專利名稱：：一種假單胞菌酯酶及其用于制備光學純扁桃酸及其衍生物的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一株假單胞菌以及利用該菌株所產(chǎn)酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸對映選擇性水解(脫乙?；?生產(chǎn)光學扁桃酸或其衍生物的用途。
背景技術：
：扁桃酸(a-羥基苯乙酌是一種重要的化工和制藥中間體，其中光學純的扁桃酸具有獨特的生理功能，在制藥工業(yè)中主要被用作關鍵的手性砌塊，(5)-扁桃酸可以合成治療尿失禁的藥物，(i)-扁桃酸可以用于合成e-內(nèi)酰胺阻斷劑。光學純的扁桃酸也是常用的手性化合物拆分試劑，具有非常重要的商業(yè)價值和廣闊的應用前景。所以，如何獲得純的扁桃酸單一對映體就成為人們所關注和研究的重要課題。目前制備光學純扁桃酸的方法主要分為物理法、化學法和生物法。物理方法主要是利用色譜法結(jié)合光學衍生物拆分扁桃酸，代價高，處理量小，其工業(yè)應用價值不大?；瘜W方法主要是用其它手性試劑拆分(例如UnitedStatesPatent4,260,815)和酸堿拆分(UnitedStatesPatent4,259,521)，不僅步驟多、過程繁瑣，產(chǎn)品的得率和光學純度也不能令人滿意。生物法的應用較為廣泛，常見的有利用氧化酶直接拆分扁桃酸外消旋體(Tetrahedron:Asymmetry,2005，16:2113-2117)，利用還原酶不對稱還原苯甲酰甲酸(UnitedStatesPatent6,777,224)，利用單加氧酶催化苯乙酸的直接羥化反應(Tetrahedron:Asymmetry,2007,18:2537-2540)，利用腈基水解酶催化扁桃腈水解反應(UnitedStatesPatent5，296,373)和利用酯水解酶催化水解扁桃酸的酯化產(chǎn)物，例如扁桃酸甲酯和扁桃酸乙酯(EnzymeMicrobialTechnology,2006，39:930-935)等方法。但至今尚未見有利用酯水解酶催化扁桃酸的2-羥基乙?；a(chǎn)物水解而制備光學純扁桃酸的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于，提供一種能夠生產(chǎn)(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸的的假單胞菌;本發(fā)明目的之二在于，提供利用上述的假單胞菌生產(chǎn)(S)-扁桃酸及(i)-扁桃酸的用途。本發(fā)明人從土壤中經(jīng)過篩選和分離，得到一株能夠選擇性催化2-乙酰氧基苯乙酸對映選擇性水解生產(chǎn)(5)-扁桃酸及(i)-扁桃酸的假單胞菌/^/^owomwsp.ECU1011，該菌株已于2009年1月13日保藏在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC),保藏號為CGMCCNo.2872。本發(fā)明的菌株具有如下微生物學特征1.微觀形態(tài)特征球狀，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性，大小約為2pmX3阿。2.平板固體培養(yǎng)基上的菌落特征(3(TC培養(yǎng)24h):圓形，邊緣整齊；低凸面；乳白色。3.生長環(huán)境可在溫度1050'C生長，在pH5-9，鹽濃度07。/。(w/v)的條件下生存。本發(fā)明的菌株i^ew由wo"assp.ECU1011(保藏號CGMCC2872)主要用于對映選擇性水解2-乙酰氧基苯乙酸以得到(S)-扁桃酸及(i)-扁桃酸，其主要操作步驟如下將CGMCC2872菌株接種至豐富培養(yǎng)基，接種量為1~10%(v/v)，在2040'C(優(yōu)選2535。C)狀態(tài)下培養(yǎng)l3天，離心洗滌之后得到菌體。其中豐富培養(yǎng)基的組成為甘油15g，蛋白胨5g，酵母膏5g，NaCllg，MgS040.2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，自來水1000ml，將pH值調(diào)節(jié)為7.0，經(jīng)121。C滅菌20分鐘。將搖瓶培養(yǎng)得到的菌體加入到含有底物的緩沖溶液中，催化底物的對映選擇性水解，分離得到(5)-扁桃酸及剩余的(i)-2-乙酰氧基苯乙酸，其中(及)-2-乙酰氧基苯乙酸經(jīng)由化學方法水解并且重結(jié)晶后，可得到(i)-扁桃酸。此生物催化拆分過程的菌體濃度為10200g/1，底物濃度為10100mM，反應溫度為2045'C，pH5.0~9.5，反應時間為0.524h。底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值("p)采用液相色譜分析，分析條件為手性OD-H柱(ChiralcefOD-H柱，cp4.6mmx250mm，日本Daicel公司出品)；流動相正己烷/異丙醇/三氟乙酸(94:6:0.2,v/v)，流速為lml/min;紫外檢測器，波長228nm;柱溫25'C。出峰時間(/)-扁桃酸，20.5min;(5)-扁桃酸，18.4min;(及)-2-乙酰氧基苯乙酸，13.9min;(5)-2-乙酰氧基苯乙酸，12.6min。上述緩沖溶液可以是pH為5.09.5的磷酸鹽、檸檬酸鹽或甘氨酸一NaOH緩沖液。上述底物的最佳選擇是2-乙酰氧基苯乙酸，也可以是2-乙酰氧基-2，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基-3，-氯苯乙酸和或2-乙酰氧基-4，-氯苯乙酸。本發(fā)明所設計的酶促拆分的產(chǎn)物(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸的光學純度高，對映體過量值^)可以達到98.1%和>99%，轉(zhuǎn)化率接近50%的理論最大轉(zhuǎn)化率；催化劑穩(wěn)定性良好，具有廣泛的工業(yè)應用前景。下面通過具體的實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的闡述。實施方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術內(nèi)容做進一步描述，其目的在于更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，而非限制本發(fā)明的保護范圍。實施例l菌株CGMCC2872的培養(yǎng)將菌株CGMCC2872接種到含有豐富培養(yǎng)基的種子液中，在30'C，180rpm下培養(yǎng)12小時；其中豐富培養(yǎng)基組成為甘油15g，蛋白胨5g，酵母膏5g，NaCllg,MgS040.2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，自來水1000ml，調(diào)節(jié)pH值為7.0。將種子液接種至豐富培養(yǎng)基中，接種量為5。/。v/v,在30'C、180rpm下培養(yǎng)18小時。培養(yǎng)結(jié)束后，于IO，OOOrpm離心得到含酶菌體。實施例2不同候選菌株對于乙酰氧基苯乙酸的水解按照實施例1所述方法得到不同候選菌株的濕菌體用濃度為0.85%w/v的生理鹽水洗漆3次，按照lg濕菌體對10ml反應液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸濃度為20mmol/L的pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，在30'C，180rpm條件下反應12小時后加入0.1。/Dv/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，振蕩萃取l分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，以液相色譜儀檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表l候選菌株的催化性能比較微生物菌株反應時間(h)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)ECUlOll1898.145.5ECU10121290.447.3ECU10131293.534.5ECU10141288.946.4ECU10151291.850.5ECU10161693.749.0ECU10171297.644.4ECU10181286.430.2表1結(jié)果說明從土壤中篩選的這8株菌均具有很高的對映選擇性催化活性，其中ECUlOll(保藏號CGMCC2872)在底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度方面效果較好。實施例3不同底物濃度對CGMCC2872反應特性的影響按照實施例1所述方法培養(yǎng)得到CGMCC2872的濕菌體，用濃度為0.85%w/v的生理鹽水洗滌3次，按照lg濕菌體對10ml反應液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸濃度分別為5、10、20、40、60和100mmol/L的pH7.0磷酸鹽緩沖溶液中，在30'C，180rpm條件下反應一定的時間，確認反應完全后，加入0.1。/。v/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，震蕩1分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，用液相色譜儀檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表2不同的底物濃度對CGMCC2872反應特性的影響底物濃度(mmol/L)反應時間(h)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)5498.147.510698.048.3620898.045.5401298.147.4601697.249.61004895.520.8表2結(jié)果顯示，在0-60mmol/L范圍內(nèi)的不同底物濃度下，CGMCC2872能夠始終達到良好的反應速率和產(chǎn)物光學純度。當?shù)孜餄舛仍?00mmol/L附近時，菌株CGMCC2872由于受到高濃度酸性底物的影響，菌體活力有所下降，反應速率有所減慢，可以通過增加菌體濃度或酶的活力來解決。實施例4不同溫度對CGMCC2872反應特性的影響按照實施例1所述方法培養(yǎng)得到的CGMCC2872濕菌體，用濃度為0.85%w/v的生理鹽水洗滌3次，按照lg濕菌體對應10ml反應液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸濃度為20mmol/L的pH7.0磷酸鹽緩沖溶液中，分別在20、25、30、35、40、45和50'C，180rpm條件下反應2小時，確認反應完全后，加入0.1%(v/v)的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，震蕩1分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，以液相色譜儀檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表3不同溫度對CGMCC2872反應性能的影響反應溫度('C)反應時間(h)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)25298.212.330298.019,135298.026.340298.136.045292.437.550269.550.4表3結(jié)果顯示，在溫度低于30'C的時候反應速率較慢，在3040'C下可以達到較好的反應效果，在40'C以上的溫度下雖然反應速度更快，但是產(chǎn)物的光學純度下降較多，主要是因為在較高的溫度下底物的自發(fā)水解反應比較嚴重，無選擇性的自發(fā)水解導致了產(chǎn)物光學純度的下降。實施例5不同pH對CGMCC2872反應性能的影響按照實施例1所述方法得到CGMCC2872濕菌體用濃度為0.85%w/v生理鹽水洗滌3次，按照lg濕菌體加入10ml反應液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸濃度為20mmol/L的pH5.0的檸檬酸鹽緩沖溶液、pH6.0、6.5、7.0和8.0的磷酸鹽緩沖溶液以及pH9.0的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖溶液中，分別在30'C，180rpm條件下反應2小時左右，確定反應完全后加入0.1%v/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，振蕩萃取l分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，以液相色譜檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表4不同pH對CGMCC2872反應性能的影響pH反應時間(h)eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)5.0297.14.76.0298.022.76.5298.019.57.0298.118.38.0296.410.69.0266.93.1表4結(jié)果表明，在pH6.07.0的弱酸性范圍內(nèi)，反應可以達到較好的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學純度。在pH6.0以下，反應速度下降；在pH7.0以上，反應速度和產(chǎn)物的光學純度都有所下降。說明在酸性和堿性環(huán)境下菌體的酶活力有所下降，在堿性環(huán)境下底物的無選擇性自發(fā)水解明顯加劇，影響了產(chǎn)物的光學純度。實施例6菌株CGMCC2872對扁桃酸衍生物的水解反應結(jié)果按照實施例1所述方法得到的CGMCC2872濕菌體用濃度為0.85%w/v生理鹽水洗滌3次，按照lg濕菌體對10ml反應液的比例，加入到分別含有20mmol/L2-乙酰氧基苯乙酸、2-乙酰氧基2，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基3，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基4'-氯苯乙酸、扁桃酸甲酯和扁桃酸乙酯的pH7.0磷酸鹽緩沖溶液中，分別在3(TC，180rpm條件下反應12小時左右，確認定反應完全后，加入0.1%v/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，振蕩萃取l分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，以液相色譜儀檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表5菌株CGMCC2872對扁桃酸及其衍生物的水解拆分反應結(jié)果底物產(chǎn)物構型eep(%)轉(zhuǎn)化率(％)HPLC檢測用柱2-乙酰氧基苯乙酸98.145.7ChiralcelOD-H2-乙酰氧基-2，-氯苯乙酸97.244.2Chiralcel②AD-H2-乙酰氧基-3'-氯苯乙酸97.140.2Chiralcel②OD-H2-乙酰氧基-4，-氯苯乙酸97.550.7ChiralcelOD-H扁桃酸甲酯42.123.6Chiralcel⑧OD-H扁桃酸乙酯39.556.7Chiralcel頃AD-H表5結(jié)果表明，對于可以歸屬于扁桃酸及其衍生物的乙?；a(chǎn)物的底物，假單胞菌株CGMCC2872對它們的催化水解反應都具有對映體選擇性。對于扁桃酸的酯化產(chǎn)物，則菌株CGMCC2872對其催化水解的選擇性不甚理想。實施例7添加有機溶劑對菌株CGMCC2872催化反應性能的影響按照實施例1所述方法得到的CGMCC2872濕菌體，用濃度為0.85%w/v的生理鹽水洗滌3次，按照lg濕菌體對應10ml反應液的比例，加入到乙酰氧基苯乙酸濃度為20mmol/L的pH7.0磷酸鹽緩沖溶液中，分別加入體積含量為5%8種有機溶劑1)9DMSO,2)DMF,3)MeOH,4)EtOH,5)1-PrOH,6)2國PrOH,7)Glycol,或8)EtOAc,在30°C，180rpm條件下反應12小時，確定反應完全后加入0.1%v/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉和乙酸乙酯，振蕩萃取l分鐘，離心取上清液，加入無水硫酸鈉靜置過夜，以液相色譜儀檢測反應的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學純度。表6添加有機溶劑對菌株CGMCC2872反應性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6結(jié)果顯示，添加有機溶劑對此反應的選擇性及反應速率并無明顯促進作用。實施例8利用CGMCC2872菌體制備光學純(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸按照實施例l中所述方法，在lL豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到CGMCC2872濕菌體10g,加入100ml乙酰氧基苯乙酸濃度為20mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，30'C，180rpm條件下反應12小時，反應結(jié)束后加入0.1%v/v的濃硫酸終止反應。加入氯化鈉去除乳化，用60ml乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)萃取液得到黃色液態(tài)的產(chǎn)物與底物混合物。用少量乙酸乙酯溶解后通過硅膠柱層析進行分離，流動相為乙酸乙酯:石油醚:甲酸=10:1:0.2^/力，將分離后的底物和產(chǎn)物分別加入無水硫酸鈉過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到(5)-扁桃酸和(及)-乙酰氧基苯乙酸，前者為白色晶體，后者為黃色液體，久置后為淡黃色晶體。將(及)-乙酰氧基苯乙酸溶解于濃度為5%的稀氨水中，50°C,180rpm條件下反應12小時得到(及)-扁桃酸溶液，加濃硫酸調(diào)pH到l之后加入乙酸乙酯萃取，重結(jié)晶后得到(i)-扁桃酸晶體。最終得到(5)-扁桃酸的光學純度為98.1。/。ee,得率為20.4%;(及)-扁桃酸的光學純度>99%ee,得率為17.3%。權利要求1.一種產(chǎn)酯酶的假單胞菌Pseudomonassp.ECU1011，保藏號為CGMCCNo.2872。2.—種以權利要求1所述的假單胞菌生產(chǎn)光學純扁桃酸及其衍生物的用途，其特征在于催化外消旋的2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物生產(chǎn)(5)-扁桃酸或其衍生物。3.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于將權利要求1所述的假單胞菌尸w^to/nomwsp.ECU1011進行發(fā)酵培養(yǎng)，以培養(yǎng)后的整體細胞作為催化劑，在磷酸鹽緩沖液中，催化外消旋的2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物的對映選擇性水解反應，然后從反應混合物中收集水解的產(chǎn)物(5)-扁桃酸或其衍生物，以及殘余的底物(及)-2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物。4.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的殘留的(及)-2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物再進行化學水解和重結(jié)晶，再得到(i)-扁桃酸或其衍生物。5.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細菌發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下甘油10~80g/L，蛋白胨1~20g/L，酵母膏1~20g/L，NaCl0.1~3g/L,MgS040.1~3g/L，KH2PO40.1~3g/L。6.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為pH5~9，溫度15~40°C，相對于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為l~10%v/v，培養(yǎng)時間為12-48h。7.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于所述的水解反應所用的緩沖液為磷酸鹽、檸檬酸鹽或者甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液。8.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的底物為羥基被酰化的扁桃酸或其衍生物。9.根據(jù)權利要求3或8所述的用途，其特征在于，所述的底物濃度為10~100mM，反應溫度為20~50°C，反應時間為l24h。全文摘要本發(fā)明公開了一株產(chǎn)酯酶的假單胞菌以及使用該菌所產(chǎn)的酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物的對映選擇性水解，制備(S)-扁桃酸、(R)-扁桃酸或其衍生物的用途。所述的酯酶為利用土壤分離菌—假單胞菌Pseudomonassp.ECU1011(保藏號為CGMCCNo.2872)培養(yǎng)所得的菌體。采用本發(fā)明公開的假單胞菌酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸的對映選擇性水解生產(chǎn)(S-扁桃酸及(R)-扁桃酸的工藝新穎，反應條件溫和，產(chǎn)物和底物的對映體純度高，對映體過量值(ee)分別為98.1％和＞99％。該生物催化劑的底物譜廣泛，可用于多種扁桃酸衍生物的手性拆分，具有很好的工業(yè)應用前景。文檔編號C12R1/38GK101538542SQ200910049768公開日2009年9月23日申請日期2009年4月22日優(yōu)先權日2009年4月22日發(fā)明者江潘,許建和,鑫鞠申請人:華東理工大學