(jié)構(gòu)可被生物活性分子覆蓋，即被能夠特異地與細(xì)胞相互作用的分子覆蓋，或被具有更好的附著性質(zhì)的另一聚合物覆蓋，以增強(qiáng)細(xì)胞的附著程度和增殖。本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，在制備用于治療病變(pathology)的藥物中的用途 本發(fā)明人觀察到，本發(fā)明的細(xì)胞群，以及所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物具有良好的心肌形成潛力，并且好于已經(jīng)描述的不同來(lái)源的其它干細(xì)胞群，因此，本發(fā)明的細(xì)胞群以及所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物是潛在地用于心臟組織再生和/或治療功能性心肌組織喪失(缺血性心臟疾病)狀況的基于細(xì)胞的試劑，例如用于患有一次或多次心肌梗死的患者，或用于出現(xiàn)充血性心力衰竭的患者，以及在適合刺激血管生成的狀況下，用于刺激血管生成。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，在制備用于心臟組織再生的藥物組合物中，或在制備用于治療缺血性心臟疾病的藥物組合物中，或在制備用于心肌梗死后治療或用于治療充血性心力衰竭的藥物組合物中，或在制備刺激血管生成的藥物組合物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含所述本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，以用于心臟組織再生，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療，或用于治療充血性心力衰竭和/或刺激血管生成。
為了再生心臟組織，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療，或用于治療充血性心力衰竭，或刺激血管生成，向需要治療的個(gè)體給藥本發(fā)明的藥物組合物、治療有效量的所述藥物組合物，其包含本發(fā)明的細(xì)胞群、或包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物、或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物。如上文所述，本發(fā)明的干細(xì)胞(存在于所述本發(fā)明的細(xì)胞群中)源自心臟脂肪組織，并組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43，優(yōu)選二者都表達(dá)。Cx43蛋白是電連接心肌細(xì)胞的間隙連接的主要蛋白之一；因此所述本發(fā)明干細(xì)胞組成型表達(dá)Cx43的事實(shí)提示，在移植了包含本發(fā)明的干細(xì)胞的所述細(xì)胞群后，與先前存在的心臟組織有良好的電偶聯(lián)。
本發(fā)明的干細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，可用于獲得適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠再生缺血心臟組織或改善一次或多次心肌梗死后心臟的功能。在具體實(shí)施方案中，所述改善是由于存在于所述本發(fā)明的細(xì)胞群中的本發(fā)明的干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞、平滑肌和/或血管內(nèi)皮組織。如上文所述，可通過(guò)常規(guī)手段完成向需要本發(fā)明的藥物組合物的個(gè)體給藥本發(fā)明的藥物組合物。在具體實(shí)施方案中，可在心肌的損傷區(qū)域，將所述藥物組合物直接給藥至需要該藥物組合物的個(gè)體，例如通過(guò)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，或通過(guò)借助導(dǎo)管的跨心肌注射。
本發(fā)明的干細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞群，或所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，可用于獲得適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠在需要刺激血管生成的病理狀況下，刺激血管生成。
基于使用本發(fā)明的干細(xì)胞或本發(fā)明的分化的細(xì)胞，用于心臟組織再生，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療，或用于治療充血性心力衰竭，或刺激血管生成的方法 本發(fā)明還涉及心臟組織再生，涉及治療喪失功能性心肌組織(例如缺血性心臟疾病)的病理性狀況，例如患有一次或多次心肌梗死的個(gè)體(患者)，或出現(xiàn)充血性心力衰竭的患者。同樣地，本發(fā)明還涉及在適當(dāng)或合理狀況下，刺激血管生成。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及用于心臟組織再生，或用于治療缺血性心臟疾病，或用于心肌梗死后治療，或用于治療充血性心力衰竭，或刺激血管生成的方法，包括向有需要的個(gè)體給藥治療有效量的本發(fā)明的干細(xì)胞，或包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，或本發(fā)明的藥物組合物。
如之前所述，為了再生心臟組織，或用于治療缺血性心臟疾病，用于心肌梗死后治療，用于治療充血性心力衰竭、或刺激血管生成，可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法(例如，通過(guò)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射、跨心肌注射等，直接向心肌的損傷區(qū)域給藥)，以治療有效量，向需要治療的個(gè)體給藥所述本發(fā)明的干細(xì)胞，所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物，或所述本發(fā)明的藥物組合物。
試劑盒 另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含本發(fā)明的干細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞群，包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，或所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物。所述本發(fā)明的干細(xì)胞和細(xì)胞群，以及所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，和所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物的特征之前已有描述。形成所述試劑盒的一部分的，存在于本發(fā)明細(xì)胞群中，或存在于所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞，與存在于所述組合物中的所述本發(fā)明的分化的細(xì)胞一樣，可以是同種異體或異種來(lái)源的。
所述試劑盒可用于診斷目的和/或用于體外研究，因此，為此目的，如果需要，本發(fā)明的干細(xì)胞可以是永生化的，從而它們能夠無(wú)限擴(kuò)充。
因此，在具體實(shí)施方案中，可對(duì)本發(fā)明的干細(xì)胞進(jìn)行永生處理，例如可逆的永生處理，以便得到永生化的本發(fā)明的干細(xì)胞，優(yōu)選可逆永生化的干細(xì)胞。在這種意義上，如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“永生”或“永生化”指細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞的方法，該細(xì)胞在培養(yǎng)中無(wú)限地增殖，而不進(jìn)入衰老。根據(jù)本發(fā)明，永生指方法，通過(guò)這種方法使細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，從而該細(xì)胞在某些方面的行為類似于腫瘤細(xì)胞，特別是與腫瘤細(xì)胞的增殖特征有關(guān)的方面。因此，“可逆永生化的細(xì)胞”指細(xì)胞，其在給定時(shí)間處于永生化狀態(tài)，但是后來(lái)利用可逆永生方法，可返回非永生化狀態(tài)。在具體實(shí)施方案中，通過(guò)包括下述步驟的方法使本發(fā)明的干細(xì)胞可逆永生化(a)用包含“可移除的多核苷酸”的載體(vector)轉(zhuǎn)化本發(fā)明的干細(xì)胞，以獲得永生化的本發(fā)明的干細(xì)胞，該“可移除的多核苷酸”含有癌基因(或癌基因的組合)；(b)使所述永生化的本發(fā)明的干細(xì)胞生長(zhǎng)；以及(c)選擇保持了本發(fā)明細(xì)胞功能屬性的永生化的本發(fā)明的干細(xì)胞的那些克隆細(xì)胞系(cell line)；如果需要，可從永生化的本發(fā)明的干細(xì)胞移除該癌基因(或癌基因的組合)。作為示例，可通過(guò)單獨(dú)的過(guò)量表達(dá)，或與一些癌基因如SV40大T抗原、端粒酶催化亞基、Bmi-1等聯(lián)合，來(lái)使細(xì)胞群永生化?？赏ㄟ^(guò)在側(cè)面加上(flank)重組酶靶標(biāo)(例如，引入識(shí)別loxP靶標(biāo)的Cre重組酶等)，而且通過(guò)添加能夠破壞永生化的細(xì)胞的胸苷激酶自殺基因來(lái)逆轉(zhuǎn)這些癌基因的過(guò)量表達(dá)。
在體外評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)生物學(xué)或藥理學(xué)試劑的應(yīng)答的方法 另一方面，本發(fā)明涉及在體外評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)生物學(xué)或藥理學(xué)試劑的應(yīng)答的方法，包括使所述試劑與包含多個(gè)本發(fā)明的干細(xì)胞的本發(fā)明的細(xì)胞群，或與包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物，所述干細(xì)胞任選地分化為特定的細(xì)胞類型，或與所述包含本發(fā)明的分化的細(xì)胞的組合物接觸，并評(píng)價(jià)所述試劑對(duì)培養(yǎng)中的所述細(xì)胞群的影響。
作為示例，細(xì)胞對(duì)生物學(xué)或藥理學(xué)試劑的應(yīng)答可在體外通過(guò)包括下述步驟的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)(a)從個(gè)體或一組個(gè)體分離本發(fā)明的細(xì)胞群，或包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物；(b)任選地，使全部或部分存在于所述細(xì)胞群，或存在于所述包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞，分化為特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞系；(c)在培養(yǎng)中，體外擴(kuò)充步驟(a)或(b)所得的細(xì)胞；(d)任選地，使在步驟(c)中擴(kuò)充的細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞類型；(e)在培養(yǎng)中，使步驟(c)或(d)所得的細(xì)胞群與一種或多種生物學(xué)或藥理學(xué)試劑接觸；以及(f)評(píng)價(jià)所述試劑對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞群的影響。
在具體實(shí)施方案中，使存在于本發(fā)明的細(xì)胞群中，或存在于包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的干細(xì)胞的組合物中的本發(fā)明的干細(xì)胞，分化為心肌細(xì)胞。分化步驟可在分離本發(fā)明的細(xì)胞群之前[步驟(b)]，或在所述細(xì)胞的體外擴(kuò)充之后[步驟(d)]進(jìn)行。
獲得生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的方法 另一方面，本發(fā)明涉及獲得生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的方法，包括在適合于表達(dá)并產(chǎn)生所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的干細(xì)胞或本發(fā)明的分化的細(xì)胞，并且，如果需要，分離所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子。所述條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，或者可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)包含在本說(shuō)明書中的信息容易地推斷。
以下的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)被考慮為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1 sub-ADSC和epi-ADSC成體干細(xì)胞的細(xì)胞分離和培養(yǎng) 從同一個(gè)體的心外膜和皮下來(lái)源的人脂肪樣品分離了兩種基本上同質(zhì)的干細(xì)胞群，并比較了它們的表型和心臟特異性標(biāo)志物的基礎(chǔ)表達(dá)。
材料與方法 獲得心外膜和皮下脂肪樣品 在得到知情同意書后，在常規(guī)心臟手術(shù)中，從4名患者(P1、P2、P3和P4)獲得心外膜和皮下脂肪樣品，并且從每名患者提取每種類型的脂肪樣品。在心臟手術(shù)期間，首先切開皮膚和皮下組織，直至暴露胸骨。利用手術(shù)鉗，從該過(guò)程中暴露的胸皮下組織獲得脂肪碎片(約2g至5g)。然后隨著心臟的暴露，進(jìn)行正中胸骨切開術(shù)并剝離心包膜。從圍繞主動(dòng)脈的心臟基部獲得心外膜脂肪組織(約0.5g至2g)。通過(guò)手術(shù)鉗選擇該脂肪組織，并采用普通手術(shù)剪切下。這項(xiàng)研究得到了Santa Creu i Sant Pau醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
從心外膜和皮下脂肪樣品分離epi-ADSC和sub-ADSC細(xì)胞群 將兩種類型的脂肪樣品(心外膜和皮下)用PBS緩沖液(GibcoInvitrogen Corp.)重復(fù)洗滌，并在剝離存在的血管后用手術(shù)刀切成小碎片。
然后，在攪拌和37℃下，用含有0.05％II型膠原酶的α-MEM(GibcoInvitrogen Corp)溶液將脂肪組織碎片酶促消化30分鐘。通過(guò)添加補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)、1mM L-谷氨酰胺(Gibco Invitrogen Corp)和1％青霉素-鏈霉素(Gibco Invitrogen Corp)的α-MEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。然后，將懸浮液在室溫下以1,200g離心10分鐘。棄去上清液，將團(tuán)(pellet)用補(bǔ)充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基重懸浮，并接種在培養(yǎng)瓶中(37℃下，含有5％CO2的空氣)。24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并用PBS洗滌附著的細(xì)胞。
之前分離的細(xì)胞的體外擴(kuò)充 于37℃下和含有5％CO2的空氣中，在補(bǔ)充了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-鏈霉素的α-MEM的存在下，培養(yǎng)附著的細(xì)胞。在相同條件下，將細(xì)胞維持在培養(yǎng)中，直至達(dá)到約80％的融合度(融合前)，并且每3天或4天更換培養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到融合前時(shí)，在通過(guò)胰蛋白酶/EDTA溶液從培養(yǎng)板剝離后，將該細(xì)胞以1∶3的稀釋度重復(fù)轉(zhuǎn)種，這對(duì)應(yīng)于5×103個(gè)細(xì)胞/cm2至6×103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度，直至第5代(3至4個(gè)月)。
結(jié)果 選擇并在體外培養(yǎng)中擴(kuò)充了來(lái)自相同個(gè)體的成體心外膜脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群和成體皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群。圖1A顯示了心外膜脂肪和皮下脂肪的提取部分。人心外膜成體脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(epi-ADSC)的形態(tài)顯示在圖1B中，而人成體皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)的形態(tài)顯示在圖1C中。
實(shí)施例2 epi-ADSC成體干細(xì)胞群的免疫表型表征 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析不同表面標(biāo)志物的表達(dá)，以便表征心外膜脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群(epi-ADSC)，并將所得的結(jié)果與分離自皮下脂肪組織的細(xì)胞群(sub-ADSC)的結(jié)果進(jìn)行比較。
材料與方法 流式細(xì)胞術(shù) 在源自心外膜脂肪組織的4種細(xì)胞群(epi-ADSC細(xì)胞)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫表型分析，該4種細(xì)胞群分離自來(lái)自指定為P1、P2、P3和P4的患者的4個(gè)樣品，并將它們與sub-ADSC細(xì)胞的代表性樣品進(jìn)行比較。在培養(yǎng)3至4周后(低傳代)，對(duì)P1和P2epi-ADSC細(xì)胞進(jìn)行表征，而在培養(yǎng)9至12周后(高傳代)，對(duì)P3和P4epi-ADSC細(xì)胞進(jìn)行表征。
在4℃下，用PBS洗滌細(xì)胞，并在培養(yǎng)條件下使用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco)，保持5分鐘將細(xì)胞從培養(yǎng)板剝離。在阻斷了胰蛋白酶的作用后，于低溫條件下，以1,400rpm將細(xì)胞離心5分鐘。在整個(gè)染色過(guò)程中，將細(xì)胞保持在冷卻的染色緩沖液(含1％FCS的1X PBS)中。通過(guò)對(duì)下述不同表面抗原特異性的抗體進(jìn)行染色CD3、CD9、CD10、CD11B、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD28、CD29、CD31、CD34、CD36、CD38、CD44、CD45、CD49a、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD621、CD62p、CD71、CD90、CD95、CD102、CD104、CD105、CD106、CD117、CD133/2、CD59、CD235a、HLAI、HLAII、NGFR和β2-微球蛋白(都來(lái)自Serotec)。
將兩種熒光團(tuán)(fluorophor)，即異硫氰酸熒光素(FITC)和藻紅蛋白(PE)用于顯示所述抗原在細(xì)胞膜中的存在，將該兩種熒光團(tuán)于4℃下，在染色緩沖液中避光稀釋1/50，保持20分鐘。在Coulter EPICS XL細(xì)胞計(jì)數(shù)器中并通過(guò)特定軟件(FCS Express 3軟件)分析樣品。
結(jié)果 圖2顯示了epi-ADSC樣品的免疫表型概況所得到的陽(yáng)性結(jié)果。用于分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)為“％陽(yáng)性”。該參數(shù)測(cè)量獲取公式(acquisition formula)中所接受的細(xì)胞的百分比，并且將該接受的細(xì)胞視為對(duì)于對(duì)照是陽(yáng)性的。FCS Express程序在統(tǒng)計(jì)學(xué)上進(jìn)行數(shù)值減法(numerical subtraction)，并將高于“細(xì)胞陽(yáng)性百分比”參數(shù)30％的值視為陽(yáng)性結(jié)果。
因此，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析免疫表型概況的結(jié)果顯示，大于90％的標(biāo)志物研究在兩種細(xì)胞群(epi-ADSC和sub-ADSC)中有類似的表達(dá)。具體地，如在sub-ADSC細(xì)胞群中的情況，epi-ADSC細(xì)胞群對(duì)CD9、CD29、CD44、CD51、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、HLA-I和β2-微球蛋白具有強(qiáng)陽(yáng)性(表1)。sub-ADSC的剩余的陰性特異性標(biāo)志物對(duì)epi-ADSC細(xì)胞也是陰性的。然而，關(guān)于細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54的表達(dá)檢測(cè)到了差異，該細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54對(duì)epi-ADSC細(xì)胞是陽(yáng)性的，對(duì)sub-ADSC細(xì)胞是陰性的。
表1 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的，與sub-ADSC細(xì)胞代表性樣品相比，epi-ADSC細(xì)胞不同樣品中表面標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果
[注意僅顯示了具有陽(yáng)性結(jié)果(高于30％的表達(dá))的那些標(biāo)志物] 實(shí)施例3 sub-ADSC和epi-ADSC干細(xì)胞群中心臟特異性標(biāo)志物基因表達(dá)的比較研究 通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)分析心臟特異性標(biāo)志物β-MHC、GATA-4、Nkx2.5、心臟肌鈣蛋白I(cTnI)、SERCA-2、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白和連接蛋白-43的基礎(chǔ)表達(dá)。
材料與方法 實(shí)時(shí)RT-PCR 用QuickPrep總RNA提取試劑盒(Amersham)，根據(jù)制造商的說(shuō)明，提取分離的細(xì)胞的總RNA。利用2μg的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，該反應(yīng)采用帶有隨機(jī)六聚體的Script單步RT-PCR(Script One-StepRT-PCR)試劑盒(Bio-Rad Laboratories)，于50℃下在10分鐘內(nèi)進(jìn)行。獲得cDNA后，用標(biāo)記了FAM

，對(duì)全部研究的基因特異性的引物，在TaqMan通用PCR master mix(TaqMan Universal PCR master mix)試劑盒(Applied Biosystems)中，準(zhǔn)備所有的PCR反應(yīng)。所用的引物為GATA-4(Hs00171403_m1)、Nkx2.5(Hs00231763_m1)、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(Hs00241650_m1)、β-MHC(Hs00165276_m1)、連接蛋白-43(Hs00748445_s1)、SERCA-2(Hs00544877_m1)、cTnI(Hs00165957_m1)和GAPDH(Hs99999905_m1)(Applied Biosystems)，反應(yīng)條件為對(duì)于所有引物，50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，以及95℃、15秒和60℃、1分鐘的40個(gè)循環(huán)。最后通過(guò)ABI Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedByosistems)來(lái)分析擴(kuò)增。為了定量基因表達(dá)，用ABI Prism 7000 SDS軟件程序來(lái)分析所得到的數(shù)據(jù)。所有的樣品都分析兩份。使用Ct(ΔCt)比較方法；Ct是PCR循環(huán)，其中檢測(cè)基礎(chǔ)水平之上的熒光的首次增加(firstincrease)，以計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)，并且將組成型表達(dá)基因GAPDH用作內(nèi)源參照(reference control)。
結(jié)果 如表2和圖3A中所示，在第二代時(shí)，與提取自相同個(gè)體的sub-ADSC細(xì)胞相比，在epi-ADSC細(xì)胞群中，檢測(cè)到心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的基因水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(p＜0.001)。相反地，對(duì)于剩余的心臟特異性標(biāo)志物(α-輔肌動(dòng)蛋白、β-MHC、cTnI、Cx43、SERCA-2和Nkx2.5)的基因表達(dá)，在所研究的兩種類型的細(xì)胞群之間，未檢測(cè)到顯著的差異(圖3A)。應(yīng)當(dāng)指出，在第5代時(shí)，GATA-4的表達(dá)差異增加(p＜0.001)，并且對(duì)于Cx43的轉(zhuǎn)錄水平也檢測(cè)到顯著的差異(p＝0.031)(圖3B和3C)。這些結(jié)果表明，與來(lái)自相同個(gè)體的皮下脂肪的細(xì)胞群(sub-ADSC)相比，心外膜脂肪來(lái)源的干細(xì)胞群(epi-ADSC)更加向心臟細(xì)胞系定型。
表2 基因表達(dá)水平的定量
實(shí)施例4 在蛋白水平上epi-ADSC細(xì)胞和sub-ADSC細(xì)胞中心臟特異性標(biāo)志物表達(dá)的比較研究 通過(guò)免疫熒光和蛋白印跡技術(shù)，在蛋白水平上分析了心臟特異性標(biāo)志物β-MHC、GATA-4、Nkx2.5、心臟肌鈣蛋白I、SERCA-2、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白和連接蛋白-43的基礎(chǔ)表達(dá)。
材料與方法 蛋白印跡 在4℃下，將細(xì)胞用冷PBS緩沖液重復(fù)洗滌，并在裂解緩沖液[25mMTris pH7.6、150mM NaCl、1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM EGTA(乙二醇四乙酸)、1％SDS(月桂基硫酸鈉)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride))、1μg/ml抑蛋白酶肽和1μg/ml亮抑蛋白酶肽]中勻漿30分鐘。在4℃下，以13,000rpm離心30分鐘獲得SDS不溶部分?？偺崛∥锏牡鞍诐舛韧ㄟ^(guò)Bio-Rad DC蛋白試劑盒(BioRad)來(lái)確定，并且將BSA用作標(biāo)準(zhǔn)。將50μg的蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45mm的硝酸纖維素膜，并用對(duì)所分析的不同心臟特異性標(biāo)志物特異性的抗體來(lái)顯影Cx43(1/100)(BD Transduction Laboratories)、GATA-4(1/100)、SERCA-2(1/100)、抗心臟肌鈣蛋白I(cTnI)(1/100)(前三種來(lái)自Santa CruzBiotechnology)、β-MHC(1/10)(Chemicon)和肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(1/100)(Sigma))。根據(jù)制造商的說(shuō)明，將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)用于觀察對(duì)應(yīng)的特異性帶(Pierce)。
免疫熒光 在室溫下，將培養(yǎng)在專用于細(xì)胞的通過(guò)共焦顯微鏡(FluoroDish，WPIInc.)研究的，具有0.17mm玻璃底的35mm板中的細(xì)胞用PBS緩沖液重復(fù)洗滌，并用配制于PBS中的4％PFA(低聚甲醛)固定15分鐘。然后，在室溫下，用含1％BSA(牛血清白蛋白)/0.1％皂苷的PBS將細(xì)胞通透化30分鐘。最后，將細(xì)胞與對(duì)所分析的不同心臟特異性標(biāo)志物特異性的抗體一起孵育Cx43(1/100)(BD Transduction Laboratories)、GATA-4(1/100)、SERCA-2(1/100)、心臟肌鈣蛋白I(cTnI)(1/100)(Santa CruzBiotechnology)、β-MHC(未稀釋)(Chemicon)和肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(1/100)(Sigma))，最后在熒光共焦顯微鏡(Leica)下進(jìn)行分析。
結(jié)果 所述標(biāo)志物蛋白水平表達(dá)的研究結(jié)果對(duì)其基因表達(dá)分析中獲得的結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充。
由此觀察到，在培養(yǎng)基中缺乏另外的心臟生成刺激物或因子時(shí)，只有epi-ADSC細(xì)胞在第2代和第5代時(shí)表達(dá)Cx43和GATA-4(圖4A和4B)。還在epi-ADSC細(xì)胞的整個(gè)體外擴(kuò)充期間(第2代至第5代)，觀察到Cx43和GATA-4表達(dá)水平的增加。
應(yīng)當(dāng)指出，在第2代時(shí)，兩種細(xì)胞群在蛋白水平上都缺乏鈣SERCA-2泵和β-MHC的表達(dá)。但是，在第5代時(shí)，在兩種細(xì)胞群中都檢測(cè)到β-MHC和SERCA-2表達(dá)的增加(圖4和5)，epi-ADSC細(xì)胞的β-MHC表達(dá)的增加比在來(lái)自同一個(gè)體的sub-ADSC細(xì)胞中所觀察到的β-MHC表達(dá)的增加更多(圖4)。
蛋白水平上這種差異表達(dá)的存在可能是由于所研究的兩種細(xì)胞群之間轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制的差異，或者是由于將mRNA翻譯為成熟蛋白的過(guò)程的差異。
對(duì)于剩下的所分析的基因/蛋白，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR和蛋白印跡以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果之間有高度的一致性。
實(shí)施例5 源自脂肪心外膜組織的干細(xì)胞(epi-ADSC)分化能力的分析 分析了源自心外膜脂肪的干細(xì)胞(epi-ADSC)分化為脂肪形成、成骨和軟骨形成細(xì)胞系的能力。
材料與方法 將epi-ADSC細(xì)胞分化為成骨、脂肪形成和軟骨形成細(xì)胞系 對(duì)每種細(xì)胞系采用特定的分化方法成骨分化、脂肪形成分化和軟骨形成分化。
○成骨分化 按照已經(jīng)為皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞和為其它細(xì)胞類型所建立的方法來(lái)進(jìn)行分化為骨細(xì)胞的誘導(dǎo)(Zuk et al.，2002.Human adipose tissue isa source of multipotent stem cells(人脂肪組織是多能干細(xì)胞的來(lái)源).MolBiol Cell.2002Dec；13(12)4279-95)。
在培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco))中將細(xì)胞保持1周后，通過(guò)在特異性分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周來(lái)誘導(dǎo)向骨細(xì)胞的分化，該分化培養(yǎng)基由DMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco)、100nM地塞米松(Sigma)、50μM抗壞血酸-2-磷酸鹽(Sigma)和10mM β-磷酸甘油(Sigma)組成。
○脂肪形成分化 按照已經(jīng)為皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞和為其它細(xì)胞類型建立的方法來(lái)進(jìn)行分化為脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)(Zuk et al.，2002，上文所引用的；Awad etal.，2003.Effects of transforming growth factor betal and dexamethasone onthe growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和地塞米松對(duì)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和軟骨形成分化的影響).Tissue Eng.2003Dec；9(6)1301-12)。
在DMEM培養(yǎng)基、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco)中，將細(xì)胞在培養(yǎng)中保持1周后，通過(guò)兩種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B)的交替(alternation)來(lái)誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞的分化，兩種培養(yǎng)基的組成具體如下 培養(yǎng)基ADMEM(BE 12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco)、1μM地塞米松(Sigma)、0.2mM吲哚美辛(Sigma)、10μg/ml胰島素(Sigma)和0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma)。培養(yǎng)基BDMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、10％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco)和10μg/ml胰島素(Sigma)。
○軟骨形成分化 按照已經(jīng)為皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞和為其它細(xì)胞類型建立的方法來(lái)進(jìn)行分化為軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)(Zuket al.，2002，上文所引用的)。通過(guò)改變培養(yǎng)基和使細(xì)胞處于低氧濃度的組合來(lái)誘導(dǎo)分化 誘導(dǎo)前(Preinduction)將克隆在錐形底96孔板中離心，并使細(xì)胞團(tuán)塊(cell agglomerate)在含有1％FBS的DMEM中生長(zhǎng)24小時(shí)。
誘導(dǎo)將克隆在特定的培養(yǎng)基中維持20天，每3天更換培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基由DMEM(BE12-614F Cambrex，Biowhitaker)、1％FBS(5253Linus Cultek)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/mL青霉素/鏈霉素(Gibco)、6.25μg/ml胰島素(Sigma)、10ng/mL TGFB-1(R&D)和50nM抗壞血酸-2-磷酸鹽(ascorbic acid-2-phosphate)(Sigma)組成。
分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的epi-ADSC細(xì)胞的染色 使用了適合于每種分化的不同染色方法 ○成骨分化的染色 在4℃下，將細(xì)胞用50％乙醇固定15分鐘。在攪拌和室溫下，用含1％茜素紅的蒸餾水(pH＝4.1)染色45分鐘。集落(colony)被染為強(qiáng)烈的紅色，所述集落已經(jīng)分化并因此在它們周圍產(chǎn)生鈣。
○脂肪形成分化的染色 在室溫下，將細(xì)胞用含1∶10稀釋的37％甲醛的PBS(pH7.4)固定20分鐘。用油紅(100ml異丙醇中含0.3g油紅，在蒸餾水中1∶2稀釋)進(jìn)行染色，并在室溫下孵育20分鐘。積累在分化的細(xì)胞的液泡中的脂質(zhì)被染為紅色。
○軟骨形成分化的染色 在室溫下，將細(xì)胞用4％甲醛稀釋液固定1小時(shí)。用含0.1％稀釋度的愛茜藍(lán)的“酸醇”(蒸餾水中含70％乙醇、1％HCl)進(jìn)行染色，并在室溫下孵育1小時(shí)。洗滌后，將染色再用4％PFA固定。分化的細(xì)胞被染為藍(lán)色。
結(jié)果 對(duì)脂肪形成、成骨和軟骨形成細(xì)胞系特異性的染色結(jié)果的分析顯示，源自心臟脂肪組織的干細(xì)胞，特別是源自心外膜區(qū)域的干細(xì)胞(epi-ADSC)的染色明顯弱于皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)。強(qiáng)烈顏色的出現(xiàn)表明較大程度的分化，因此可得出結(jié)論，相對(duì)于皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)，心臟脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(epi-ADSC)具有較弱的分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力。
實(shí)施例6 人心臟脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC)的分離和表征 1.材料與方法 1.1心臟脂肪組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的收集 從在開始心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(cardiopulmonary bypass)之前接受心臟手術(shù)的患者獲得心臟脂肪組織的活組織檢查樣品。從接近心臟并圍繞主動(dòng)脈獲取心外膜脂肪組織的活組織檢查樣品(平均約0.5g至1.0g)。將來(lái)自117名患者(年齡67.5±9.2歲)的心臟脂肪組織的活組織檢查用于進(jìn)行這項(xiàng)研究，所述患者提供了他們的知情同意書。本研究得到Santa Creu i SantPau醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
如Martinez-Estrada，O.M.，et al.，Human adipose tissue as a source ofFlk-1+cellsnew method of differentiation and expansion(人脂肪組織為Flk-1+細(xì)胞的來(lái)源新的分化和擴(kuò)充方法).Cardiovasc Res 65，328-33(2005)所述，處理并分離樣品。在補(bǔ)充了10％FBS和1％青霉素-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco Invitrogen Corp.，Grand Island，NY，USA)中，使附著的細(xì)胞生長(zhǎng)，直至亞融合(subconfluence)，并在通常條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
1.2產(chǎn)克隆(clonogenic)測(cè)定 根據(jù)McFarland[McFarland，D.C.Preparation of pure cell cultures bycloning(通過(guò)克隆制備純細(xì)胞培養(yǎng)物).Methods Cell Sci 22，63-6(2000)]描述的方法進(jìn)行產(chǎn)克隆測(cè)定。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞以400個(gè)細(xì)胞/100cm2的密度接種在培養(yǎng)板內(nèi)，使單個(gè)的克隆發(fā)展至它們達(dá)到幾毫米(mm)的直徑。然后，除去培養(yǎng)基，并將克隆環(huán)圍繞集落放置。向克隆環(huán)內(nèi)添加補(bǔ)充了20％FBS和1％青霉素-鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基，并將板以通常條件進(jìn)行培養(yǎng)。
1.3畸胎瘤的評(píng)價(jià) 為了評(píng)價(jià)人心臟ADSC的致畸潛力，對(duì)4只12周大SCID小鼠(CB17xC57B1/6)(30g，Charles River Laboratories Inc.Wilmington，MA，USA)進(jìn)行了皮下和肌肉內(nèi)注射(1.5×106個(gè)細(xì)胞)。每周檢查動(dòng)物以評(píng)價(jià)腫瘤的形成。細(xì)胞注射后4個(gè)月后，收集皮膚、骨骼肌、肝和脾并對(duì)它們進(jìn)行組織學(xué)分析。
1.4脂肪形成和成骨分化測(cè)定 對(duì)擴(kuò)充的原代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定以確定脂肪形成和成骨潛力。如之前的描述[Phillis，B.D.，et al.Modification of d-amphetamine-inducedresponses by baclofen in rats(大鼠中通過(guò)巴氯芬改變d-苯丙胺誘導(dǎo)的應(yīng)答).Psychopharmacology(Berl)153，277-84(2001)；Roura，S.et al.Effect ofaging on the pluripotential capability of human CD105+mesenchymal stemcells(老化對(duì)人CD105+間充質(zhì)干細(xì)胞的多能能力的影響).Eur J HeartFail 8，555-63(2006)]，進(jìn)行分化和茜素紅S染色測(cè)定。
1.5流式細(xì)胞術(shù) 在第二代收集細(xì)胞，并用對(duì)CD105(Serotec)、CD44、CD166、CD29、CD90、CD117、CD106、CD34、CD45、CD14、CD133和VEGFR2特異性的單克隆抗體(BD Pharmingen)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。每種抗原的流式細(xì)胞水平通過(guò)特異性抗體與IgG同種型對(duì)照(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，USA)之間的比率來(lái)定義(1＝無(wú)差異)。將Coulter EPICS XL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Miami，F(xiàn)L，USA)用于獲得全部數(shù)據(jù)，并利用Expo32程序(Beckman Coulter)進(jìn)行分析。
1.6免疫抑制測(cè)定 為了分析心臟ADSC對(duì)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)增殖的影響，在存在或不存在適當(dāng)?shù)拇碳の?PHA 5μg/ml)的情況下，將心臟ADSC與2×105個(gè)PBL接種在5×103板中。將供體L100605(CMDL)的皮下ADSC接種在板中作為免疫抑制的對(duì)照。刺激4天后，向培養(yǎng)基添加BrdU，保持24小時(shí)，并按制造商的說(shuō)明(細(xì)胞增殖ELISA BrdU，Roche)，通過(guò)ELISA來(lái)確定增殖。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。顯示了關(guān)于無(wú)祖細(xì)胞PBL增殖的數(shù)據(jù)。
1.7基因芯片表達(dá)的分析 利用QuickPrep總RNA提取試劑盒(Amersham，F(xiàn)reiburg，Germany)，根據(jù)制造商的說(shuō)明，于第2代，分離4名不同患者的心臟ADSC的總RNA。從RNA制備cRNA，與Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片雜交，并進(jìn)行分析以確定差異表達(dá)的基因。如以前的描述[Virtaneva，K.et al.Expressionprofiling reveals fundamental biological differences in acute myeloidleukemia with isolated trisomy 8 and normal cytogenetics(表達(dá)譜揭示具有單獨(dú)的8三體性與正常細(xì)胞遺傳學(xué)的急性髓細(xì)胞白血病中的基本生物學(xué)差異).Proc Natl Acad Sci USA 98，1124-9(2001)]，由Instituto deInvestigacióen Biomedicina(生物醫(yī)學(xué)研究院(Institute of BiomedicalResearch))(Barcelona，Spain)的Grupo de Genómica Funcional(功能基因組小組(Functional Genomic Group))，根據(jù)制造商的說(shuō)明(Affymetrix，SantaClara，CA)，處理基因芯片微陣列。在惠普基因陣列掃描儀(Hewlett-Packard GeneArray Scanner)中掃描表達(dá)信號(hào)。
利用R對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先，采用R中所提供的gcRMA算法，使未經(jīng)處理的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，然后利用FLUSH[Calza，S.et al.Filteringgenes to improve sensitivity in oligonucleotide microarray data analysis(過(guò)濾基因以改進(jìn)寡核苷酸微陣列數(shù)據(jù)分析的靈敏度).Nucleic Acids Res 35，e102(2007)]來(lái)過(guò)濾探針，并利用GenePattern[Reich，M.et al.GenePattern2.0.Nat Genet 38，500-1(2006)]來(lái)提取相關(guān)的變化。將所得的結(jié)果與從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；注冊(cè)IDGDS2366)獲得的那些關(guān)于未分化的皮下脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞的公開陣列的結(jié)果[Tchkonia，T.et al.Identification of depot-specific human fat cell progenitors throughdistinct expression profiles and developmental gene patterns(通過(guò)不同的表達(dá)譜和發(fā)育基因模式鑒定部位特異性人脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞).Am J PhysiolEndocrinol Metab 292，E298-307(2007)]進(jìn)行比較。為此，將陣列中的每組以百分比范圍策略(percentage range strategy)進(jìn)行分類(兩項(xiàng)研究都在相同平臺(tái)中進(jìn)行)，然后在這2項(xiàng)研究之間比較這種百分比范圍。使用百分比范圍而不是強(qiáng)度值使得能防止可能存在于任何雜交中的任何系統(tǒng)偏差。
1.8定量實(shí)時(shí)RT-PCR 如之前所解釋的，分離心臟ADSC和皮下ADSC的總RNA。利用隨機(jī)六聚體(Qiagen)和ScriptTM單步RT-PCR試劑盒(BioRad Laboratories)，根據(jù)制造商的方法，從2mg的總RNA合成cDNA。定量實(shí)時(shí)RT-PCR方法的細(xì)節(jié)描述如下。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)PCR，用2ml的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并且最終體積為50μl，其含有25ml的TaqMan 2X通用PCR Master Mix和用從AppliedBiosystems(Foster City，CA，USA)獲得的FAM標(biāo)記的每種探針/引物2mlGATA4(Hs00171403_m1)、連接蛋白43(Cx43)(Hs00748445_s1)、SERCA2(Hs00544877_m1)、心臟肌鈣蛋白I(cTn-I)(Hs00165957_m1)、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(Hs00241650_m1)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)(Hs00165276_m1)、VCAM-1(Hs00365486_m1)、馮維勒布蘭德(vonWillebrand)因子(vWF)(Hs00169795_m1)、VE-鈣粘著蛋白(Hs00174344_m1)、CD34(Hs00990732_m1)、EGR-3(Hs00231780_m1)、CD102(Hs00168384_m1)、CD36(Hs00169627_m1)、VEGF-A(Hs00173626_m1)、EGR-1(Hs00152928_m1)、CD31(Hs00169777_m1)、SDF-1(Hs00930455_m1)、CXCR-4(Hs00237052_m1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(Hs99999905_m1)。在ABI Prism 7000(ABI)序列檢測(cè)系統(tǒng)中收集并分析數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品分析兩次。如已經(jīng)描述的[Pfaffl]，M.W.A newmathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR(實(shí)時(shí)RT-PCR中用于相對(duì)定量的新數(shù)學(xué)模型).Nucleic Acids Res 29，e45(2001)]，將Δ閾值循環(huán)方法(Ct)用于(Ct是PCR循環(huán)，其中第一次檢測(cè)到高于起初水平的指示劑熒光的增加)計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)的相對(duì)定量，并且將GAPDH用作內(nèi)源參照。
1.9蛋白提取和蛋白印跡 根據(jù)已經(jīng)描述的方法[Roura，S.et al.Idiopathic dilated cardiomyopathyexhibits defective vascularization and vessel formation(特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病顯示有缺陷的血管化和血管形成).Eur J Heart Fail 9，995-1002(2007)]來(lái)獲得蛋白提取物。通過(guò)Bio-Rad DC蛋白測(cè)定(Bio-Rad)，用牛血清白蛋白(BSA)來(lái)將蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并且將樣品在5％至10％的SDS-PAGE凝膠中分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Bio-Rad)上，分別用對(duì)GATA4(1∶500)、SERCA2(1∶100)、α-肌動(dòng)蛋白(1∶300)、cTnI(1∶300)(Santa CruzBiotech.)、Cx43(1∶500)(BD Transduction，Lexington，KY，USA)、β-MHC(1∶10)(Chemicon，Temecula，CA，USA)和肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白(1∶500)(Sigma，St.Louis，MO，USA)特異性的單克隆抗體(AcM)對(duì)蛋白進(jìn)行檢查。將增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham BioSciences)用于觀察蛋白帶。
1.10免疫細(xì)胞熒光染色 在室溫下，將細(xì)胞通透化，在5％正常山羊血清(normal goat serum)中封閉30分鐘，并用抗-GATA4、抗SERCA2、抗cTnI(2μg/ml)(Santa CruzBiotechnology)、抗α肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(1∶500稀釋)(Sigma)、抗β-MHC(不稀釋)(Chemicon)和抗Cx43(2.5μg/ml)(BD Transduction)的抗體標(biāo)記1小時(shí)。應(yīng)用與Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 568偶聯(lián)的第二抗體(5μg/ml)(Molecular Probes)，并用共焦激光掃描顯微鏡(Leica TCS SP5)來(lái)觀察信號(hào)。
1.11心臟ADSC共培養(yǎng) 如之前描述的[Gandia，C.et al.Human dental pulp stem cells improveleft ventricular function，induce angiogenesis，and reduce infarct size in ratswith acute myocardial infarction(人牙髓干細(xì)胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、誘導(dǎo)血管生成并減小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)]，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，用eGFP標(biāo)記心臟ADSC。如之前描述的[Fukuhara，S.et al.Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key forbone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro(直接細(xì)胞細(xì)胞相互作用對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外成為心臟細(xì)胞系是關(guān)鍵的).J ThoracCardiovasc Surg 125，1470-80(2003)]，通過(guò)酶分散，從初生大鼠(1天至3天大)分離新生大鼠心肌細(xì)胞。在4∶1DMEM∶M-199(Sigma)中，將心肌細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度維持在涂覆有2％明膠的板上，用于實(shí)驗(yàn)，該4∶1DMEM∶M-199(Sigma)補(bǔ)充了5％FBS、10％馬血清(Invitrogen)、1％青霉素-鏈霉素和100μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma)。然后將eGFP+ADSC和新生心肌細(xì)胞以1∶25的比率混合，并將它們以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種。在37℃下和含5％CO2的空氣中，將這些細(xì)胞不間斷地一起培養(yǎng)(共培養(yǎng))30天。
1.12內(nèi)皮分化測(cè)定 如之前描述的[Heydarkhan-Hagvall，S.et al.Human adipose stem cellsa potential cell source for cardiovascular tissue engineering(人脂肪干細(xì)胞心血管組織工程的潛在細(xì)胞來(lái)源).Cells Tissues Organs 187，263-74(2008)；Liu，J.W.et al.Characterization of endothelial-like cells derived from humanmesenchymal stem cells(源自人間充質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)皮樣細(xì)胞的表征).JThromb Haemost 5，826-34(2007)]，擴(kuò)充心臟ADSC并分析內(nèi)皮分化。將Dil-Ac-LDL(10μg/ml，Biomedical Technologies)的摻入用于評(píng)價(jià)內(nèi)皮分化。
1.13血管結(jié)構(gòu)的體外形成 為了誘導(dǎo)管腔化(tubulogenesis)，將心臟ADSC以每cm2 26,000個(gè)細(xì)胞的密度接種在涂覆有1％ECMatrixTM(Chemicon International)的板上，并且用生物素化的GSLI同工凝集素B4(Griffonia Simplicifolia I B4凝集素)(Vector Labs)，在2、4和7小時(shí)檢查小管形成。將偶聯(lián)了Alexa Fluor568的鏈霉親和素(5μg/ml)(Molecular Probes)用于檢測(cè)被標(biāo)記的細(xì)胞。
1.14心臟ADSC的成血管(vasculoeenesis)潛能 在常氧(21％O2)、中度低氧(5％O2)和重度低氧(1％O2)下培養(yǎng)24小時(shí)的第二代中，從10,000個(gè)細(xì)胞/cm2獲得條件培養(yǎng)基。利用多重免疫測(cè)定(Procarta細(xì)胞因子測(cè)定試劑盒(Cytokine Assay Kit)，Panomics)來(lái)分析血管生成細(xì)胞因子濃度。條件培養(yǎng)基中所分析的的細(xì)胞因子為IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、PDGFBB和bFGF。結(jié)果表示為收集培養(yǎng)基時(shí)，106個(gè)細(xì)胞所分泌的因子的平均值±s.d.(pg)。
2.結(jié)果 2.1心臟ADSC的分離和表征 從所有經(jīng)歷心臟手術(shù)患者的心臟脂肪組織樣品成功地分離干細(xì)胞(祖細(xì)胞)群，并在單層培養(yǎng)中擴(kuò)充和進(jìn)行表征(圖6)。在所描述的條件下培養(yǎng)3天后，出現(xiàn)類似于連接的成纖維細(xì)胞的一些伸長(zhǎng)的細(xì)胞(圖6b)。
這些細(xì)胞是產(chǎn)克隆的，復(fù)制時(shí)間(Td)約為5天的，并且不在SCID小鼠中誘導(dǎo)畸胎瘤形成(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，觀察到用脂肪形成和成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)心外膜脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(epi-ADSC)未引起脂滴(lipiddrop)的細(xì)胞內(nèi)積累，也未引起細(xì)胞外鈣沉積(圖7a)；然而，相反地，皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(sub-ADSC)容易地獲得脂肪形成細(xì)胞系(圖7b)。
對(duì)表面標(biāo)志物情況進(jìn)行檢查以在免疫表型上表征所分離的心臟ADSC。超過(guò)90％的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)類型模式。所述細(xì)胞對(duì)CD105、CD44、CD166、CD29和CD90為強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)CD106、CD117、CD34、CD45、CD14和CD133以及VEGFR2為弱陽(yáng)性或陰性(圖6c)。
另外，心臟ADSC可部分地抑制外周血淋巴細(xì)胞增殖(42％增殖減少)，這表明了心臟ADSC中等的免疫抑制能力。
2.2心臟ADSC的心肌形成細(xì)胞系分化 進(jìn)行微陣列基因芯片分析以分析心臟ADSC的基因表達(dá)譜。將結(jié)果與從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)得到的未分化的皮下脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行比較。在檢查的約22,000個(gè)基因中，與皮下脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)了心臟ADSC內(nèi)一些心臟標(biāo)志物的差異表達(dá)(表3)。
利用定量實(shí)時(shí)RT-PCR(圖8)，與分離的皮下脂肪組織干細(xì)胞相比，在心臟ADSC中檢測(cè)到GATA4轉(zhuǎn)錄因子和連接蛋白43(Cx43)非常高的表達(dá)，該連接蛋白43為負(fù)責(zé)鄰近心肌細(xì)胞間電化學(xué)偶聯(lián)的蛋白。SERCA2、cTnI、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白和β-MHC的轉(zhuǎn)錄水平在兩種細(xì)胞群中類似。
在蛋白水平上，在初始培養(yǎng)基中，心臟ADSC表達(dá)β-MHC、SERCA2、肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白、Cx43和GATA4(圖9a)以及痕量的Tbx5(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)蛋白印跡(圖9a)和免疫熒光(圖9b至9e)證實(shí)了這些結(jié)果。如所觀察到的，β-MHC纖維已顯示出確定的胞質(zhì)分布(圖9b)。相反地，皮下ADSC顯示出缺乏β-MHC、Cx43、cTnI和GATA4，以及肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白的較低表達(dá)(圖9a)。
人心臟ADSC和新生大鼠心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)顯示了所分析的人細(xì)胞的心臟生成潛力。共培養(yǎng)中β-MHC(圖10c)、肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白(圖10n)、Cx43(圖10m)、SERCA2(圖10q)和GATA4(圖10r)的強(qiáng)度和配置(disposition)增強(qiáng)了，并且與在新生心肌細(xì)胞中所觀察到的強(qiáng)度和配置相當(dāng)。更重要的是，共培養(yǎng)刺激了肌鈣蛋白I的表達(dá)，其是重要的肌節(jié)蛋白，而在未刺激的培養(yǎng)中沒有觀察到該肌鈣蛋白I的表達(dá)(圖10b、10f和10j)。肌鈣蛋白I胞質(zhì)中的排列也類似于在培養(yǎng)中的心肌細(xì)胞內(nèi)所觀察到的亞細(xì)胞肌節(jié)組織(organization)。
2.3培養(yǎng)中的心臟ADSC向內(nèi)皮細(xì)胞系的分化 如之前所述的，在心臟ADSC中進(jìn)行的基因芯片微陣列分析，及其與未分化的皮下脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞的比較顯示了心臟ADSC中具有更大百分比范圍的促血管生成基因的表達(dá)。另外，血管生成抑制劑的表達(dá)顯著地低(表4)。
為了確定人心臟ADSC的內(nèi)皮細(xì)胞系潛力，用EGM-2分化培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。處理與未處理(對(duì)照)細(xì)胞的內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄水平的比較顯示出內(nèi)皮標(biāo)志物CD34、VEGF-α、VCAM-1、VE-鈣粘著蛋白、ERG-1、ERG-3、CD31和SDF-1表達(dá)的增加(圖11)。有趣的是，觀察到SDF-1因子表達(dá)出現(xiàn)了120倍的增加，該SDF-1因子有助于內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及增強(qiáng)成血管[Yamaguchi，J.et al.Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivoexpanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemicneovascularization(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1對(duì)為缺血性新血管形成所募集的離體擴(kuò)充的內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響).Circulation 107，1322-8(2003)；Zhang，M.et al.SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic supportof cardiac myocytes after myocardial infarction(間充質(zhì)干細(xì)胞的SDF-1表達(dá)導(dǎo)致對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持).Faseb J 21，3197-207(2007)]，而CD31、ERG1和ERG3分別增加15、10和16倍以上。而且，也通過(guò)DiI-Ac-LDL的快速摻入和代謝證實(shí)了這些細(xì)胞的內(nèi)皮分化[Voyta，J.C.etal.Identification and isolation of endothelial cells based on their increaseduptake of acetylated-low density lipoprotein(基于內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)乙?；兔芏戎鞍讛z取的增加而鑒定并分離內(nèi)皮細(xì)胞).J Cell Biol 99，2034-40(1984)](圖11b)。
還進(jìn)行了功能性血管生成測(cè)定，以證實(shí)心臟ADSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞系的能力。在基質(zhì)膠涂層內(nèi)和通常條件下培養(yǎng)細(xì)胞后，形成了管狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)快速發(fā)展以形成管狀網(wǎng)絡(luò)，并且在其組織結(jié)構(gòu)和其直徑方面生長(zhǎng)(圖11c至11e)。還對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行染色以檢測(cè)特異性內(nèi)皮標(biāo)志物GSLI同工凝集素B4(圖11f和11g)。
2.4心臟ADSC分泌促血管生成因子 在低氧條件下分析了促血管生成因子的體外分泌，以測(cè)試，當(dāng)將心臟ADSC注射入心肌缺血時(shí)，該心臟ADSC是否在宿主組織中分泌這些因子，從而增強(qiáng)血管形成。在常氧下，細(xì)胞分泌顯著量的IL-6(53.677±24.613pg/ml/106個(gè)細(xì)胞)和VEGF(3.201±1.011pg/ml/106個(gè)細(xì)胞)，以及少量的bFGF(161.0±31.2pg/ml/106個(gè)細(xì)胞)和TNF-α(59.1±16.0pg/ml/106個(gè)細(xì)胞)。未檢測(cè)到IL-1β或PDGFBB的表達(dá)。在中度低氧(5％O2)和重度低氧(1％O2)下，VEGF的分泌大量增加(92％；p＝0.04)，IL-6、bFGF和TNF-α濃度增加約20％。IL-1β和PDGFBB的水平仍然是不可檢測(cè)的。
實(shí)施例7 心肌梗死后心臟ADSC的移植改善心臟功能 1.材料與方法 1.1心肌梗死和細(xì)胞移植模型 1.1.1大鼠 將總共16只雄性裸大鼠(200g至250g；NIH-Foxn1rnu，Charles RiverLaboratories Inc.Willmington，MA，USA)用于這項(xiàng)研究。如之前所述的[Gandia，C.et al.Human dental pulp stem cells improve left ventricularfunction，induce angiogenesis，and reduce infarct size in rats with acutemyocardial infarction(人牙髓干細(xì)胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、誘導(dǎo)血管生成并減小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)]，將左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。將大鼠插管，用O2/喜保福寧(Sevorane)混合物麻醉，并進(jìn)行機(jī)械通氣(Harvard Apparatus 683型小動(dòng)物換氣機(jī)(HarvardApparatus model 683 small animal ventilator))，并且在胸廓切開術(shù)后，通過(guò)用6-0聚丙烯紡織纖維永久性結(jié)扎LAD冠狀動(dòng)脈來(lái)誘導(dǎo)急性心肌梗死。將切口用3-0絲縫線閉合。一周后，將大鼠麻醉，并通過(guò)正中胸骨切開術(shù)再次打開，以便進(jìn)行心肌內(nèi)移植(懸浮在鹽水中的106個(gè)心臟GFP-ADSC細(xì)胞或等體積鹽水)，用漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)在梗死邊界區(qū)域的5個(gè)點(diǎn)注射5次5μl的體積。
注射細(xì)胞約30天后，用終止液(68.4mM NaCl、59mM KCl、11.1mM葡萄糖、1.9mM NaHCO3、29.7mM BDM(2，3-丁二酮-單肟(2，3-butanedione-monoxime))、1,000U肝素)將心臟停止在舒張期，將心臟切開、固定、冷凍于含30％蔗糖的PBS中，包埋在OCT(Sakura，Torrance，California，USA)中，并用液氮在冷卻的異戊烷中快速冷凍。將組織塊保存在-80℃，直到將它們切片。
在所有過(guò)程中，使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究所的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Animal Research)(NIH Pub.No.86-23，1996年修訂)的標(biāo)準(zhǔn)。
1.1.2超聲波心動(dòng)描記法 為了評(píng)價(jià)心臟功能，如以前描述的[Friedrich，J.et al.31P nuclearmagnetic resonance spectroscopic imaging of regions of remodeledmyocardium in the infarcted rat heart(梗死大鼠心臟中重塑心肌區(qū)域的31P核磁共振光譜成像).Circulation 92，3527-38(1995)]，在大鼠中進(jìn)行經(jīng)胸廓超聲波心動(dòng)描記法。使用配備了10MHz線性網(wǎng)絡(luò)傳感器(transducer)的超聲波心動(dòng)描記系統(tǒng)(General Electric)，并且在初始水平(梗死前1天)和細(xì)胞移植后15及30天進(jìn)行測(cè)量。在胸骨旁短軸觀(view)進(jìn)行中央乳頭二維(2-D)M模式超聲波心動(dòng)描記。利用常規(guī)方法[Litwin，S.E.，Katz，S.E.，Morgan，J.P.& Douglas，P.S.Serial echocardiographic assessment of leftventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat(大鼠中大面積心肌梗死后左心室?guī)缀涡螤詈凸δ艿倪B續(xù)超聲波心動(dòng)描記評(píng)價(jià)).Circulation 89，345-54(1994)]，在5個(gè)連續(xù)心臟循環(huán)上計(jì)算功能參數(shù)。
對(duì)舒張期和收縮期中前壁和后壁(AW和PW)的尺寸、舒張末期(LVDd)和收縮末期(LVDd)LV的尺寸、舒張末期面積(EDA)和收縮末期面積(ESA)進(jìn)行定量。AW和PW的變化分別計(jì)算為(AWs/AWd-1)x100和(PWs/PWd-1)x100?？s短分?jǐn)?shù)(FS)按[(LVDd-LVDs)/LVDd]x100計(jì)算，射血分?jǐn)?shù)(EF)按[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]x 100計(jì)算。
1.2形態(tài)測(cè)量 1.2.1大鼠 將大鼠心臟橫切為三個(gè)節(jié)段頂部、中部(包含結(jié)扎)和基部。為了測(cè)量，將中部節(jié)段的10μm厚的冷凍切片(6個(gè)切片，分開200μm)用Masson三色連續(xù)染色，并利用圖像分析軟件(ImageJ，NIH)確定形態(tài)測(cè)量參數(shù)。梗死大小根據(jù)總LV壁表面內(nèi)平均瘢痕面積的百分比來(lái)測(cè)量。梗死厚度根據(jù)部分心內(nèi)(endocardial)梗死面積的總和來(lái)計(jì)算[Takagawa，J.et al.Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction modelcomparison of area-and length-based approaches(小鼠慢性梗死模型中的心肌梗死大小測(cè)量基于面積和基于長(zhǎng)度的方法的比較).J Appl Physiol 102，2104-11(2007)]。對(duì)所有的切片都進(jìn)行盲檢(examine blindly)，并利用Leica立體鏡(Leica TL RCI)照相。
1.2.2免疫熒光組織學(xué) 對(duì)大鼠心臟的冷凍切片進(jìn)行雙重免疫染色。將組織與抗CD31(1∶25)(Abcam)和肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白(1∶500稀釋)(Sigma)或cTnI(2μg/ml)(SantaCruz Biotechnology)的第一抗體一起孵育。為了對(duì)大鼠心臟中的人細(xì)胞進(jìn)行免疫組織學(xué)檢測(cè)，將組織切片與抗人核抗原抗體(HNA，Chemicon)一起孵育。使用與Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568和Alexa Fluor 647偶聯(lián)的第二抗體(5μg/ml)(Molecular Probes)。用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylyndole)(DAPI，Sigma)對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染，并用LeicaTCS SP5進(jìn)行分析。
1.2.3毛細(xì)血管密度 為了確定梗死的邊界區(qū)域中和梗死的遠(yuǎn)端心肌中的毛細(xì)血管密度，利用生物素化的GSLI同工凝集素B4(Vector Labs)將心臟切片染色。將偶聯(lián)了Alexa Fluor 568的鏈霉親和素用作檢測(cè)系統(tǒng)。在4只對(duì)照動(dòng)物和5只處理的動(dòng)物的至少12個(gè)隨機(jī)選擇的部位(6個(gè)邊界區(qū)域+6個(gè)遠(yuǎn)端區(qū)域)中對(duì)毛細(xì)血管記數(shù)。結(jié)果表示為每mm2組織面積的平均毛細(xì)血管數(shù)量。兩名對(duì)處理不知情的獨(dú)立觀察者分析了對(duì)照組和處理組，并且組間相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient between classes)(CHF)在邊界區(qū)域中為0.821(p＜0.001)，在遠(yuǎn)端區(qū)域中為0.743(p＜0.001)?？紤]到研究者獲得的值是類似的，每個(gè)點(diǎn)的最終結(jié)果為平均值±SEM。
1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的切片都由兩名研究者進(jìn)行盲檢、記數(shù)和審核(review)。FS、EF和AWT數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)用于組間多重比較的方差分析(雙因素ANOVA(two-way ANOVA))來(lái)評(píng)價(jià)，并應(yīng)用Greenhouse校正。MI期間和30天后的超聲波心動(dòng)描記參數(shù)(表5)，以及對(duì)照組與細(xì)胞之間的形態(tài)測(cè)量值都利用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果表示為平均值±SD。利用t檢驗(yàn)，還比較邊界和遠(yuǎn)端區(qū)域內(nèi)對(duì)照組與細(xì)胞之間的毛細(xì)血管密度差異。p＜0.05的值被認(rèn)為在組間是顯著的。用SPSS進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)。
2.結(jié)果 2.1心臟ADSC移植改善心肌梗死后的心臟功能 在最初水平，心肌梗死(MI)后，以及向裸大鼠注射細(xì)胞高達(dá)30天后獲得對(duì)照組和心臟ADSC組的超聲波心動(dòng)描記參數(shù)(表5)。在最初水平和MI后，所分析的超聲波心動(dòng)描記參數(shù)值在處理和未處理的動(dòng)物中類似，這表明相似水平的組織損傷。MI后，在MI與30天之間，在處理的組中檢測(cè)到明顯的功能改善(表5)。對(duì)照組的發(fā)展顯示出由于左心室(LV)的重塑而引起的心臟功能參數(shù)的進(jìn)行性(progressive)惡化，這通過(guò)LV的直徑和舒張末期及收縮末期LV的面積來(lái)確定(表5)。利用雙因素ANOVA系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與用細(xì)胞處理的組在縮短分?jǐn)?shù)(p＝0.024)和射血分?jǐn)?shù)(p＝0.003)方面有顯著差異(圖12a和12b)。而且，在心臟ADSC處理30天后，前壁顯著地更厚(p＝0.014)(圖12c)。心臟活動(dòng)性的視頻記錄顯示了心臟ADSC組中收縮性的改善，但對(duì)照組中并非如此。
2.2心臟ADSC移植減少梗死大小 將Masson三色染色的橫切片用于測(cè)量MI大鼠模型中形態(tài)參數(shù)。在結(jié)扎LAD后出現(xiàn)了中度瘢痕(LV面積的約20％)，并且心臟ADSC的有益效果是非常明顯的。與對(duì)照動(dòng)物相比，處理的動(dòng)物中纖維瘢痕組織面積百分比低75％，并且處理的動(dòng)物中LV壁厚45％。因此，通過(guò)組織病理學(xué)，注射心臟ADSC 30天后，心臟ADSC有效地降低了梗死大小。
2.3人心臟ADSC移植和體內(nèi)分化 通過(guò)跟蹤eGPF表面熒光(eGPF epifluorescence)來(lái)分析人心臟ADSC圖，并且通過(guò)HNA(人核抗原)檢測(cè)(紅色信號(hào))來(lái)證實(shí)來(lái)源于人(圖14a)。還通過(guò)染色分離的光譜分析(λ考察(lambda exploration))來(lái)證實(shí)eGFP的特異性信號(hào)(圖15)。有趣的是，觀察到細(xì)胞均勻地位于組織的瘢痕區(qū)域內(nèi)，并且與針對(duì)梗死邊界區(qū)域的注射無(wú)關(guān)，這表明細(xì)胞能夠向可能特別需要它們的地方遷移(圖14b)。為了分析所注射細(xì)胞的心臟和內(nèi)皮分化水平以及它們?cè)谒拗鹘M織內(nèi)的移植，進(jìn)行了針對(duì)心臟標(biāo)志物(肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白I)和內(nèi)皮標(biāo)志物(CD31)的雙重免疫染色。心臟eGFP+-ADSC再次顯示出肌鈣蛋白I的表達(dá)(圖14b)，并且對(duì)肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白是陽(yáng)性的(圖14c)。在心臟eGPF+-ADSC中也觀察到CD31的表達(dá)，其在形成管狀結(jié)構(gòu)的組織內(nèi)普遍排列(arrange)，這提示這些細(xì)胞有助于新血管的形成(圖14d)。
2.4心臟ADSC導(dǎo)致血管密度增加 最后，將GSLI同工凝集素B4用于評(píng)價(jià)纖維化組織(fibrotic tissue)邊界區(qū)域內(nèi)和心臟ADSC移植一段時(shí)間后的毛細(xì)血管密度。如圖16c所示，接收了心臟ADSC的動(dòng)物中邊界區(qū)域內(nèi)的毛細(xì)血管密度比對(duì)照動(dòng)物高1.6倍(p＝0.003)(圖16a和16b)，并且還發(fā)現(xiàn)了遠(yuǎn)端區(qū)域內(nèi)毛細(xì)血管密度增加的趨勢(shì)(p＝0.057)。這些血管的管腔(lumen)內(nèi)血細(xì)胞的存在表明這些血管是有功能的。
3.討論 本說(shuō)明書所附的實(shí)施例1至7中所示的結(jié)果清楚地表明，已經(jīng)鑒定并表征了心臟脂肪組織來(lái)源的新成體干細(xì)胞群(心臟ADSC)。所述心臟ADSC表達(dá)類似于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的表面標(biāo)志物，并保留了產(chǎn)克隆能力；而且，盡管所述心臟ADSC來(lái)自脂肪組織，但是它們不像MSC那樣分化為脂肪細(xì)胞，這表明了較低的可塑性和更為確定的狀況。而且，心臟ADSC表達(dá)幾種必要的心肌形成標(biāo)志物，例如GATA4、Cx43、β-MHC、肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白或SERCA2。心臟ADSC和皮下ADSC的基因表達(dá)及心肌形成蛋白的比較顯示，這些蛋白在心臟ADSC中表達(dá)明顯更高。這些結(jié)果提示，盡管新心臟ADSC位于脂肪細(xì)胞環(huán)境中，但是它們可在心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起作用。圍繞心臟的脂肪還可充當(dāng)細(xì)胞的預(yù)留(reservation)，來(lái)用于更新心肌組織；然而，梗死后產(chǎn)生的面臨風(fēng)險(xiǎn)的大量心肌超出了組織修復(fù)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力。
當(dāng)心臟ADSC受新生大鼠心肌細(xì)胞的影響時(shí)，心肌形成標(biāo)志物的表達(dá)被明顯上調(diào)(α-輔肌動(dòng)蛋白肌節(jié)、β-MHC、SERCA2)，或被從頭激活(肌鈣蛋白I)。較早的研究證實(shí)，新生心肌細(xì)胞刺激的心臟分化的機(jī)制可以是分化因子的分泌、細(xì)胞間相互作用以及電和機(jī)械刺激。而且，心臟ADSC在基質(zhì)膠或在內(nèi)皮分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)導(dǎo)致管狀結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致Dil-Ac-LDL的摻入，以及導(dǎo)致內(nèi)皮標(biāo)志物表達(dá)的增強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了心臟ADSC分化為心臟細(xì)胞系的能力。當(dāng)心臟ADSC被移植入梗死的心肌中時(shí)，觀察到所述心臟ADSC表達(dá)肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白、cTnI和CD31，并且被有效地移植在心肌中。細(xì)胞相互作用連同組織的電和機(jī)械影響刺激了心臟ADSC的分化。細(xì)胞移植獲得了改善的心臟功能，并且用細(xì)胞處理的動(dòng)物中射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)和LV壁厚度有明顯增加。心臟ADSC的有益效果等同或優(yōu)于通過(guò)骨髓細(xì)胞[Agbulut，O.et al.Comparison ofhuman skeletal myoblasts and bone marrow-derived CD 133+progenitors forthe repair of infarcted myocardium(用于修復(fù)梗死的心肌的人骨骼成肌細(xì)胞和骨髓來(lái)源CD133+祖細(xì)胞的比較).J Am Coll Cardiol44，458-63(2004)]和成體心臟干細(xì)胞[Beltrami，A.P.et al.Adult cardiac stem cells aremultipotent and support myocardial regeneration(成體心臟干細(xì)胞是多能性的并支持心肌再生).Cell 114，763-76(2003)]所觀察到的有益效果，所述骨髓細(xì)胞和所述成體心臟干細(xì)胞分別改善射血分?jǐn)?shù)7％和9.7％；或者等同或優(yōu)于通過(guò)臍帶血單核細(xì)胞[Henning，R.J.et al.Human umbilical cordblood mononuclear cells for the acute myocardial infarction treatment(用于急性心肌梗死治療的人臍帶血單核細(xì)胞).Cell Transplant 13，729-39(2004)]所觀察到的有益效果，當(dāng)所述臍帶血單核細(xì)胞被移植入梗死的心肌中時(shí)，它們顯示了27％的射血分?jǐn)?shù)降低。
為了確定心臟ADSC是否能夠在缺血性組織中存活并有益于血管生成，將細(xì)胞在中度和重度低氧條件下培養(yǎng)，并分析促血管生成因子向培養(yǎng)基中的分泌。結(jié)果顯示，與常氧相比，VEGF、TNF-β、bFGF和IL-6增加了。已有報(bào)道，當(dāng)向動(dòng)脈硬化患者提供單一的血管生成因子時(shí)，新血管形成應(yīng)答僅是有限的。這種結(jié)果可能的解釋是，血管網(wǎng)絡(luò)的形成及其擴(kuò)充是需要多種因子協(xié)同作用的過(guò)程。因此，心臟ADSC基線條件下促血管生成因子的組合的分泌以及該促血管生成因子在低氧狀況下的增加使得這些細(xì)胞潛在地用于它們?cè)谛募∪毖械淖⑸洹Ｊ聦?shí)上，在將心臟ADSC移植入梗死的心臟后，觀察到了毛細(xì)血管密度的明顯增加。所有這些情況綜合地提示，這些細(xì)胞(心臟ADSC)可對(duì)心肌缺血有旁分泌效果，從而有益于新血管的形成。大量的毛細(xì)血管改善了心肌中的氧限制，因此有益于這樣的梗死大小明顯減小，即大鼠中43％的減少。而且，有報(bào)道顯示SDF-1的增加可在梗死后改善心肌細(xì)胞的存活并誘導(dǎo)新血管形成[Penn，M.S.& Mangi，A.A.Genetic enhancement of stem cell engraftment，survival，and efficacy(干細(xì)胞植入、存活和功效的遺傳增強(qiáng)).Cire Res 102，1471-82(2008)]。因此，心臟ADSC體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞系的證實(shí)和體外內(nèi)皮分化后觀察到的SDF-1明顯的過(guò)量表達(dá)提示，SDF-1具有對(duì)心肌細(xì)胞的心臟保護(hù)效果以及血管生成效果。
應(yīng)當(dāng)觀察到，盡管心臟ADSC被注射在梗死的邊界區(qū)域內(nèi)，但是細(xì)胞卻位于纖維化瘢痕內(nèi)。這表明了心臟ADSC從注射位點(diǎn)向特別需要它們的缺血區(qū)域遷移的能力。利用其它干細(xì)胞系的較早期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了類似的結(jié)果，這通過(guò)由于低氧條件下VEGF的趨化效應(yīng)所導(dǎo)致的細(xì)胞遷移應(yīng)答(migration response)得到了解釋[Gandia，C.et al.Human dental pulp stemcells improve left ventricular function，induce angiogenesis，and reduceinfarct size in rats with acute myocardial infarction(人牙髓干細(xì)胞在患有急性心肌梗死的大鼠中改善左心室功能、誘導(dǎo)血管生成并減小梗死大小).Stem Cells 26，638-45(2008)；Matsushita，K.et al.The role of vascularendothelial growth factor in human dental pulp cellsinduction of chemotaxis，proliferation，and differentiation and activation of the AP-1-dependentsignaling pathway(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在人牙髓細(xì)胞中的作用誘導(dǎo)趨化性、增殖和分化并激活A(yù)P-1依賴性信號(hào)途徑).J Dent Res 79，1596-603(2000)]。在同級(jí)別的證據(jù)中，在雞胚胎中進(jìn)行的研究顯示，心臟損傷是吸引人臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞的有力刺激[Torre-Perez，N.et al.Migrationand differentiation of human umbilical cord stem cells after heart injury inchicken embryos(雞胚胎中人臍帶血干細(xì)胞在心臟損傷后的遷移和分化).Stem Cells Dev(2008)]。
心臟脂肪組織圍繞心臟緊密排列，因而心臟ADSC的獲取是不利條件。盡管可容易地進(jìn)行左側(cè)胸廓切開術(shù)以獲得心臟脂肪活組織檢查來(lái)分離這些心臟ADSC，但是這種方法看來(lái)在心肌梗死的緊急狀況下，在臨床上是不合適的，雖然其可在穩(wěn)定的缺血性患者的冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)之前使用。但是，心臟ADSC具有類似于對(duì)其它類型的間充質(zhì)干細(xì)胞描述的免疫抑制能力的事實(shí)使得在將來(lái)有在同種異體治療上使用這些細(xì)胞的可能性。
總之，本發(fā)明描述了具有內(nèi)在內(nèi)皮和心臟潛力的新類型的干細(xì)胞(祖細(xì)胞)，所述細(xì)胞在體外和體內(nèi)可分化為心臟細(xì)胞系，并且，在MI后將它們注射入損傷心肌時(shí)具有有益的功能和組織病理學(xué)效果。無(wú)意被任何理論所束縛，認(rèn)為可能存在重塑衰減的雙重機(jī)制，其中所述細(xì)胞具有替代損失的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的潛力，并且還對(duì)增強(qiáng)血管生成具有旁分泌效果。這些性質(zhì)，連同免疫抑制能力和不存在致畸性，使得心臟ADSC是安全的，并且對(duì)于它們將來(lái)用在再生損傷心肌的細(xì)胞治療中是有希望的候選物。







權(quán)利要求
1.源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，還組成型表達(dá)β-MHC。
3.如權(quán)利要求1或2中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，還表達(dá)一種或多種選自CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166的表面標(biāo)志物。
4.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，不表達(dá)下述表面標(biāo)志物的一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
5.如權(quán)利要求3或4中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，其(i)表達(dá)下述表面標(biāo)志物的一種、兩種、三種、四種、五種或優(yōu)選全部下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，以及(ii)不表達(dá)下述表面標(biāo)志物的一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，選自
a)(i)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105，并且(ii)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106或CD117的細(xì)胞；
b)(i)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，并且(ii)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2的細(xì)胞；以及
c)i)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105和CD166，并且(ii)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2的細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，其中所述脂肪心臟組織為脂肪心外膜組織。
8.如權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
9.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞，其中所述GATA-4和/或Cx43的組成型表達(dá)在所述細(xì)胞的體外擴(kuò)充期間保持穩(wěn)定。
10.源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的成體干細(xì)胞，選自
(i)源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，其
a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；
b)組成型表達(dá)β-MHC；
c)組成型表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105；以及
d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106或CD117；
(ii)源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，其
a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；
b)組成型表達(dá)β-MHC；
c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90和CD105及CD166；以及
d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2；以及
(iii)源自脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，其
a)組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43；
b)組成型表達(dá)β-MHC；
c)表達(dá)所有下述表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD59、CD90和CD105及CD166；以及
d)不表達(dá)任何下述表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD106、CD117或VEGFR2。
11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述GATA-4和/或Cx43的組成型表達(dá)在所述細(xì)胞的體外擴(kuò)充期間保持穩(wěn)定。
12.源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的分離的成體干細(xì)胞群，包含一組如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞。
13.獲得包含源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的組合物的方法，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43，所述方法包括
a)獲得哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織樣品的細(xì)胞懸液；
b)從所述細(xì)胞懸液分離所述細(xì)胞；
c)在固體支持物上的培養(yǎng)基中，在允許所述細(xì)胞附著至所述固體支持物的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及
d)收集所述源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。
14.包含通過(guò)如權(quán)利要求13所述的方法獲得的源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞的組合物，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。
15.獲得分化的細(xì)胞的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或通過(guò)如權(quán)利要求13所述的方法獲得的源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，并包括在適當(dāng)?shù)奶禺愋苑只囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞。
16.通過(guò)如權(quán)利要求15所述的方法獲得的分化的細(xì)胞。
17.包含通過(guò)如權(quán)利要求15所述的方法獲得的分化的細(xì)胞的組合物。
18.包含如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞群，或如權(quán)利要求14所述的組合物，或如權(quán)利要求17所述的組合物以及藥物可接受的媒介物的藥物組合物。
19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，用于其胃腸外給藥。
20.包含如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞群，如權(quán)利要求14所述的組合物，如權(quán)利要求18或19中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，或如權(quán)利要求17所述的組合物的生物材料。
21.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞群，或如權(quán)利要求14所述的組合物，或如權(quán)利要求17所述的組合物，在制備用于心臟組織再生的藥物組合物中，或在制備用于治療缺血性心臟疾病的藥物組合物中，或在制備用于心肌梗死后治療或用于治療充血性心力衰竭的藥物組合物中，或在制備刺激血管生成的藥物組合物中的用途。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述藥物組合物與一種或多種不同的治療劑同時(shí)或順序地給藥。
23.如權(quán)利要求20或21中任一權(quán)利要求所述的用途，其中包含在所述細(xì)胞群中的細(xì)胞是自體的。
24.如權(quán)利要求20或21中任一權(quán)利要求所述的用途，其中包含在所述細(xì)胞群中的細(xì)胞是同種異體的。
25.包含如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞群，或如權(quán)利要求14所述的組合物，或如權(quán)利要求17所述的組合物的試劑盒。
26.在體外評(píng)價(jià)對(duì)生物學(xué)或藥理學(xué)試劑的細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括使所述試劑與如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含多個(gè)如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的干細(xì)胞，或與如權(quán)利要求14所述的組合物，所述細(xì)胞任選地分化為特定的細(xì)胞類型，或與如權(quán)利要求17所述的組合物接觸，并評(píng)價(jià)所述試劑對(duì)培養(yǎng)中的所述細(xì)胞群的影響。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。
28.獲得生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的方法，包括在適合于表達(dá)和產(chǎn)生所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的源自哺乳動(dòng)物脂肪心臟組織的成體干細(xì)胞，或根據(jù)如權(quán)利要求13所述的方法獲得的干細(xì)胞，或根據(jù)如權(quán)利要求15所述的方法獲得的分化的細(xì)胞，以及，如果需要，分離所述生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及源自脂肪心臟組織的新成體干細(xì)胞群的分離和表征，所述成體干細(xì)胞組成型表達(dá)GATA-4和/或Cx43。所述細(xì)胞群可用在細(xì)胞治療方法中以再生損傷的心肌組織。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101820890SQ200880110345
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日
發(fā)明者德爾克·巴斯徹爾, 安東尼奧·百耶斯吉尼斯, 圣地亞哥·羅拉費(fèi)瑞爾, 若爾迪·法瑞克雷斯波, 克里斯蒂娜·普拉特維道爾 申請(qǐng)人:崔克斯基因有限公司, 圣達(dá)克魯斯和圣保羅醫(yī)院研究所和私人基金會(huì)