專利名稱：重組人hmbox1表達(dá)載體以及該載體表達(dá)產(chǎn)物及其抗體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人HMB0X1表達(dá)載體以及該載體表達(dá)產(chǎn)物及其抗體與應(yīng)用，屬基因工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人HMB0X1基因是一種功能性新基因，廣泛表達(dá)在人體組織中，其中在腦、胰腺、胎盤、 前列腺、胸腺和睪丸組織中高表達(dá)。并且人HMB0X1基因和小鼠、大鼠、雞、蟾蜍相比具有 較高同源性，所以在遺傳上具有高度保守性。人HMB0X1蛋白由421個(gè)氨基酸組成，含有和 HNF (H印atocyte Nuclear Factor)相同的功能域，提示其功能可能與HNF相關(guān)。HMB0X1 是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，其與胰腺疾病具有相關(guān)性，并且與免疫殺傷功能有一定關(guān)系，但其具 體機(jī)制尚不清楚。人HMB0X1抗體可以與HMB0X1特異性結(jié)合，對(duì)于研究HMB0X1在人體中的
作用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組人HMB0X1表達(dá)載體以及該載體表達(dá)產(chǎn)物及 其抗體與應(yīng)用。
一種重組人HMB0X1表達(dá)載體，通過(guò)如下步驟構(gòu)建制得
(1) 從人自然殺傷(NK)細(xì)胞系M92細(xì)胞中擴(kuò)增得到人HMB0X1基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示；
(2) 將步驟(1)制得的人HMB0X1基因與pGEM easy T載體(購(gòu)自Promega公司)連 接構(gòu)建成pGEM-HMBOXl;連接方法參見pGEM easy T載體使用說(shuō)明書。
(3) 以步驟(2)制得的pGEM-HMB0X1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物時(shí)分別在5'端 和3，端設(shè)計(jì)BamH I和Hind III酶切.位點(diǎn)，得擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物序列為SEQ ID NO. 2所 示；
(4) 將步驟(3)制得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后與載體pET22b (購(gòu)自 Novagen公司)連接，構(gòu)建得到表達(dá)產(chǎn)物C端帶有6XHistidine標(biāo)簽的pET22b-HMB0X1表 達(dá)基因載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)中，得到重組人HMB0X1表達(dá)載體。連接方 法參見pET22b載體使用說(shuō)明書。
上述步驟(3)中，引物序列如下
5，端引物為5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3，， 3，端引物為5， - CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。 上述步驟(3)中，PCR反應(yīng)條件為
95。C變性60s, 58。C退火60s， 72。C延伸90s，循環(huán)25次。
上述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。 上述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，具體步驟如下 (1)將重組HMB0X1表達(dá)載體接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至ODeoo為0. 4后，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopr叩yl e -D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度lmM， 在3(TC繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，得誘導(dǎo)菌液；
(2)將步驟(1)制得的誘導(dǎo)菌液用Ni-NTA交聯(lián)的瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化，純化后 的HMB0X1蛋白再一次進(jìn)行Ni-NTA交聯(lián)的瓊脂糖親和吸附，并直接在柱上呈梯度降低變性劑 尿素的濃度對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，最后收集復(fù)性蛋白，即為重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物。
上述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法步驟(2)中的具體步驟如下
1) 用蒸餾水浸濕空柱，棄去蒸餾水。
2) 吸取2mlNTA-Resin樹脂到空柱中(下端封閉)，使其自然沉積，然后拔掉下端塞子， 使液體流出。
3) 依次用3ml蒸餾水、5ml 1 XCharge Buffer (50mMNiSO4)、 3ml 1 XBinding Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)過(guò)柱子，力卩載Ni離子。
4) 將以6M尿素溶解的包涵體蛋白通過(guò)柱子，最適流速10ml/h。
5) 然后依次用5ml 1 XBinding Buffer和5ml 1 XWash Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCI 60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗滌柱子。
6) 依次加入以下梯度尿素1 XBinding Buffer溶液6M尿素2ml、 5. 5M尿素lml、 5M 尿素lml、 4. 5M尿素lml、 4M尿素lml、 3. 5M尿素lml、 3M尿素lml、 2. 5M尿素lml、 2M尿 素lml、 1.5M尿素lml、 1M尿素lml、 0.5M尿素lml、 0M尿素2ml。
7) 力卩入5mllXWash Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol pH7.9)洗滌。
8) 力卩入4ml lXElute Buffer (0.5MNaCl 20mM Tris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脫，收
集流出液，為復(fù)性蛋白，即重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物。
該重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物主要是以包涵體的形式存在，該表達(dá)產(chǎn)物具有SEQ ID NO. 3序列特征。
上述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的抗體，通過(guò)如下步驟制備
(1) 用重組人HMB0Xl表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物免疫8周齡BALB/c小鼠，首次每只50ug， 每間隔兩周免疫一次，每次25ug，腹腔注射，用間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，達(dá)到l:l X105時(shí)，取免疫小鼠脾細(xì)胞，備用；
(2) 復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，保證融合時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并用8-氮鳥嘌呤篩選， 保持HGPRT缺陷，得備用骨髓瘤細(xì)胞；
(3) 取8周齡BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，接種到恥孔的孔板上，靜置 24小時(shí)，備用；
(4) 取步驟(1)制得的免疫小鼠脾細(xì)胞與步驟(2)制得的備用骨髓瘤細(xì)胞混合，加 入50%的PEG4000進(jìn)行細(xì)胞融合，然后加入到步驟(3)制備好的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔的孔 板上，培養(yǎng)10-14天后，取培養(yǎng)上清，用間接ELISA檢測(cè)抗人HMB0X1抗體效價(jià),對(duì)抗人HMB0X1 抗體效價(jià)高的陽(yáng)性孔進(jìn)行三次單克隆培養(yǎng)，直至所有克隆孔均成陽(yáng)性，得單克隆抗體雜交瘤 細(xì)胞溶液，該單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞溶液每毫升含有1乂106個(gè)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞；
(5) 先用石蠟油腹腔注射BALB/c小鼠，詞養(yǎng)一周，得備用小鼠；
(6) 取步驟(4)制得的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞溶液0.5ml，腹腔注射步驟(5)制得的 備用小鼠，2-3周后收集小鼠腹水，12000r/min離心20min后收集上清，即為含有抗HMB0X1 的單克隆抗體，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨沉淀和Protein A親和純化后，得到重組人HMB0X1表達(dá)載
5體的表達(dá)產(chǎn)物的抗體。
上述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，上述實(shí)驗(yàn)試劑均為市售產(chǎn)
叩o
利用重組人HMBOXl表達(dá)載體和重組人HMBOXl表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物可以進(jìn)一步了解 HMBOXl的生化性質(zhì)和特點(diǎn)，深入研究HMBOXl的蛋白三級(jí)構(gòu)象。利用重組人HMBOXl表達(dá)載 體的表達(dá)產(chǎn)物制備的抗人HMBOXl蛋白抗體不僅可以用于研究人HMBOXl蛋白在人體各組織中 的表達(dá)情況，還可以對(duì)HMBOXl在疾病中的差異表達(dá)作進(jìn)一步分析。另外，此抗體可應(yīng)用于 HMBOXl在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的機(jī)制研究，闡明HMBOXl蛋白的結(jié)合位點(diǎn)以及和其它轉(zhuǎn)錄因子的 相互作用。


圖1為人HMBOXl cDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。M為Marker, 1為目的基因。 圖2為pET22b-HMBOXl載體構(gòu)建的PCR和雙酶切驗(yàn)證。Ml和M2為DNA marker, 1-4為 載體的四個(gè)克隆菌株質(zhì)粒。左邊四道為PCR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)，右邊四道為BamH I和Hind III雙酶
切驗(yàn)證結(jié)果。
圖3為pET22b-HMB0Xl載體在大腸桿菌Rosseta (DE3)中的表達(dá)。M為蛋白質(zhì)分子量 marker, C為pET22b空質(zhì)粒誘導(dǎo)組，1-7為pET22b-HMBOXl質(zhì)粒載體誘導(dǎo)組，箭頭所指處為 表達(dá)的目的蛋白。
圖4為重組HMB01蛋白復(fù)性的非還原SDS-PAGE和western blot驗(yàn)證。左圖為非還原 SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果，右圖為western blot驗(yàn)證結(jié)果，M為蛋白質(zhì)分子量marker, 1為包涵 體未復(fù)性蛋白，2為復(fù)性蛋白。結(jié)構(gòu)顯示，復(fù)性蛋白的遷移速度稍快，并有二聚體形成。
圖5為競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體的特異性。
圖6為western blot檢測(cè)單克隆抗體的特異性。分別展示了 HMBOXl蛋白在大腸桿菌 Rosseta (DE3)、 HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)。1為HEK293T細(xì)胞，2為服K 293T (SiRNA)細(xì)胞， 3為RoseUa (pET22b) ， 4為Rosetta (pET22b/腿0Xl) ， 5為純化的融合蛋白HMBOXl-6His。 結(jié)果顯示單克隆抗體能檢測(cè)到HMBOXl在HEK 293T細(xì)胞中表達(dá)，并且經(jīng)HMBOXl特異性SiRNA 干擾，HMBOXl表達(dá)水平下降；而且單克隆抗體能檢測(cè)原核系統(tǒng)中HMBOXl的表達(dá)。
圖7為免疫組織化學(xué)檢測(cè)單克隆抗體的特異性。展示了 HMBOXl蛋白在HEK293T細(xì)胞中 的表達(dá)，并且經(jīng)HMBOXl特異性SiRNA干擾，HMBOXl表達(dá)水平下降。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本 發(fā)明。
實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)試劑均為市售產(chǎn)品。 實(shí)施例
1、目的基因的獲得和含有目的基因克隆載體的構(gòu)建
以人自然殺傷(NK )細(xì)胞系NK92細(xì)胞的cDNA為模板，用5'端引物 5, -GGTACCGGATATTGATCCGCCTCATG-3，和3，端引物5， -CTCGAGGGTGCTACGTCTMACTMGTT -3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增人HMBOXl基因，其中5'端引物含有Kpn I酶切位點(diǎn)，3'端引物含有Xho I酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為95。C變性60s， 57'C退火60s， 72'C延伸120s，先循環(huán)6次； 然后94。C變性60s, 50. 5。C退火60s， 72。C延伸90s，再循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂 糖凝膠電泳，顯示為一條1300bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期1336相符(如圖1所示)。將擴(kuò)增得到的HMBOXl片段切膠回收純化并定量后與pGEM easy T載體(Promega公司產(chǎn)品) 連接構(gòu)建成pGEM-HMBOXl ，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證，篩選獲 得有目的基因片段的菌株。經(jīng)測(cè)序證明與GeneBank序列一致，該基因序列為SEQ ID NO. 1 所示。
2、 含有目的片段的重組表達(dá)載體的構(gòu)建
以 pGEM-HMBOXl 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，5， 端引物為 5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3， ， 3， 端引物為 5，-
CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。其中5，端引物含有BaraH I酶切位點(diǎn)和起始密碼， 3'端引物含有Hind III酶切位點(diǎn)并使終止密碼突變。PCR反應(yīng)條件為95C變性60s， 58 。C退火60s， 72-C延伸90s，循環(huán)25次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切連接到表達(dá)載體pET22b,構(gòu)建 表達(dá)產(chǎn)物C端帶有6XHistidine標(biāo)簽的pET22b-HMBOXl表達(dá)質(zhì)粒載體。將重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證(如圖2所示)，篩選獲得有目 的基因片段的菌株，并且經(jīng)測(cè)序證明與GeneBank序列一致，該基因序列為SEQ ID NO. 2所 示。
3、 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化
含有重組HMBOXl基因的大腸桿菌Rosetta(DE3)接種到放入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，培養(yǎng)至0De。。為0. 4后，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopr叩yl P -D-thiogalactoside， IPTG)至終濃度lmM誘導(dǎo)，在30。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，取lml誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。 與空載體誘導(dǎo)株和pET22b-HMBOXl未誘導(dǎo)株相比，發(fā)現(xiàn)pET22b-HMB0Xl誘導(dǎo)菌株在60kD左 右有特異性條帶的表達(dá)(如圖3所示)，說(shuō)明pET22b-HMBOXl在宿主菌Rosetta (DE3)中表 達(dá)了重組HMBOXl融合蛋白，其序列為SEQ ID NO. 3所示。由于表達(dá)的HMBOXl重組蛋白含有 6XHistidine標(biāo)簽，可以利用Ni-NTA交聯(lián)的瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化,可依次用3ml蒸餾 tK、 5ml 1 XCharge Buffer (50mMNiSO4)、 3ml 1 XBinding Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)過(guò)柱子，加載Ni離子，然后以6M尿素溶解的包涵體蛋白通過(guò) 柱子，流速10ml/h，然后再用5ml 1 XBinding Buffer和5ml lXWash Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗滌柱子，最后用4ml 1 XElute Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol 6M尿素pH7.9)洗脫，收集流出液，即為純化蛋白，為了驗(yàn) 證純化蛋白是否是人HMBOXl蛋白，在純化蛋白透析除鹽后，進(jìn)行6XHistidine親和標(biāo)記的 western blot鑒定，并且經(jīng)Q-T0F2質(zhì)譜測(cè)序，有5個(gè)肽段與人HMB0X1蛋白完全一致，證 明所獲得的蛋白序列正確。
4、 重組HMB0X1蛋白的復(fù)性
將步驟3制得的純化蛋白再一次進(jìn)行Ni-NTA瓊脂糖親和吸附，并直接在柱上呈梯度降 低變性劑尿素的濃度，梯度濃度為(IX Binding Buffer溶液)6M尿素2ml、 5.5M尿素lml、 5M尿素lml、 4. 5M尿素lml、 4M尿素lml、 3. 5M尿素lml、 3M尿素lml、 2.5M尿素lml、 2M 尿素lml、 1.5M尿素lml、 lM尿素lml、 0. 5M尿素lml、 0M尿素2ml，然后加入5ml 1 XWash Buffer (0,5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol)洗滌，最后加入4ml 1 X Elute Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脫，收集流出液，為復(fù)性蛋白，即重組人HMBOXl 表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物。復(fù)性蛋白經(jīng)透析除鹽，超濾濃縮，得到濃度為lmg/ml的復(fù)性HMBOXl 蛋白。復(fù)性HMBOXl蛋白經(jīng)非還原SDS-PAGE驗(yàn)證，證明其構(gòu)象恢復(fù)，并且有二聚體形成(如 圖4所示)。5、 抗人HMB0X1多克隆抗體的制備
(1) 新西蘭兔免疫選擇體重2kg以上的健康兔，采用背部皮下多點(diǎn)注射，初次免疫 每只200ug，以后每?jī)芍茏⑸湟淮?，每?00ug，用間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，達(dá)到 1: 1乂104時(shí)，可采血分離血清。
(2) 采血分離血清最后一次加強(qiáng)免疫后的第七天采血。采血前禁食12小時(shí)，但不禁 水。動(dòng)物麻醉固定，從頸動(dòng)脈一次性放血，血液37r放置l小時(shí)，再放4"過(guò)夜，使血清充 分析出。離心取上清，分裝-8(TC保存。
6、 抗人HMB0X1單克隆抗體的制備
(1) 小鼠免疫用復(fù)性的重組人HMB0Xl蛋白免疫8周齡BALB/c小鼠(購(gòu)自中國(guó)上海 斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，首次每只50ug，每間隔兩周免疫一次，每次25yg，腹腔注射， 用間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，達(dá)到1:1X105時(shí)，取免疫小鼠脾細(xì)胞以備融合。
(2) 細(xì)胞融合篩選細(xì)胞融合前復(fù)蘇SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞(購(gòu)自上海麥莎生物科技有 限公司)，保證融合時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并用8-氮鳥嘌呤篩選，保持HGPRT缺陷。融合 前一天取8周齡BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，接種到96孔的孔板上。 一天后取 免疫小鼠脾細(xì)胞與上述培養(yǎng)的SP2/0細(xì)胞混合，加入50M的PEG4000進(jìn)行細(xì)胞融合，加入到 預(yù)先制備好的含有詞養(yǎng)細(xì)胞的96孔的孔板上。培養(yǎng)14天后，觀察融合細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，取培 養(yǎng)上清，用間接ELISA檢測(cè)抗人HMB0X1抗體效價(jià)。對(duì)抗人HMB0X1抗體效價(jià)高的陽(yáng)性孔進(jìn)行 三次單克隆培養(yǎng)，每次用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，直至所有克隆孔均成陽(yáng)性， 一共得到2株針 對(duì)融合HMB0X1蛋白不同抗原表位的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，即2A5F4和4A4F2，抗體亞 型為IgG亞類。
(3) 單克隆抗體的大量制備
將一定量的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射BALB/c小鼠，注射前一周預(yù)先用石蠟油腹腔注射此小 鼠。2-3周后收集小鼠腹水，離心后收集上清，即為含有抗HMB0X1的單克隆抗體。然后進(jìn) 行飽和硫酸銨沉淀和Protein A親和純化。
(4) 單克隆抗體的特異性檢測(cè)
① ELISA:免疫陽(yáng)性血清或雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清能與重組HMB0X1蛋白反應(yīng)，而未免 疫陰性血清不能與重組蛋白反應(yīng)。說(shuō)明多克隆抗體和單克隆抗體特異性針對(duì)重組HMB0X1蛋 白(如圖5所示)。
② Westernblot:分別用重組HMB0X1蛋白和細(xì)胞系蛋白作為檢測(cè)樣品，經(jīng)western blot 鑒定，結(jié)果在47kD左右有一條特異性條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了多克隆抗體和單克隆抗體能夠特 異性結(jié)合重組HMB0X1蛋白，并且可以和天然蛋白特異性結(jié)合，用于western blot鑒定(如 圖6所示)。
③ 免疫組織化學(xué)利用制備的抗體檢測(cè)HEK 293T細(xì)胞(包括經(jīng)SiRNA干擾的HEK 293T 細(xì)胞)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示HMB0X1蛋白在此細(xì)胞中有表達(dá)，而且表達(dá)水平有差異，證明 制備的抗體可與天然構(gòu)象的HMB0X1蛋白結(jié)合，用于免疫組織化學(xué)的檢測(cè)(如圖7所示)。
8SEQUENCE LISTING
<110> 山東大學(xué)
〈120〉重組人HMBOXl表達(dá)載體以及該載體表達(dá)產(chǎn)物及其抗體與應(yīng)用
〈160> 3
<170〉 Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 1348
〈212〉 DNA
<213> 人
〈400〉 1
ggtaccggatattgatccgcctcatgtaaagtatgcttagttcctttccagtggttttgc60
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tgagcaggatg￡LC￡lgta>Cg￡lgccateigtgacc3cc犯geiccccatctcat1200tagctgtgga aatggcagca gtcaeiccaca ctatcttggc attggcccga caaggagcca 1260 acgaaatcaa gacagaggcc ctggatgeitg actgatcagg gaggttaaac atgacaagtt 1320 aacttagttt agacgtagca ccctcgag 1348
〈210〉 2
〈211〉 1282
<212> DNA
〈213〉 人
<400> 2
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<211> 443
〈212〉 PRT
<213〉 人
〈400〉 3 Met Asp lie
Gly lie Asn Ser Asp Pro Met Leu Ser Ser Phe
1
Val
Leu Leu
lie Glu
Lys
Glu
65
Tyr
His 50 His
Gin
35
Glu
Glu
20
lie
5
Thr
Met Ser His
Asp Leu Leu
lie Leu His
Ser Asp Lys Gly Asn Ser
Ala Ser Thr
Ser Tyr
Glu
Arg 145 Ser
Arg
Arg
Ser
Asn 130 Tyr
Asp 115 Asn
Gin 100 Thr
Thr 85 Thr
Phe
70
Asn
Ala
55
Gly
Gin
40
Leu
Tyr
25
Arg
10 Thr
Asp Leu Arg Arg Glu Thr Leu
Glu Pro
Arg Arg Ser
Asn Val Pro
Gin His Ser
Ser Pro Gin
Glu Arg Leu
His Ala Asn
Glu Glu Asp Asp
Arg Arg
Ser
lie 195 lie
Ser 180 Ser
Leu 165 Val
Ser 150 Asp
Ser 135 Met
Pro 120 Thr
Gly 105 Cys
Ala
90
Met
Ser
75
Ser
Asp 60 Tyr
Thr 45 Arg
Arg
30
Gly
Pro Val 15
Phe Thr Met Thr
L>eu Asp Gin Gly Gly
Ser Ser Thr
Ser Pro Ser
Thr Thr Asn
Gly Val Asp Asp lie Lys Glu
Ser Asn Gly Gin Arg
Gin Ala Val
Val 200
Glu 185 Ala
Lys 170 lie
Ser 155 Val
Lys 140 Tyr
Gin 125 Met
Pro 110 Asn
Ser Ser
80 Ala Thr 95
Ser Asn Gly Arg
Ser Pro Thr
Ser Phe
Glu Glu Leu
Lys Ala Phe
Gin Val Thr
Gly 205
Leu 190 lie
Glu Ala 160 Met Arg 175
Ala Asn Ser Gin
Ser His Trp Leu Leu Gin Gin Gly Ser Asp Leu Ser Glu
11Lys Lys Arg Ala
Gin 225
Pro Gly Ala Thr
Pro Glu Trp Arg 260 Arg
Phe 230 Ser
215 Tyr
Met
Leu 245
Gin Thr Pro Pro
Arg Trp Tyr Arg
Pro
220
Gin Leu Glu Lys 235
Pro lie Pro lie
Ala 250
Val Ser Ala Thr
Phe Arg Leu 275
Met Glu Ser
Arg Gly Ser
Ala
Lys 305 Gly
Val 290
Arg Glu Glu lie
Gly Tyr
Pro 265
Phe Thr Trp Arg
Phe 295 Asn
Arg 280
Asn Glu Asn Gin
Lys 285 Pro
Ser 270 Glu
Asp
I>ys Lys Leu Asn Trp Phe
Ala 310
Asp Leu Glu
Ala Cys Asn
Ser 325
Asn Arg Arg Lys
Cys Arg
Tyr 300
Val lie Gin
Ala 340
lie Leu Glu Ser
Glu Ala Ala 355
Ser Asn Ser Asp
Gly
His 370
Asp Ser Thr Ser
His 360 Val
Glu 345 Gly
Val 330 lie
Ala 315
Thr Ser Leu Lys
Lys Asp
Asp Gly Asn
Thr Asn 240 Glu Asp 255
Gly Thr
Cys Leu
Glu Ala
Lys Pro 320 Val Tyr 335
Asn lie
lie
Asp 385
Val Glu Met Ala
Asp 375
Ser Asp His Gin
Arg Arg Ala 350
Val Gin Ser Pro Gly 365
Tyr Ser Glu Gin
His 390
Val Asn His Thr
Asp 380
Pro lie Ser
Ala 405
lie Lys Thr Glu
Asp 395
Leu Ala Leu Ala
Gly Ala Asn Glu 420
Ala Ala Ala Leu Glu His His 435
lie 410
Leu Asp Asp Asp
His 440
Ala 425
His His His
Trp 430
Leu Ala 400 Arg Gin 415
Lys Leu
1權(quán)利要求
1、一種重組人HMBOX1表達(dá)載體，通過(guò)如下步驟構(gòu)建制得(1)從人自然殺傷細(xì)胞系NK92細(xì)胞中擴(kuò)增得到人HMBOX1基因，其序列為SEQ ID NO.1所示；(2)將步驟(1)制得的人HMBOX1基因與pGEM easy T載體連接構(gòu)建成pGEM-HMBOX1；(3)以步驟(2)制得的pGEM-HMBOX1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物時(shí)分別在5’端和3’端設(shè)計(jì)BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，得擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物序列為SEQ ID NO.2所示；(4)將步驟(3)制得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切后與載體pET22b連接，構(gòu)建得到表達(dá)產(chǎn)物C端帶有6×Histidine標(biāo)簽的pET22b-HMBOX1表達(dá)基因載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中，得到重組人HMBOX1表達(dá)載體。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組人HMB0X1表達(dá)載體，其特征在于，上述步驟(3)中，引 物序列如下5，端引物為5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3，， 3，端引物為5， — CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。
3、 如權(quán)利要求1所述的重組人HMB0X1表達(dá)載體，其特征在于，上述步驟(3)中，PCR 反應(yīng)條件為95。C變性60s, 58。C退火60s, 72'C延伸90s,循環(huán)25次。
4、 一種如權(quán)利要求1所述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
5、 一種如權(quán)利要求4所述重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，具體步驟如下(1) 將重組HMBOX1表達(dá)載體接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至ODeo。為 0.4后，加入異丙基硫代半乳糖苷至終濃度lmM，在30'C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，得誘導(dǎo)菌液；(2) 將步驟(1)制得的誘導(dǎo)菌液用Ni-NTA交聯(lián)的瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化，純化后 的HMB0X1蛋白再一次進(jìn)行Ni-NTA交聯(lián)的瓊脂糖親和吸附，并直接在柱上呈梯度降低變性劑 尿素的濃度對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，最后收集復(fù)性蛋白，即為重組人HMBOXl表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物。
6、 如權(quán)利要求5所述的重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的具體步驟如下1) 用蒸餾水浸濕空柱，棄去蒸餾水；2) 吸取2ml NTA-Resin樹脂到空柱中，使其自然沉積，然后拔掉下端塞子，使液體流出；3) 依次用3ml蒸餾水；5ml 1 XCharge Buffer,含有50mMNiSO4; 3ml 1 XBinding Buffer 含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9;過(guò)柱子，力tl載Ni離子；4) 將以6M尿素溶解的包涵體蛋白通過(guò)柱子，流速10ml/h;5) 然后依次用5ml lXBinding Buffer和5ml lXWash Buffer含有0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol 6M尿素pH7.9，洗滌柱子；6) 依次加入梯度尿素lXBinding Buffer溶液；7) 力卩入5mllXWash Buffer含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol,洗滌；8) 加入4ml lXElute Buffer含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol pH7.9，洗脫， 收集流出液，為復(fù)性蛋白，即重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物。
7、 如權(quán)利要求6所述的重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征在于， 所述步驟6)中的尿素的濃度梯度分別為6M尿素2ml 、 5. 5M尿素lml 、 5M尿素lml 、 4. 5M尿素lml 、 4M尿素lml 、 3. 5M尿素lml 、 3M尿素lml、 2. 5M尿素lml、 2M尿素lml、 L5M尿素lml、 1M尿素lml、 0.5M尿素lml、 OM尿素2ml。
8、 一種如權(quán)利要求4所述的重組人HMB0X1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的抗體，通過(guò)如下步驟 制備(1) 用重組人HMB0Xl表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物免疫8周齡BALB/c小鼠，首次每只50ug， 每間隔兩周免疫一次，每次25pg，腹腔注射，用間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，達(dá)到l:l X105時(shí)，取免疫小鼠脾細(xì)胞，備用；(2) 復(fù)蘇SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞，保證融合時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并用8-氮鳥嘌呤篩 選，保持HGPRT缺陷，得備用骨髓瘤細(xì)胞；(3) 取8周齡BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，接種到96孔的孔板上，靜置 24小時(shí)，備用；(4) 取步驟(1)制得的免疫小鼠脾細(xì)胞與步驟(2)制得的備用骨髓瘤細(xì)胞混合，加 入50y。的PEG4000進(jìn)行細(xì)胞融合，然后加入到步驟(3)制備好的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔的孔 板上，培養(yǎng)10-14天后，取培養(yǎng)上清，用間接ELISA檢測(cè)抗人HMB0X1抗體效價(jià)，對(duì)抗人HMB0X1 抗體效價(jià)高的陽(yáng)性孔進(jìn)行三次單克隆培養(yǎng)，直至所有克隆孔均成陽(yáng)性，得單克隆抗體雜交瘤 細(xì)胞溶液，該單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞溶液每毫升含有1乂106個(gè)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞；(5) 先用石蠟油腹腔注射BALB/c小鼠，飼養(yǎng)一周，得備用小鼠；(6) 取步驟(4)制得的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞溶液0.5ml，腹腔注射步驟(5)制得的 備用小鼠，2-3周后收集小鼠腹水，12000r/min離心20niin后收集上清，即為含有抗HMB0X1 的單克隆抗體，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨沉淀和Protein A親和純化后，得到重組人HMB0X1表達(dá)載 體的表達(dá)產(chǎn)物的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人HMBOX1表達(dá)載體以及該載體表達(dá)產(chǎn)物及其抗體與應(yīng)用，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明詳細(xì)闡述了人HMBOX1表達(dá)載體的構(gòu)建、HMBOX1表達(dá)產(chǎn)物的制備及、HMBOX1表達(dá)產(chǎn)物的抗體的制備，可以進(jìn)一步了解HMBOX1的生化性質(zhì)和特點(diǎn)，深入研究HMBOX1的蛋白三級(jí)構(gòu)象。利用重組人HMBOX1表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物制備的抗人HMBOX1蛋白抗體不僅可以用于研究人HMBOX1蛋白在人體各組織中的表達(dá)情況，還可以對(duì)HMBOX1在疾病中的差異表達(dá)作進(jìn)一步分析。另外，此抗體可應(yīng)用于HMBOX1在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的機(jī)制研究，闡明HMBOX1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)以及和其它轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101555484SQ200910015258
公開日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者建 張, 軍 戴, 田志剛 申請(qǐng)人:山東大學(xué)