專利名稱：結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，尤其涉及一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體；此外， 本發(fā)明還涉及該結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，是目前單一傳染性細(xì) 菌致人死亡的主要因素。近年來，隨著艾滋病的流行、多種惡性腫瘤患者的增多以及多重抗 藥性菌株的出現(xiàn)，更是增加了結(jié)核菌感染癥防治上的困難。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界有結(jié)核病 菌感染者20億(占總?cè)丝?1/3)，每秒鐘感染一人，全球結(jié)核病菌每年新感染800萬人，如 果不立即采取防擴(kuò)散措施，結(jié)核病將在今后10年內(nèi)奪去3000多萬人的生命。我國全國結(jié) 核病感染者3. 3億，結(jié)核病人600萬，每年因結(jié)核病死亡的病人高達(dá)25萬，為各類傳染病死 亡總和的兩倍，因此我國已將結(jié)核病由丙類傳染病升為乙類傳染病，列入嚴(yán)格管理范疇。據(jù) WHO統(tǒng)計(jì)，全世界每年有5千萬至一億人感染結(jié)核，約三百萬人死于結(jié)核病，其中80%以上 在發(fā)展中國家。因此，如何快速盡早地診斷并治療成為控制結(jié)核病擴(kuò)散和傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，肺結(jié)核的診斷除了一般胸部X光檢查外，主要是靠取痰液檢查，包括抗酸桿 菌痰涂片染色鏡檢與結(jié)核桿菌培養(yǎng)，結(jié)核桿菌的細(xì)菌學(xué)檢查是確診肺結(jié)核的重要依據(jù)?？?酸桿菌涂片檢查敏感性低，特異性差，并且無法確定細(xì)菌死活。結(jié)核桿菌培養(yǎng)通常是將待檢 標(biāo)本接種至改良的羅氏培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 60天，待細(xì)菌生長(zhǎng)后再依據(jù)生物學(xué)特征及生 化反應(yīng)多項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷。由于結(jié)核菌的菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，富脂質(zhì)，疏水性，使得肺結(jié)核桿菌 生長(zhǎng)速度緩慢，每隔十二 二十四小時(shí)才分裂一次。所以，利用培養(yǎng)方法來偵測(cè)結(jié)核菌的存 在，往往需要三 八周的時(shí)間才可以得到結(jié)果，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且操作繁瑣，無法滿足快速 確診肺結(jié)核的需要，經(jīng)常延誤治療的時(shí)機(jī)且敏感性不高(陽性率不過40%左右)。最近幾年，噬菌體快速擴(kuò)增法利用恥垢分枝桿菌的快速生長(zhǎng)特性以及D29噬菌體 的相對(duì)專一性，進(jìn)行結(jié)核桿菌的快速檢測(cè)。該方法的核心內(nèi)容是a.用樣品處理液室溫處理待檢樣品30分鐘，離心去上清；b.用增菌液37°C增菌24小時(shí)；c.加入D29分枝桿菌噬菌體37°C溫育1小時(shí)，感染結(jié)核桿菌菌體；d.用中止液滅活未侵入結(jié)核桿菌的噬菌體，室溫作用10分鐘以中止感染；e.取步驟d所得的待測(cè)液，滴于恥垢分枝桿菌預(yù)包被的瓊脂菌落培養(yǎng)皿上，37°C 溫育15-20小時(shí)；f.根據(jù)菌落培養(yǎng)皿上噬菌斑的形成情況判定結(jié)果。該方法的試劑盒特異性強(qiáng)、結(jié)果明晰，無需特殊儀器，可用于各種待檢樣品中活的 結(jié)核桿菌菌體快速鑒定；但是整個(gè)測(cè)試至少需要48小時(shí)才能完成，而且操作較復(fù)雜，靈敏 度也不夠高。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、抗原純化技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)的日益成熟，一些 快速的檢驗(yàn)方法相繼問世，如聚合酶鏈反應(yīng)法(polymerase chain reaction，PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、斑點(diǎn)免疫金滲濾法(dot immuno-gold filtration assay, DIGFA)及免疫層析法(immunochromatographic test, ICT)。多聚酶鏈反應(yīng)是由一對(duì)特定的寡核苷酸引物介導(dǎo)待檢標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA特定 序列片段的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)，通過三個(gè)不同溫度、數(shù)十個(gè)變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)，特定靶 序列可被擴(kuò)增數(shù)百萬倍，而顯示其快速、高靈敏度、可定量分析以及理論上的高特異性等特 點(diǎn)。不過該方法操作比較復(fù)雜，對(duì)操作設(shè)備和人員的技術(shù)要求較高，實(shí)驗(yàn)室易產(chǎn)生污染。酶聯(lián)免疫吸附法、斑點(diǎn)免疫金滲濾法和免疫層析法均是基于血清免疫學(xué)發(fā)展起來 的檢測(cè)方法。這些方法均是以結(jié)核桿菌的特征性抗原為捕獲物，以標(biāo)記的抗人免疫球蛋白 或葡萄球菌蛋白A (Staphylococci Protein A，SPA)等為指示系統(tǒng)，檢測(cè)患者體內(nèi)存在的抗 結(jié)核分枝桿菌的循環(huán)抗體，間接地對(duì)病人的患病情況進(jìn)行診斷。酶標(biāo)法需要專業(yè)的儀器及 高操作技能的專業(yè)人員。免疫滲濾法及免疫層析法均不需要任何儀器，檢測(cè)所需時(shí)間也大 為縮短，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀。但上述方法共同的問題是靈敏度以及特異性很難達(dá)到要求， 并且不能區(qū)分曾經(jīng)感染已經(jīng)治愈的病例；有的產(chǎn)品甚至不能區(qū)分注射過卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)的病例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體的 制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體在 檢測(cè)結(jié)核桿菌中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一方面，提供一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，該抗體能識(shí) 別結(jié)核桿菌噬菌體。優(yōu)選的，該抗體是單克隆抗體。優(yōu)選的，該抗體是抗體片段。優(yōu)選的，該抗體是Fab。優(yōu)選的，該抗體是標(biāo)記的抗體。優(yōu)選的，該抗體是膠體金標(biāo)記的抗體。所述抗體用含結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白第180到230位氨基酸的多肽做抗原免疫 小鼠獲得；該結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體的制備方 法，包括如下步驟(1)合成結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段通過分子克隆的方法將含SEQ ID NO=I 序列的核酸插入到PCDNA3載體(Irwitrogen)，測(cè)序鑒定后選正確克隆擴(kuò)增，提取DNA后轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，表達(dá)并純化結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的片段；(2)將步驟(1)純化的結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段免疫小鼠，取脾細(xì)胞與骨髓 瘤細(xì)胞融合，挑選產(chǎn)生抗體好的細(xì)胞株，注射小鼠腹腔；注射后10天左右抽取腹水并純化抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體在檢測(cè)結(jié)核 桿菌中的應(yīng)用，采用膠體金法免疫層析測(cè)試筆檢測(cè)結(jié)核桿菌噬菌體的方法，測(cè)試筆中膠體 金標(biāo)記的抗體為該結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，測(cè)試線上固定的抗體為結(jié)合結(jié)核 桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體。本文所采用的術(shù)語“單克隆抗體(單抗)”指從一純系細(xì)胞得到的免疫球蛋白，具 有相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性，對(duì)單一抗原決定簇有特異性。單克隆抗體與常規(guī)多克隆抗體制 劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決 定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤或重組工程細(xì)胞 培養(yǎng)獲得，不會(huì)混雜有其它免疫球蛋白。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從均一的 抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明具有以下有益效果該抗體能識(shí)別結(jié)核桿菌噬菌體D29的頭部蛋白，從而 識(shí)別結(jié)核桿菌噬菌體D29，進(jìn)一步通過建立的方法反映檢測(cè)樣品中是否有活的結(jié)核桿菌。該 抗體用含頭部蛋白第180到230位氨基酸的多肽做抗原免疫小鼠獲得。本發(fā)明的抗體可以 快速識(shí)別噬菌體，進(jìn)一步縮短噬菌體擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核桿菌的時(shí)間，同時(shí)提高檢測(cè)的靈敏度。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述實(shí)施例1，識(shí)別結(jié)核桿菌噬菌體D29頭部蛋白的抗體的制備1，結(jié)核桿菌噬菌體D29頭部蛋白片段的合成結(jié)核桿菌噬菌體D29頭部蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示，結(jié)核桿菌 噬菌體D29頭部蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。通過分子克隆的方法將含SEQ ID NO 1序列的核酸插入到pcDNA3載體(購自 Invitrogen公司)，測(cè)序鑒定后選正確克隆擴(kuò)增，提取DNA后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)并純化D29 頭部蛋白的片段。2，識(shí)別D29頭部蛋白片段的抗體的制備a)動(dòng)物免疫將前面純化的D29頭部蛋白片段與等體積的福氏佐劑混合制成油包水乳劑，每只 小鼠腹腔注射0. 5ml上述混合液(含頭部蛋白片段100 μ g)，共注射6只BALB/c小鼠。兩 周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，7天后以間接ELISA檢測(cè)小鼠血清頭部蛋白 多抗的效價(jià)，效價(jià)高者頭靜脈再?zèng)_擊免疫1次，每只20 μ g，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合。b)雜交瘤細(xì)胞株的建立將免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以5 1的比例在聚乙二醇作用下 按常規(guī)法融合，用HAT完全1640培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。以D29頭部蛋白(1 μ g/ml)作為抗原包 被酶標(biāo)96孔板，間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，所測(cè)的0D490 (490nm處的吸收) 比陰性對(duì)照高10倍的克隆，進(jìn)行亞克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存。經(jīng)過3次有限稀釋克隆化，將 分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系大量擴(kuò)增并凍存，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克 隆化鑒定。c)單克隆抗體腹水的制備
BALB/c小鼠腹腔內(nèi)分別注射0. 5ml不完全福氏佐劑，5 7天后每只小鼠腹腔內(nèi) 注射0. 5ml含2X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞的溶液，7 10天后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水。d)單克隆抗體的純化將識(shí)別D29頭部蛋白的單克隆抗體腹水先后用50% (質(zhì)量體積比)飽和硫酸銨鹽 析和Protein G親和層析的方法進(jìn)行純化，得到的單克隆抗體用蛋白電泳法鑒定純度。實(shí)施例2，D29噬菌體在結(jié)核桿菌和恥垢桿菌中的擴(kuò)增及檢測(cè)1.用4%的NaOH溶液(樣品液NaOH液=1 4)室溫處理待檢樣品20分鐘， 離心去上清；2.加入增菌液(將米氏7H9培養(yǎng)基7g、CaCl2 2g、氨芐青霉素50g、兩性霉素B 50g、BSA 200g、葡萄糖15g、油酸2g和過氧化氫酶0. 2g溶于IL水中制備)2ml，37°C培養(yǎng) 18 24小時(shí)；3.取上述培養(yǎng)后的菌液0. 9ml，加入濃度為IO9個(gè)/ml的D29噬菌體溶液0. Iml, 37°C溫育2小時(shí)，讓噬菌體感染結(jié)核桿菌；4.向上述溶液中加入殺滅劑(8%的硫酸亞鐵銨)0. 1ml，室溫作用10分鐘以滅活 所有未侵入結(jié)核桿菌的噬菌體；5.往上述含滅活劑的菌液中加入5ml增菌液，再加入Iml的恥垢桿菌(4X IO6個(gè) /ml，在 600nm 時(shí) OD 為 1. 0)，37°C溫育 4 小時(shí)；6.噬菌體溶液可采用申請(qǐng)?zhí)枮?00810043709.4，申請(qǐng)日為2008年8月14日，發(fā) 明名稱為“一種快速檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法和試劑盒”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)說明書中所記載 的方法制得的膠體金法免疫層析測(cè)試筆(金探針用膠體金標(biāo)記實(shí)施例1制得的抗D29頭部 蛋白的抗體獲得，測(cè)試線抗體也用該抗體)檢測(cè)噬菌體濃度，從而間接檢測(cè)結(jié)核桿菌。用此 法檢測(cè)的結(jié)核桿菌最少到100個(gè)。序列表<110>上海英伯肯醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司<120>結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體及其制備方法和應(yīng)用<130>NP-09-13394<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>153<212>DNA<213>人工序列<400>1aagaagtgga cccacaccct tctggacgac atcaccgagc cgatcctgaa cggcgcgaag 60gaccagaacg gtcgcccgct gttcatcgag tcgacctacg gtgaggccgc gagcccgttc 120cgttcgggcc ggatcgtcgc ccgtccgacc ate153<210>2<211>51<212>PRT
<213>人工序列<400>2KKffTHTLLDD ITEPILNGAK DQNGRPLFIE STYGEAASPF RSGRIVARPT I 5權(quán)利要求
一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，該抗體能識(shí)別結(jié)核桿菌噬菌體。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，該抗體是單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，該抗體是抗體片段。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，該抗體是Fab。
5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，該抗體是標(biāo)記的抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，該抗體是膠體金標(biāo)記的抗體。
7.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體用含結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白第 180到230位氨基酸的多肽做抗原免疫小鼠獲得；該結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列和SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列。
8.一種包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的抗體的溶液和裝置。
9.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1，2，3，4和7中任一項(xiàng)所述的抗體的細(xì)胞。
10.一種如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)合成結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段通過分子克隆的方法將含SEQID N0:1序列 的核酸插入到PCDNA3載體，測(cè)序鑒定后選正確克隆擴(kuò)增，提取DNA后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)并 純化結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的片段；(2)將步驟(1)純化的結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段免疫小鼠，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞融合，挑選產(chǎn)生抗體好的細(xì)胞株，注射小鼠腹腔；注射后10天左右抽取腹水并純化抗體。
11.一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體在檢測(cè)結(jié)核桿菌中的應(yīng)用，其特征在于， 采用膠體金法免疫層析測(cè)試筆檢測(cè)結(jié)核桿菌噬菌體的方法，測(cè)試筆中膠體金標(biāo)記的抗體為 權(quán)利要求6所述的抗體，測(cè)試線上固定的抗體為權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，該抗體能識(shí)別結(jié)核桿菌噬菌體。此外，本發(fā)明還公開了該抗體的制備方法，包括步驟合成結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段，將純化的結(jié)核桿菌噬菌體頭部蛋白片段免疫小鼠，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，挑選產(chǎn)生抗體好的細(xì)胞株，注射小鼠腹腔，注射后10天左右抽取腹水并純化抗體。此外，本發(fā)明還公開了該抗體在檢測(cè)結(jié)核桿菌中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗體可以快速識(shí)別噬菌體，進(jìn)一步縮短噬菌體擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核桿菌的時(shí)間，同時(shí)提高檢測(cè)的靈敏度。
文檔編號(hào)C12N15/06GK101993491SQ20091005777
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者楊揮, 胡志能 申請(qǐng)人:上海英伯肯醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司