臨床回輸級細(xì)胞治療用人脂肪干細(xì)胞ADSCs分離提取培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種臨床回輸級細(xì)胞治療用人脂肪干細(xì)胞ADSCs分離提取培養(yǎng)方法，本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞醫(yī)學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，特別公開發(fā)明了從人類脂肪來源獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs體外分離及規(guī)?；囵B(yǎng)擴(kuò)增及保存的方法。通過高擬體外細(xì)胞外基質(zhì)附著鎖定目標(biāo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以及貼附培養(yǎng)，利用優(yōu)選的培養(yǎng)基組合，梯度仿體內(nèi)生態(tài)環(huán)境無血清馴化培養(yǎng)體系獲得臨床治療級別的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明獲得干細(xì)胞符合國際細(xì)胞協(xié)會(ISCT)標(biāo)準(zhǔn)具有高純度、干細(xì)胞增殖擴(kuò)增、傳代活性強、以及凍存保護(hù)細(xì)胞活性技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用是干細(xì)胞治療領(lǐng)域核心基礎(chǔ)，滿足了干細(xì)胞臨床藥物設(shè)計開發(fā)與醫(yī)療機構(gòu)開展干細(xì)胞療法回輸安全有效應(yīng)用的需求。
【專利說明】
臨床回輸級細(xì)胞治療用人脂肪干細(xì)胞ADSCs分離提取培養(yǎng) 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。涉及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi)貼附 環(huán)境分離篩選，脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞醫(yī)學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，特別 公開發(fā)明了從人類脂肪來源獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs體外分離及規(guī)?；囵B(yǎng)擴(kuò)增及保存 的方法。通過高擬體外細(xì)胞外基質(zhì)附著鎖定目標(biāo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以及貼附培養(yǎng)，利用優(yōu) 選的培養(yǎng)基組合，梯度無血清馴化培養(yǎng)體系獲得臨床治療級別的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方 法。獲得干細(xì)胞符合國際細(xì)胞協(xié)會（ISCT)標(biāo)準(zhǔn)具有高純度、干細(xì)胞增殖擴(kuò)增、傳代活性強、 以及凍存保護(hù)細(xì)胞活性技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用是干細(xì)胞治療領(lǐng)域核心基礎(chǔ)，滿足了干細(xì)胞臨床 藥物設(shè)計開發(fā)與醫(yī)療機構(gòu)開展干細(xì)胞療法回輸安全有效應(yīng)用的需求。
【背景技術(shù)】
[0002] 到目前為止，間充質(zhì)干細(xì)胞是成人干細(xì)胞具有多向分化潛能的熱點細(xì)胞，是一種 大多數(shù)成人器官中發(fā)現(xiàn)的具有骨形成能力和造血功能的細(xì)胞群體，可以從骨髓、臍血、脂肪 中提取，在特定的培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和 肌細(xì)胞等。
[0003] 間充質(zhì)干細(xì)胞是目前組織工程的主要種子細(xì)胞。經(jīng)歷了多年多學(xué)者的研究后，雖 然組織工程已經(jīng)獲得了很大進(jìn)展，然而，但由于目前缺乏理想篩選方法，間充質(zhì)干細(xì)胞不易 獲取、體外擴(kuò)增困難等限制，使其在臨床級別回輸?shù)膽?yīng)用受到限制。因此，尋找一種易于獲 得、免疫原性低、易于體外擴(kuò)增的臨床治療級別的種子細(xì)胞是目前組織工程迫切需要解決 的問題之一。
[0004] Zuk等從脂肪組織分離出一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)特殊體 系中成功地分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與肌細(xì)胞等，這種可分化的干細(xì)胞被認(rèn)可 為脂肪來源的間充質(zhì)細(xì)胞，即脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年來 從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞具有分化多胚層全 能性特征，其中包括中胚層，內(nèi)胚層和外胚層分化細(xì)胞的能力，能分泌許多潛在的有利的生 長因子和細(xì)胞活素以細(xì)胞為基礎(chǔ)的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方法快速發(fā)展。脂肪源性干細(xì)胞是 一群多功能間充質(zhì)干細(xì)胞，可以分化為其他的細(xì)胞系在脂肪組織的非脂肪（間質(zhì))碎片中存 在大量的脂肪源性細(xì)胞，且易于分離獲取。
[0005] 作為各種組織缺損的輔助治療方法，脂肪源性干細(xì)胞被推薦應(yīng)用。在創(chuàng)面愈合過 程中，血管再生是一個重要的步驟新生血管的形成是支持肉芽組織形成和角化細(xì)胞存活擴(kuò) 增愈合創(chuàng)傷的的必要條件。因此認(rèn)為，脂肪源性干細(xì)胞是通過快速促血管再生從而促進(jìn)創(chuàng) 面的愈合。另外，脂肪源性干細(xì)胞還顯示出通過細(xì)胞分化以及分泌促進(jìn)膠原合成和真皮成 纖維細(xì)胞迀移的長因子來促進(jìn)創(chuàng)面的愈合
[0006] LiuS等人將脂肪源性干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)支架成分聯(lián)合應(yīng)用于動物的皮膚軟組 織創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)脂肪源性干細(xì)胞以促進(jìn)支架的血管化能力。NieC等人的結(jié)果提示脂肪源性細(xì) 胞對創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用與脂肪源性干細(xì)胞促進(jìn)上皮化和肉芽組織的形成有關(guān)，并且脂肪 源性干細(xì)胞有潛在的表皮細(xì)胞分化能力研究結(jié)果還提示脂肪源性干細(xì)胞的遠(yuǎn)位分化能力 是多功能脂肪干細(xì)胞對創(chuàng)面的微環(huán)境的一個反應(yīng)。脂肪源性干細(xì)胞對局部血管的重塑包括 直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和分泌血管生長因子，后兩者則有益于血管的再生。即是說，脂肪 源性干細(xì)胞通過細(xì)胞分化和血管再生促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。等人將脂肪源性干細(xì)胞與血小板源 性生長因子，即一種眾所周知的參與正常創(chuàng)面愈合過程的因子，聯(lián)合用于創(chuàng)面的治療。研究 結(jié)果顯示二者的聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，即可能通過提高生長因子的水平而促進(jìn)了創(chuàng)面的愈 合。
[0007] 理論上講，細(xì)胞療法前景廣闊，因為多功能干細(xì)胞或祖細(xì)胞通過對創(chuàng)面缺失組織 的再生和持續(xù)提供許多有利因子而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。盡管如此，關(guān)于脂肪源性干細(xì)胞對創(chuàng) 面愈合的機制的研究仍有待于進(jìn)一步探索。脂肪源性干細(xì)胞對局部血管的重塑包括直接分 化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和分泌生血管生長因子，后兩者則有益于血管的再生。
[0008] ADSCs的應(yīng)用前景在各疾病動物模型上的應(yīng)用上用來干預(yù)治療糖尿病、肝臟損傷 修復(fù)、膀肌重建、2型糖尿病陽疹、心肌梗死、腦梗、認(rèn)知功能障礙、中風(fēng)、椎間盤修復(fù)、膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤治療、骨缺損、創(chuàng)傷后血管新生、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、唇愕裂、心力衰竭、結(jié)腸炎?尿失禁 等。西班牙學(xué)者Peran等首次將ADSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〖?xì)胞，既重新編程了成熟的干細(xì)胞，又能改 善心臟病的治療。也有學(xué)者將ADSCs與纖維蛋白膠復(fù)合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁 上，ADSCs在臨床組織工程治療心肌梗塞上會有很大的前景。ADSCs作為種子細(xì)胞放于網(wǎng)狀 支架中，成功地修復(fù)了狗的顱骨損傷，為臨床治療顱骨損傷。荷蘭埃拉斯莫斯大學(xué)的杜克斯 博士的科研小組應(yīng)用心臟病人腹部脂肪的ADSCs注射進(jìn)他們的心臟以后，減少了心臟的損 傷、同時也增加了血流，干細(xì)胞注射進(jìn)心臟以后經(jīng)過6個月，病人心臟接受帶氧血液的能力 提高，心臟左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT顯像證明接受ADSCs注射的病人心栗的 能力增加了 5.7%，核磁掃描也顯示患者的平均心肌疤痕面積由原來的31.6%下降到 15.4%，這一研究成果發(fā)布在2010年美國心臟協(xié)會科學(xué)年會上。ADSCs在組織修復(fù)過程中可 以調(diào)節(jié)周圍組織中的生長激素和細(xì)胞因子等防治細(xì)胞凋亡，Kim等試驗證明ADSCs可以分泌 各種皮膚生長因子如纖維細(xì)胞生長因子（（Basic fibroblastgrowth factor，bFGF)等來促 進(jìn)成纖維細(xì)胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皺、抗紫外福射等作用。Garcia-Olmo等研 究小組用ADSCs來治療病人復(fù)雜性肛屢已經(jīng)進(jìn)入到II期臨床實驗。Yoshimura等用人的 ADSCs移植入15名乳房萎縮、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡對稱， 乳房X光檢測，被修復(fù)的乳房自然柔軟完全無鈣化，無囊腫現(xiàn)象，無明顯的注射疤痕。最近的 臨床研究顯示，肌內(nèi)注射ADSCs對糖尿病足和閉塞性動脈硬化癥也有一定的療效。在注射 ADSCs的6個月后，從臨床上看，患者的靜息疼痛得到了緩解，無痛行走的距離明顯延長，而 且并未發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥。Vanikar等試驗ADSCs誘導(dǎo)成胰島樣細(xì)胞回輸糖尿病患者，術(shù)后隨 訪23個月，發(fā)現(xiàn)患者的外源性胰島素用量下降，患者的平均體重增加了而且患者無不適或 副反應(yīng)。
[0009] 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織參與創(chuàng)傷修復(fù)，當(dāng)脂肪細(xì)胞受到創(chuàng)傷刺激后，基因表達(dá) 發(fā)生應(yīng)激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、細(xì)胞間粘附因子、趨化因子，急性反映蛋白，受體等炎癥 基質(zhì)的基因表達(dá)都會增加，這些因子調(diào)控都是我們了解脂肪細(xì)胞參與修復(fù)的內(nèi)在治療機 制，這種調(diào)節(jié)體系是值得我們思考的精密調(diào)控。獲得的科研成果是豐富創(chuàng)傷修復(fù)的理論基 礎(chǔ)。臨床應(yīng)用傷及真皮下組織脂肪層的深度皮損創(chuàng)傷，脂肪回輸治療均可以達(dá)到加速創(chuàng)面 修復(fù)的理想治療效果，國外研究學(xué)者也應(yīng)用脂肪細(xì)胞，膠原蛋白與彈性蛋白應(yīng)用組織工程 技術(shù)制備含有脂肪細(xì)胞的人工皮膚，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)可減少全層皮膚缺損的組織修復(fù)造成的 創(chuàng)面收縮，這一現(xiàn)象提示我們脂肪組織中存在具有修復(fù)作用的因子與細(xì)胞。
[0010] 前脂肪細(xì)胞分化特征是細(xì)胞形態(tài)的改變-從成纖維細(xì)胞樣變成圓形，和與脂肪代 謝相關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)。這種形態(tài)轉(zhuǎn)變與纖維鏈接蛋白、層黏連蛋白、膠原、白肌動蛋白、微 管蛋白、蛋白聚糖、細(xì)胞外骨架越來越多的學(xué)者關(guān)注其質(zhì)與量環(huán)境改變密切相關(guān)，這種環(huán)境 也就是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分，是 細(xì)胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達(dá)、傳遞、互惠所依賴的及其重要場所。早期研究學(xué)者認(rèn) 為.外基質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)。Hauschka和Konigsberg在1966年研 究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象。并在兩年之后，得以證明學(xué) 者們才對這種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識和思考。
[0011] Hay在11年后報道了 ECM對胚胎發(fā)育過程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行為 的現(xiàn)象得以關(guān)注并進(jìn)行廣泛的研究但是并沒有成型的理論基礎(chǔ)，并佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動態(tài)互惠"的模型。 在這個模型中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號通過細(xì)胞膜傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞漿 中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達(dá)。
[0012] 并證明這些基因的表達(dá)產(chǎn)物又可以逆向來對ECM發(fā)生作用，近幾年許多研究證實 了這個模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用直接參與了細(xì)胞的黏附、生長、游走、分 化和程序性老化死亡(凋亡）的過程;外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長因子的活性;還能夠直 接激活、啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制。由于這種對細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對信號的傳導(dǎo)作用。因此，啟 迪研究者們必須充分了解細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)的、物理的、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的 形成和修復(fù)中的作用，才能更好地應(yīng)用這些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完 善再生的"生物構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深 入開展對ECM的認(rèn)識，同時也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，這種研究模式促進(jìn)學(xué)科前行 及發(fā)展。
[0013] 綜上所述，脂肪干細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附強快速特性，體外篩選培養(yǎng)的人脂肪 來源的間充質(zhì)干細(xì)胞得以在國內(nèi)外方法特異性發(fā)展。而干細(xì)胞生物學(xué)性能，可以做到增進(jìn) 功能、避免潛在有害基因及對干細(xì)胞控制分化時間與控制不同分化方向等，在基礎(chǔ)科研、臨 床治療、干細(xì)胞治療研究方向、皮膚再生損傷修復(fù)、高擬組織工程皮膚的構(gòu)建方面等均有歷 史時期不可取代的指導(dǎo)意義。
[0014] 三、組織工程皮膚背景介紹
[0015] 再生組織工程細(xì)胞建立系工作始于本世紀(jì)(Harrison 1907，Carrel 1912)，指導(dǎo) 引領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，稱為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻(xiàn)者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進(jìn)行孵化培養(yǎng)、使得組織細(xì)胞健康生長。
[0016] 組織工程皮膚建立早期應(yīng)用于修復(fù)燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領(lǐng)域，麻省總醫(yī) 院的John F.Burke與MIT的Yannas I.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織皮 膚替代物并不與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)，隸屬于組織工程皮膚支架材料學(xué)范疇。隨著細(xì)胞生物學(xué) 的基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展，人們開始整合兩大學(xué)科，共同協(xié)作解決創(chuàng)傷皮膚修復(fù)構(gòu)建，真正的含活性 細(xì)胞組織工程皮膚在哈福大學(xué)Honward Green與MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早期定制 皮膚移植救治取得了生物學(xué)醫(yī)學(xué)界矚目關(guān)注。
[0017] 20世紀(jì)80年代初期支架材料被roA許可上市，由膠原網(wǎng)格組成的復(fù)合皮膚移植材 料被創(chuàng)造出來，內(nèi)層為牛膠原和硫酸軟骨素構(gòu)成，外層為硅膠樹脂，創(chuàng)面移植后內(nèi)層與創(chuàng)面 接觸被緩慢降解，數(shù)周后硅樹脂層移除，清創(chuàng)后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0018] MIT的科學(xué)家Bellhe把材料學(xué)和生物學(xué)完美結(jié)合創(chuàng)造了組織工程皮膚并建立了世 界上第一家組織工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科學(xué)界商人的典范。這家活性組織 工程皮膚先驅(qū)引領(lǐng)公司仍然是在人工皮膚市場占有率最高的組織工程公司之一。
[0019] 1997年通過美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個組織工程產(chǎn)品由Advanced Bionhealing公 司生產(chǎn)的TransCyte。用于燒傷創(chuàng)面修復(fù)治療。該產(chǎn)品屬于膠原支架材料種植滅活性的纖維 細(xì)胞，成為商業(yè)化的第一個"異體無活性細(xì)胞組織工程真皮療法"。Dermagraf t和Integra以 及Organogenesis Inc制造的Apligraf也獲得FDA批準(zhǔn)，利用新生兒包皮經(jīng)生物學(xué)體外培養(yǎng) 活性細(xì)胞，制備的組織工程皮膚，用于潰瘍皮膚和大面積燒傷再生治療。該產(chǎn)品是嚴(yán)格按照 以上具有類皮膚組織工程人工皮膚，含活性4~8傳代細(xì)胞種植，是具有完整表皮真皮細(xì)胞 構(gòu)建在組織工程支架上的可降解全層人工皮膚。并且部分剔除減少朗格漢斯細(xì)胞，降低了 受體的免疫排斥反應(yīng)，無活性的死亡細(xì)胞經(jīng)過創(chuàng)面組織液及相關(guān)體液因子代謝的作用被分 解可用于創(chuàng)面修復(fù)的小分子片段基礎(chǔ)營養(yǎng)愈合物質(zhì)被創(chuàng)面吸收利用。這種產(chǎn)品制成后置 于一 70°C保存，37°C迅速復(fù)蘇，復(fù)蘇后有50%的活性細(xì)胞具有活性，活性維持5天通過快遞 郵寄到指定的醫(yī)療部門。這些產(chǎn)品的市場準(zhǔn)入引領(lǐng)了嶄新的再生醫(yī)學(xué)組織工程皮膚時代。
[0020] 基于國內(nèi)國際組織工程人工皮膚現(xiàn)狀，建立組織工程脂肪干細(xì)胞一高擬體內(nèi)細(xì)胞 外基質(zhì)，基質(zhì)附著體外篩選方法設(shè)計首例含有臨床治療級脂肪干細(xì)胞組織工程人工皮膚產(chǎn) 業(yè)化產(chǎn)品。
[0021] 獲得脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞還可以應(yīng)用臨床相關(guān)疾病細(xì)胞治療的回輸治療，以 及美容整形注射用填充。
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[0047] [25]朱寧文王凌儀中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃《細(xì)胞治 療制品臨床級皮膚細(xì)胞生物反應(yīng)器規(guī)?；療o血清制備及高效生物載體細(xì)胞移植關(guān)鍵技術(shù) 研究》(863計劃)課題實施方案計劃書與科技年度報告[M] ,2014-2016.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0048] 一、高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)種類：
[0049] 1.1其特征在于:針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體內(nèi) 真皮層作為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體脂肪干細(xì)胞篩選分離和體外培養(yǎng)的方法，并使獲 得的高純度脂肪干細(xì)胞。
[0050] 1.2其特征在于:針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體內(nèi) 全層皮膚并包括皮下組織層(皮下脂肪組織層)作為為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或皮膚 脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞篩選分離和體外培養(yǎng)的方法，并使獲得高純度脂肪干細(xì)胞。
[0051] 發(fā)明屬生物成體(胎兒)干細(xì)胞細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，方法特征包括：同體真皮脫細(xì)胞真 皮底物預(yù)備;同體脂肪干細(xì)胞的分離;利用高擬體內(nèi)附著基質(zhì)脂肪干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。
[0052] 同體全層皮膚及皮下組織層脫細(xì)胞底物預(yù)備；同體脂肪干細(xì)胞的分離;利用高擬 體內(nèi)附著基質(zhì)脂肪干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。
[0053]目前用該法在體外已穩(wěn)定培養(yǎng)傳代超過25(代），經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增25代前的脂肪干 細(xì)胞仍具有正常的染色體組型，無異常改變.經(jīng)體內(nèi)外實驗證實該細(xì)胞無細(xì)胞毒，具有強的 增殖能力，并可以形成分化，脂肪干細(xì)胞在科研、教學(xué)及臨床的應(yīng)用起到不可估量的作用， 同時孕育著巨大學(xué)術(shù)方向與社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。通過此種方法的理論基礎(chǔ)推進(jìn)我國脂肪 干細(xì)胞的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)建立。
[0054]二、高擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)外構(gòu)成：
[0055] 經(jīng)分析含有多種膠原并包含IV型、其中I型膠原含量最大（I與m型膠原的比例為 10:1)，同時還保留了完整的基底膜結(jié)構(gòu)(包括表皮層、真皮層、皮下組織層）。
[0056] 三、高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)底物孔隙率與黏附表面特征：
[0057]高擬底物電鏡觀察，測定表皮黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32~145y m，促進(jìn)黏附真皮組織再生底物基底膜多孔孔隙直徑為72~191wii。促進(jìn)黏附皮下組織層再 生底物基底膜多孔孔隙直徑為25~400wii。這種孔隙率所構(gòu)建的空間黏附表面均有有利于 干細(xì)胞黏附附著生長、增殖、分化。
[0058] 通過以上制備方法，有效的保留了細(xì)胞外基質(zhì)的微觀構(gòu)架和完整的基底膜結(jié)構(gòu)， 其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質(zhì)成分，可為脂肪干 細(xì)胞快速粘附、增殖擴(kuò)展提供有力的支持。因此，高擬底物是目前最理想的細(xì)胞篩選的解決 方案。
[0059] 四、細(xì)胞高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備具體實施步驟與方法：
[0060] 一、包括以下兩個步驟種方法：
[0061]步驟一 ：1.1皮膚消毒處理過程:取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、 頭皮、腋下皮膚、及軀干皮膚含皮下組織層均可)剝離含表皮層與皮下組織層結(jié)構(gòu)、保留真 皮層、剪切成組織塊浸泡在生理鹽水稀釋含〇 . 05~0.1 %苯扎溴銨溶液中10~15min，消毒 處理，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗殘余苯扎溴銨。
[0062] 1.2皮膚消毒處理過程:取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、頭皮、腋 下皮膚、及軀干皮膚含皮下組織層均可)含表皮層、真皮層、皮下組織層結(jié)構(gòu)的器官組織，剪 切成組織塊浸泡在生理鹽水稀釋含0.05~0.1 %苯扎溴銨溶液中10~15min，消毒處理，用 無菌生理鹽水反復(fù)沖洗殘余苯扎溴銨。
[0063] 步驟二：低溫一30~一 100°C冷凍干燥，真空度達(dá)到10~130pa，脫去組織塊90~ 95%以上水分，取出密封與真空包裝，經(jīng)輻照15~80KGY劑量滅菌。終品可以長期保存。啟動 只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營養(yǎng)液復(fù)蘇15~30min即可應(yīng)用，浸泡延長至10~12h效果 更佳。使用后并且應(yīng)用去細(xì)胞漂洗液(見下方法中相應(yīng)提及適合的脫細(xì)胞液)脫細(xì)胞處理、 再經(jīng)過上述過程永生反復(fù)使用的特點。
[0064] 1:步驟二【具體實施方式】：
[0066]上述所提及的脫細(xì)胞液制備如下所述：
[0067]二、方法：
[0068] 實例方法1:組織器官經(jīng)處理后加入0.1~0.5%蛋白酶冰浴冷消48~12h。
[0069]用含0.25 %戊二醛磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)PH在7.20~7.40之間用交聯(lián)液沖洗組織塊3 ~6次，最后放入交聯(lián)液中交聯(lián)4~6h，結(jié)束后用超純水(或注射用水)反復(fù)沖洗8~10次去除 殘留戊二醛，即可進(jìn)行冷凍干燥脫水封裝。
[0070] 1.1:實例方法1【具體實施方式】：
[0072] 方法一特點：交聯(lián)劑可有效的使結(jié)締組織蛋白不可溶性交聯(lián)構(gòu)架，增強底物的抗 降解性，保持底物完整，蛋白酶處理底物可使其柔韌性增強。
[0073] 皮膚表皮層內(nèi)含四層結(jié)構(gòu)，各層細(xì)胞量為10~30%，其中生發(fā)層稱為基底細(xì)胞層 是細(xì)胞最為活躍的附著分裂分化場所，有9~15層之多；顆粒層結(jié)構(gòu)含有大量間隙層狀物， 角化層多呈網(wǎng)狀編織狀，立體復(fù)雜的三維空間互穿行結(jié)構(gòu)，真皮層空間架構(gòu)，與皮下組織層 空間架構(gòu)，體外支架材料很難模擬模仿。故此類底物基質(zhì)是最適合細(xì)胞粘附增殖生長分化 所需的理想微環(huán)境場所。
[0074] 實例方法2:酶一非離子表面活性劑一絡(luò)合劑聯(lián)合法
[0075] 0.1~0.25%018?&86中性蛋白酶與0.01~0.02%￡0了厶聯(lián)合消化，中性蛋白酶作用 于基底膜，選擇性地分解纖維連接素與IV型膠原(4°C下作用48h)，然后應(yīng)用非離子型表面 活性劑使細(xì)胞溶解破壞TritonX -100(聚乙二醇辛基苯基醚）（0.1~0.8%溶液，室溫下作 用48~24h)與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物溶解于溶液中，同時TritonX -100中 的親油基端也能和細(xì)胞外膜蛋白結(jié)合破壞生物膜，從而達(dá)到脫棄細(xì)胞作用。
[0076] 消化后可選擇性剝離表皮真皮皮下組織層器官，經(jīng)方法1進(jìn)行戊二醛交聯(lián)步驟，即 可進(jìn)行冷凍干燥脫水封裝。
[0077] 2.1:實例方法2【具體實施方式】：
[0080]實例方法3:絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法
[0081 ] 利用高滲氯化鈉溶液（（0.01~0.02% EDTA含0.1~lmo 1/L氯化鈉溶液，37 °C下作 用24~12h))使錨狀細(xì)絲與表皮基底細(xì)胞的半橋粒分離開來，從而完整去除細(xì)胞，再用破膜 劑十二烷基磺酸鈉(0.1~〇.8%SDS溶液，室溫下作用60~30min)將細(xì)胞成分從組織中去 除。
[0082]以上步驟可選擇性剝離表皮層、真皮層、皮下組織層，保留全層經(jīng)方法1進(jìn)行戊二 醛交聯(lián)步驟，即可進(jìn)行冷凍干燥脫水封裝。
[0083] 3.1:實例方法3【具體實施方式】：
[0085] 實例方法4:用0 ? 1~0 ? 6 %胰蛋白酶和0 ? 01~0 ? 1 % EDTA體積比（1: 2)混合液聯(lián)合 消化組織塊，37°C，快速消化60~lOmin，反復(fù)漂洗脫細(xì)胞，最后放入交聯(lián)液中交聯(lián)4~6h，結(jié) 束后用超純水(或注射用水)反復(fù)沖洗8~10次去除殘留戊二醛，即可進(jìn)行冷凍干燥脫水封 裝。
[0086] 4.1:實例方法4【具體實施方式】：
[0089] 以上方法均可組合制備出高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)所述：1.1、1.2、進(jìn)行篩選脂肪干細(xì) 胞。
[0090] 上述方法制得略有差異，時間上成本上有異、但均可有效使得細(xì)胞成分被清除，基 質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性被保留，含有彈力素、硫酸角質(zhì)素、層粘素、IV型膠原、纖維連接素、結(jié)合素、 HLA-DR的含量較多，基底膜結(jié)構(gòu)成分均可以完整保留。
[0091] 對于附著性的種子脂肪干細(xì)胞提供了有利微環(huán)境，使其表達(dá)、生長、增殖、分化等 起到極其重要的作用，常規(guī)篩選方法不可替代高模擬附著狀態(tài)三維空間架構(gòu)，我們稱之為 "細(xì)胞種植黑土壤環(huán)境"。
[0092]高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)篩選脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)法 [0093]五、脂肪取材篩選：
[0094]脂肪干細(xì)胞的分離常規(guī)麻醉，將皮膚切口，用器械分裂皮下脂肪組織，生理鹽水與 腎上腺素處理，降低出血量防止血細(xì)胞夾帶污染，開展實施吸脂手術(shù)，獲取吸出的脂肪(分 別取其脂肪組織約30g)用無菌(青霉素80~100u/ml和80~100μg/ml鏈霉素)PBS充分浸泡3 ~5min以PBS沖洗3次，盡量剔除筋膜血管及夾帶的血細(xì)胞以及麻醉藥，眼科剪將組織剪成 1.0~2.0_ 3組織塊，并將其剪成碎成糊狀。此步驟獲得下一篩選培養(yǎng)所需的脂肪糊狀組織 塊。
[0095]脂肪取材篩選步驟中的脂肪糊狀組織塊 [0096]六、脂肪干細(xì)胞篩選培養(yǎng)步驟
[0097] 因為脂肪干細(xì)胞對基底膜有較強的粘附性，對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附速度要比其它類 型細(xì)胞快得多，貼壁生長習(xí)性所以利用該種特性進(jìn)行培養(yǎng)篩選。
[0098] 七、脂肪干細(xì)胞篩選培養(yǎng)權(quán)利要求方法：
[0099] 1、培養(yǎng)液制備：
[0100] 配制培養(yǎng)液A:胎盤多肽注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干細(xì)胞生長因子(SCF)2 ~llng/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5~15μg/ml、谷氨酰胺1 ? 5mmol/L、維生素B4 0? 5~lmg/L、維生素Cl~ 4μg/ml、胰島素5~8μg/ml、青霉素50~100u/ml、鏈霉素100u/m L、氫化可的松0.4μg/ml、商 用培養(yǎng)基-低糖DMEM/F12( 3:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。
[0101 ] A. 1:配制培養(yǎng)液A【具體實施方式】
[0103]配制培養(yǎng)液B:胎盤多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白（HSA)l~3g/L、
[0104]人血纖粘蛋白（FN) 1~4yg/L、人層粘連蛋白（LN)5~8yg/L、血小板衍生因
[0105] 子(PDGF)l ~10mg/L、EGF5 ~10ng/ml、干細(xì)胞生長因子（SCF)l ~3ng/ml、維生
[0106] 素B5~8mg/L、葉酸 1 ~10ng/ml、維生素E 0.05~lmg/L、維生素B4 0.5~lmg/L、
[0107] 黃體酬0? 01~0? (Myg/L、輔酶Q10 0? 1~2mM/L、膽固醇1~10mg/L、牛橫
[0108] 酸0 ? 1~0 ? 4g/L、胰島素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用
[0109] 培養(yǎng)基低糖DMEM與商用培養(yǎng)基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。
[0110] B.1:配制培養(yǎng)液B【具體實施方式】
[0112] 配制培養(yǎng)液C:胎盤多肽注射液0.02~0.8ml/L、人血清白蛋白（HSA)3~6g/L、人血 纖粘蛋白（FN)5~15yg/L、人層粘連蛋白（LN)10~80yg/L、重組人胰島素樣生長因子-1 (IGF-l)l ~4mg/L、胎盤生長因子(rhPIGF)6 ~1111^/146?士?6?10~151^/1111、干細(xì)胞生長 因子（SCF)5~10ng/ml、維生素B25~8mg/L、葉酸1~8ng/ml、黃體酮0.01~0.06yg/L、維生 素E 0.05~1.25mg/L、維生素C 2~llmg/L、維生素B4 0.5~lmg/L、輔酶Q10 0.1 ~2mM/L、 膽固醇1~18mg/L、?；撬? ? 1~0.6g/L、還原性谷胱甘肽2~5yg/L、油酸0 ? 5~7 ? 5mg/L、谷 氨酰胺〇. 5~2.5mmol/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6~20μg/ml、胰島素5~7μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素 10011/11^、商用培養(yǎng)基低糖01^與商用培養(yǎng)基？12(1 :1)定容到5001111。？田空制在7.2~7.4。
[0113] C.1:配制培養(yǎng)液C【具體實施方式】
[0115] 說明：臨床細(xì)胞治療回輸階段細(xì)胞擴(kuò)增。相應(yīng)進(jìn)行遞減性馴化培養(yǎng)相應(yīng)降低或剔 除以上所述配方中的有藥理藥效作用的添加物質(zhì)。
[0116] 2、消化液配制法：
[0117] 消化液配制A:消化液配制A:含溶質(zhì)0.1%中性蛋白酶和0.01%EDTA(體積比1:1)， 無Ca 2+、Mg2+、無菌PBS為溶劑，配制溶液。
[0118] 消化液配制B:含溶質(zhì)0.2 %胰酶和0.075 % II型膠原酶(體積比1:1)，無胎盤多肽 注射液培養(yǎng)液A為溶劑，配制溶液。
[0119] 消化液配制C:含溶質(zhì)0.15 %中性蛋白酶和0.2 % I型膠原酶(體積比1:1 )，無胎盤 多肽注射液培養(yǎng)液A為溶劑，配制溶液。
[0120] 3、篩選脂肪干細(xì)胞凍融保存液制備：
[0121] 抗凍溶質(zhì)組分包括：維生素B4 1~10μg/ml，維生素C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、 (優(yōu)選自體血清)人AB血清10~15 %、甘油20 %、甘露醇3ml、細(xì)胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亞 砜(DMS0) 10%、硫酸軟骨素3~6%，保存液以配制培養(yǎng)液ABC為溶劑制備抗凍溶液。PH控制 在7.3~7.4，0.22mi微孔濾過除菌。
[0122] 3.1:3篩選細(xì)胞凍融保存液制備【具體實施方式】：
[0124] 說明，其特征在于:該冷凍液可以通過冷凍長期保存脂肪干細(xì)胞活性
[0125] 5、脂肪干細(xì)胞篩選步驟方法：
[0126] 步驟1、取脂肪取材篩選步驟中的脂肪糊狀組織塊，用無菌(青霉素80~lOOu/ml和 80~100μg/ml鏈霉素）PBS充分浸泡3~5min，以PBS沖洗3次，以消化液A常溫消化10~ 15min，組織塊懸液離心(900r/min離心5~lOmin)，棄去消化液A，收集組織塊與細(xì)胞沉淀， 在以消化液B或C(37°C，振蕩120r/min條件下消化30min-60min)，用數(shù)倍含10%自體血清或 人AB血清培養(yǎng)液A洗滌終止消化，，1200g離心10min去除上清及懸浮的殘存組織夜，后用培 養(yǎng)液A重懸細(xì)胞沉淀，然后室溫下用6倍體積的（NH4CI 154mmol/L+KHC03 10mmol/L+EDTA 0.1mmol/L)紅細(xì)胞裂解液孵育6~10min，1200g/min離心6min棄掉上清液(雜細(xì)胞懸浮的殘 存組織及紅細(xì)胞），獲得高濃度脂肪組織細(xì)胞團(tuán)，用適量的無菌含抗PBS液清洗3次，過直徑 200wii的鋼制篩網(wǎng)除去未完全消化的組織。再用適量培養(yǎng)液A重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)以細(xì)胞密 度，4X10 4/ml〇
[0127] 步驟2、取高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)選1.2、也可選1.1，用含抗生素的PBS沖洗3次，再用 配制培養(yǎng)液A沖洗3次，于37°C，浸泡在培養(yǎng)液A中復(fù)蘇10~12h備用。
[0128] 步驟3、脂肪干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng):取預(yù)備好的1.2放入100mm平皿加入配制培養(yǎng)液 B，加入細(xì)胞濃度4X 104/ml脂肪干細(xì)胞懸液，37°C，氣相5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~72h取出，取 出轉(zhuǎn)移1.2，PBS或培養(yǎng)液B清洗3~6次，目標(biāo)脂肪干細(xì)胞貼壁粘附于1.2上。換皿加入配制培 養(yǎng)液C培養(yǎng)，隔10~72h后更換全部培養(yǎng)基C，此后每2~3d換液一次繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0129] 步驟4、消化富集傳代培養(yǎng):上述脂肪干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增后，當(dāng)脂肪干細(xì)胞生長至80 % ~90 %融合時，加入消化液配制BSC消化1.2，37°C消化15~30min，用數(shù)倍含10%自體血清 或人AB血清培養(yǎng)液B終止消化;稍加吹打，過濾收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，600~1200r/ min離心4~6min，棄上清液，加入配制的培養(yǎng)液C，重懸細(xì)胞，以1~3 X 106/ml的密度轉(zhuǎn)移傳 代按照上述步驟培養(yǎng)，置37°C、氣相5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2~3d換配制培養(yǎng)液C一次繼續(xù)擴(kuò) 增培養(yǎng)。
[0130] 6、脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫組織化學(xué)法檢：
[0131] ADSCs細(xì)胞形態(tài):倒置顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)。接種高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)6~24h后 細(xì)胞多已貼壁，換液除去未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)2~3d后貼壁細(xì)胞開始分裂增殖，均呈長梭形或 多角形外觀。7d后細(xì)胞融合單層達(dá)80%鋪滿這時進(jìn)行消化傳代。
[0132] 免疫組織化學(xué)表型:選取3代細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測研究發(fā)現(xiàn)ADSCs均陽性表達(dá) CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49d、CD73、CD90、CD 105、CD166、和 HLA-ABC，并且陽性率均高達(dá) 96.1~97.6%以上。CD29是識別整合素亞單位的蛋白，廣泛存在于除了紅細(xì)胞外的各種組 織及細(xì)胞中。CD44是目前所發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞最廣泛表達(dá)的分布在胞膜和胞漿標(biāo)志物，該 陽性表達(dá)進(jìn)一步證明干細(xì)胞的身份。CD90和⑶105為間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表型。且均能夠 高表達(dá)陽性印證所獲取的脂肪干細(xì)胞具有較強的貼壁能力，細(xì)胞活性好。陰性表達(dá)⑶34、 〇)45、〇)19、〇)14、〇)31、〇)621、〇)951和111^-01?。〇)34和〇)45是造血細(xì)胞系分子標(biāo)志物，說明 獲得的干細(xì)胞具有成脂及成骨分化潛能。
[0133] 細(xì)胞活性均>98 %;
[0134] 干細(xì)胞生長曲線：3代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的潛伏期一般為3d;第4~5d開始細(xì)胞 增殖明顯加快，呈對數(shù)樣增殖進(jìn)入對數(shù)生長期，該期持續(xù)至5~6d;第9d左右細(xì)胞增殖速度 趨于平緩進(jìn)入生長平臺期。
[0135] 說明：鑒定以及本發(fā)明的培養(yǎng)體系結(jié)果表明本分離培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞為人脂肪干 細(xì)胞，細(xì)胞純度較高。在提升目標(biāo)脂肪干細(xì)胞純度，可重復(fù)進(jìn)行脂肪干細(xì)胞具體實施方法3 步驟獲得更高純度的脂肪干細(xì)胞。同時也可以選取1.1高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)行篩選。
[0136] 八、本發(fā)明的具有以下優(yōu)點：
[0137] 最常規(guī)的一種培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基就是添加有動物血清的培養(yǎng)基。然而，采 用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，不僅因添加量問題出現(xiàn)生長過快或比較緩慢現(xiàn)象，超過 幾代之后其分化成功能細(xì)胞的潛能大大降低，動物血清培養(yǎng)技術(shù)綜合增殖能力、免疫調(diào)節(jié) 能力、分泌細(xì)胞因子的能力這三方面均會受到不可控方向變化。國外不同地域廠商來源的 動物源血清批次存在潛在的不重復(fù)性，也是影響了其細(xì)胞擴(kuò)增規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)瓶頸；另 一方面，相對于人是異源性，異種蛋白混入潛在細(xì)胞治療不確定性，從而限制了其在臨床上 的應(yīng)用。因此，探索快速擴(kuò)增脂肪干細(xì)胞而又不影響其潛能的培養(yǎng)條件及其培養(yǎng)基組成的 優(yōu)化組合是非常重要的研究內(nèi)容。
[0138] 多組合培養(yǎng)體系仿生脂肪干細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境的無血清培養(yǎng)方案與傳統(tǒng)的含動物血 清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供取得脂肪干細(xì)胞純度高、貼壁性能強、獲取細(xì)胞能夠保持干細(xì)胞 幼稚形態(tài)、具有更好的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞干性，培養(yǎng)獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞性能 同時降低了培養(yǎng)成本，適應(yīng)了臨床細(xì)胞治療安全性需求。
[0139] 本發(fā)明公開了脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選、擴(kuò)增技術(shù)，這些瓶頸一直是生物學(xué)干細(xì)胞 領(lǐng)域研究的熱點和難點，目前利用基底膜顯著黏附特性進(jìn)行分離純化，采用三維培養(yǎng)擴(kuò)增 手段來獲得。
[0140] 該發(fā)明適合依賴擴(kuò)增貼壁型細(xì)胞并提供三維高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo) 細(xì)胞水平的篩選與分離。
[0141] 本發(fā)明屬于高模擬體內(nèi)貼附環(huán)境，體外培養(yǎng)成體(胚胎)脂肪干細(xì)胞的生物細(xì)胞新 型培養(yǎng)技術(shù)。其特征在于:細(xì)胞基質(zhì)底物為供體脫細(xì)胞基質(zhì)底物篩選最佳黏附場所篩選干 細(xì)胞的制備方法;相應(yīng)脂肪干細(xì)胞高模擬底物所在環(huán)境黏附篩選培養(yǎng)目標(biāo)干細(xì)胞。用該方 法取得的干細(xì)胞，具有高傳代能力，高增殖能力，并可在體外環(huán)境下分化形成其他細(xì)胞，此 方法比傳統(tǒng)意義上的干細(xì)胞篩選更具科研與教學(xué)臨床應(yīng)用意義深入研究干細(xì)胞生長增殖 分化提供了不可估量的科研學(xué)術(shù)價值，開創(chuàng)體外高擬體內(nèi)貼壁附著培養(yǎng)的新紀(jì)元，此方法 提出為國內(nèi)國際首創(chuàng)。
[0142] 通過這種高目標(biāo)模式的篩選，結(jié)合組織工程免疫原性細(xì)胞如何安全獲得免疫逃 逸，延長移植時間增加組織工程臨床應(yīng)用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合與皮膚疾病提供了絕對優(yōu)勢的解 決方案。
[0143] 1、組織工程皮膚；同體-高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)附著體外篩選方法對種子脂肪 干細(xì)胞進(jìn)行篩選與于體內(nèi)的微環(huán)境一致性是目前任何方法不可取代的，并且制備簡單可反 復(fù)使用;是構(gòu)建世界首例含脂肪干細(xì)胞組織工程產(chǎn)品基礎(chǔ)；
[0144] 2、特異性強，通過免疫組化檢測、透射電鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明本發(fā) 明的脂肪干細(xì)胞純度高；
[0145] 3、創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用、在基因研究方面、美容整形修復(fù)、口腔疾病、皮膚病領(lǐng)域；
[0146] 4、脂肪干細(xì)胞科研價值:脂肪干細(xì)胞譜系的研究，深入探討研究脂肪干細(xì)胞黏附， 生長、增殖、分化、免疫表達(dá)等學(xué)科基礎(chǔ)研究；
[0147] 5、該方法可為其它器官體外培養(yǎng)再生提供良好的科研理論基礎(chǔ)；
[0148] 6、再生醫(yī)學(xué)組織工程領(lǐng)域應(yīng)用種子干細(xì)胞庫。
[0149] 脂肪干細(xì)胞的豐富來源。成體干細(xì)胞作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，由于較少存在倫 理問題，為臨床中用常規(guī)治療方法難以治療的疾病帶來了新的希望，隨著生物化學(xué)、材料化 學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等的發(fā)展，脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)，誘導(dǎo)定向分化已成為確實可行有 研究前景的技術(shù)，相信對脂肪干細(xì)胞高擬體外基質(zhì)共培養(yǎng)技術(shù)及機制的深入研究，將會模 擬建立更為真實的生物體微環(huán)境培養(yǎng)系，為應(yīng)用于臨床治療級別細(xì)胞深入研究奠定有力基 礎(chǔ)，為組織工程、再生醫(yī)學(xué)以及各種人類疾病提供臨床治療級別的種子細(xì)胞。
【附圖說明】
[0150] 圖1是本發(fā)明皮膚細(xì)胞高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的制備流程。
[0151] 圖2是本發(fā)明的臨床治療級細(xì)胞治療用ADSCs應(yīng)用高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng) 方法流程。
【主權(quán)項】
1. 一種臨床治級脂肪干細(xì)胞ADSCs制備方法，由以下步驟組成； (1 )ADSCs培養(yǎng)液組合；（2)篩選用高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備；（3)應(yīng)用高擬體內(nèi)細(xì)胞外 基質(zhì)與ADSCs培養(yǎng)液組合篩選培養(yǎng)ADSCs，以及ADSCs長期凍融保存液制備。2. -種利用權(quán)利要求1所述的ADSCs培養(yǎng)液組合包括： 配制培養(yǎng)液A:胎盤多肽注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干細(xì)胞生長因子（SCF)2~ llng/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5~15μg/ml、谷氨酰胺1.5mmol/L、維生素 Μ 0 · 5~lmg/L、維生素 C1~4μ g/ml、胰島素5~8μg/ml、青霉素50~100u/ml、鏈霉素100u/m L、氫化可的松0.4μg/ml、商用 培養(yǎng)基-低糖DMEM/F12( 3:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4; 配制培養(yǎng)液B:胎盤多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白（HSA) 1~3g/L、人血纖粘蛋白 (FN)1~4yg/L、人層粘連蛋白（LN)5~8yg/L、血小板衍生因子（roGF)l~10mg/L、EGF5~ 10ng/ml、干細(xì)胞生長因子（SCF) 1~3ng/ml、維生素 B5~8mg/L、葉酸1~10ng/ml、維生素 E 0·05~lmg/L、維生素 B40·5~lmg/L、黃體酬0·01~0·04yg/L、輔酶Q10 0· 1~2mM/L、膽固醇 1~10mg/L、?；撬? · 1~0.4g/L、胰島素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用 培養(yǎng)基低糖DMEM與商用培養(yǎng)基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4; 配制培養(yǎng)液C:胎盤多肽注射液0.02~0.8ml/L、人血清白蛋白（HSA)3~6g/L、人血纖粘 蛋白（FN)5~15yg/L、人層粘連蛋白（LN)10~80yg/L、重組人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)1 ~4mg/L、胎盤生長因子(rhPIGF)6~1111^/146?士?6?10~151^/1111、干細(xì)胞生長因子(3〇卩） 5~10ng/ml、維生素 B25~8mg/L、葉酸1~8ng/ml、黃體酬0 · 01~0 · 06yg/L、維生素 E 0.05~ 1.25mg/L、維生素 C 2~llmg/L、維生素 B4 0.5~lmg/L、輔酶Q10 0.1~2mM/L、膽固醇1~ 18mg/L、?；撬? · 1~0 · 6g/L、還原性谷胱甘肽2~5yg/L、油酸0 · 5~7 · 5mg/L、谷氨酰胺0 · 5 ~2.5mmol/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6~20μg/ml、胰島素5~7μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商 用培養(yǎng)基低糖DMEM與商用培養(yǎng)基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。3. -種利用權(quán)利要求1所述篩用高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備方法，包括 其中所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)分為兩種：1.1真皮層作為細(xì)胞外基質(zhì)；1.2全層皮膚 并包括皮下組織層作為細(xì)胞外基質(zhì)； 制備包括以下步驟:A)組織消毒處理;B)高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)脫細(xì)胞處理;C)將消毒或 經(jīng)脫細(xì)胞處理的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行低溫、脫水、輻照滅菌處理;其中所述步驟 B)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶一非離子表面活性劑一絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽_ 陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合Η)ΤΑ交聯(lián)液法。4. 如權(quán)利要求3所述的B)高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)脫細(xì)胞處理步驟，其特征在于，所述的高 擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的制備方法中的冷酶交聯(lián)劑法是:加入〇. 1~〇. 5 %蛋白酶冰浴冷消48~ 12h，用含0.25 %戊二醛磷酸緩沖溶液，pH在7.20~7.40之間，交聯(lián)4~6h，超純水或注射用 水沖洗8~10次； 所述的制備方法中的酶一非離子表面活性劑一絡(luò)合劑聯(lián)合法是:0.1~0.25%中性蛋 白酶與0.01~0.02%EDTA，0.1~0.8%TritonX -100溶液，室溫下作用48~24h; 所述的絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是:〇. 01~〇. 〇2%EDTA含0.1~lmol/L氯化鈉 溶液，37 °C下作用24~12h，后用0.1~0.8 % SDS溶液，室溫下作用60~30min; 所述的胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是:0.1~0.6 %胰蛋白酶和0.01~0.1 % EDTA，胰蛋白酶與 EDTA溶液按照體積比為1:2配比，37 °C快速消化60~1 Omin，交聯(lián)液中交聯(lián)4~6h，交聯(lián)后用 超純水或注射用水沖洗8~10次。5. 如權(quán)利要求3所述的C)步驟低溫、脫水、輻照滅菌，其特征在于，低溫一30~一 100°C 冷凍干燥，真空度達(dá)到10~130pa，脫去臍帶組織高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)90~95 %以上水分， 取出密封與真空包裝，經(jīng)輻照15~80KGY劑量滅菌。6. -種利用權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)與ADSCs培養(yǎng)液組合篩選培養(yǎng) ADSCs的方法，包括： a) 制備ADSCs懸液:取材，消化液A，B或C二步消化，用權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)液A終止消 化，紅細(xì)胞裂解液處理，過濾清洗，重懸細(xì)胞計數(shù)，后加入培養(yǎng)液A; b) ADSCs的篩選及培養(yǎng):將高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)加入權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)液B，加入步 驟a)制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標(biāo)ADSCs貼壁粘附于高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，加入權(quán)利要 求2所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； c) 消化富集傳代培養(yǎng)：消化液B或C消化，含10 %人血清培養(yǎng)液B終止消化，離心后加入 權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； d) ADSCs長期凍融保存液制備。7. -種利用權(quán)利要求6所述的消化液A、B、C，其特征在于，組分包括： 消化液配制A:消化液配制A:含溶質(zhì)0.1 %中性蛋白酶和0.01 %EDTA(體積比1:1)，無 Ca2 +、Mg2+、無菌PBS為溶劑，配制溶液。 消化液配制B:含溶質(zhì)0.2%胰酶和0.075% Π 型膠原酶(體積比1:1)，無胎盤多肽注射 液培養(yǎng)液A為溶劑，配制溶液。 消化液配制C:含溶質(zhì)0.15%中性蛋白酶和0.2%1型膠原酶(體積比1:1)，無胎盤多肽 注射液培養(yǎng)液A為溶劑，配制溶液。8. -種利用權(quán)利要求1所述的ADSCs凍融保存液制備，其特征在于，抗凍溶質(zhì)組分包括： 維生素 Μ 1~10μg/ml，維生素 C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、（優(yōu)選自體血清)人AB血清10~ 15%、甘油20%、甘露醇3ml、細(xì)胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亞砜(DMSO)IO%、硫酸軟骨素3~ 6%，保存配制液以權(quán)利要求2所訴無抗的培養(yǎng)液ABC為溶劑制備抗凍溶液。PH控制在7.3~ 7.4，0.22μηι微孔濾過除菌。
【文檔編號】A01N1/02GK105820998SQ201610194945
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月30日
【發(fā)明人】王凌儀
【申請人】王凌儀