專利名稱：：一種連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵獲取脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用連續(xù)發(fā)酵獲半連續(xù)發(fā)酵獲取脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
：地爾硫卓是一種鈣離子通道阻滯劑，被廣泛應(yīng)用于心絞痛和高血壓的長期治療。采用脂肪酶拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，不需要的(+)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯被脂肪酶選擇性地水解，(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯被保留下來，可用于合成(+)-地爾硫卓。脂肪酶是生產(chǎn)(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的關(guān)鍵。利用沙雷氏桿菌wa/re^mECm010(保藏號CGMCCNo.1219)所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行手性拆分，產(chǎn)品光學(xué)純度能達(dá)到99%ee以上。文獻(xiàn)J.Ind.MicrobiolBiotechnol2004,31:525-530報(bào)道了通過分批發(fā)酵獲取脂肪酶的方法。通過培養(yǎng)基、溶氧、誘導(dǎo)劑優(yōu)化，5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵，脂肪酶酶活達(dá)到11060U/L。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于，通過連續(xù)發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵方式獲得脂肪酶，縮短輔助操作時(shí)間、提高生產(chǎn)強(qiáng)度。本發(fā)明通過下列方案實(shí)現(xiàn)(1)用沙雷氏桿菌&rnrf,'"w"rc"'ceraECU1010(保藏號CGMCCNo.1219)作為發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶菌種。(2)發(fā)酵過程由種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶兩部分組成，需要種子罐和發(fā)酵罐。(3)進(jìn)種子罐前，經(jīng)過斜面種子培養(yǎng)和搖瓶種子培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖5-20，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，食鹽5-10，pH7.5。將菌種轉(zhuǎn)接于斜面上，20-40。C培養(yǎng)20-48h。搖瓶培養(yǎng)基(g/L):糊精5-20，吐溫-800-15，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，KH2P042-5，(NH4)2S042-5，食鹽5-10，MgSO40-2，F(xiàn)eS04'7H200-0.1，CaCl20-0.5。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。500ml三角瓶裝液量50-150ml，接l環(huán)菌至三角瓶中，204(TC培養(yǎng)8-24h。種子罐培養(yǎng)基同搖瓶培養(yǎng)基。接種量1-10%，2535°C，0.52vvm，培養(yǎng)12-24hr。當(dāng)發(fā)酵液濁度OD咖達(dá)到0.650時(shí)，按停留時(shí)間l3h，邊進(jìn)料，邊排出成熟的種子進(jìn)入發(fā)酵罐。所用培養(yǎng)基同搖瓶培養(yǎng)基。4種子液進(jìn)入發(fā)酵罐后，流加10-30g/L濃度的吐溫-80。此時(shí)即進(jìn)入發(fā)酵產(chǎn)酶階段。發(fā)酵液中吐溫濃度1-15g/L，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)脂肪酶。(4)采用連續(xù)發(fā)酵方式時(shí)，種子罐流加發(fā)酵培養(yǎng)基，第一個(gè)發(fā)酵罐流加吐溫-80。采用罐頂進(jìn)料、罐底出料的方式進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝料系數(shù)始終維持在60-80%。發(fā)酵液依次流過每個(gè)發(fā)酵罐直至出料。種子罐壓力維持在O.lMPa，第一個(gè)發(fā)酵罐壓力維持在0.07-0.08MPa，之后每個(gè)發(fā)酵罐壓力降低O.OlMPa。出料時(shí)，脂肪酶活5000-12000U/L。生產(chǎn)強(qiáng)度500-]200U/L.h。連續(xù)發(fā)酵時(shí)，種子罐、發(fā)酵罐時(shí)刻有料液。發(fā)酵液僅從最后一個(gè)發(fā)酵罐流出。發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐僅在第一次使用前空消滅菌；連續(xù)發(fā)酵過程，發(fā)酵罐不再空消滅菌。(5)卡連續(xù)培養(yǎng)獲取脂肪酶時(shí)，發(fā)酵罐并聯(lián)。種子液進(jìn)入一個(gè)發(fā)酵罐后，連續(xù)流加誘導(dǎo)劑吐溫-80、誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生脂肪酶。發(fā)酵罐液位達(dá)到6080%時(shí)，將種子液引入另一個(gè)發(fā)酵罐，連續(xù)流加誘導(dǎo)劑。如此不斷循環(huán)。種子罐壓力維持在O.lMPa，所有并聯(lián)發(fā)酵罐壓力均維持在0.070.08MPa。出料時(shí)，脂肪酶活5000-12000U/L。生產(chǎn)強(qiáng)度800-2000U/L七。半連續(xù)發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液可以從任一發(fā)酵罐流出。過程中維持正壓操作，發(fā)酵罐在第一次使用前需要空消滅菌，之后可不再滅菌。具體實(shí)施方式實(shí)施例h用沙雷氏桿菌5Wr""flwwm.vc饑s'ECU1010(保藏號CGMCCNo.l219)作為發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶菌種。斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖10，蛋白胨10,牛肉膏10，食鹽5，pH7.5。將菌種轉(zhuǎn)接于斜面上，3CTC培養(yǎng)48hr。搖瓶培養(yǎng)基(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨10，牛肉膏10，KH2P042，(NH4)7S042，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)cS04'7H200.01，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。500ml三角瓶裝液量50ml，接l環(huán)菌至三角瓶中，3CTC培養(yǎng)12hr。種子罐培養(yǎng)基(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨10，牛肉膏10，KH2P042，(NH4)2S042，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)eS047H200.01，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。接種量5%,30°C,lvvm,250rZmin，培養(yǎng)8hr。當(dāng)發(fā)酵液濁度OD6W)達(dá)到0.650時(shí)，連續(xù)流加培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨10，牛肉膏10，KIIP042，(NH4)2S()42，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO4'7H2O0.01，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH至7.5。使用1個(gè)5L種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，液位控制在80%。培養(yǎng)基進(jìn)料速度為2L/'h，種子出料速度為2L/h。停留時(shí)間控制在2h。流加時(shí)，溫度3(TC，通氣量lwm,攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.1MPa。流出的種子液直接進(jìn)入發(fā)酵罐。使用3個(gè)5L發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶。發(fā)酵罐底和下一個(gè)發(fā)酵罐頂通過管道相連通，每個(gè)發(fā)酵罐液位控制在80%。種子罐流出的種子液進(jìn)入第一個(gè)發(fā)酵罐的同時(shí)，連續(xù)補(bǔ)入30g/L吐溫-80，使發(fā)酵液中吐溫-80含量達(dá)到2g/L。第一個(gè)發(fā)酵罐溫度30°C，通氣量1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.08MPa。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)發(fā)酵罐液位達(dá)到80%，將正在培養(yǎng)的發(fā)酵液通過管道轉(zhuǎn)入第二個(gè)發(fā)酵罐，流速2.1L/h。第二個(gè)發(fā)酵罐溫度30。C，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.07MPa。當(dāng)?shù)诙€(gè)發(fā)酵罐液位達(dá)到80%，將正在培養(yǎng)的發(fā)酵液通過管道轉(zhuǎn)入第三個(gè)發(fā)酵罐，流速2.1L/h。第三個(gè)發(fā)酵罐溫度3(TC，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.06MPa。當(dāng)?shù)谌齻€(gè)發(fā)酵罐液位達(dá)到80%，發(fā)酵結(jié)束，脂肪酶活8000U/L。控制出料速度2.1L/h。料液收集后可用于制備固定化脂肪酶。連續(xù)發(fā)酵過程中，產(chǎn)酶情況如下表所示(以出料作為Oh):<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2:用沙雷氏桿菌,化/ra"aw^r"araECU1010(保藏號CGMCCNo.1219)作為發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶菌種。斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，食鹽5，pH7.5。將菌種轉(zhuǎn)接于斜面上，30。C培養(yǎng)48hr。搖瓶培養(yǎng)基(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨10，牛肉膏10，KHP042，(NH4)2S042，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)eS04'7H200.01，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。500ml三角瓶裝液量50ml，接l環(huán)菌至三角瓶中，3CTC培養(yǎng)12h。種亍罐培養(yǎng)基(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨IO，牛肉膏10，KH2PO42，(NH4)2S042，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO4'7H2O0.0I，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。接種量5%，30°C，lvvm，250r/min，培養(yǎng)8hr。當(dāng)發(fā)酵液濁度OD6Q。達(dá)到0.650時(shí)，連續(xù)流加培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成(g/L):糊精5，吐溫-8010，蛋白胨10，牛肉膏10，KH2P042，(NH4)2S042，食鹽5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO4'7H2O0.01，CaCl20.1。氫氧化鈉調(diào)pH7.5。使用1個(gè)5L種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，液位控制在80%。培養(yǎng)基進(jìn)料速度為2L/h，種子出料速度為2L/h。停留時(shí)間控制在2h。流加時(shí)，溫度3(TC，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/nrin，罐壓0.1MPa。流出的種子液直接進(jìn)入發(fā)酵罐。使用4個(gè)5L發(fā)酵罐進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶，通過管道實(shí)現(xiàn)4個(gè)發(fā)酵罐并聯(lián)。種子罐流出的種子液進(jìn)入第一個(gè)發(fā)酵罐的同時(shí)，連續(xù)補(bǔ)入30g/L吐溫-80，使發(fā)酵液中吐溫-80含量達(dá)至U2g/L。第一個(gè)發(fā)酵罐溫度30°C，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.08MPa。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)發(fā)酵罐液位達(dá)到80%，將種子液通過管道切換入第二個(gè)發(fā)酵罐，流速仍保持2L/h。種子液進(jìn)入第二個(gè)發(fā)酵罐后，連續(xù)補(bǔ)入30g/L吐溫-80，使發(fā)酵液中吐溫-80含量達(dá)到2g/L。第二個(gè)發(fā)酵罐溫度3(TC，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.08MPa。依次操作，直至第三個(gè)、第四個(gè)發(fā)酵罐液位達(dá)到80%。發(fā)酵過程中，控制溫度30'C，通氣量1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，罐壓0.08MPa。在進(jìn)行第四個(gè)發(fā)酵罐操作時(shí)，第一個(gè)發(fā)酵罐產(chǎn)酶8000U/L，發(fā)酵結(jié)束。丌底閥，出料。過程中，通空氣維持罐壓0.08MPa。料液排空后，第一個(gè)發(fā)酵罐仍維持0.08MPa的罐壓，不淸洗、不空消。當(dāng)?shù)谒膫€(gè)發(fā)酵罐操作結(jié)束，將種子液切換第一個(gè)發(fā)酵罐。重新開始發(fā)酵產(chǎn)酶。連續(xù)發(fā)酵過程中，產(chǎn)酶情況如下表所示操作批次發(fā)酵罐產(chǎn)酶(U/L)生產(chǎn)強(qiáng)度(U/L-h)1#9000■2#92009203#Q5009504#10000畫1#10400104022#1050010503#92009204#900090031#1005010057<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵獲取脂肪酶的方法。2、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，菌種為沙雷氏桿菌S^mriflwawescewECU1010(保藏號CGMCCNo.1219)。3、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，采用連續(xù)發(fā)酵方式或半連續(xù)發(fā)酵方式培養(yǎng)沙雷氏桿菌獲取脂肪酶，設(shè)備可分為種子罐、發(fā)酵罐。4、如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，整個(gè)過程可分為種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。(1)斜面種子培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖5-20，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，食鹽5-10，pH7.5。將菌種轉(zhuǎn)接于斜面上，20-4(TC培養(yǎng)20-48h。(2)搖瓶種子培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)基(g/L):糊精5-20，吐溫-800-15,蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，KH2P042-5，(NH4)2S042-5，食鹽5-10，MgSO40-2，F(xiàn)eS04.7H200-0.1，CaCl20-0.5。以氫氧化鈉調(diào)pH7.5。500ml三角瓶裝液量50-150ml，接1環(huán)菌種至三角瓶中，20-40'C培養(yǎng)12-24h。(3)種子罐培養(yǎng)。發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基同搖瓶培養(yǎng)基。接種量1-10%，25-35°C，0.5-2.0wm，培養(yǎng)8-24h。當(dāng)發(fā)酵液濁度OD6co達(dá)到0.650時(shí)，按停留時(shí)間1-3h，邊進(jìn)料，邊排出成熟的種子液進(jìn)入發(fā)酵罐。所用培養(yǎng)基同搖瓶培養(yǎng)基。(4)發(fā)酵罐產(chǎn)酶。當(dāng)種子液進(jìn)入發(fā)酵罐后，開始流加10-30g/L濃度的吐溫-80，使發(fā)酵液中吐溫濃度達(dá)到l-15g/L，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)脂肪酶。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，可以采用l-6個(gè)發(fā)酵罐串聯(lián)進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，也可以采用1-6個(gè)發(fā)酵罐并聯(lián)進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵。6、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，采用連續(xù)發(fā)酵方式時(shí)，種子罐流加發(fā)酵培養(yǎng)基，第一個(gè)發(fā)酵罐流加吐溫-80。采用罐頂進(jìn)料、罐底出料的方式進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝料系數(shù)始終維持在60-80%。發(fā)酵液依次流過每個(gè)發(fā)酵罐直至出料。種子罐壓力維持在0.1MPa，第一個(gè)發(fā)酵罐壓力維持在0.07-0.08MPa，之后每個(gè)發(fā)酵罐壓力遞降0.01MPa。出料時(shí)，脂肪酶活5000-12000U/L。連續(xù)發(fā)酵時(shí)，種子罐、發(fā)酵罐時(shí)刻有料液。發(fā)酵液僅從最后一個(gè)發(fā)酵罐流出。發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐僅在第一次使用前空消滅菌；連續(xù)發(fā)酵過程，發(fā)酵罐不再空消滅菌。7、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，采用半連續(xù)發(fā)酵方式時(shí)，發(fā)酵罐之間并聯(lián)，沒有連接。種子罐流加發(fā)酵培養(yǎng)基，第一個(gè)發(fā)酵罐流加吐溫-80。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)發(fā)酵罐裝液量達(dá)到60-80%時(shí)，切換管道，將種子液轉(zhuǎn)向第二個(gè)發(fā)酵罐，第一個(gè)發(fā)酵罐自然發(fā)酵結(jié)束。如此不斷循環(huán)。種子罐壓力維持在0.1MPa，所有并聯(lián)發(fā)酵罐壓力均維持在0.07-0.08MPa。出料時(shí)，脂肪酶活5000-12000U/L。半連續(xù)發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液可以從任一發(fā)酵罐流出。過程中維持正壓操作，發(fā)酵罐在第一次使用前需要空消滅菌，之后可不再滅菌。全文摘要本發(fā)明涉及一種連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵獲取脂肪酶的方法。采用本方法，可以通過連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)獲得含有脂肪酶的發(fā)酵液。本發(fā)明所用方法節(jié)約了洗罐、滅菌等輔助操作時(shí)間，具有生產(chǎn)強(qiáng)度高、易自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12N9/18GK101580823SQ200910025660公開日2009年11月18日申請日期2009年3月5日優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日發(fā)明者朱偉杰,朱月珍,陸幫榮,陸雅臣申請人:江蘇華榮生物科技有限公司