專利名稱：來自蓖麻植物的種子優(yōu)選性基因啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠驅(qū)動其它核苷酸序列表達的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
關(guān)于產(chǎn)生重組植物的一項重要考慮是使用在驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達方面展現(xiàn)出合適活 性的基因啟動子。啟動子不僅能控制基因表達的水平，而且還能控制表達的時機和組織特 異性。有興趣開發(fā)可以用于生產(chǎn)具有特定工業(yè)效用的脂肪酸的工業(yè)含油種子作物。蓖麻 植物(蓖麻(Ricinus communis))由于其在蓖麻油方面的長期種植歷史而成為在這點上特 別感興趣的。因此，在產(chǎn)生蓖麻和其它植物的轉(zhuǎn)基因品種中使用的來自蓖麻的啟動子會是 本領(lǐng)域中的一項進步。發(fā)明概述本發(fā)明的例示性實施方案包括包含如下的分離的核苷酸序列的核苷酸序列、載 體、細胞、植物、和/或種子，所述分離的核苷酸序列包含與SEQ IDNO :9或SEQ ID N0:10的 序列具有至少約90%同源性的核苷酸序列。本發(fā)明的別的例示性實施方案包括包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接 的感興趣核苷酸序列的核苷酸序列、載體、細胞、植物、和/或種子，所述分離的核苷酸序列 包含與SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10的序列具有至少約90%同源性的核苷酸序列。本發(fā)明的別的例示性實施方案包括一種促進由感興趣的核苷酸序列編碼的分子 表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣的 核苷酸序列。本發(fā)明的別的例示性實施方案包括一種在細胞中生成由感興趣核苷酸序列編碼 的分子的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣 的核苷酸序列；向所述細胞提供所述可操作連接的核苷酸序列；并表達所述感興趣的核苷 酸序列。本發(fā)明的別的例示性實施方案包括一種在細胞中調(diào)控靶物表達的方法，該方法包 括提供感興趣的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠在細胞中調(diào)控所述靶物表達 的反義寡核苷酸或siRNA ；將權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣的 核苷酸序列；向所述細胞提供所述可操作連接的核苷酸序列；并表達所述感興趣的核苷酸 序列。
附圖簡述

圖1圖示性描繪了用于在全植物中測試蓖麻油質(zhì)蛋白和54-SSP啟動子的植物二 元表達載體。圖2A、圖2B、和圖2C是CopGFP在來自多種組織的提取物中的表達的圖示，所述多 種組織自用PD0W2771 (54-SSP啟動子)轉(zhuǎn)化的T2擬南芥植物分離。圖2A描述了自6種不 同Tl系產(chǎn)生的T2植物的CopGFP表達結(jié)果均值(+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差)。對于每種T2系，左側(cè)柱 形對應(yīng)于葉表達，中間柱形對應(yīng)于發(fā)育中的長角果表達，而右側(cè)柱形對應(yīng)于成熟的種子表 達。圖2B相對于葉中的GFP表達描繪了多種組織中的CopGFP表達。對于每種T2系，左側(cè) 柱形對應(yīng)于葉葉表達，中間柱形對應(yīng)于發(fā)育中的長角果葉表達，而右側(cè)柱形對應(yīng)于成熟 的種子葉表達。圖2C描繪了各個T2系中的CopGF表達。RFU =相對熒光單位；η =自每 種Tl系檢查的Τ2植株的數(shù)目。圖3Α、圖3Β、和圖3C是CopGFP在來自多種組織的提取物中的表達的圖示，所述多 種組織自用pD0W2772(油質(zhì)蛋白啟動子)轉(zhuǎn)化的Τ2擬南芥植物分離。圖3A描述了自7種 不同Tl系產(chǎn)生的T2植物的CopGFP表達結(jié)果均值(+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差)。對于每種T2系，左側(cè) 柱形對應(yīng)于葉表達，中間柱形對應(yīng)于發(fā)育中的長角果表達，而右側(cè)柱形對應(yīng)于成熟的種子 表達。圖3B相對于葉中的GFP表達描繪了多種組織中的CopGFP表達。對于每種T2系，左 側(cè)柱形對應(yīng)于葉葉表達，中間柱形對應(yīng)于發(fā)育中的長角果葉表達，而右側(cè)柱形對應(yīng)于成 熟的種子葉表達。圖3C描繪了各個T2系中的CopGF表達。RFU =相對熒光單位；η =自 每種Tl系檢查的Τ2植株的數(shù)目。圖4是擬南芥中的脂肪酸生成的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能夠驅(qū)動其它核苷酸序列表達的核苷酸序列。本發(fā)明的一個方面提供 了一種分離的核苷酸序列，其包含與選自SEQ ID NO 9和SEQ IDNO 10的核苷酸序列具有 至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約 95%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的進一步的方面，此類序列能夠充當(dāng)啟動子。本發(fā)明的別的方面提供了包含如下的分離的核苷酸序列的載體，所述分離的核苷 酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少 約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性。本發(fā)明的別的方面提供了包含如下的分離的核苷酸序列的細胞，所述分離的核苷 酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少 約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性。本發(fā)明的別的方面提供了含有包含如下的分離的核苷酸序列的載體的細胞，所述 分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少約60% 同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一 性。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會顯而易見的是，細胞可以是能夠包含核苷酸序列和/或載 體的任何種類的細胞。依照本發(fā)明有用的細胞的例子包括但不限于真核細胞、原核細胞、動 物細胞、植物細胞、細菌細胞、種系細胞、種子細胞、擬南芥(Arabidopsis sp.)細胞、向日葵 細胞、棉細胞、油菜籽細胞、玉蜀黍細胞、棕櫚細胞、煙草細胞、花生細胞、大豆細胞、和蓖麻 (Ricinus sp.)細胞。
本發(fā)明的別的方面提供了包含如下的分離的核苷酸序列的植物，所述分離的核苷 酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約 70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性。依照本發(fā)明有 用的植物的例子包括但不限于向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、擬南芥、 和蓖麻。本發(fā)明的別的方面提供了包含如下的分離的核苷酸序列的種子，所述分離的核苷 酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少 約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性。依照本發(fā)明 有用的種子的例子包括但不限于來自向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、 擬南芥、和蓖麻的種子。本發(fā)明的別的方面提供了與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感興趣的核 苷酸序列，所述分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10的核苷酸序列具有 至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約 95%同一性。本發(fā)明的別的方面提供了包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感興趣 的核苷酸序列的載體，所述分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一 性、或至少約95%同一性。本發(fā)明的別的方面提供了包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感興趣 的核苷酸序列的細胞，所述分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少約60 %同一性、至少約70 %同一性、至少約80 %同一性、至少約90 %同一 性、或至少約95%同一性。本發(fā)明的別的方面提供了含有包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感 興趣核苷酸序列的載體的細胞，所述分離的核苷酸序列與選自SEQID NO :9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約 90%同一性、或至少約95%同一性。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會顯而易見的是，細胞可以是 能夠包含核苷酸序列和/或載體的任何種類的細胞。依照本發(fā)明有用的細胞的例子包括但 不限于真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、種系細胞、種子細胞、向日葵細 胞、棉細胞、油菜籽細胞、玉蜀黍細胞、棕櫚細胞、煙草細胞、花生細胞、大豆細胞、擬南芥細 胞、和蓖麻細胞。本發(fā)明的別的方面提供了包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感興趣 的核苷酸序列的植物，所述分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核 苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同 一性、或至少約95%同一性。依照本發(fā)明有用的植物的例子包括但不限于向日葵、棉、油菜 籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、擬南芥、和蓖麻。本發(fā)明的別的方面提供了包含與如下的分離的核苷酸序列可操作連接的感興趣 核苷酸序列的種子，所述分離的核苷酸序列與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一 性、或至少約95%同一性。依照本發(fā)明有用的種子的例子包括但不限于來自向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、擬南芥、和蓖麻的種子。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會顯而易見的是，感興趣的核苷酸序列可以是希望表達 的任何核苷酸序列。感興趣的核苷酸序列的例子包括但不限于編碼蛋白質(zhì)、核酶、反義RNA、 siRNA, RNAi分子、標(biāo)志物、報告物、酶、信號傳導(dǎo)分子、牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或 調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)、靶向編碼牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的RNA的反義 RNA、和靶向編碼牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的RNA的siRNA和/或 RNAi分子的核苷酸序列。本發(fā)明的別的方面提供了表達感興趣的核苷酸序列的方法。此類方法的一個例子 包括將感興趣的核苷酸序列可操作連接至如下的分離的核苷酸序列，其與選自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80% 同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性；并容許感興趣的核苷酸序列進行表達。 正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會顯而易見的是，容許感興趣的核苷酸序列進行表達一般涉及給 可操作連接的核苷酸序列提供或?qū)⒖刹僮鬟B接的核苷酸序列提供至容許感興趣的核苷酸 序列表達的環(huán)境。容許感興趣的核苷酸序列表達的環(huán)境的例子一般是本領(lǐng)域已知的，包括 但不限于至少一種dNTP和聚合酶的任何環(huán)境，諸如但不限于體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)、細 胞、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、種系細胞、種子細胞、向日葵細胞、 棉細胞、油菜籽細胞、玉蜀黍細胞、棕櫚細胞、煙草細胞、花生細胞、大豆細胞、擬南芥細胞、 和蓖麻細胞。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的，可以使用本領(lǐng)域已知的任何規(guī)程將 可操作連接的核苷酸序列提供至容許表達的環(huán)境。此類方法的例子包括但不限于使 用例如Lipofectin或Lipofectamine進行的轉(zhuǎn)染、土壤桿菌介導(dǎo)的導(dǎo)入(參見例如 Chistou (1996)，Trends Plant Sci. ，1 423~432 ；及 Hooykaas 禾口 Schilperoot (1992)， Plant Mol. Bio.，19 15-38)、浸花(floral dip)(參見例如 Clough 和 Bent (1998)，Plant J.，16 (6) 735-743)、電穿孔(參見例如 Shigekawa 和 Dower (1988)，Biotechniques, 6 742 ；Miller 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 856-860 ；及 Powell 等(1988)， Appl. Environ. Microbiol.，54 655-660)；直接的 DNA 攝取機制(參見例如 Mandel 和 Higa(1972),J. Mol. Biol. ,53 159-162 ；Dityatkin 等(1972)，Biochimica et Biophysica Acta, 281 319-323 ；Wigler 等(1979)，Cell, 16 77 ；及 Uchimiya 等(1982)，于:Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara(編)，Jap. Assoc, for Plant TissueCulture，Tokyo，第 507 頁-第 508 頁)；融合機制(參見例如 Uchidaz 等(1980)， 于Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga 等(編) Wistar Symposium Series, 1 169-185)；感染劑(參見 Fraley 等(1986)，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，4:1-46)；和 Anderson (1984)，Science, 226 401-409)；顯微注射機制(參見 例如Crossway等(1986)，Mol. Gen. Genet.，202 179-185)；和高速度射彈機制(參見例如 Miller, Schuchardt, Skokut 禾口 Gould(Dow ChemicalCompany)的 EPO 0405 696)。本發(fā)明的具體的實施方案提供了以種子優(yōu)選性方式表達感興趣的核苷酸序列的 方法。此類方法的一個例子包括將感興趣的核苷酸序列可操作連接至如下的分離的核苷 酸序列，其與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至 少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性；向種子細
7胞直接或間接提供所述可操作連接的核苷酸序列；并容許感興趣的核苷酸序列表達。本發(fā)明的其它實施方案提供了降低靶蛋白質(zhì)水平的方法。此類方法的一個例子包 括提供編碼能夠結(jié)合編碼靶蛋白質(zhì)的RNA的反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列；將編 碼反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作連接至如下的分離的核苷酸序列，其與選自 SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一性、 至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性；并容許編碼反義RNA和/或 siRNA的核苷酸序列表達。本發(fā)明的其它方面提供了以種子優(yōu)選性方式降低靶蛋白質(zhì)的水平的方法。此類方 法的一個例子包括提供編碼能夠結(jié)合編碼靶蛋白質(zhì)的RNA的反義RNA和/或siRNA的核 苷酸序列；將編碼反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作連接至如下的分離的核苷酸 序列，其與選自SEQ ID NO :9和SEQ IDNO :10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少 約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性；向種子細胞 直接或間接提供所述可操作連接的核苷酸序列；并容許編碼反義RNA和/或siRNA的核苷 酸序列表達。本發(fā)明的別的方面提供了改變種子的脂肪酸含量的方法。此類方法的一個例子包 括將編碼牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作連接至 如下的分離的核苷酸序列，其與選自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少 約60%同一性、至少約70%同一性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95% 同一性；向種子細胞直接或間接提供所述可操作連接的核苷酸序列；并容許感興趣的核苷 酸序列表達。牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的例子包括但不限于ACC 酶、FAS、KAS I、KAS II、KAS III、Fad2、和 Fad3。改變種子的脂肪酸含量的方法的別的例子包括提供編碼能夠結(jié)合編碼牽涉脂肪 酸合成、降解、貯存、和/或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的RNA的反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列；將 編碼反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作連接至如下的分離的核苷酸序列，其與選 自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少約60%同一性、至少約70%同一 性、至少約80%同一性、至少約90%同一性、或至少約95%同一性；向種子細胞直接或間接 提供所述可操作連接的核苷酸序列；并容許編碼反義RNA和/或siRNA的核苷酸序列表達。如本文中所使用的，“啟動子”指牽涉RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)識別和結(jié)合以啟動 轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，一般在轉(zhuǎn)錄起始位點上游。啟動子可以包括增強子和阻抑物。如本文中所使用的，“可操作連接的”指核苷酸序列被連接以使得以其預(yù)期方式發(fā) 揮功能?！翱刹僮鬟B接的”序列可以或者不可以是直接鄰接的。例如，與感興趣的核苷酸序 列可操作連接的啟動子可以以如下方式連接和定位，所述方式使得其能夠驅(qū)動感興趣的核 苷酸序列表達。
實施例本發(fā)明在以下實施例中進一步的描述，所述實施例作為例示提供，而并不意圖以 任何方式限制本發(fā)明。實施例1啟動子分離
經(jīng)由隨機cDNA測序方案來鑒定編碼豆球蛋白樣(“54-SSP”)和油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì) 的基因，其中使用基于序列的與已知基因的同源性來實現(xiàn)基因注解。經(jīng)由基于PCR的“基 因組步行”使用基因組Walker 試劑盒(ClontechLaboratories，Inc.)依照制造商的指令 來分離這些選定基因的啟動子。在此技術(shù)中，首先將具有已知序列的短寡核苷酸接頭分子 連接至已經(jīng)用數(shù)種不同平端切割限制性酶消化過的蓖麻基因組DNA的末端上。使用退火至 接頭分子的正向PCR引物和特異性退火至54-SSP或油質(zhì)蛋白基因編碼區(qū)內(nèi)的DNA的反向 PCR引物來實施初次PCR反應(yīng)。然后實施使用巢式引物進行的第二輪PCR，其也基于已知的 接頭和基因特異性序列。使用此策略，分離選定編碼序列上游的DNA序列，將其插入克隆載 體pCR2. ldnvitrogen Corp.)中，并對其測序。下文顯示了此方法中所使用的引物。54-SSP 引物初次PCR反應(yīng)引物接頭引物1(正向引物)5，GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3，(SEQID NO 1)54-SSP 引物 B(反向引物)5，GAG AGC AGC GAA GAA GGC TGA ACCATA G 3，(SEQ ID NO 2)巢式PCR反應(yīng)引物巢式接頭(adaptor)引物2 (正向引物)5，ACT ATA GGG CAC GCG TGGT 3，(SEQ ID NO 3)54-SSP 引物 A(反向引物)5，GAG AGC CAT GGA AGA GAA CAA GTAGGAA 3，(SEQ ID NO 4)油質(zhì)蛋白引物初次PCR反應(yīng)引物接頭引物1(正向引物)5，GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3，(SEQID NO 5)油質(zhì)蛋白引物B(反向引物)5，ATA GGC TTG CAG AAT CAG AGC TTCTGG TTA 3，(SEQ ID NO 6)巢式PCR反應(yīng)引物巢式接頭引物2(正向引物)5，ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3，(SEQID NO 7)油質(zhì)蛋白引物A(反向引物)5，GGT GAC TAA CAA CCG GTG ATTGTT GAT GCT 3，(SEQ ID NO 8)一旦測定以此方式獲得的啟動子片段的序列，便有可能生成別的PCR產(chǎn)物，其中 將特定的克隆位點建造入引物序列中以便于表達載體構(gòu)建。54-SSP啟動子的共有核苷酸序列(就在54-SSP起始密碼子前的1124個堿基對) 可參見 SEQ ID NO :9ο油質(zhì)蛋白啟動子的共有核苷酸序列(就在油質(zhì)蛋白起始密碼子前的528個堿基 對)可參見SEQ ID NO=IO0應(yīng)當(dāng)注意，用于油質(zhì)蛋白啟動子測試的克隆具有PCR產(chǎn)生的序 列錯誤，其中第234位的T被A替換。實施例2啟動子的測試經(jīng)由使用報告基因綠色熒光蛋白(GFP)在全植物(擬南芥 (Arabidopsisthaliana))中測試油質(zhì)蛋白和54-SSP基因啟動子的活性。構(gòu)建供擬南芥轉(zhuǎn)化用的二元載體，其具有的表達盒具有CopGFP基因(Evrogen)上游的油質(zhì)蛋白或 54-SSP啟動子，接著有花椰菜花葉病毒35S終止子區(qū)。圖1中顯示了下列載體的圖譜 PD0W2771-54-SSP啟動子可操作連接至CopGFP報告基因；和pD0W2772_油質(zhì)蛋白啟動子可 操作連接至CopGFP報告基因。通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植物(Clough和 Bent (1998) Plant Journal 16 :735_743)。 二元載體含有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因，其容許在除草劑草丁磷上選擇轉(zhuǎn)化體。為 了測定啟動子是否主要在種子中有活性，自第一代(Tl)轉(zhuǎn)化體收集某些組織，包括葉、發(fā) 育中的長角果、和成熟的種子。對這些組織測試CopGFP熒光，如下文所描述的。種植來自 Tl植株的種子以產(chǎn)生T2植株，也自其采集葉、發(fā)育中的長角果、和成熟的種子樣品，并進行 分析。通過如下CopGFP測定法規(guī)程來分析組織樣品CodGFP測定法在組織勻漿器中將組織樣品在IX CCLR緩沖液(細胞培養(yǎng)物溶胞 緩沖液5X試劑(Promega Corp.，產(chǎn)品目錄編號E153A)，其含有125mM具有H3PO4的Tris (pH 7. 8) UOmM CDTAUOmM DTT、50%甘油和5% Triton X-100)中碾碎1分鐘。將樣品放置 在干冰上，直至進一步使用。于4°C以14Κ χ g將提取物離心15分鐘。將上清液流體轉(zhuǎn)移 入另一管中，并用于進一步分析。將200 μ 1每種上清液放置在Costar 96孔平底微量滴 定板(Corning，Inc.，產(chǎn)品目錄編號3915)中，并使用SpectraMax Gemini XS微板讀板儀 (MolecularDevices, Inc.)來測量熒光。使用含有表達CopGFP的大腸桿菌菌株的培養(yǎng)物 作為標(biāo)準(zhǔn)。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce Biotechnology, Inc.；產(chǎn)品目錄編號23225) 來測定組織提取物的蛋白質(zhì)濃度。熒光表示為每mg蛋白質(zhì)的熒光。一式兩份實施所有實 驗。圖2和圖3中呈現(xiàn)了這些研究的結(jié)果。對于54-SSP啟動子和油質(zhì)蛋白啟動子兩 者，在種子中比在營養(yǎng)葉材料中有多得多的活性。發(fā)育中的長角果含有營養(yǎng)組織和發(fā)育中 的種子兩者，并且這些組織中的啟動子活性介于葉組織和成熟種子的啟動子活性之間。使用熒光素酶基因作為報告基因在擬南芥植物中實施對油質(zhì)蛋白啟動子的別的 測試。這些實驗的結(jié)果也指明油質(zhì)蛋白啟動子在種子中的活性較高。實施例3用于調(diào)控脂肪酸合成基因的載體如實施例2中所概述的那樣創(chuàng)建用于調(diào)控脂肪酸合成蛋白的載體。創(chuàng)建54-SSP 啟動子控制下的編碼脂肪酸合成蛋白的下列載體pSSP:Fad2-54-SSP啟動子可操作連接至Fad2基因；pSSP:Fad3-54-SSP啟動子可操作連接至Fad3基因；和pSSP:KASII-54-SSP啟動子可操作連接至KASII基因。創(chuàng)建油質(zhì)蛋白啟動子控制下的編碼脂肪酸合成蛋白的下列載體p01eo:Fad2-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至Fad2基因；p01eo:Fad3-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至Fad3基因；和pOleo:KASII-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至KASII基因。創(chuàng)建54-SSP啟動子控制下的編碼針對脂肪酸合成蛋白的反義分子的下列載體pSSP:Fad2:AS-54-SSP啟動子可操作連接至針對Fad2 RNA的反義物；pSSP:Fad3:AS-54-SSP啟動子可操作連接至針對Fad3 RNA的反義物；
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pSSPKASII :AS-54_SSP啟動子可操作連接至針對KASII RNA的反義物。創(chuàng)建油質(zhì)蛋白啟動子控制下的編碼針對脂肪酸合成蛋白的反義分子的下列載 體p01eo:Fad2:AS-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對Fad2 RNA的反義物；p01eo:Fad3:AS-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對Fad3 RNA的反義物；和p01eo:KASII:AS-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對KASII RNA的反義物。創(chuàng)建編碼針對脂肪酸合成蛋白的SiRNA分子的載體?？梢栽O(shè)計SiRNA分子以表 達如下的RNA分子，所述RNA分子與自身雜交以形成包含單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對莖的發(fā)夾結(jié) 構(gòu)。堿基配對的莖區(qū)包含對應(yīng)于整個或部分編碼就是要抑制其表達的基因的內(nèi)源信使RNA 的有義序列，和與有義序列完全或部分互補的反義序列。如此，分子的堿基配對莖區(qū)一般決 定RNA干擾的特異性。這些發(fā)夾RNA分子在抑制內(nèi)源基因表達方面是高度有效的，而且它 們誘導(dǎo)的RNA干擾被后續(xù)世代繼承。參見例如，Chuang和Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97 :5985_5990 ；Stoutjesdijk 等(2002)Plant Physiol. 129 :1723-1731 ； 及 Waterhouse 和 Helliwell (2003)Nat. Rev. Genet. 5 :29-38。用于使用 hpRNA 干擾來抑 制或沉默基因表達的方法記載于例如Chuang和Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 5985-5990 ；Stoutjesdijk 等(2002)Plant Physiol. 129 :1723_1731 ；Waterhouse 和 Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5 :29_38 ；Pandolfini 等 BMC Biotechnology 3 :7，及 美國專利公開文本No. 20030175965。關(guān)于發(fā)夾RNA構(gòu)建體在體內(nèi)沉默基因表達的功效的瞬 時測定法已經(jīng)記載于 Panstruga 等(2003)Mol. Biol. Rep. 30 135-150。創(chuàng)建在54-SSP啟動子控制下的編碼針對脂肪酸合成蛋白的SiRNA分子的下列載 體pSSP:Fad2:si-54_SSP 啟動子可操作連接至針對 Fad2 RNA 的 siRNA ；pSSP:Fad3: si-54-SSP啟動子可操作連接至針對Fad3 RNA的siRNA ；和pSSPKASII si-54-SSP 啟動子可操作連接至針對 KASII RNA 的 siRNA。創(chuàng)建在油質(zhì)蛋白啟動子控制下的編碼針對脂肪酸合成蛋白的反義分子的下列載 體p01eo:Fad2:si-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對Fad2 RNA的siRNA ；p01eo:Fad3:si-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對Fad3 RNA的siRNA ；禾口p01eo:KASII: si-油質(zhì)蛋白啟動子可操作連接至針對KASII RNA的siRNA。實施例4擬南芥和蓖麻種植和轉(zhuǎn)化在正常的條件下種植擬南芥和蓖麻。通過電穿孔將載體導(dǎo)入根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 pMP90中，并用于通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥 和蓖麻植物(N. Bechtold, J. Ellis,和 G. Pelletier (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316， 1194-1198)。還使用高速度顆粒來導(dǎo)入載體，并在初始開花后約5天實施感染原轉(zhuǎn)化 (infectious agent transformation)。實施例5測定擬南芥和蓖麻種子中的脂肪酸含量脂肪酸分析使種子甲基化(1ml IN HC1、甲醇，Supelco，80°C達1小時)，用己烷提取，并進行三甲基硅烷化(trimethylsilylate) (100 μ 1 BSTFA-TMCS (二 (三甲硅烷基) 三氟乙酰胺三甲基硅烷)，3叩61(0，901達45分鐘)。通過蒸發(fā)來除去BSTFA-TMCS，并將 樣品在乙烷中重懸。在裝備有5973質(zhì)量選擇檢測器(GC/MS)和Supelco SP-2340氰基毛 細管柱(60m χ 250ym χ 0. 25 μ m)的Hewlett-Packard 6890氣體層析儀上分析樣品。將 注射器保持在225°C，爐溫度有所變化(以15°C /分鐘的100-240°C，接著是240°C達5分 鐘)，并且氦流速為1. Iml/分鐘。基于洗脫時間對真實標(biāo)準(zhǔn)品來實施峰身份的分配，并基于 其質(zhì)譜來確認(rèn)。使用Hewlett-Packard Chemstation軟件來實施定量。實施例6調(diào)控擬南芥和蓖麻中的脂肪酸合成比較三種調(diào)控經(jīng)由Fad2進行脂肪酸合成的方法(基因表達、反義表達、siRNA表 達)。選擇三種基因來比較基因阻抑的三種方法(12-去飽和酶FAD2和15-去飽和酶FAD3， 因為它們?nèi)菀走M行評分；而且FAD2由于其之前在評估基因表達降低方面已經(jīng)使用過)，以 及β _酮脂酰-ACP合酶(KAS) II。圖4中描繪了這些酶與脂肪酸合成之間的關(guān)系。選擇種子進行分析，因為它們?nèi)菰S通過氣相層析對其組成進行可再現(xiàn)的定量分 析，而且因為它們?nèi)菰S對峰進行質(zhì)譜分析以定性確認(rèn)峰作為特定脂肪酸的分配。使用學(xué)生 (Student)T檢驗將顯著性歸入均值間的差額(基于每個均值10個或更多個樣品)。實施例7對KASII表達的調(diào)控KASII在質(zhì)體中將16C延長至18C脂肪酸。對于KASII，比較16:0加16:1脂肪酸 (KAS11的底物)的水平與其產(chǎn)物18:0和18:1加上代謝物18:2和18:3的水平。將野生型擬南芥和蓖麻與用pSSP:KASII、p01eo:KASII、pSSP:KASII :AS、 p01eo:KASII:AS、pSSP:KASII: si、或 p01eo:KASII: si 轉(zhuǎn)化的品系進行比較。那些包 含pSSP:KASII和p01eO:KASII載體的植物顯示160脂肪酸的顯著降低及C18和高級 脂肪酸的相應(yīng)升高。那些包含 pSSP:KASII:AS、p01eo:KASII:AS、pSSP:KASII si、和 p01eo:KASII:si載體的植物顯示16:0脂肪酸的顯著升高及C18和高級脂肪酸的相應(yīng)降低。實施例8對FAD2表達的調(diào)控對于FAD2，比較18 1脂肪酸(FAD2的底物)的水平與其產(chǎn)物18 2和代謝物18 3 的水平。為了分析，總計18 2與18 3以獲得已經(jīng)被FAD2去飽和的總脂肪酸比例。將野生型擬南芥和蓖麻與用pSSP:FAD2、p01eo:FAD2、pSSP:FAD2:AS、 p01eo:FAD2:AS、pSSP:FAD2: si、或p01eo:FAD2: si轉(zhuǎn)化的品系進行比較。那些包含 pSSP:FAD2和p01eo:FAD2載體的植物顯示18:2和18:3脂肪酸的顯著升高。那些包含 pSSP:FAD2:AS、p01eo:FAD2:AS、pSSP:FAD2:si、和 p01eo:FAD2: si 載體的植物顯示 18:2 和 18:3脂肪酸的顯著降低及低級脂肪酸的相應(yīng)升高。實施例9對FAD3表達的調(diào)控對于FAD3，比較18:1加上18:2脂肪酸(18:2是FAD3的底物)的水平與其產(chǎn)物 18:3的水平。將野生型擬南芥和蓖麻與用pSSP:FAD3、p01eo:FAD3、pSSP:FAD3:AS、
12p01eo:FAD3:AS、pSSP:FAD3: si、或 p01eo:FAD3: si 轉(zhuǎn)化的品系進行比較。那些包 含pSSP:FAD3和p01eo:FAD3載體的植物顯示183脂肪酸的顯著升高。那些包含 pSSP:FAD3:AS、p01eo:FAD3:AS、pSSP:FAD3:si、和 p01eo:FAD3: si 載體的植物顯示 18:3 脂 肪酸的顯著降低及低級脂肪酸的相應(yīng)升高。 雖然本發(fā)明已經(jīng)在某些例示性實施方案中進行過描述，本發(fā)明可以在本公開內(nèi)容 的精神和范圍內(nèi)進一步進行修飾。因此，本申請意圖覆蓋使用其一般原理的本發(fā)明的任何 變型、用途、或改編。此外，本申請意圖覆蓋諸如在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的已知或習(xí)慣實踐 內(nèi)，而且落入所附權(quán)利要求書的限制內(nèi)的本公開內(nèi)容的偏離。
權(quán)利要求
一種分離的核苷酸序列，其包含與SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少約90％同源性的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列，其進一步包含與如下核苷酸序列可操作連接的感 興趣核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO 9或SEQ IDN0 10的序列具有至少約90% 的同源性。
3.權(quán)利要求2的分離的核苷酸序列，其中所述感興趣核苷酸序列編碼選自下組的分 子蛋白質(zhì)、反義寡核苷酸、和siRNA。
4.一種載體，其包含權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列。
5.依照權(quán)利要求4的載體，其進一步包含與如下核苷酸序列可操作連接的感興趣核苷 酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10的序列具有至少約90%的同源性。
6.權(quán)利要求4的載體，其中所述核苷酸序列編碼選自下組的分子蛋白質(zhì)、反義寡核苷 酸、禾P siRNA。
7.依照權(quán)利要求5的載體，其進一步包含選擇標(biāo)志。
8.依照權(quán)利要求7的載體，其中所述選擇標(biāo)志是膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
9.一種細胞，其包含權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9的細胞，其中在所述細胞的基因組中穩(wěn)定整合權(quán)利要求1的分離的核苷 酸序列。
11.依照權(quán)利要求9的細胞，其中所述細胞選自下組真核、原核、動物、植物、種系、種 子、擬南芥、向日葵、棉細胞、油菜籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、和蓖麻的細胞。
12.權(quán)利要求9的細胞，其中所述細胞包含權(quán)利要求4的載體。
13.一種植物，其包含權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列。
14.依照權(quán)利要求13的植物，其中所述植物選自下組擬南芥、向日葵、棉細胞、油菜 籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、和蓖麻。
15.依照權(quán)利要求13的植物，其中所述植物包含權(quán)利要求4的載體。
16.依照權(quán)利要求13的植物，其中所述植物包含權(quán)利要求9的細胞。
17.—種種子，其包含權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列。
18.依照權(quán)利要求17的種子，其中所述種子選自下組擬南芥、向日葵、棉細胞、油菜 籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生、大豆、和蓖麻種子。
19.依照權(quán)利要求17的種子，其中所述植物包含權(quán)利要求4的載體。
20.依照權(quán)利要求17的種子，其中所述植物包含權(quán)利要求9的細胞。
21.一種促進由感興趣的核苷酸序列編碼的分子表達的方法，該方法包括將權(quán)利要 求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣的核苷酸序列。
22.依照權(quán)利要求21的方法，其中以種子優(yōu)選性方式促進所述由感興趣的核苷酸序列 編碼的分子表達。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述由感興趣的核苷酸序列編碼的分子選自下組蛋白 質(zhì)、反義寡核苷酸、和siRNA。
24.一種在細胞中生成由感興趣核苷酸序列編碼的分子的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣的核苷酸序列；并向所述細胞提供所述可操作連接的核苷酸序列；表達所述感興趣的核苷酸序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述由感興趣的核苷酸序列編碼的分子選自下組蛋白 質(zhì)、反義寡核苷酸、和siRNA。
26.—種在細胞中調(diào)控靶物表達的方法，該方法包括提供感興趣的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠在細胞中調(diào)控所述靶物表達 的反義寡核苷酸或siRNA ；將權(quán)利要求1的分離的核苷酸序列可操作連接至所述感興趣的核苷酸序列；向所述細胞提供所述可操作連接的核苷酸序列；并表達所述感興趣的核苷酸序列。
27.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述細胞選自下組原核、真核、細菌、土壤桿菌、酵 母、植物、哺乳動物、和人細胞。
28.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述植物細胞選自下組蓖麻屬、擬南芥屬、向日葵、 棉、油菜籽、玉蜀黍、棕櫚、煙草、花生或大豆細胞。
29.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述靶物是基因、寡核苷酸序列、和/或蛋白質(zhì)。
30.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述靶物選自牽涉脂肪酸合成、降解、貯存、和/或調(diào) 節(jié)的蛋白質(zhì)。
31.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述靶物選自下組ACC酶、FAS、KASI,KAS II,KAS III、Fad2、和 Fad3。
32.權(quán)利要求13的植物的遺傳后代。全文摘要
包含與SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少約90％同源性的核苷酸序列的核苷酸序列。公開了與如下核苷酸序列可操作連接的感興趣核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少約90％的同源性。還公開了載體、調(diào)節(jié)靶物表達的方法、提供包含所述核苷酸序列的細胞、植物、和種子的方法。
文檔編號C12N15/82GK101896609SQ200880119861
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者保羅·G·羅斯勒, 拉達·拉索喬瓦, 文森特·D·李 申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司