專利名稱：重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，尤其是涉及一種使用巴斯德畢赤酵母(P/c/n'a 進(jìn)行表達(dá)的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及應(yīng)用，屬于生物藥工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal immunomodulatory protein, FIP)最早是從靈芝子實(shí)體中提取獲得的一種小分子蛋白質(zhì)(命名為LZ-8, Kino et al.， 1989， J Biol Chem:264:472-478)，具有刺激外周血淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)白介素和干擾素等細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成，抑制過敏反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。目前已從六種食、藥用真菌中獲得了這種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，分別是赤靈芝(LZ-8)，松杉靈芝(FIP-gts)，金針燕(FIP-fve; Ko et al., Eur J Biochem, 1995,228:244-249)，草菇(FIP-vvo)，紫芝(FIP-gja)和小孢子靈芝(FIP-gmi)，形成了 FIP家族。這六種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白之間有較高的同源性(60%~70%)和相似的免疫學(xué)活性，具有與凝集素和免疫球蛋白相似的結(jié)構(gòu)。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠凝集血細(xì)胞，促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞增殖，抑制多種過敏性反應(yīng)，降低抗體產(chǎn)生，對(duì)抗小鼠足墊水腫和移植組織的排斥反應(yīng)。其免疫調(diào)節(jié)活性主要表現(xiàn)為可促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(白介素-2、腫瘤壞死因子和干擾素IFN-y等)。另外，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有抗病毒和細(xì)菌感染，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長或者直接殺傷作用。
金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-Fve由114個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為12704Da，不含組氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸。其一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)與人類免疫球蛋白重鏈可變區(qū)相似，為單純蛋白質(zhì)，不含糖基。利用NaBr滲透對(duì)FIP-fVe進(jìn)行單向不規(guī)則的晶體衍射方法揭示報(bào)道了其17A結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于FIP-fve活性起重要作用的二聚化是由于N端(X螺旋的三維交換形成，其二聚化主要靠疏水作用穩(wěn)定
(Paaventhan et al. 2003, J Mol Biol, 332: 461-470)。
FIP-fve是一種有絲分裂原，作為一種激活劑，具有促進(jìn)外周血單核細(xì)胞周期G0/G1向細(xì)胞周期S發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂和增殖(Ko et al. 2008,Process Biochemistry 43:423-430)。 FIP-fVe能夠激活和誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌白介素IL-2、干擾素IFNi、腫瘤壞死因子TNF-ot等細(xì)胞因子以及粘附因子ICAM-1，后者可促進(jìn)不同的白細(xì)胞與靶細(xì)胞牢固結(jié)合，在上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥的調(diào)控、免疫反應(yīng)和組織修復(fù)中起重要作用。在非特異性免疫方面，F(xiàn)IP-fve還可以提高TNF-(3和一氧化氮的產(chǎn)量，顯著地提高腹腔細(xì)胞對(duì)患癌細(xì)胞的殺滅能力，提高罹患小鼠血清中特異性抗體的濃度。還能有效抑制鼠類系統(tǒng)性過敏毒素反應(yīng)，鼠足墊水腫反應(yīng)。研究表明FIP-fve對(duì)食物過敏和過敏性呼吸道類疾病也有較好的治療效果，可以對(duì)抗器官移植后的排異現(xiàn)象以及抑制對(duì)自體免疫所引起的糖尿病，通過減少IL-5ct受體以及凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡而有效抑制炎癥和過敏反應(yīng)。因此，F(xiàn)IP-fVe是一種潛在的非常有效的免疫調(diào)節(jié)類藥用蛋白。
由臺(tái)灣發(fā)明人申請的專利"真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白之用途"(中國200610127042.7)公開了天然和重組的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作
用。其中提到天然金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白對(duì)降低糖尿病患者血糖的作用。由臺(tái)灣發(fā)明人申請的專利"用敏感貼劑對(duì)過敏性鼻炎進(jìn)行鼻腔局部免疫治療"(Localnasal immunotherapy with allergen strip for allergic rhinitis; 美國 US Patent20040071718)闡述了天然金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白可以治療過敏性鼻炎。由新加坡發(fā)明人申請的專禾U"分子"(Molecule;美國20060275312 USPTO)公開了天然金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并以天然和細(xì)菌重組的融合蛋白為例闡述了金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療和診斷免疫疾病方面的用途。
從天然金針燕菌體中提取真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)率很低，約為30mg^g干重。因此應(yīng)用基因工程將FlP-^e基因轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的宿主中表達(dá)獲得大量重組蛋
4白，進(jìn)而開發(fā)應(yīng)用是非常有意義和前景的。已有報(bào)道FIP-fVe在大腸桿菌TGI 和昆蟲細(xì)胞Sf21中的重組表達(dá)(Koetal, 1997, J Formos Med Assoc, 96: 517-524; Jinn et al. 2006, Biosci Biotechnol Biochem, 70:2627- 2634)，但產(chǎn)量較低僅為 15mg/L和6.25mg/L。盡管細(xì)菌表達(dá)具有簡單快速的特點(diǎn)，但是對(duì)于目的蛋白的 高級(jí)修飾不完善，生物學(xué)活性低于天然蛋白；而昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白接近 天然蛋白的生物學(xué)活性，但比較費(fèi)時(shí)且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提出的，目的是利用巴斯德畢赤酵 母的重組表達(dá)，通過設(shè)計(jì)和構(gòu)建，獲得高產(chǎn)率和高純度的重組金針燕免疫調(diào)節(jié) 蛋白，5升發(fā)酵工藝表達(dá)量300mg/L~350mg/L，具有與天然金針菇菌體中提取真 菌免疫調(diào)節(jié)蛋白相同的免疫生理功能，且成本低、容易實(shí)現(xiàn)的重組金針燕免疫 調(diào)節(jié)蛋白的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在免疫制劑中的應(yīng)用。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是重組金針燕免疫調(diào)節(jié) 蛋白的制備方法，包括下述步驟
(1) 、編碼FIP-fVe基因的克隆取干燥金針菇菌絲體在液氮研磨后，加入 DNA提取液，獲得基因組DNA，根據(jù)GenBank中已登錄FIP-fVe蛋白質(zhì)序列
(Accession P80412)設(shè)計(jì)PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強(qiáng)重組免疫 蛋白的表達(dá)效率和準(zhǔn)確性；
(2) 、重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆的目的基因與載體 pPIC9 —起經(jīng)過酶切，回收和連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，提取質(zhì)粒 pPIC9隱FIP-fve;
(3) 、重組巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的獲得將上述構(gòu)建好的重組酵母表達(dá)
載體pPIC9-FIP-fVe用BglII酶切線性化，采用電轉(zhuǎn)法將目的基因轉(zhuǎn)入酵母GS115 中表達(dá)，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的選擇培養(yǎng)基MD上，2S。C至少 培養(yǎng)3天分別挑至MM和MD培養(yǎng)基對(duì)比，提取轉(zhuǎn)化子酵母的總DNA;(4)、重組FIP-fVe的誘導(dǎo)表達(dá)和純化選取正確的酵母轉(zhuǎn)化子，首先用搖 瓶500-1000ml振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，確定其有表達(dá)后，挑選其中表達(dá)量 高的酵母菌進(jìn)行5L發(fā)酵罐大量培養(yǎng)，發(fā)酵上清經(jīng)透析后SDS-PAGE檢測，并用 君意凝膠分析系統(tǒng)測定目的蛋白產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量至少為158.2 mg/L， 5L 發(fā)酵罐的產(chǎn)量至少為300mg/L~350mg/L，樣品進(jìn)一步通過超濾系統(tǒng)超濾濃縮， 4。C的低溫透析后用血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)確定其活性，并進(jìn)行DEAE-A25離子柱層析 純化，再進(jìn)一步用高效液相色譜進(jìn)行純化，收集具有生理學(xué)活性的目的蛋白， 最后檢測重組FIP-fVe的純度。
歩驟(1)所述的設(shè)計(jì)PCR引物為上游，5、-cagaattcatgtccgccacgtcgctc acc-3 、； 下游，5 、 - ag gaattc ggatcc tea agt ctt ctt cca etc age -3、。
所述重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在免疫制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下
本發(fā)明的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，是通過克隆編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 的基因，構(gòu)建巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，并經(jīng)應(yīng)用證明，通過工程菌發(fā)酵表達(dá) 獲得大量高產(chǎn)率和高純度的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，經(jīng)純化后檢測其生物特
性和免疫生理活性。5升發(fā)酵工藝獲得的重組蛋白產(chǎn)量可達(dá)300mg/L 350mg/L， 純度達(dá)到90%以上，生物學(xué)特點(diǎn)和免疫生理活性與天然金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白相 同，具有凝血活性，促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖及分泌白介素和干擾素的功能，并 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。具體說明如下
1. 重組FIP-fVe和天然的FIP-fVe氨基酸組分一致采取酸水解方法分析重組 FIP蛋白的氨基酸組分，對(duì)氨基酸組分進(jìn)行分析，證明重組蛋白的正確性。
2. 重組FIP-fVe和天然蛋白同樣具有相似的低含量a-螺旋和較多的(3-結(jié)構(gòu) 對(duì)圓二色譜(CD)進(jìn)行分析，重組FIP-fVe的a-螺旋，p-折疊和P-轉(zhuǎn)角的含量 分別為11.3%， 34.3%和11.9%，相對(duì)比例為l: 3: 1，與天然的FIPAe三者比 例接近。
3. 重組FlP-^e發(fā)生了糖基化修飾通過對(duì)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白糖含量分析，證明巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的重組FIP-fVe發(fā)生了糖基化修飾，而天然的 FIP-fVe不含糖成分，重組FIP-fVe經(jīng)過一定的糖修飾，得到了正確的折疊而具有 生物學(xué)活性。
4. 重組FIP-fve與細(xì)胞的相互作用經(jīng)熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果表明重組 FIP-fve與三種細(xì)胞(人外周血淋巴細(xì)胞HPBL，人胚腎細(xì)胞293T，人肺癌細(xì)胞 A549)孵育后，重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠進(jìn)入這三種細(xì)胞內(nèi)(正常淋巴細(xì) 胞和腫瘤細(xì)胞)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能，對(duì)作用細(xì)胞沒有特異選擇性。
5. 重組FIP-fVe體外促脾淋巴細(xì)胞增殖活性用MTT法檢測其在體外刺激小 鼠淋巴細(xì)胞的增殖，結(jié)果表明重組FIP-fve在促小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的活性和天 然蛋白相類似。另外，重組FIP-fve還和刀豆蛋白ConA共同作用刺激小鼠淋巴細(xì) 胞增殖，結(jié)果表明重組FIP-fVe主要是針對(duì)T型淋巴細(xì)胞起作用。
6. 重組FIP-fVe促進(jìn)細(xì)胞的白介素-2和i干擾素分泌用ELISA方法檢測，結(jié) 果表明重組FIP-^e明顯的增強(qiáng)了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白介素2 (IL-2)和y-干擾 素的水平，具有和天然蛋白以及昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白相似的功能。
7. 重組FIP-fve抑制腫瘤細(xì)胞的生長對(duì)體外抗腫瘤活性檢測，結(jié)果表明重 組FIP-^e對(duì)NB-4有明顯的抑制作用，在濃度為8pg/ml時(shí)的抑制率為38.5。/。和 45%。顯微鏡下觀察加入重組FIP-fVe的腫瘤細(xì)胞明顯有聚集和破裂現(xiàn)象，說明重 組FIP-fVe誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，可以通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生 長。


圖1是本發(fā)明表達(dá)重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白載體的示意圖。
圖2是本發(fā)明巴斯德畢赤酵母表達(dá)的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白電泳圖。
圖3是本發(fā)明熒光標(biāo)記FITC重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞的相互作用照片。
圖4是本發(fā)明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖柱狀圖。
圖5是本發(fā)明自重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞分泌白介素-2和Y-干擾素柱狀圖。
圖6是本發(fā)明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NB4凋亡顯微鏡觀察圖。
圖7是本發(fā)明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NB4凋亡的流式細(xì)胞儀 記錄圖。
具體實(shí)施例方式
下面參見本發(fā)明的圖1至圖7并結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩詳細(xì) 說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體的實(shí)施例所限制，以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。另 外，以不違背本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。 實(shí)施例1
金針菇子實(shí)體購自市場。巴斯德畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9購自美國 Invitrogen生命技術(shù)公司。限制性內(nèi)切酶，質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒以及相 關(guān)生化試劑均購自大連寶生物公司，引物由上海生工公司合成。
(1) 、編碼FIP-^e基因的克隆取0.5g干燥的菌絲體在液氮中研磨，加入 15mlDNA提取液，然后加入K+，從而有效的去除多糖，同時(shí)用酚、氯仿和異 戊醇抽提2次，最后得到并提取較純的基因組DNA， 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 其結(jié)果?？寺【幋aFIP-fve基因的引物設(shè)計(jì)為上游，5、-caga加catgtccgccacg tcg etc acc-3、， 下游，5、-ag gwaWc ggafcc tea agt ctt ctt cca etc agc國3、 PCR產(chǎn)物 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。根據(jù)GenBank中已登錄FIP-fVe蛋白序列
(Accession P80412)設(shè)計(jì)PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強(qiáng)重組免疫 蛋白的表達(dá)效率和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳，出現(xiàn)了約350bp 的DNA片段，與設(shè)計(jì)堿基大小相符。
(2) 、重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體pPIC-9上可用的多 克隆位點(diǎn)很少，而NotI位點(diǎn)堿基在目的片段基因端點(diǎn)很難被酶切識(shí)別，所以用 單酶切連接，將克隆的目的基因與pPIC9分別用EcoRI酶切后16"連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落提取質(zhì)粒pPIC9-FIP-^e， 并用多組酶切檢測和測序，用基因本身和載體上都有的酶切位點(diǎn)Bamffl或Kpnl 鑒定構(gòu)建結(jié)果為正確的重組子，獲得的正確表達(dá)載體。如圖1所示為表達(dá)重組 金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白載體的示意圖。
用酶切電泳方法獲得正確的重組表達(dá)載體后，為了更進(jìn)一步的證明基因的 準(zhǔn)確和載體構(gòu)建的正確性，將重組質(zhì)粒測序，以573，AOX為引物，結(jié)果與 GenBank中已登錄的FIP-fVe序列比對(duì)后，證明完全正確。
cgteg敏fca"敏cfc妙cC敏cg紹贈(zèng)ccflac"cgcag妙cacc妙cgg敏gcagacc她aac"c "ccagtocaacaag欲gtofgg妙cgcggacaccaaaacg加carag做cgffgfc誠ccag"toccggcafl" cggagg贈(zèng)acato(3fcgc妙g敏czagaagacf妙ggafccgafl"cc。 (3)、重組巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的獲得
將上述構(gòu)建好的重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-FIP-^e用BglII酶切 線性化，采用電轉(zhuǎn)法將目的基因轉(zhuǎn)入酵母GS115中表達(dá)，含目的基因的線性質(zhì) 粒DNA片段上有HIS密碼基因，而野生型的巴斯德畢赤酵母GS115不能合成 該基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于fflS缺失的選擇培養(yǎng)基MD上，28"C培養(yǎng) 3天長出酵母單克隆菌落，再分別挑至MM和MD培養(yǎng)基對(duì)比，鑒定表型。如 果在二者上酵母菌生長相似，菌落大小一樣，說明目的片段為單點(diǎn)插入整合， 表型為His+Mut+,如果在MD上生長的菌落大小明顯比MM上的要大，說明基因 片段為雙點(diǎn)替換整合，表型為His+Muf。獲得的金針燕FIP-fVe的酵母轉(zhuǎn)化子， 經(jīng)過MM和MD培養(yǎng)后觀察結(jié)果，從表型上鑒定都為His+Muf型。
對(duì)巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR進(jìn)行鑒定，采用HIS選擇培養(yǎng)基初步鑒定 后，參照表達(dá)手冊方法提取轉(zhuǎn)化子酵母的總DNA。再用FIP-fVe基因的引物進(jìn) 行PCR檢測，結(jié)果表明所有的酵母轉(zhuǎn)化子均為陽性結(jié)果，說明目的基因已經(jīng)成 功轉(zhuǎn)入酵母GS115中。
9(4)、重組FIP-fVe的誘導(dǎo)表達(dá)和純化先選取正確的酵母轉(zhuǎn)化子之后，
i 、搖瓶發(fā)酵
挑取新鮮活化的Muts型酵母轉(zhuǎn)化子至50ml BMGY中，3(TC振搖過夜培養(yǎng)； 取500jil菌液至含有250ml BMGY的搖瓶中，3(TC振搖培養(yǎng)16-18h，至 OD600=2-6;
將菌液倒入滅菌離心管，4000rpm室溫離心5分鐘，收集酵母細(xì)胞； 無菌條件下將菌沉淀重懸浮于5-10倍體積的BMM中，放到含有500ml BMM培養(yǎng)基的搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；
每隔24h，補(bǔ)加0.5% (v/v)甲醇，共誘導(dǎo)培養(yǎng)4天； 收集發(fā)酵液，12000rpm室溫離心5分鐘，保留上清； 將上清液放入6000透析袋中4。C透析，每2h更換蒸餾水，共5次； SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)。
ii 、重組FIP-fVe的5升發(fā)酵罐發(fā)酵
發(fā)酵罐為WKT-J-7D/0型發(fā)酵罐(江蘇綠揚(yáng)電子集團(tuán)威科特)；罐體總?cè)莘e 5升；裝液系數(shù)75%;材質(zhì)為不銹鋼；攪拌方式為平葉/斜葉；在位滅菌；溫度
控制在3(TC;轉(zhuǎn)速控制在200rpm，專用發(fā)酵軟件。
從新鮮YPD平板挑重組FIP-fVe酵母工程菌單菌落接種于10mLBMGY種 子培養(yǎng)基，3(TC振蕩培養(yǎng)至OD6。。為5-6;
轉(zhuǎn)接于400mLBMGY培養(yǎng)基中，3(TC振蕩培養(yǎng)至OD柳達(dá)6-8作為發(fā)酵菌
種；
按10M接種量轉(zhuǎn)入5L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵96h; 收集發(fā)酵液經(jīng)6000卬m室溫25min離心，收集上清； 將上清液放入6000透析袋中4'C透析24h備用； SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)。
從圖2中可以看出，l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2， 3為空白菌對(duì)照；4， 5， 6， 7， 8分 別為誘導(dǎo)培養(yǎng)2， 3， 4， 5， 6天的樣品；9為純化后的樣品，與野生型畢赤酵母相比，轉(zhuǎn)化酵母上清SDS-PAGE分析出現(xiàn)15-20kD的2個(gè)蛋白帶，所述的蛋白
帶與重組蛋白的不同修飾水平有關(guān)。樣品透析后電泳檢測，并取3等分50ml樣
品透析后SDS-PAGE電泳并用君意凝膠掃描和分析系統(tǒng)(JY04S-3C)粗略分析
目的蛋白產(chǎn)量，分析目的蛋白泳道和條帶，與蛋白marker做比對(duì)，分析系統(tǒng)自
動(dòng)給出蛋白帶的OD值，換算重組FIP-fve的產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量為158.2
mg/L， 5L發(fā)酵罐的產(chǎn)量為300 mg/L~350 mg/L。
以搖瓶發(fā)酵為例，計(jì)算目的蛋白方法為如上樣量為15pl，稀釋倍數(shù)為1.8 (50ml—卯ml)， Marker蛋白帶為0.5嗎，艮P: [(0.846+0.812+0.856+0.818+0.833+0.806)/3]/[(0.433+0.510)/2]x0.5xl.8/20=0.1582 pg/Vl，相當(dāng)于158 .2mg/L。
iii、 超濾純化
離心收集后的酵母發(fā)酵液上清用PALL超濾系統(tǒng)5kD的濾膜對(duì)透析后的發(fā) 酵上清液進(jìn)行超濾，加入蒸餾水，最終收集濾膜膜上濃縮液約100ml，整個(gè)過程 中更換冰袋放入濾液缸，保持4'C的低溫操作。
iv、 離子柱純化
取處理好的DEAE-Sephadex-A25凝膠，裝柱(2x20cm)，用pH8.0， 10mM
Tris，HCl磷酸緩沖液過夜平衡；
將濃縮的超濾發(fā)酵液12000rpm離心2分鐘，上清液上柱； 用pH 8.0、 10mM Tris'HCl緩沖液300ml過夜洗滌凝膠柱； 用0-0.4MNaCl的Tris，HCl緩沖液對(duì)凝膠柱進(jìn)行線性離子梯度洗脫，洗脫流
速為40ml/h，每管收集10ml;
收集洗脫峰的洗脫液，透析后取微量用于SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，同時(shí)
檢測其血細(xì)胞凝集活性；
其余透析液低溫凍干備用。
由于FIP-fve的等電點(diǎn)為6.2，所以重組FIP-Re顯負(fù)性，進(jìn)行DEAE-A25離子柱層析分離時(shí)，重組FIP-fVe被掛柱，然后用0-0.4M NaCl的Tris'HCl緩沖
液進(jìn)行線性鹽濃度梯度洗脫，從層析圖看出，有小部分的雜蛋白在不同時(shí)間被 洗脫，但是目的蛋白的吸收峰明顯高，準(zhǔn)確收集峰洗脫液，透析后樣品進(jìn)行血 細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)表明其確實(shí)有活性。
v、 HPLC純化
取離子凝膠柱層析洗脫后的目的蛋白凍干樣溶于pH 8.0、 10mM Tris，HCl 磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)樣品濃度為3mg/ml;
高效液相色譜純化采用日本SHIMADZU LC-10AVP系統(tǒng)，檢測器 SHIMADZU LC-10AVP，工作站CLASS-Vp，色譜柱TSK-GEL, G3000PWXL， 流動(dòng)相為pH8.0、 10mM PBS磷酸緩沖液，流速為0.5ml/min，柱溫為4'C， 柱壓為1.6mpa;
對(duì)照收集的蛋白峰和記錄峰，結(jié)果有兩個(gè)活性峰出現(xiàn)，峰1量較大，峰2 較小，分別準(zhǔn)確收集兩個(gè)峰的洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和血細(xì)胞凝集活 性實(shí)驗(yàn)檢測，確定1峰為目的蛋白；
嚴(yán)格收集第一活性峰，徹底透析，低溫凍干后得到重組免疫調(diào)節(jié)蛋白純 品，保存?zhèn)溆谩?br> vi、 重組FIP-fve的純度測定
重組蛋白產(chǎn)量測定取15iil或2(^1發(fā)酵上清的透析液，SDS-PAGE凝膠 電泳后，用君意凝膠掃描和分析系統(tǒng)(JY04S-3C)分析和計(jì)算重組蛋白的產(chǎn)
純化的重組蛋白純度測試取高效液相純化后樣品，溶于pH8.0、 lOmM PBS中，調(diào)節(jié)濃度為l-2mg/ml。用BCA蛋白檢測試劑盒(PIERCE)檢測蛋白 純度，BSA作標(biāo)準(zhǔn)。分別取待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml和2mlBCA工作液，混勻 后放置37'C， 30分鐘，于560nm下測定吸光值，以BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以純 品BSA作對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0009X+0.0962 (R2=0.9668， P <0.001)， Y為吸收OD值，X為樣品蛋白濃度(嗎/ml)，代入平均OD (1.208)，
12最后計(jì)算出重組FIP-fVe的純度為92.4%。
對(duì)重組金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行理化特征檢測如下
一、 方法
1. 重組FIP-iVe的氨基酸分析 采取酸水解方法分析重組蛋白的氨基酸組分。準(zhǔn)確稱量純化的重組
FIP-fvelOmg，溶于2ml 6M HCL，充分溶解后轉(zhuǎn)入到5ml水解管中，嚴(yán)密封口 后ll(TC水解反應(yīng)20-24小時(shí)，吸出水解液至蒸發(fā)皿中，沸水浴蒸干驅(qū)盡HCL， 樣品送至吉林大學(xué)分析測試中心，在Agilent 1100型氨基酸自動(dòng)分析儀分析氨基 酸組分。
2. 重組FIP-fVe的圓二色譜(CD)分析
重組FlP-^e的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元分析采用圓二色譜(CD)檢測。準(zhǔn)確稱量1.3mg 純品重組蛋白，溶于lml滅菌4"C水中，然后稀釋10倍，調(diào)節(jié)最終蛋白終濃度 至10義10々M。樣品送至吉林大學(xué)分析測試中心，在J-810型圓二色譜儀上檢測 和記錄。分析結(jié)果數(shù)據(jù)用Origin 6.0軟件作圖，同時(shí)把測試結(jié)果的數(shù)據(jù)用Chen 和Yang的方法計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)單元含量。
3. 重組FIP-fVe的糖含量分析
用苯酚-硫酸法測定重組FlP-^e的可溶性中性糖含量。準(zhǔn)確稱量1.5mg純品 重組FIP-fve，溶于lmlpH 8.0、 10mM PBS緩沖液，調(diào)節(jié)最終蛋白濃度為
0. 25mg/ml。取lml稀釋蛋白液至大試管(2xl5cm)中，用移液管準(zhǔn)確加入6% 苯酚0.5ml，振蕩混勻后，延試管壁緩慢準(zhǔn)確加入2.5ml濃硫酸，振蕩混勻后沸 水浴煮沸10分鐘，然后放置冷卻至室溫，在723型可見光分度計(jì)于490nm測定 每管OD值，平行做3管，取平均值。同時(shí)，取lml滅菌蒸餾水做負(fù)對(duì)照，lml 不同濃度葡萄糖(10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90和100pg/ml) PBS溶 液做正對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算重組FIP-^e的糖含量。
二、 結(jié)果
1. 重組FIP-fve氨基酸組分分析
13采取酸水解方法分析重組FIP-fVe蛋白的氨基酸組分。根據(jù)檢測結(jié)果，計(jì)算 各種測試氨基酸的重量百分比含量，與已發(fā)表的氨基酸組分進(jìn)行比對(duì)，重組
FIP-fve和天然的氨基酸組分一致，證明重組FIP-fVe的正確性。
2. 重組FIP-fVe圓二色譜(CD)分析 功能蛋白的正確折疊對(duì)蛋白活性很關(guān)鍵，而FIP-fVe的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成尤其
是a-螺旋對(duì)二聚體形成和生物活性至關(guān)重要。采用圓二色譜(CD)對(duì)重組FIP-fVe 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定，確定其形成二級(jí)結(jié)構(gòu)單元和可能的正確折疊。用Yang 等人的方法，通過換算計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的含量，重組FIP-fve的a-螺旋，(3-折疊和P-轉(zhuǎn)角的含量分別為11.3%， 34.3%和11.9%,相對(duì)比例為1: 3: 1，天 然的FIP-fVe三者比為3: 6: 1，和天然蛋白一樣具有相似的低含量oi-螺旋和較 多的(3-結(jié)構(gòu)。
3. 重組FIP-fVe糖含量分析 重組FIP-fVe的糖含量用苯酚-硫酸方法測定，以純品葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回
歸方程為Y=0.01553X+0.00518 (R2=0.923， P<0.01)， Y為490勤吸收值，X 為樣品糖濃度，然后代入重組FIP-fVe樣品，最后算出重組FIP-fve糖含量為1.2% 。 天然的FIP-fVe不含糖成分，而重組FlP-^e糖含量，說明用巴斯德畢赤酵母系 統(tǒng)表達(dá)的重組FIP-^e發(fā)生了糖基化修飾。重組FIP-fVe得到了一定的修飾，可 能使重組FIP-fVe得到正確的折疊從而具有生物活性。
對(duì)重組金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白免疫生理活性的檢測如下 一、方法
1. FITC熒光素標(biāo)記蛋白和顯微鏡觀察
材料儀器異硫氰酸熒光素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte， FITC)，購自
吉爾生化(上海)；二甲基亞砜;碳酸鹽緩沖液(pH8-9.5);磷酸鹽緩沖液(PBS);
Desalting Hiprep 26/10脫鹽柱；AKTA purifier; IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液(Hyclone)， 胎牛血清(FBS， Gibco)，日立分光光度計(jì)，激光掃描共聚焦顯微鏡80i(Nikon)。 熒光標(biāo)記蛋白將純化的重組FIP-fVe (7.5mg'mr1) 20ml溶于碳酸鹽緩沖液(pH8.3)透析過夜，稱取3.75mgFITC，加入二甲亞砜(DMSO)3.75ml 配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小燒杯中先放入重組FIP-fVe溶液，加入 逐滴FITC-DMSO溶液，再用PBS加至30ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌4h， 用Desalting Hiprep 26/10脫鹽柱于AKTA purifier系統(tǒng)上除去游離熒光素，75ml PBS洗脫，280和495nm檢測，峰收集。將制備的FITC-重組FIP-fve (IO倍 稀釋)于220-520謡掃描，A495=0.445， A280=0.67，計(jì)算標(biāo)記效率(F/P)為 3.80。
細(xì)胞培養(yǎng)將不同種類的細(xì)胞以2><106接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml， 以IMDM (2%FBS)培養(yǎng)液配制FITC-重組FlP-^e為lOOng.mr1,每孔0.5ml 孵育(37°C)，設(shè)空白對(duì)照組和24h實(shí)驗(yàn)組。24h后取出細(xì)胞加入至1.5mlEP 管中，1000rpm離心，棄上清，以PBS清洗3次，洗凈重懸，制片。 細(xì)胞觀察于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，照相記錄。 2.促小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性測定
采用MTT法測定重組FIP-Re對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的促分裂作用，所用抗生素， 重組FIP-^e樣，ConA， LPS和MTT都用0.22pm超濾膜過濾，-20°€:保存。
取4-6周無致敏環(huán)境下生長的Ba舊/C小鼠，斷頸處死小鼠，75%酒精浸泡3 分鐘，在超凈工作臺(tái)中無菌條件下取脾臟；
采用研磨法，用4-6層滅菌紗布，分離脾淋巴細(xì)胞；
用3ml RPMI1640培養(yǎng)液(不含BSA和雙抗)懸浮脾細(xì)胞，2000rpm離心2 分鐘；
小心吸取上清，重復(fù)上一步驟3-5次；
將脾細(xì)胞懸浮于lml配制好的RPMI1640培養(yǎng)液(含有10% BSA, 100U/ml 青霉素，100pg/ml鏈霉素)中，稀釋濃度至lxl(^細(xì)胞/ml;
在96孔培養(yǎng)板上每孔加入lOOpl脾淋巴細(xì)胞懸浮液，加入重組FlP-^e PBS 溶液(終濃度1, 2, 4， 8， 16和32嗎/ml)，重組FIP-fVe PBS溶液(終濃度10, 20, 40, 60, 80和100|ig/ml)，同時(shí)加pH7.2， lOmMPBS， ConA (終濃度5(ig/ml)和LPS (終濃度2pg/ml)分別做為負(fù)對(duì)照和正對(duì)照；
將培養(yǎng)板封口，放置于5%(302， 37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖效果；
沿培養(yǎng)板孔內(nèi)壁小心加入20^ilMTT的PBS液，輕輕振蕩30秒混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(shí)；
小心吸取上清，盡量吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入lOOpl 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10分鐘后，放入酶標(biāo)儀(Model 680， Bio-Rad)，于570nm測定吸光值，記錄讀數(shù)，制作重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)-曲線柱狀圖，如圖4所示。
3.促細(xì)胞因子白介素IL-2和干擾素分泌活性測定
通過ELISA方法檢測重組FIP-fve促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白介素(IL-2)
和Y-干擾素的作用以測定其免疫調(diào)節(jié)活性。
BalB/C小鼠脾淋巴細(xì)胞懸浮液制備同上，最終稀釋于配制好的RPMI1640培養(yǎng)液(含有10。/oBSA， 100U/ml青霉素，100|ig/ml鏈霉素)中，稀釋濃度至lxl()7細(xì)胞/ml;
在96孔培養(yǎng)板加入lOOpl細(xì)胞懸浮液，lOO(il重組FIP-fVe液終工作濃度為1， 2, 4， 8, 16和32嗎/ml，同時(shí)加100^1 ConA (5pg/ml)和pH7.2， 10mM PBS做正負(fù)對(duì)照。每個(gè)樣品做2個(gè)平行 L。密封好后，輕輕震蕩混勻，放于5%(302，37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；
吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，2000rpm室溫離心5分鐘，收集上清。以下步驟用小鼠IL-2定量ELISA試劑盒操作；
加入100pl樣品上清，同時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)品小鼠IL-2和干擾素，分別稀釋至終濃度為15.6， 31.2, 62.5, 125, 250, 500和1000 pg/ml作為正對(duì)照和制作標(biāo)準(zhǔn)，用PBS做負(fù)對(duì)照，加入100(il標(biāo)準(zhǔn)品和PBS，每個(gè)樣品做2個(gè)平行孔；
輕微震蕩混勻后，放于37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，小心吸出上清液，用洗滌液每孔200W洗滌5次，倒置濾紙上盡量空干液體；每孔加入一抗5(V1，放于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)，洗滌液洗板同上；
加入二抗(酶標(biāo)抗體)10(^1，放于37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)，洗板同上。每孔加入底物工作液10(^1，放于37'C培養(yǎng)箱中暗反應(yīng)IO分鐘，每孔加入
50|ll終止反應(yīng)液；
將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，于492nm測定吸光值，記錄讀數(shù)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品IL-2含量。
4. MTT法測定體外抗腫瘤活性
采用MTT方法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性。首先用MTT法粗測定重組FIP-fVe對(duì)人白血病細(xì)胞NB4和小鼠肉瘤細(xì)胞S-180的作用。
NB4和S-180細(xì)胞由吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)所提供，在高糖DMEM中傳代培養(yǎng)后，測量細(xì)胞濃度直到其濃度為5xl()S細(xì)胞/ml;
在96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入10(^1腫瘤細(xì)胞懸浮液，100pil重組蛋白樣品，重組FIP-fVe終濃度為1， 2， 4， 8， 16， 32， 64和128(ig/ml，同時(shí)加入5-氟尿嘧啶(5嗎/ml、 10嗎/ml)做正對(duì)照。每個(gè)樣品做3個(gè)平行孔；
混勻后，放于5%<:02， 37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-72小時(shí)，每隔12小時(shí)顯微鏡觀察抗腫瘤結(jié)果；
24小時(shí)后，沿培養(yǎng)板孔內(nèi)壁小心加入20(^1 MTT的PBS液，輕輕振蕩30秒混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(shí)；
小心吸取上清，盡量吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入lOOjil 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10分鐘后，放入酶標(biāo)儀(Model 680， Bio-Rad)，于570nm測定吸光值，記錄讀數(shù)。制作反應(yīng)-曲線柱狀圖。計(jì)算重組FIP-fVe對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。
5. 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定抗腫瘤活性
在用MTT法初步確定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性后，采用FCM法進(jìn)一步準(zhǔn)確測定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性。
在5%(202， 37'C培養(yǎng)箱中用高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)NB4細(xì)胞，使其生長至濃度為lxl(^細(xì)胞/ml;
在12孔培養(yǎng)板中每孔加入0.8ml腫瘤細(xì)胞懸浮液，加入0.2ml終濃度為8，16和32pg/ml的重組FIP-fVe，以正常生長的NB-4細(xì)胞做負(fù)對(duì)照，每個(gè)樣品濃度做2個(gè)平行孔。在5%002， 37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
用3000rpm室溫離心5分鐘，收集腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡率用Annexin-V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測定；
用pH7.2、 10mMPBS洗漆NB-4細(xì)胞，3000rpm室溫離心5分鐘，共2次，
確保最終收集細(xì)胞為1-5X105;
加入試劑盒內(nèi)結(jié)合緩沖液500iLi1，混勻；再加入2^ilAnnexin-V-EGFP，混勻，最后加入5pl碘化丙啶(PI)，充分混勻；
室溫避光暗處反應(yīng)10-15分鐘，在1個(gè)小時(shí)內(nèi)送至流式細(xì)胞儀進(jìn)行測試；
FCM采用488nm激發(fā)波長，530nm發(fā)射波長；Annexin-V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道(FL1), PI紅色熒光通過PI通道(FL3);
以未經(jīng)PI和EGFP染色的正常生長的NB4細(xì)胞做純陰性對(duì)照，記錄所有被熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)計(jì)算誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率。
二、結(jié)果
1. 重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白一與細(xì)胞的相互作用
熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)FITC標(biāo)記的重組FIP-fVe (6.25|ig/ml)與三種細(xì)胞(人外周血淋巴細(xì)胞HPBL，人胚腎細(xì)胞293T，人肺癌細(xì)胞A549)孵育24h后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光都增強(qiáng)，標(biāo)記蛋白大部分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，未標(biāo)記蛋白處理的細(xì)胞無綠色熒光，如圖3是本發(fā)明熒光標(biāo)記FITC重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞的相互作用照片，結(jié)果表明重FIP-fve能夠進(jìn)入這三種細(xì)胞內(nèi)(正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能，對(duì)作用細(xì)胞沒有特異性選擇。
2. 促脾淋巴細(xì)胞增殖活性檢測
天然的FIP-fVe被證明可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞或者是人外周血淋巴細(xì)胞的增殖，用MTT法檢測重組FIP-^e在體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明，加入了重組FIP-fVe的小鼠脾淋巴細(xì)胞明顯數(shù)目增多，雖然比LPS作用弱相比， 但是在某些濃度時(shí)比ConA還要強(qiáng)，如圖4所述本發(fā)明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖柱狀圖，正常脾淋巴細(xì)胞作為負(fù)對(duì)照，LPS和ConA作為正 對(duì)照，重組FIP-,e濃度分別從10-320[ig/mL， (**)表示P〈0.01。重組FIP-fVe 在80嗎/mL時(shí)最大限度促進(jìn)細(xì)胞增殖；而天然的FlP-^e在100pg/mL達(dá)到最有 效濃度，說明重組FIP-fVe和天然蛋白一樣具有促小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的功能。 另外，重組FIP-^e還和ConA共同作用刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖，其最有效濃度 為8|iig/mL，說明重組FIP-fve主要是針對(duì)T型淋巴細(xì)胞起作用。
3. 促白介素-2和Y-干擾素分泌活性檢測
以前的研究報(bào)道指出FIP-fVe可以在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞和人血 淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，該活性與FIP-^e的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤功能密 切相關(guān)。測定了重組FlP-^e促細(xì)胞增殖活性后又用ELISA方法檢測了其增強(qiáng)小 鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞白介素2(IL-2)和Y-干擾素的能力。結(jié)果表明重組FIP-^e 明顯的增強(qiáng)了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2和Y-干擾素的水平，如圖5是本發(fā)明自 重組金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞分泌白介素-2和Y-千擾素柱狀圖， 以已知的PBS和ConA分別作為負(fù)對(duì)照和正對(duì)照，重組FIP-fVe的濃度從 l-16pg/mL， ConA誘導(dǎo)水平為1032.8 pg/ml，與已發(fā)表的結(jié)論一致。重組FIP-fVe 在16， 8和4pg/mL時(shí)誘導(dǎo)IL-2分泌水平為618， 430和316 pg/ml，而來自昆蟲 細(xì)胞表達(dá)的重組FlP-^e在15， 10和5pg/mL時(shí)誘導(dǎo)IL-2水平分別為668， 503 和349pg/ml，這說明從巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的重組FIP-fVe具有和天然蛋白以 及昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組FIP-fVe相似的增強(qiáng)IL-2胞因子分泌水平的活性。
4. 體外抗腫瘤活性檢測
用MTT法測定重組FIP-fVe對(duì)白血病細(xì)胞NB-4和小鼠肉瘤細(xì)胞S-180的抑 制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組FIP-fVe對(duì)NB-4和S-180有明顯的抑制作用，在濃度為 8呢/ml時(shí)最大抑制率為38.5%。顯微鏡下觀察到加入重組FIP-fve的細(xì)胞明顯有 聚集和破裂現(xiàn)象，說明重組蛋白誘導(dǎo)癌細(xì)胞NB-4和S-180的死亡，如圖6是本
19發(fā)明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NB4凋亡顯微鏡觀察圖片，顯微鏡
(20x16)下觀察正常NB-4細(xì)胞和重組FIP-fVe誘導(dǎo)死亡的癌細(xì)胞；圖7是本發(fā) 明重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NB4凋亡的流式細(xì)胞儀記錄圖，a為 正常生長的NB-4細(xì)胞作為負(fù)對(duì)照。B、 c、 d表示不同濃度重組FIP-^e (64、 32 和16pg/ml)誘導(dǎo)NB-4細(xì)胞凋亡結(jié)果。Bl: I染色的癌細(xì)胞，機(jī)械和自然死亡 的細(xì)胞；B2:被PI和EGFP雙染色的癌細(xì)胞，表示正常死亡和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞； B3:不被染色的細(xì)胞，即活的癌細(xì)胞；B4:被EGFP染色的細(xì)胞，即被誘導(dǎo)凋 亡的癌細(xì)胞。
為了進(jìn)一步更準(zhǔn)確的檢測其抗腫瘤活性，用流式細(xì)胞術(shù)檢測重組FlP-^e誘 導(dǎo)NB-4細(xì)胞凋亡。結(jié)果可以看出，作為負(fù)對(duì)照的正常生長的NB-4細(xì)胞的活細(xì) 胞占62.3%，而加入了重組FIP-fVe的NB-4活細(xì)胞比例分明下降到54.8， 43.1 和48.8%;另夕卜，凋亡的NB-4細(xì)胞的比例明顯增加，由正常的17.3%增加到 32.4%，表明重組FIP-fve具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白免疫制劑的應(yīng)用
1、 重組FIP七e用于提高免疫力的保健口服液以重組FIP-fve為活性劑， 有效含量為200mg/L，制備口服液，具體用法成人每日兩次、每次服用20mL， 對(duì)化療后病人用藥2—3周就有提高人體免疫力功效，特別是具有升高白細(xì)胞的 功效。
2、 重組FIP-We治療過敏癥藥物以重組FlP-^e為活性劑，有效濃度35 %，制成外用噴劑鼻腔噴入給藥，成人每次每鼻孔2—3撳，每日三次、使用1 一3就有預(yù)防和治療過敏性鼻炎的作用。
3、 重組FIP-^e升高白細(xì)胞治療制劑以重組FIP-fVe為活性劑，有效含量 為200mg/Kg，制成口服藥物和非腸道藥物，具體用法成人每日三次、每次服 用20mg，用于各種原因引發(fā)的白細(xì)胞減少癥的治療。
4、 重組FIP-^e作為艾滋病藥物或疫苗佐劑以重組FIP-fVe為活性齊U，有 效濃度60%，制成防治和治療艾滋病的免疫藥物或疫苗佐劑，重組FIP-fVe和艾
20滋病病毒都作用于T淋巴細(xì)胞，但效果拮抗。艾滋病病毒通過受感染的T細(xì)胞 在死亡前產(chǎn)生病毒粒子來慢慢損耗健康的白細(xì)胞，造成機(jī)體免疫力低下。而
FIP-fve主要作用于T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分泌細(xì)胞因子，提高免疫力。 FIP-fve能有效地抵抗和防御艾滋病病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞的侵害和對(duì)免疫系統(tǒng)的破 壞。
5、重組FIP-fVe作為抗腫瘤藥物以重組FIP-fve為活性劑，有效含量為300 mg/Kg，制成口服藥物和非腸道藥物用于腫瘤的治療，特別是用于淋巴系統(tǒng)腫瘤 的治療。具體用法成人每日三次、每次服用20mg。重組FIP-fVe可以通過誘 導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌Y-干擾素，白介素-2和腫瘤壞死因子等，并且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞凋亡，達(dá)到直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力的目的。
權(quán)利要求
1、重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)、編碼FIP-fve基因的克隆取干燥金針菇菌絲體在液氮研磨后，加入DNA提取液，獲得基因組DNA，根據(jù)GenBank中已登錄FIP-fve蛋白質(zhì)序列(Accession P80412)設(shè)計(jì)PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強(qiáng)重組免疫蛋白的表達(dá)效率和準(zhǔn)確性；(2)、重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆的目的基因與載體pPIC9一起經(jīng)過酶切，回收和連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，提取質(zhì)粒pPIC9-FIP-fve；(3)、重組巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的獲得將上述構(gòu)建好的重組酵母表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve用BglII酶切線性化，采用電轉(zhuǎn)法將目的基因轉(zhuǎn)入酵母GS115中表達(dá)，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的選擇培養(yǎng)基MD上，28℃至少培養(yǎng)3天分別挑至MM和MD培養(yǎng)基對(duì)比，提取轉(zhuǎn)化子酵母的總DNA；(4)、重組FIP-fve的誘導(dǎo)表達(dá)和純化選取正確的酵母轉(zhuǎn)化子，首先用搖瓶500-1000ml振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，確定其有表達(dá)后，挑選其中表達(dá)量高的酵母菌進(jìn)行5L發(fā)酵罐大量培養(yǎng)，發(fā)酵上清經(jīng)透析后SDS-PAGE檢測，并用君意凝膠分析系統(tǒng)測定目的蛋白產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量至少為158.2mg/L，5L發(fā)酵罐的產(chǎn)量至少為300mg/L～350mg/L，樣品進(jìn)一步通過超濾系統(tǒng)超濾濃縮，4℃的低溫透析后用血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)確定其活性，并進(jìn)行DEAE-A25離子柱層析純化，再進(jìn)一步用高效液相色譜進(jìn)行純化，收集具有生理學(xué)活性的目的蛋白，最后檢測重組FIP-fve的純度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于 步驟(1)所述的設(shè)計(jì)PCR弓I物為上游，5、-ca gaattc atg tcc gcc acg tcg etc acc-3、； 下游，5、- ag gaattc ggatcc tea agt ctt ctt cca etc age -3、。
3、 所述重組金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白在免疫制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種使用巴斯德畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及應(yīng)用。包括下述步驟(1)編碼FIP-fve基因的克?。?2)重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建；(3)重組巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的獲得；(4)重組FIP-fve的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。本發(fā)明通過克隆編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，構(gòu)建巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，獲得大量高產(chǎn)率和高純度的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，5升發(fā)酵工藝獲得的重組蛋白產(chǎn)量達(dá)300mg/L～350mg/L，純度達(dá)90％以上，經(jīng)純化后檢測其生物學(xué)特點(diǎn)和免疫生理活性與天然金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白相同，具有凝血活性，促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖及分泌白介素和干擾素的功能，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101487020SQ20091001057
公開日2009年7月22日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者劉立俠, 非 孫, 韌 張, 林景衛(wèi), 許守民 申請人:劉立俠