專利名稱：：用于治療小便失禁的含有來自蛻膜或脂肪的干細胞的細胞治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療小便失禁的細胞治療劑，更具體地，涉及含有來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪組織的干細胞的用于治療小便失禁的細胞治療劑。
背景技術(shù)：
：干細胞指的是不僅具有自我復(fù)制能力而且具有分化成至少兩個細胞能力的細胞，它可以分為全能干細胞、多功能性干細胞和多潛能性干細胞。全能干細胞是具有能夠發(fā)育成一個完整個體的全能性質(zhì)的細胞，并且在卵母細胞和精子受精之后直到8細胞階段時細胞都具有這些特性。當這些細胞被分離并移植到子宮中時，它們可發(fā)育成一個完整個體。多功能性干細胞是來源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的能夠發(fā)育成不同細胞和組織的細胞，多功能性干細胞來自于在受精4-5天之后產(chǎn)生的胚泡內(nèi)的內(nèi)細胞團。這些細胞被稱為“胚胎干細胞”，并可分化成各種其他組織細胞，但不能形成新的生物體。多潛能性干細胞是這樣的干細胞，其僅僅能夠分化成針對含有這些細胞的組織和器官的細胞。多潛能性干細胞首先從成人骨膜中分離(Y.Jiang等人，Nature,418:41，2002)，隨后也在其他各種成人組織中發(fā)現(xiàn)(C.M.Verfaillie，TrendsCellBiol.,12=502,2002)換言之，雖然骨膜是最廣為人知的干細胞源，但是也在皮膚、血管、肌肉和大腦中發(fā)現(xiàn)了多潛能性干細胞(J.G.Tomas等人，Nat.CellBiol.，3778,2001；M.Sampaolesi等人，Science,301487,2003；Y.Jiang等人，Exp.Hematol.,30:896，2002)。但是，在成人組織諸如骨膜中的干細胞非常少，并且在不誘導(dǎo)分化時這些細胞很難培養(yǎng)，從而在缺少專一性篩選培養(yǎng)基的情況下同樣難以培養(yǎng)。也就是說，在體外保持分離的干細胞非常困難。近來發(fā)現(xiàn)，脂肪組織成為多潛能性干細胞的新來源(B.Cousin等人，BBRC.，3011016,2003；A.Miranville等人，Circulation,110349,2004；S.Gronthos等人，J.CellPhysiol.，18954,2001；M.J.Seo等人，BBRC.，328258,2005)。SP，據(jù)報道，通過抽脂術(shù)得到的人脂肪組織中含有一組未分化的細胞，其具有分化成脂肪細胞、成骨細胞、肌細胞和成軟骨細胞的能力(P.A.Zuk等人，TissueEng.，7211,2001；A.M.Rodriguez等人，BBRC.，315:255，2004)。脂肪組織具有的優(yōu)點在于它可以大量提取，因此它作為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷的新的干細胞源而引起注意。而且，近來使用動物模型實驗的研究表明，來自脂肪組織的細胞具有再生肌肉和刺激神經(jīng)血管分化的能力。因此，這些來自脂肪組織的細胞作為新的干細胞來源而受到關(guān)注。本發(fā)明的發(fā)明人以前在含有膠原酶和bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過精細切割的胎盤組織，從培養(yǎng)液中分離胎盤干細胞，然后使分離的干細胞分化成肌細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和胰腺0細胞(韓國專利申請NO.2007-0101756A)。同時，女性的小便失禁是由尿道和膀胱的松垂引起的，這種松弛是由頻繁生育和老化導(dǎo)致的陰部神經(jīng)損傷引起的盆底肌肉弱化所造成的。目前，韓國女性小便失禁患者的數(shù)目大約為4，000,000-5,000,000,并且隨著老齡婦女數(shù)目的迅速增加而逐年增加。因此，女性小便失禁正逐漸成為世界范圍內(nèi)的一個嚴重的社會問題。為了治療小便失禁患者，使用了用于支持尿道和膀胱的注射治療或者外科手術(shù)治療。目前，作為侵入性方法的外科手術(shù)治療具有的一個問題是會出現(xiàn)并發(fā)癥，注射治療具有的問題是由于其采用昂貴的物質(zhì)，因此不容易應(yīng)用于所有患者，并且其成功率僅為50-60%，從而再次需要注射和外科手術(shù)。干細胞注射治療不需要麻醉，并且干細胞可以很容易地注射到尿道括約肌中。因此，如果干細胞注射治療能夠改善尿道括約肌的收縮性并提高漏尿點的壓力，則干細胞治療可有利地用于治療小便失禁。但是，目前還沒有關(guān)于將干細胞用于治療小便失禁的研究。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力來開發(fā)含有干細胞的用于治療小便失禁的試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞對于小便失禁的治療是有效的，由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的主要目的在于提供用于治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備用于治療小便失禁的細胞治療劑的方法，所述細胞治療劑含有作為活性成分的來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞。本發(fā)明又一目的在于提供來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞在防止小便失禁上的用途。通過下列詳細描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實施方式將更加明顯。附圖簡要說明圖1示出了來自胎盤蛻膜的間葉干細胞(MSC)的形態(tài)的顯微照片。圖2示出了作為來自蛻膜的干細胞的傳代數(shù)的函數(shù)的累計群體倍增水平(cumulativepopulationdoublinglevel,CPDL)白勺圖表0圖3示出了形成球形的在SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第一代蛻膜細胞的照片。圖4示出了通過使用流式細胞儀(FACS)分析來自蛻膜的MSC表面抗原得到的結(jié)果的照片。圖5示出了使用標記抗體進行的免疫細胞化學(xué)分析結(jié)果的照片[A:0CT4；BSSEA4；以及C:CD44，CD54和對照]。圖6示出了0CT4的RT-PCR結(jié)果[1道標記物；2道RT_反應(yīng)對照；3道羊膜干細胞；4道來自蛻膜的干細胞，以及5道PCR-反應(yīng)對照]。圖7示出了在肌生成中，在MM-3160培養(yǎng)基(用于肌原分化的SKBM培養(yǎng)基)中的來自蛻膜的干細胞誘導(dǎo)10天時的免疫細胞化學(xué)分析(aMyosin-FITC)結(jié)果的顯微照片。圖8示出了裸鼠的陰部神經(jīng)被切斷的照片。圖9示出了使用傾斜臺測定漏尿點壓力的過程的照片(A和B)。圖10示出了根據(jù)實施例6中得到的結(jié)果的漏尿點壓力測定的結(jié)果的圖表(A:4周時的漏尿點壓力，B8周時的漏尿點壓力，N正常組，D對照組，PI:實驗組1，以及P2實驗組2)。圖11示出了根據(jù)實施例7中得到的結(jié)果的漏尿點壓力測定結(jié)果的圖表(A:4周時的漏尿點壓力，B8周時的漏尿點壓力，N正常組，D對照組，Al:實驗組1，以及A2實驗組2)。圖12示出了使用器官浴槽測定尿道括約肌收縮性的過程的照片(A和B)。圖13示出了根據(jù)實施例8中得到的結(jié)果的通過電場刺激測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖14示出了根據(jù)實施例8中得到的結(jié)果的通過乙酰膽堿給藥測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖15示出了根據(jù)實施例9中得到的結(jié)果的通過電場刺激測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖16示出了根據(jù)實施例9中得到的結(jié)果的通過乙酰膽堿給藥測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖17示出了實施例10中進行的雌性裸鼠尿道組織的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的結(jié)果。圖18示出了根據(jù)實施例10中得到的結(jié)果的雄鼠尿道組織的H/E免疫染色結(jié)果。圖19示出了根據(jù)實施例11得到的結(jié)果的雌性裸鼠尿道組織的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的結(jié)果。圖20示出了根據(jù)實施例11中得到的結(jié)果的雄鼠尿道組織的H/E免疫染色結(jié)果。具體實施例在一個方面，本發(fā)明涉及用于治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞。在本發(fā)明中，來自胎盤蛻膜的干細胞具有以下特征(a)對⑶29和⑶90顯示免疫表型陽性，但對CD31和CD45顯示免疫表型陰性；(b)對0ct4、SSEA-4和Cripto_l顯示免疫表型陽性；(c)附著在塑料上生長，形態(tài)特征為圓形或紡錘形，并在SFM培養(yǎng)基中形成球形以便長期保持未分化狀態(tài)；以及(d)具有分化成肌細胞的能力。1、術(shù)語定義在本文中，術(shù)語“干細胞”指的是可無限復(fù)制以形成組織和器官的專門細胞的主細胞，包括發(fā)育的多功能性干細胞和多潛能性干細胞。干細胞可分化成兩個子體干細胞，或者一個子體干細胞和一個祖細胞(“過渡細胞”)，該祖細胞然后增殖形成組織的成熟的完全成形的細胞。在本文中，術(shù)語“分化”指的是在細胞分裂、增殖或生長過程中細胞的結(jié)構(gòu)或功能專門化的現(xiàn)象，也就是說，有機體的細胞或組織的特征或功能發(fā)生變化以便執(zhí)行給定的工作。一般說來，該術(shù)語指的是相對簡單的系統(tǒng)被分成兩種或多種性質(zhì)不同的分系統(tǒng)的現(xiàn)象。例如，其意味著在開始彼此相同的任何生物系統(tǒng)各部分之間的性質(zhì)出現(xiàn)不同，例如，在個體發(fā)育中開始彼此性質(zhì)相同的受精卵各部分之間出現(xiàn)差異，如頭或身體，或者在細胞之間出現(xiàn)諸如肌肉細胞或神經(jīng)細胞的差異，或者生物系統(tǒng)由于該結(jié)果而被分成性質(zhì)不同的部分或分系統(tǒng)。在本文中，術(shù)語“細胞治療劑”指的是用于治療、診斷和預(yù)防目的的藥物，其含有通過從人類、培養(yǎng)物和特定手術(shù)(由USFDA提供)中分離制備的細胞或組織。特別地，細胞治療劑是一種用于治療、診斷和預(yù)防目的的藥物，其通過一系列的體外增殖、分選活的自體、異體和異種細胞，或者通過其他方式改變細胞的生物學(xué)性質(zhì)而用于恢復(fù)組織和細胞的功能。根據(jù)細胞的分化水平，細胞治療劑廣義上被分為體細胞治療劑和干細胞治療劑。本發(fā)明特別涉及含有來自蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞的細胞治療劑。2、來自蛻膜的干細胞的分離和純化胎盤是在懷孕過程中為了胚胎而形成的，一般來說為盤形，重大約500g、直徑大約15-20cm、厚度為2-3cm。胎盤的一側(cè)與母體接觸，另一側(cè)與胚胎接觸。胎盤的間隙含有母體血液以便為胚胎供應(yīng)養(yǎng)分。胎盤包括三層羊膜、絨毛膜和蛻膜。羊膜是圍繞胚胎的薄的透明膜并含有羊水，胚胎干細胞存在于羊膜中。蛻膜是在子宮的上皮細胞改性以使受精卵可移植到子宮壁上的過程中形成的一種膜。蛻膜含有母體干細胞。在本發(fā)明中，干細胞分離自蛻膜。根據(jù)本發(fā)明的從人胎盤分離的來自蛻膜的干細胞被歸類為自體成體干細胞，其不引起倫理問題，因為它們來自胎盤組織。干細胞通常通過下列方法從胎盤蛻膜中分離并純化。哺乳動物的胎盤(優(yōu)選人胎盤)從子宮排出之后，將蛻膜與胎盤分離，處理并培養(yǎng)以產(chǎn)生多潛能性干細胞、胎盤蛻膜干細胞和其他生物材料。來自胎盤蛻膜的干細胞是從自子宮排出的胎盤中獲得的。在優(yōu)選實施例中，在生長因子例如bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的存在下對胎盤進行培養(yǎng)。在本發(fā)明中，通過下列方法從人胎盤蛻膜中分離并純化干細胞。將蛻膜組織從人胎盤組織樣品中分離并使用PBS清洗，然后將蛻膜組織精細切割。將精細切割的蛻膜組織轉(zhuǎn)移到100-mm皿中，在含有膠原酶(lmg/ml)的DMEM(Dulbecco‘sModifiedEagleMedium,Gibco)中37°C下化學(xué)降解一小時。將化學(xué)分解后的組織用100-ym篩過濾以除去未分解組織，然后1200rpm離心1-10分鐘。吸去上清，將保留在底部的微團用PBS清洗，然后1200rpm離心1-10分鐘。將保留在底部的微團作為單細胞進行懸浮，然后在含有bFGF的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此時，間葉干細胞附著到底部，其他細胞被懸浮。這些來自胎盤蛻膜的干細胞附著在塑料上并顯示圓形和紡錘形的形態(tài)特征。兩天后，使用PBS清洗未附著到皿底的細胞并進行培養(yǎng)，同時以2-3天為間隔更換培養(yǎng)基，由此得到分離自人胎盤的來自蛻膜的干細胞的溶液。測定分離的來自蛻膜的干細胞的增殖率，從結(jié)果可以看出，這些細胞在CPDL中逐漸增加，直到傳代數(shù)達到12，結(jié)果表明這些細胞具有較高的增殖率(圖2)。從胎盤蛻膜中得到的干細胞在SFM培養(yǎng)基中形成球形，由此可長期保持在未分化狀態(tài)(圖3)。在本發(fā)明中使用的SFM培養(yǎng)基的一個例子是含有2%B27、500mM2-巰基乙醇、lyg/ml皮質(zhì)醇、5iig/ml胰島素、20ng/mlEGF和20ng/mlbFGF的MEBM(哺乳動物上皮細胞基本培養(yǎng)基)。通過使用標準細胞測定技術(shù)測定形態(tài)和細胞表面標記物的變化，例如用流式細胞儀、細胞分選計、免疫細胞化學(xué)(諸如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體染色)、熒光活化細胞分選(FACS)、磁活化細胞分選(MACS)，或通過使用光學(xué)顯微鏡或共焦顯微鏡測定細胞形態(tài)，或者通過使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)諸如PCR和基因表達譜測定基因表達變化，由此可對增殖細胞的數(shù)目和類型輕松進行監(jiān)測。在優(yōu)選實施例中，來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分選，例如密度梯度離心、磁細胞分離、流式細胞儀和其他細胞分離方法。從上面得到的來自胎盤或月經(jīng)液的蛻膜的干細胞培養(yǎng)液得到表達所需表面抗原的多潛能性干細胞的方法，其包括使用具有分選功能的流式細胞儀的FACS方法(Int.Immunol.，10(3):275，1998)，使用磁珠的方法，以及使用專一性識別多潛能性干細胞的抗體的淘選方法(J.Immunol.，141(8):2797，1998)。而且，用于從大量培養(yǎng)液中得到多潛能性干細胞的方法包括一種方法，其中專一性識別在細胞表面上表達的分子的抗原(此后稱為“表面抗原”)被單獨使用或者作為柱而結(jié)合使用。流式細胞儀分選法可包括水滴電荷法和細胞捕獲法。在一個實施例中，用不同的熒光標記物標記細胞表面的標記物專一性的抗體或者配體。細胞經(jīng)過細胞分選器被處理，允許細胞基于它們與使用的抗體結(jié)合的能力而分離。FACS-分選的微?？芍苯映练e到96孔或384孔板的單個孔中以利于分離和克隆。在這些方法的任何一種中，專一性識別細胞表面上的抗原的抗體被熒光標記，與在細胞表面上表達的分子結(jié)合的抗體發(fā)出的熒光的強度被轉(zhuǎn)化成電信號，從而可對抗原的表達量進行定量。還能夠通過使用的熒光類型的組合來分離表達多種表面抗原的細胞。在這種情況下可使用的熒光的例子包括FITC(異硫氰酸熒光素)，PE(藻紅蛋白)，APC(藻藍蛋白)，TR(德克薩斯紅)，Cy3,CyChrome,Red613,Red670,,TRI-Color,QuantumRed等寸。使用流式細胞儀的FACS方法包括一種方法，其中收集上述干細胞培養(yǎng)液，細胞通過離心從其中分離并使用抗體直接染色；和另一種方法，其中細胞在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)并生長，然后使用抗體染色。細胞的染色如下進行，將識別表面抗原的初級抗體與靶細胞樣品混合并在4°C下將混合物培養(yǎng)30分鐘到1小時。當初級抗體被熒光標記時，清洗后使用流式細胞儀分離細胞。當初級抗體沒有被熒光標記時，與初級抗體反應(yīng)的細胞和具有與初級抗體結(jié)合活性的熒光標記的次級抗體在清洗后混合，混合物在4°C下培養(yǎng)30分鐘到1小時。清洗后，使用初級和次級抗體染色的細胞使用流式細胞儀分離。上述用于分離和純化來自蛻膜的干細胞的方法也可以應(yīng)用于本發(fā)明的來自脂肪的干細胞。3、來自胎盤蛻膜的干細胞的特性分離自胎盤蛻膜的干細胞是同源且無菌的。此外，得到的干細胞形式上適于給藥到人類，也就是說，它們是醫(yī)藥級的。在長期培養(yǎng)后，細胞可具有CD-系列表面抗原標記物的特征，例如CD29(單核細胞標記物)、⑶31(內(nèi)皮細胞和干細胞標記物)、⑶45(造血細胞標記物)和⑶90(單核干細胞標記物)，并可應(yīng)用于FACS分析。通過本發(fā)明的方法得到的優(yōu)選的來自胎盤蛻膜的干細胞可通過具有下列特征的細胞表面標記物的存在來識別對⑶29和⑶90顯示免疫表現(xiàn)型陽性，但對⑶31和⑶45顯示免疫表現(xiàn)型陰性。所述細胞表面標記物根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進行常規(guī)測定，例如通過流式細胞儀，接著清洗并使用抗細胞表面標記物抗體染色。而且，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞可使用被認為是對于干細胞的未分化標記物的0ct4、SSEA-4和Cripto-1標記物識別(圖4、5和6)。0ct4是公知的用于干細胞的未分化標記物，并且其通常用于檢測0ct4表達能力以便識別出于未分化狀態(tài)的干細胞，如同在題為“Monoclonalantibodyspecifictohumanembryonicstemcells”的韓國專利申請No.10-2004-0105716、題為"Double-strandedRNAforinhibitionofexpressionof0ct4genethatmaintainsundifferentiatedstateofmammalianembryonicstemcells”的韓國專利申請No.10-2004-0096780、題為“Humanumbilicalcordblood-derivedmultipotentstemcellshavingincreasedabilitytoproliferateduetoosteoblast-basedstructureandpreparationmethodthereof"的韓國專利申請No.10-2006-0092128以及類似專利申請中公開的那樣。而且，公知的是SSEA4(階段特異性胚胎抗原4)和Cripto-1存在于人胚胎干細胞表面上。0ct4的表達使用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))與FACS—起確認。RT-PCR方法是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)包括使用特定區(qū)域的RNA作為模板合成相應(yīng)的cDNA并使用cDNA進行PCR擴增，并包括下列步驟(1)使用逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA制備cDNA，以及⑵使用cDNA擴增特定區(qū)域，并且步驟(2)與由基因組DNA擴增特定基因區(qū)域的方法相同。與通過諸如Northern印跡雜交的方法進行RNA分析相比，該方法更為簡單，并且其可以測定基因的堿基序列。因此，該方法主要在研究堿基序列和mRNA轉(zhuǎn)錄水平方面非常有用。本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞在0ct4、SSEA4和Cripto-1的表達上呈陽性(圖4、5禾口6)。4、來自胎盤蛻膜的干細胞的分化根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自胎盤蛻膜的干細胞可被誘導(dǎo)分化成特定細胞系，包括分化成肌細胞。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自胎盤蛻膜的干細胞被誘導(dǎo)分化，以便在移植和體外治療方案中使用。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自胎盤蛻膜的干細胞被誘導(dǎo)分化成特定細胞類型，并且被基因工程化以提供治療性基因廣品。來自胎盤蛻膜的干細胞分化成特定肌細胞可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法測定，通過使用氮雜胞苷對胎盤蛻膜干細胞進行一天的預(yù)處理，然后在SKBM培養(yǎng)基(Cambrex，Co.)中培養(yǎng)預(yù)處理的細胞，來自胎盤蛻膜的干細胞可被誘導(dǎo)分化成肌細胞。可通過本領(lǐng)域公知的方法來確定已經(jīng)干細胞是否已分化成肌細胞，例如使用諸如流式細胞儀或者免疫細胞化學(xué)等技術(shù)測定形態(tài)變化和細胞表面標記物(例如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體對細胞進行染色)，或者通過使用光學(xué)顯微鏡或者共聚焦顯微鏡檢查細胞的形態(tài)，或者通過使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)諸如PCR和基因表達譜測定基因表達的變化。5、來自胎盤蛻膜的干細胞的用途以及由其分化的細胞根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞可用于眾多的治療方案中，其中身體組織或器官通過所需細胞群諸如來自胎盤蛻膜的干細胞群的移入、移植或注入而擴增、修復(fù)或者替換。本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞可被用于替換或擴增現(xiàn)有組織以生長新的或者替代的組織，或者將組織與生物組織或結(jié)構(gòu)結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，來自胎盤蛻膜的干細胞可在自體或異體移植中使用，包括HLA-匹配和HLA-不匹配的造血移植。本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞可在典型地使用祖細胞的治療或研究方案中代替特定種類的祖細胞使用(例如軟骨細胞、干細胞、造血細胞、胰腺薄壁細胞、成神經(jīng)細胞、肌肉祖細胞等)。另外，本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞可被制成注射制劑(例如W096/39101，其全部內(nèi)容通過引用而結(jié)合到本文中)。在替代實施例中，本發(fā)明的細胞和組織可使用可聚合或交聯(lián)水凝膠來制備，如在US5709854,5516532和5654381中描述的那樣，這些專利的全部內(nèi)容都通引用而結(jié)合到本文中。6、來自脂肪的干細胞及其用途本發(fā)明的來自脂肪的干細胞從通過抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中而得到，其附著在塑料培養(yǎng)皿上生長。特別地，本發(fā)明的來自脂肪的干細胞是根據(jù)由本申請的申請人遞交的韓國專利申請No.10-2007-0050624、韓國專利申請No.10-2007-0042645、韓國專利注冊No.10-0679642或者韓國專利注冊No.10-0788632公開的內(nèi)容分離并培養(yǎng)的來自脂肪組織的干細胞。來自脂肪的干細胞具有如下特征(a)對⑶73、⑶90、⑶29、⑶44和⑶105全部都顯示陽性免疫應(yīng)答，并對⑶133、⑶34、⑶45、⑶4、⑶31、⑶62p、⑶14和HLA-DR全部都顯示陰性免疫應(yīng)答；并且(b)附著在塑料材料上生長，顯示紡錘形形態(tài)特征，并在含有C0RM-2的培養(yǎng)基中形成球形以便長期保持未分化狀態(tài)。在本發(fā)明中，為了本發(fā)明的干細胞的球形培養(yǎng)，分離的來自脂肪的多潛能性干細胞在含有C0RM-2的MEBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果它們在接種后3天開始形成球形。這表明來自脂肪的干細胞保持未分化狀態(tài)，因此具有高增殖率。而且，為了根據(jù)(但不限于)在上述專利文獻中描述的免疫學(xué)性質(zhì)分析而檢查來自脂肪的干細胞的免疫學(xué)特性，使用PBS清洗來自脂肪的干細胞并用胰蛋白酶處理。收集處理后的細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之后，使用2%FBSP和PBS混合物清洗細胞，接著以lOOOrpm離心5分鐘。此后，棄去上清，然后將細胞懸浮在PBS中并以1x10s個細胞的密度將每種樣品分散到孔板中。將抗體(R-共軛藻紅蛋白鼠抗-人單克隆抗體)放置到每個孔中，并且在冰上培養(yǎng)40分鐘以誘導(dǎo)其結(jié)合。培養(yǎng)后，將細胞懸浮液以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之后，使用PBS清洗細胞兩次。然后，使用多聚甲醛固定細胞，得到的多潛能性干細胞的表面抗原通過FACS進行分析。結(jié)果，本發(fā)明的來自脂肪的多潛能性干細胞對于CD73(91%),CD90(97%),CD29(96%),CD44(83%)和CD105(80%)呈陽性。而且，分析了用于其它抗原的多潛能性干細胞的免疫表現(xiàn)型，結(jié)果，這些細胞對于⑶133、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR呈陰性。將來自脂肪的多潛能性干細胞分別儲存在生理鹽水、生理鹽水+蔗糖、生理鹽水+蔗糖+5%白蛋白以及PBS+蔗糖中，然后分析其形成球形的能力。為此，將來自脂肪的多潛能性干細胞以5xl04-lxl05個細胞/mL的濃度接種到含有無血清MEBM培養(yǎng)基(含有10yMC0RM-2、5ml抗生素-抗真菌素溶液(100X)、1yg/ml皮質(zhì)醇、5yg/mL胰島素、20ng/mLEGF、40ng/mLFGF、B27和巰基乙醇)的6孔培養(yǎng)板的每個孔中并進行培養(yǎng)。結(jié)果，接種后3_7天干細胞開始形成球形，并且甚至在接種后7-10天干細胞也增殖形成球形。在本發(fā)明的一個實施例中，來自脂肪的干細胞通過如下方式得到制備原材料，該原材料含有通過抽脂術(shù)或者具有連接的導(dǎo)管的一次性注射器得到的腫脹液和脂肪組織，將原材料進行支原體試驗和無菌試驗，從原材料中選擇滿足質(zhì)量標準的樣品，將所選樣品離心成脂肪層和水層，使用膠原酶溶液對水層樣品進行預(yù)處理，然后在上述專利文獻公開的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細胞。根據(jù)本發(fā)明得到的來自脂肪的干細胞可用于各種各樣的治療方案，其中身體的組織或器官通過所需細胞群如來自脂肪的干細胞或者來自脂肪組織的干細胞群的移入、移植或注入而擴增、修復(fù)或者替換。本發(fā)明的來自脂肪的干細胞可用于替換或擴增現(xiàn)有組織以生長新的或者替代組織，或者將組織與生物組織或結(jié)構(gòu)結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自脂肪的干細胞可被誘導(dǎo)分化成特定細胞譜系，包括分化成肌細胞。在一特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自脂肪的干細胞被誘導(dǎo)分化以便在移植和體外治療方案中使用。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的來自脂肪的干細胞被誘導(dǎo)分化成特定細胞類型，并且被基因工程化以提供治療性基因產(chǎn)品。來自脂肪的干細胞分化成特定肌細胞可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法測定?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法來確定干細胞是否已經(jīng)分化成肌細胞，例如使用諸如流式細胞儀或者免疫細胞化學(xué)等技術(shù)測定形態(tài)變化和細胞表面標記物(例如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體對細胞進行染色)，或者通過使用光學(xué)顯微鏡或者共聚焦顯微鏡檢查細胞的形態(tài)，或者通過使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)諸如PCR和基因表達譜測定基因表達變化。7、用于治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜或脂肪的干細胞的試劑的開發(fā)本發(fā)明的用于治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜或脂肪的干細胞的細胞治療劑基于以下原理來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞可增加漏尿點壓力，表現(xiàn)為內(nèi)部尿道括約肌功能的改善，同時增加尿道括約肌的收縮性，表現(xiàn)為外部尿道括約肌功能的改善。在本文中，術(shù)語“漏尿點壓力”指的是尿液泄露時的膀胱內(nèi)壓或者Valsalva漏尿點壓力，并且漏尿點壓力的降低是小便失禁的主要原因。在本發(fā)明中，為了測定來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞對小便失禁特別是漏尿點壓力的治療效果，將雌性裸鼠分成正常組、對照組和實驗組。然后，增加正常組、對照組(其中陰部神經(jīng)被切除)和實驗組(其中陰部神經(jīng)被切除，然后注射來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞)每組的膀胱內(nèi)壓，并且測定每組中的漏尿點壓力。結(jié)果證明，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞增加了漏尿點壓力，因此可被用作治療小便失禁的試劑。尿道括約肌由于自身的收縮性而起到調(diào)節(jié)排尿的作用，尿道括約肌收縮性減弱也是小便失禁的主要原因。在本發(fā)明中，為了測定來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞對小便失禁特別是尿道括約肌收縮性的治療效果，將雄鼠分成正常組、對照組和實驗組。然后，對每組的尿道組織部分施加電場刺激或者乙酰膽堿藥物，測定每組中尿道括約肌的收縮性。結(jié)果證明，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞增加了尿道括約肌的收縮性，因此可被用作治療小便失禁的細胞治療劑。8、用于治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜的干細胞、來自月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞的細胞治療劑在本文中，術(shù)語“胎盤蛻膜”指的是在子宮的上皮細胞改性過程中形成的一種膜，使受精卵可移植到子宮壁上。在本文中，月經(jīng)液含有宮頸粘液、陰道分泌物、子宮細胞、子宮上皮細胞和毛細血管血液，主要由形成細胞的蛋白質(zhì)及類似物組成。這里，從子宮流出并包含在月經(jīng)液中的子宮上皮細胞被稱為“月經(jīng)液蛻膜”。來自脂肪的干細胞從通過抽脂術(shù)收集的脂肪組織中獲得，并附著到塑料上生長。如上所述，胎盤蛻膜和月經(jīng)液蛻膜主要由子宮上皮細胞組成。在本發(fā)明的實施例中，僅僅專門證明了來自胎盤蛻膜的干細胞對小便失禁的治療效果，但可以很容易推斷來自月經(jīng)液蛻膜的干細胞也具有治療小便失禁的效果。此外，來自脂肪的干細胞也具有多潛能性，因此可以很容易推斷來自脂肪的干細胞也可用于治療小便失禁。因此，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明不僅能夠?qū)崿F(xiàn)將含有胎盤蛻膜的干細胞的用于治療小便失禁的細胞治療劑，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)將含有月經(jīng)液蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞的用于治療小便失禁的細胞治療劑。實施例隨后，將參照實施例進一步對本發(fā)明進行描述。但是，應(yīng)當理解的是，這些實施例僅用于說明的目的，而非對本發(fā)明的范圍的限制。實施例1根據(jù)本發(fā)明的干細胞的分離和培養(yǎng)(1)來自胎盤蛻膜的干細胞的分離和培養(yǎng)根據(jù)以本申請的申請人的名義提交的韓國專利公開No.10-2007-0101756A中描述的方法從胎盤中分離蛻膜。特別地，根據(jù)韓國大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的機構(gòu)審查委員會的指導(dǎo)，在韓國大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Guro醫(yī)院里，在正常分娩和早產(chǎn)的過程中收集胎盤并將其用于研究目的。將胎盤組織放入含有抗生素的生理鹽水中，在此狀態(tài)下將其轉(zhuǎn)移到實驗室。使用PBS清洗轉(zhuǎn)移到實驗室的胎盤組織以除去血細胞和各種其他組織，或者使用溶血緩沖液處理組織以除去血細胞，或者使用鑷子小心地分離構(gòu)成胎盤的羊膜、絨毛膜、蛻膜和胎盤床組織。將分離的蛻膜組織置于100-mm皿中并使用消毒剪刀精細切割成l-2mm的尺寸。然后，將切割的組織置于含膠原酶的培養(yǎng)基中并在恒溫箱中在37°C培養(yǎng)1-4小時，此后將用膠原酶處理過的組織經(jīng)過100-目金屬絲網(wǎng)過濾。將由此分離的細胞置于75-燒瓶中并在含有bFGF的DMEM中在5%C02條件下于37°C培養(yǎng)(圖1)。(2)來自脂肪的干細胞的分離和培養(yǎng)在該實施例中使用的來自脂肪的干細胞根據(jù)以本申請的申請人的名義提交的韓國專利注冊No.10-0679642中描述的方法進行分離。特別地，通過抽脂術(shù)從腹部區(qū)域分離11脂肪組織，并使用PBS清洗然后精細切割。切割的組織在含有1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM中于37°C下消化2小時。消化的組織使用PBS清洗然后以lOOOrpm離心5分鐘。吸去上清，使用PBS清洗保留在底部的微團然后以lOOOrpm離心5分鐘。得到的微團經(jīng)過100um篩過濾以去除雜質(zhì)，接著使用PBS清洗。將得到的細胞在DMEM培養(yǎng)基(10%FBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)。過夜后，使用PBS清洗未附著的細胞，并在角化細胞-SFM培養(yǎng)基(含有2mMNAC，0.2mM抗壞血酸，0.09mM鈣，5ng/mlrEGF,50ug/mlBPE，5iig/ml胰島素禾口74ng/ml皮質(zhì)醇)中培養(yǎng)，同時以兩天為間隔更換培養(yǎng)基，由此分離出多潛能性干細胞。實施例2來自胎盤蛻膜的干細胞的增殖率檢查檢查了根據(jù)上述來自人胎盤蛻膜組織的多潛能性干細胞的增殖方法得到的干細胞的增殖率。通過在實施例1中描述的分離方法，從不同的人類個體的胎盤蛻膜組織樣品獲得了來自胎盤蛻膜的干細胞，然后將其以2xl05個細胞的密度接種到75-燒瓶中。CPDL是表示細胞增殖率的指數(shù)，并以下列方程表示CPDL=In(Nf/Ni)/ln2其中，M初始接種細胞數(shù)；Nf最終細胞數(shù)來自蛻膜的干細胞的CPDL根據(jù)傳代數(shù)進行觀察，結(jié)果，細胞在第12代顯示大約30的CPDL值。該CPDL值與來自人脂肪組織的干細胞的CPDL值類似(Lin等人，stemcellsanddevelopment,1492,2005；Zuk等人，Tissueeng.，7211,2001)。這些結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞具有非常高的增殖率(圖2)。實施例3來自胎盤蛻膜的多潛能性干細胞的免疫學(xué)性質(zhì)將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的多潛能性干細胞使用PBS清洗并用胰蛋白酶處理。然后，收集細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之后，將細胞懸浮在PBS中并以lxlO5個細胞的密度分散到多孔板的每個孔中。將抗體(R-共軛藻紅蛋白鼠抗-人單克隆抗體)放置到每個孔中，并且將細胞在4°C下培養(yǎng)40分鐘。培養(yǎng)后，將細胞培養(yǎng)液以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之后，使用PBS清洗細胞并以lOOOrpm離心5分鐘。然后，棄去上清之后，使用PBS清洗細胞并以1500rpm離心5分鐘。棄去上清之后，使用多聚甲醛固定細胞，并使用流式細胞儀進行分析。分析的結(jié)果為，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞的免疫學(xué)性質(zhì)可如下表1所示，細胞對CD29、CD90、Oct-4、SSEA-4和Cripto_l呈免疫表現(xiàn)型陽性，但對⑶31和⑶45呈陰性(圖4)。表1來自胎盤蛻膜的干細胞的表面抗原分析(FACS分析)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>抗原蛻膜-MSCs<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>實施例4來自胎盤蛻膜的多潛能性干細胞的0ct4和SSEA-4表達的分析將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的干細胞用PBS清洗三次并使用含有4%多聚甲醛的PBS固定30分鐘。使用PBS清洗3次后，將細胞用含有0.l%Triton-X100的PBS滲透10分鐘。使用PBS清洗3次后，使用封閉緩沖液(5%羊血清)處理細胞并在4°C下培養(yǎng)1小時，然后使細胞與含有初級抗體的封閉緩沖液反應(yīng)過夜。在使用PBS清洗3次后，細胞與次級抗體在暗房里反應(yīng)1小時。在使用PBS清洗3次后，將細胞固定。結(jié)果，如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明的多潛能性干細胞對作為人胚胎干細胞標記物的0ct4和SSEA-4呈陽性。而且，使用RT-PCR分析0ct4的表達。RT反應(yīng)在37°C進行50分鐘，在70°C進行10分鐘；PCR反應(yīng)在95°C進行10分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95°C30秒，58°C40秒以及72°C1分鐘，然后72°C10分鐘。結(jié)果，如圖6所示，可以看出來自蛻膜的干細胞在800bp處表達。實施例5來自胎盤蛻膜的多潛能性干細胞分化成肌細胞將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的干細胞分散到涂覆lOng/ml纖粘蛋白的燒瓶中，然后使用IOpM5'-氮雜胞苷預(yù)處理24小時。預(yù)處理之后，將細胞在SKBM(Cambrex,Co.)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，接著進行免疫染色。結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤組織的多潛能性干細胞對作為肌細胞特異性抗原的肌球蛋白呈陽性。該結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的來自人胎盤組織的多潛能性干細胞分化成肌細胞(圖7)。實施例6注射了來自胎盤蛻膜的干細胞的雌性裸鼠的漏尿點壓力測定(1)實驗動物模型的制備為了測定來自胎盤蛻膜的干細胞對漏尿點壓力的效果，使用了56只雌性裸鼠。將雌性裸鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14;其中陰部神經(jīng)被切除)，實驗組l(n=14;在陰部神經(jīng)切除2周后注射105個來自胎盤蛻膜的干細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射107個來自胎盤蛻膜的干細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，并在4周和8周時測定漏尿點壓力。對照組的制備使用三氟溴氯乙烷將14只雌性裸鼠麻醉，并且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經(jīng)。然后，將陰部神經(jīng)電灼大約2cm，然后縫合皮膚。實驗組1和2的制備使用三氟溴氯乙烷將28只雌性裸鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然后剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經(jīng)切除2周后出現(xiàn)小便失禁時，使用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自胎盤蛻膜的干細胞注射到14只鼠中(實驗組1)，并將另外14只注射107個細胞(實驗組2)。(2)漏尿點壓力測定使用氨基甲酸乙酯將雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，并在T9-T10的水平下切除脊髓。然后，通過低中線切口打開腹部以剝離膀胱，隨后使用PE-90導(dǎo)管對膀胱進行恥骨上膀胱造口術(shù)。為了測定漏尿點壓力，將正常組、對照組和實驗組的每組雌性裸鼠置于垂直傾斜/膀胱壓力加緊模型中(圖9)。將150ml生理鹽水連接到PE-90管中，生理鹽水的高度每次都略微增加以便增大實驗鼠的膀胱壓力。在尿液泄露開始時記錄的壓力被定義為LPP(漏尿點壓力)。如圖10所示，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)在4周時的漏尿點壓力分別為22.8士0.9,11.6士0.6,20.4士0.8和21.5士0.9cmH20(圖10A)，在8周時的漏尿點壓力分別為22.6士0.8,11.5士0.7,20.6士0.6禾口22.5士0.8cmH20(圖10B)。因此，從統(tǒng)計學(xué)上講，在4周和8周時，正常組和實驗組1和2的漏尿點壓力都高于對照組的漏尿點壓力，并且對照組的漏尿點壓力低于正常組的漏尿點壓力。因此，在以實施例1中制備的來自胎盤蛻膜的干細胞給藥的實驗組1和2中，漏尿點壓力增加到與正常組類似的水平，表明來自胎盤蛻膜的干細胞起到增加漏尿點壓力的作用。實施例7注射了來自脂肪的干細胞的雌性裸鼠的漏尿點壓力的測定(1)實驗動物模型的制備為了測定來自脂肪的干細胞對漏尿點壓力的效果，使用56只雌性裸鼠。將雌性裸鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經(jīng)被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射105個來自脂肪的干細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射107個來自脂肪的干細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，并在4周和8周時測定漏尿點壓力。對照組的制備使用三氟溴氯乙烷將14只雌性裸鼠麻醉，并且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經(jīng)。然后，將陰部神經(jīng)電灼大約2cm，然后縫合皮膚。實驗組1和2的制備使用三氟溴氯乙烷將28只雌性裸鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然后剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經(jīng)切除后2周出現(xiàn)小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自脂肪的干細胞注射到14只鼠中(實驗組1)，并將另外14只注射107個細胞(實驗組2)。(2)漏尿點壓力測定使用氨基甲酸乙酯將雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，并在T9-T10的水平下切除脊髓。然后，通過低中線切口打開腹部以剝離膀胱，隨后使用PE-90導(dǎo)管對膀胱進行恥骨上膀胱造口術(shù)。為了測定漏尿點壓力，將正常組、對照組和實驗組的每組雌性裸鼠置于垂直傾斜/膀胱壓力加緊模型中(圖9)。將150ml生理鹽水連接到PE-90管，生理鹽水的高度每次都略微增加以便增大實驗鼠的膀胱壓力。在尿液泄露開始時記錄的壓力被定義為LPP(漏尿點壓力)。如圖11所示，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)在4周時的漏尿點壓力分別為22.8士0.9,11.6士0.7,18.7士0.9和19.2士0.7cmH20(圖10A)，在8周時的漏尿點壓力分別為22.6士0.9,11.5士0.7,20.4士0.7和21.5士0.8cmH20(圖11B)。因此，可以確認，在以本發(fā)明的來自脂肪的干細胞給藥的實驗組A1和A2中，漏尿點壓力在144周和8周時都增加了。而且，A2組漏尿點壓力高于A1組的漏尿點壓力，但二者之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(圖11)。實施例8注射了來自胎盤蛻膜的干細胞的雄鼠的尿道括約肌收縮性的測定(1)實驗動物模型的制備為了測定來自胎盤蛻膜的干細胞對尿道括約肌收縮性的影響，使用56只雄鼠。將雄鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經(jīng)被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射105個來自胎盤蛻膜的干細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射107個來自胎盤蛻膜的干細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，并在4周和8周時測定尿道括約肌收縮性。對照組的制備使用三氟溴氯乙烷將14只雄鼠麻醉，并且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經(jīng)。然后，將陰部神經(jīng)電灼大約2cm，然后縫合皮膚。實驗組1和2的制備使用三氟溴氯乙烷將28只雄鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然后剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經(jīng)切除后2周出現(xiàn)小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例2中得到的105個來自胎盤蛻膜的干細胞注射到14只鼠中(實驗組1)，并將另外14只注射107個細胞(實驗組2)。(2)尿道括約肌收縮性的測量獲得每只雄鼠的尿道后，將尿道螺旋切割，由此制備尿道組織切片(10X2mm)。在器官浴槽實驗中，使用C02/重碳酸鹽緩沖的Tyrode溶液對垂直室(verticalchamber)(20-ml體積)進行灌注，然后將尿道組織切片固定在室中。然后，使用乙酰膽堿檢查尿道組織切片中尿道括約肌收縮性(圖12)。結(jié)果，如圖13所示，當在雄鼠實驗中進行現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的電場刺激(EFS，60V)時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.45士0.06,0.34士0.02,0.39士0.02和0.45士0.05g/張力，在8周時分別為0.44士0.06,0.35士0.02,0.41士0.04和0.46士0.03g/張力。因此，在電場刺激實驗中，實驗組在4周和8周時都顯示出比對照組更高的尿道括約肌收縮性，并顯示與正常組類似或更高的尿道括約肌收縮性。另外，實驗組2顯示出比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性。同時，如圖14所示，將測試樣品使用乙酰膽堿(Ach)處理時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.54士0.04、0.28士0.03,0.52士0.02和0.54士0.03g/張力(圖14A)，在8周時分別為0.56士0.03、0.3士0.02、0.56士0.04和0.59士0.04§/張力(圖14B)。因此，當以乙酰膽堿給藥時，正常組和實驗組1和2中尿道括約肌收縮性都高于D組，并且實驗組2顯示了比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性，但二者之間不存在統(tǒng)計學(xué)上的差別。換言之，不能得出實驗組2顯示比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性的結(jié)論。實施例9使用來自脂肪干細胞給藥的雄鼠尿道括約肌收縮性的測定(1)實驗動物模型的制備為了測定來自脂肪的干細胞對尿道括約肌收縮性的影響，使用56只雄鼠。將雄鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經(jīng)被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射105個來自脂肪的干細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經(jīng)切除2周后注射107個來自脂肪的干細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，并在4周和8周時測定尿道括約肌收縮性。對照組的制備使用三氟溴氯乙烷將14只雄鼠麻醉，并且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經(jīng)。然后，將陰部神經(jīng)電灼大約2cm，然后縫合皮膚。實驗組1和2的制備使用三氟溴氯乙烷將28只雄鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然后剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經(jīng)切除后2周出現(xiàn)小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自脂肪的干細胞注射到14只鼠中(實驗組1)，并將另外14只注射107個細胞(實驗組2)。(2)尿道括約肌收縮性的測定獲得每只雄鼠的尿道后，將尿道螺旋切割，由此制備尿道組織切片10X2mm)。在器官浴槽實驗中，使用C02/重碳酸鹽緩沖的Tyrode溶液對垂直室(verticalchamber)(20-ml體積)進行灌注，然后將尿道組織切片固定在室中。然后，使用乙酰膽堿檢查尿道組織切片中尿道括約肌的收縮性(圖12)。結(jié)果，如圖15所示，當在雄鼠實驗中進行現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的電場刺激(EFS，60V)時，正常組(N)，對照組⑶，實驗組1(A1)和實驗組2(A2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.46士0.08,0.32士0.03,0.35士0.03和0.38士0.03g/張力，在8周時分別為0.44士0.06,0.31士0.02,0.39士0.02和0.44士0.05g/張力。因此，在電場刺激實驗中，N組和A組的尿道括約肌收縮性在4周和8周時都高于D組，并且A2與A1之間沒有差別。同時，如圖16所示，將測試樣品使用乙酰膽堿(Ach)給藥時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(A1)和實驗組2(A2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.54士0.05、0.29士0.04、0.48士0.03和0.51士0.05g/張力，在8周時分另ij為0.55士0.05、0.29士0.03,0.55士0.02和0.54士0.05g/張力。因此，當以乙酰膽堿給藥時，正常組和實驗組1和2中尿道括約肌的收縮性都高于D組，并且實驗組1與實驗組2之間沒有差別。實施例10注射了來自胎盤蛻膜的干細胞的鼠組織的免疫染色根據(jù)上述實施例6-8在4周和8周測定了漏尿點壓力和尿道括約肌收縮性之后，收集每種尿道組織并使用已經(jīng)在液氮中冷卻的2-甲基丁烷無損傷冷凍。將尿道組織冷卻并切片，然后進行H/E染色。同樣，為了觀察干細胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌動蛋白(a-SMA)和肌球蛋白重鏈(MyHC)對組織進行免疫染色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。結(jié)果，如圖17所示，在根據(jù)實施例6的雌性裸鼠的正常尿道括約肌中，平滑肌豐富，并且骨骼肌被微弱染色(圖17的“A”、“B”和“C”)。在陰部神經(jīng)切除后，可觀察到平滑肌的數(shù)量減少(圖17的“D”，“E”和“F“)。當在4周(圖17的“G”、“H”“I”)和8周(圖17的“J“、”K“和”L“)注射來自胎盤蛻膜的干細胞時，平滑肌被染成淺綠色，表明平滑肌的數(shù)量增加。而且，在平滑肌之間，觀察到被紅色和綠色共染的黃細胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的綠色，并且在平滑肌細胞之間注射的細胞顯示紅色。而且，如圖18所示，如上所述，因為雄鼠的尿道在實施例8中被螺旋切割，所以不能觀察到最初的尿道形狀；但是，在尿道括約肌收縮性實驗之后可以觀察到PKH在組織中表達(圖18的“A“和"B“)，表明注射的來自胎盤蛻膜的干細胞有助于尿道括約肌的收縮。作為參考，PKH是用于活細胞熒光染色的物質(zhì)，并且在該實施例中，來自胎盤蛻膜的干細胞在注射之前被PKH(紅色)標記?？傊?，在其中構(gòu)建了與小便失禁患者類似的強迫性小便失禁的動物模型的實施例6到8中，來自胎盤蛻膜的干細胞的注射增加了小便失禁裸鼠模型的漏尿點壓力，并增加了小便失禁鼠模型的尿道括約肌收縮性。漏尿點壓力沒有根據(jù)注射的干細胞數(shù)目發(fā)生極大改變，但是尿道括約肌的收縮性隨著注射的干細胞的數(shù)目增加而增加。這表明根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤蛻膜的干細胞也可被用作小便失禁患者的極佳的細胞治療劑。如上所述，胎盤蛻膜和月經(jīng)液蛻膜主要由子宮上皮細胞構(gòu)成。在本發(fā)明的實施例中，僅特別證明了來自胎盤蛻膜的干細胞的小便失禁的治療效果，但可以很容易推斷，來自月經(jīng)液蛻膜的干細胞也具有治療小便失禁的效果。實施例11注射了來自脂肪的干細胞的鼠組織的免疫染色根據(jù)上述的實施例7-9在4周和8周測定了漏尿點壓力和尿道括約肌收縮性后，收集每種尿道組織并使用已經(jīng)在液氮中冷卻的2-甲基丁烷無損傷冷凍。將尿道組織冷凍并切片，然后進行H/E染色。同樣，為了觀察干細胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌動蛋白(a-SMA)和肌球蛋白重鏈(MyHC)對組織進行免疫染色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。結(jié)果，如圖19所示，在實施例7中制備的裸鼠的正常尿道括約肌中，平滑肌豐富，并且骨骼肌被微弱染色(圖19的“A”、“B”和“C”)。在陰部神經(jīng)切除之后，可觀察到平滑肌的數(shù)量減少(圖19的“D”，“E”和“F“)。當注射(8周時)來自脂肪的干細胞時，平滑肌被染成綠色，表明平滑肌的數(shù)量增加。而且，在平滑肌之間，觀察到被紅色和綠色共染的黃細胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的綠色，并且在平滑肌細胞之間注射的細胞顯示紅色。而且，如圖20所示，如上所述，因為雄鼠的尿道在實施例9中被螺旋切割，所以不能觀察到最初的尿道形狀；但是，在尿道括約肌收縮性實驗之后可以觀察到PKH在組織中表達(8周；圖20的“A“和"B“)，表明注射的來自脂肪的干細胞有助于尿道括約肌的收縮。作為參考，PKH是用于活細胞熒光染色的物質(zhì)，并且在該實施例中，來自脂肪的干細胞在注射之前被PKH(紅色)標記。工業(yè)實用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的來自胎盤或月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞具有極好地分化成肌細胞的能力，因此顯示出了使漏尿點壓力增加和提高尿道括約肌收縮性的效果。所以，干細胞可用作治療小便失禁的試劑。雖然已經(jīng)根據(jù)特定特征對本發(fā)明進行了詳細描述，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，該描述僅用于優(yōu)選實施例，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物來限定。權(quán)利要求一種用于治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪的干細胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療小便失禁的細胞治療劑，其特征在于，來自胎盤蛻膜的干細胞具有如下特征(a)對⑶29和⑶90顯示免疫表現(xiàn)型陽性，但對⑶31和⑶45顯示免疫表現(xiàn)型陰性；(b)對0ct4、SSEA-4和Cripto_l顯示免疫表現(xiàn)型陽性；(c)附著在塑料上生長，具有圓形或者紡錘形的形態(tài)特征，并在SFM培養(yǎng)基中形成球形以便長期保持未分化狀態(tài)；以及(d)具有分化成肌細胞的能力。3.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療小便失禁的細胞治療劑，其特征在于，來自脂肪的干細胞具有如下特征(a)對CD73、CD90、CD29、CD44和CD105都顯示陽性免疫應(yīng)答，并對CD133、CD34、CD45、⑶4、⑶31、⑶62p、⑶14和HLA-DR都顯示陰性免疫應(yīng)答；(b)附著在塑料上生長，具有紡錘形形態(tài)特征，并在含有C0RM-2的培養(yǎng)基中形成球形以便長期保持未分化狀態(tài)。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療小便失禁的細胞治療劑，具體涉及用于治療小便失禁的含有來自胎盤或月經(jīng)液的蛻膜的干細胞或者來自脂肪組織的干細胞的細胞治療劑。來自蛻膜的干細胞或者來自脂肪組織的干細胞顯示出了使漏尿點壓力增加和提高尿道括約肌收縮性的作用，因此作為治療小便失禁的試劑十分有用。文檔編號A61K9/26GK101801352SQ200880024249公開日2010年8月11日申請日期2008年12月1日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者曹政允,李恒永,羅正燦,金允正申請人:Rnl生物技術(shù)株式會社