專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物油脂的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離提取油脂的方法，是一種從產(chǎn)油微生物發(fā)酵液中分離提取油脂并 聯(lián)產(chǎn)菌渣的方法，屬于生物工程下游后處理技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
某些微生物，如酵母菌、霉菌、藻類(lèi)等在一定條件下將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為脂肪酸甘油酯 并貯存在細(xì)胞內(nèi)，其中胞內(nèi)油脂含量可超過(guò)生物總量20%以上的菌株稱(chēng)為產(chǎn)油微生物。某 些產(chǎn)油微生物菌屬以糖質(zhì)原料為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，能夠積累占其細(xì)胞干重70%以上的油 月旨(Li, Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai,F. Enzyme Microb. Technol.，2007，41，312-317)。利用發(fā)酵法得 到的油脂稱(chēng)為微生物油脂，又稱(chēng)為單細(xì)胞油脂。部分微生物油脂的脂肪酸組成和常見(jiàn)的植 物油脂如菜籽油、棕櫚油、大豆油等相似，主要含有棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸及其它 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸等。利用微生物生產(chǎn)油脂具有不受季節(jié)和氣候的影響、生產(chǎn)原料來(lái)源 廣泛、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品高值化等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)際上微生物油脂大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)仍未實(shí)現(xiàn)，其主要原因是成本比較高。 微生物油脂的成本主要包括原料成本和分離提取成本。原料成本的高低取決于菌種的生 產(chǎn)效率及所采用的發(fā)酵工藝，而分離提取成本則主要取決于采用的工藝。由于微生物油 脂大多存在于菌體細(xì)胞內(nèi)，傳統(tǒng)技術(shù)都需用離心或過(guò)濾等方法先從發(fā)酵液中分離出菌體， 再按照植物油脂的提取類(lèi)似的方法進(jìn)行提取，主要提取方法包括壓榨法(Matthews R F， Braddock R J. Food Technology，1987，41 :57_61)、超臨界提取法(Sovova H, Zarevucka Μ, Vacek Μ, et al. J. Supereritical Fluids，2001，(20) 15-28)和有機(jī)溶劑萃取法(Biigh E G，Dyer W J. J. Biochem. Physiol. ,1959,37 :911_917)等。這些方法的缺點(diǎn)就是在提取 前要進(jìn)行固液分離，但由于產(chǎn)油微生物發(fā)酵后期具有菌體濃度高，粘度高，菌體密度低等特 性，菌體分離回收困難，成本高。另外這些方法的缺點(diǎn)還有壓榨法損失較大，提取率不高， 提取前要對(duì)得到的菌體烘干后才可以進(jìn)行，所需設(shè)備較多；超臨界提取法設(shè)備投資大，成本 高；常規(guī)的有機(jī)溶劑法需對(duì)分離后的濕菌體中的微生物油脂進(jìn)行細(xì)胞破碎后進(jìn)行提純，破 碎的方法有凍融法(W000/13660)、酶水解法(W002/10423)和酸熱法(CN1923960A)等，這些 方法有些對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理需用的能耗較大，需要的步驟繁瑣；其中酸處理法對(duì)菌體進(jìn) 行破壁處理，造成菌體中蛋白等生物分子水解或降解，降低了菌渣的應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)濟(jì)性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效地從產(chǎn)油微生物發(fā)酵液中提取微生物油脂并聯(lián)產(chǎn) 菌渣的方法，簡(jiǎn)化工藝過(guò)程，縮短操作周期，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)資源綜合利用。本發(fā)明的方 法可在微生物油脂大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)(1)直接將產(chǎn)油微生物發(fā)酵液與有機(jī)溶劑按體積比1 0.25 1 5的比例混 合，在20°C 90°C下浸提10分鐘 24小時(shí)，得到浸提混合物料；
(2)對(duì)浸提混合物料進(jìn)行固液分離操作，得到有機(jī)溶劑相、水相和固相物料；(3)有機(jī)溶劑相按常規(guī)方法除去有機(jī)溶劑，得到微生物油脂；(4)固相物料經(jīng)干燥得到菌渣。本發(fā)明使用的有機(jī)溶劑包括但不限于氯仿、二氯甲烷、甲苯、二甲苯、石油醚、含有 4 12個(gè)碳原子的脂肪醇、含有1 12個(gè)碳原子的脂肪醇的酯、四號(hào)溶劑、六號(hào)溶劑或者它 們之間的混合物。并且這些有機(jī)溶劑中還可以含有體積百分含量不超過(guò)60%的甲醇、乙醇 或丙醇。本發(fā)明使用的固液分離操作為離心、過(guò)濾、沉降或者它們的必要組合。本發(fā)明從有機(jī)溶劑相中除去有機(jī)溶劑得到微生物油脂的方法為蒸餾或蒸發(fā)。本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過(guò)細(xì)胞干重20% (w/w)的真菌、細(xì)菌或微藻。它們包括但不限于，產(chǎn)油真菌，如Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus curvatus、Yarrowia lipolytica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomyces starkeyi> Mortiere 1 Iaisabellina> Mucor circinelloides 禾口 Cunninghamella ；產(chǎn)油細(xì)菌，如 Croynebacterium、Nocardia 禾口 Mycobacterium ；產(chǎn)油微 藻， 如 Botryococcusbraunii、Crypthecodinium cohnii、Chlorellaprotothecoides> Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytrium limacinum。本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物發(fā)酵液為產(chǎn)油真菌、細(xì)菌或微藻在液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵 培養(yǎng)得到的含有菌體的醪液。本發(fā)明使用菌體材料的實(shí)際油脂含量參照文獻(xiàn)(Li，Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai, F. Enzyme Microb. Technol.，2007，41，312-317)的方法測(cè)定，并以此為基準(zhǔn)計(jì)算其它方法的油脂提取率。本發(fā)明的有益效果是1)與傳統(tǒng)的微生物油脂提取方法相比，本發(fā)明使用全發(fā)酵 液直接萃取，省去了從發(fā)酵液回收菌體的固液分離操作和菌體干燥等預(yù)處理過(guò)程，簡(jiǎn)化了 工藝步驟，縮短了操作周期；2)本發(fā)明通過(guò)提取細(xì)胞內(nèi)油脂，可以有效降低發(fā)酵液粘度，改 變菌體密度，有助于固液分離操作和菌渣回收；3)本發(fā)明無(wú)需對(duì)菌體進(jìn)行破壁處理，降低 了能耗，減少了腐蝕性化學(xué)試劑的使用；4)本發(fā)明菌渣污染物少，回收率高，提高了油脂發(fā) 酵過(guò)程的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。總之，本發(fā)明技術(shù)簡(jiǎn)單有效，設(shè)備投資少，可連續(xù)操作，能耗低，有利 于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明微生物油脂提取并聯(lián)產(chǎn)菌渣工藝流程簡(jiǎn)圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例選取了一些典型的產(chǎn)油微生物菌種，有助于了解本專(zhuān)利，但不以任何 形式限制在其它菌株材料上應(yīng)用本發(fā)明。實(shí)施例1^ M JC M (Li, Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai, F. Enzyme Microb. Technol. ,2007,41 312-317)所述的方法，將生長(zhǎng)于YEPD培養(yǎng)基中的產(chǎn)油酵母Rhodosporidiumtoruloides AS 2. 1389(菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)按10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，通氣量0. 8vvm，補(bǔ)料1000g/L的葡萄糖500ml五次，培養(yǎng)120h后得到細(xì)胞干重 92g/L(油脂含量60. 1%)的發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液50ml，加入50ml氯仿，在20°C下，攪拌 浸提lh，沉降分層，取下層有機(jī)溶劑相，蒸餾后干燥得到油脂2. 06g，油脂提取率74. 6%。剩 余物離心處理，得到固體相，經(jīng)干燥得菌渣2. 31g。實(shí)施例2按照文獻(xiàn)(黃建忠，施巧琴，周曉蘭，等。微生物學(xué)通報(bào)，1998，(4) :187_191)所 述的方法，將培養(yǎng)28h產(chǎn)油霉菌Mortierella isabellina AS 3. 3410 (菌株來(lái)源于中國(guó)普 通微生物菌種保藏管理中心)種子液以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，280rpm，25°C 下培養(yǎng)701!，得到細(xì)胞干重348/1(油脂含量47.2%)的發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液25ml，加入 75ml氯仿甲醇2 1(V/V)，在70°C下，攪拌浸提lh，離心后取下層有機(jī)溶劑相，蒸發(fā)后干 燥得到油脂0. 37g，油脂提取率92 %。上層過(guò)濾得到濕菌渣，干燥后殘?jiān)|(zhì)量0. 25g。實(shí)施例3參照實(shí)施例1所述的方法，補(bǔ)料兩次，發(fā)酵62h后得到細(xì)胞干重48g/L (油脂含量 55.2%)的產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保 藏管理中心)發(fā)酵液100ml，加入25ml六號(hào)溶劑，在30°C下，攪拌浸提IOmin后沉降分層， 取上層溶劑相，干燥后蒸發(fā)得到油脂0.72g，油脂提取率27%。下層相離心處理，得到固體 相，干燥后菌渣2. 80go實(shí)施例4按照文獻(xiàn)(王菊芳，梁世中，吳振強(qiáng)，等。華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2008， 28(10) 28-31)所述的方法，將培養(yǎng) 24h 隱甲藻 Crypthecodinium cohnii ATCC 30556 (菌 株來(lái)源于美國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)的種子液以5%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在25°C，170rpm條件下培養(yǎng)65h后得到細(xì)胞干重15g/L(油脂含量30. )的發(fā)酵液。 取上述發(fā)酵液50ml，加入50ml正辛醇，在80°C下，攪拌浸提2h，離心取上層有機(jī)溶劑相，干 燥后蒸餾得到油脂0. 158g，油脂提取率70. 1%。剩余物繼續(xù)離心處理，得到固體相，干燥得 到菌渣0. 49g。實(shí)施例5參照實(shí)施例1所述的方法，補(bǔ)料四次，發(fā)酵90h后得到細(xì)胞干重79g/L (油脂含量 49% )的產(chǎn)油酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 703 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保 藏管理中心)發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液50ml，加入200ml 二甲苯，在90°C下，攪拌浸提Ih后 沉降分層，取上層溶劑相，蒸發(fā)后干燥得到油脂l.Olg，油脂提取率52%。將下層相離心處 理，收集固體相，干燥得到菌渣2. 63g。實(shí)施例6參照實(shí)施例4所述的方法，發(fā)酵54h后得到細(xì)胞干重20g/L(油脂含量37. 4% ) 的產(chǎn)油微藻Botryococcus braunii LB572 (菌株來(lái)源于美國(guó)德克薩斯大學(xué))發(fā)酵液。取上 述發(fā)酵液30ml，加入100ml石油醚，在50°C下，攪拌浸提20min后離心取上層溶劑相，蒸發(fā) 后干燥得到油脂0. lg，油脂提取率42.6%。繼續(xù)去除中層水相，收集固體相，干燥得到菌渣 0. 39g。實(shí)施例7參照實(shí)施例1所述的方法，補(bǔ)料三次，發(fā)酵72h后得到細(xì)胞干重70g/L (油脂含量50. 3% )的產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液50ml，加入125ml氯仿乙酸乙酯3 1(V/V)，在 35°C下，攪拌24h后沉降分層，取下層有機(jī)溶劑相，蒸發(fā)后干燥得到油脂1. 43g，油脂提取率 81%。將剩余物離心處理，得到固體相，干燥后得到菌渣1. 35g。實(shí)施例8參照實(shí)施例4所述的方法，發(fā)酵64h后得到細(xì)胞干重21. 7g/L(油脂含量24. 3% ) 的產(chǎn)油小球藻Chlorella protothecoides CS-41 (菌株來(lái)源于澳大利亞CSIRO微藻研究中 心)發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液50ml，加入IOOml四號(hào)溶劑，在80°C下，攪拌2h，沉降分層，取上 層溶劑相，蒸發(fā)后干燥得到油脂0. 14g，油脂提取率53.2%。下層水相過(guò)濾處理，濾餅干燥 后得到菌渣0. 68g。實(shí)施例9參照實(shí)施例1所述的方法，補(bǔ)料三次，發(fā)酵130h后得到細(xì)胞干重65g/L (油脂含量 62.7%)的產(chǎn)油酵母Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種 保藏管理中心)發(fā)酵液。取上述發(fā)酵液50ml，加入150ml氯仿，在30°C下，攪拌1.5h后沉 降分層，取下層溶劑相，蒸發(fā)后干燥得到油脂1. 73g，油脂提取率85%。離心處理除去有機(jī) 溶劑相的剩余物，收集固體相，干燥得到菌渣0. 95g。
權(quán)利要求
一種微生物油脂的分離方法，其特征在于是從產(chǎn)油微生物發(fā)酵液原料中分離提取油脂并聯(lián)產(chǎn)菌渣的方法，將產(chǎn)油微生物發(fā)酵液與有機(jī)溶劑混合浸提一定時(shí)間，進(jìn)行固液分離操作，對(duì)有機(jī)溶劑相去除溶劑，得到油脂；對(duì)固體相進(jìn)行干燥，得到菌渣。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、甲苯、二 甲苯、石油醚、含有4 12個(gè)碳原子的脂肪醇、含有1 12個(gè)碳原子的脂肪醇的酯、四號(hào)溶 劑或六號(hào)溶劑中的一種或者一種以上的混合物。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑中可以添加甲醇、乙醇 或丙醇中的一種或多種形成混合溶劑，添加后它們于混合溶劑中的體積百分含量< 60%。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述浸提操作條件為，操作溫度20°C 90°C、操作時(shí)間10分鐘 24小時(shí)。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述固液分離操作為離心、過(guò)濾、沉降中 的一種或者一種以上的必要組合。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵液與有機(jī)溶劑的體積比為 1 0. 25 1 5。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑的去除方法為蒸餾或蒸發(fā)。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的產(chǎn)油微生物發(fā)酵液為產(chǎn)油真菌、細(xì) 菌或微藻在液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)得到的含有菌體的醪液。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的產(chǎn)油微生物為在一定培養(yǎng)條件下 可在胞內(nèi)積累含量超過(guò)細(xì)胞干重20%油脂的真菌、細(xì)菌或微藻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種微生物油脂的分離方法，是從產(chǎn)油微生物發(fā)酵液中直接分離提取油脂并聯(lián)產(chǎn)菌渣的方法，屬于生物工程下游后處理技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案如下將產(chǎn)油微生物發(fā)酵液與有機(jī)溶劑按一定比例混合拌浸提一定時(shí)間，進(jìn)行固液分離操作，對(duì)有機(jī)溶劑相去除溶劑，得到油脂；對(duì)固體相進(jìn)行干燥得到菌渣。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、操作條件溫和、油脂提取收率高、菌渣質(zhì)量好、耗能低，有利于進(jìn)行規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/64GK101824440SQ20091001056
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者趙宗保, 趙鑫 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所