專利名稱：利用噬菌體展示技術(shù)展示抗原制備抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該技術(shù)利用噬菌體展示技術(shù)原理將外源抗原基因與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面。用展示有外源抗原及抗原表位的噬菌體顆粒為免疫原制備抗體。
二.
背景技術(shù)：
近20年來(lái)，抗體作為體外診斷用藥在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛發(fā)展。在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)，基于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，化學(xué)發(fā)光，配體-受體相結(jié)合等原理為基礎(chǔ)而建立的檢測(cè)技術(shù)，尤其是基于蛋白質(zhì)三大標(biāo)記技術(shù)(熒光、核素、酶)而衍生的ELISA、RIA、MRIA、Western-blot、電化學(xué)發(fā)光、免疫比濁等特異、靈敏檢測(cè)方法的建立，為分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、免疫病理學(xué)及對(duì)臨床疾病的診斷、治療及預(yù)防作出了重大貢獻(xiàn)。隨著生物芯片技術(shù)的出現(xiàn)，將基因芯片及蛋白質(zhì)芯片的開發(fā)成為各種體外診斷試劑是這一領(lǐng)域發(fā)展的重點(diǎn)，其中蛋白質(zhì)芯片占有相當(dāng)重要的地位。從技術(shù)角度而言，無(wú)論是免疫蛋白技術(shù)還是蛋白芯片技術(shù)，其關(guān)鍵是高質(zhì)量抗體，其中包括單抗(McAb)及多抗(PcAb)。因此，高特異，高親和性抗體的研制具有十分重要的意義。
抗體的產(chǎn)生-般有三種方法1.異種動(dòng)物免疫(多抗)，2.雜交瘤技術(shù)(單抗)，3.基因工程(小分子鼠源或人源Fab，scFv)。無(wú)論何種技術(shù)，抗體的產(chǎn)生取決于抗原。理論上一個(gè)氨基酸就能產(chǎn)生抗體。但是肽鏈的長(zhǎng)度、分子量大小與抗原性直接相關(guān)。理論上分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，顆粒性抗原大于可溶性抗原。對(duì)普通分子量抗原而言，用常規(guī)免疫學(xué)方法產(chǎn)生抗體并無(wú)困難，但分子量小于20000的抗原，就有可能使產(chǎn)生的抗體滴度很低，親和力不強(qiáng)，無(wú)法應(yīng)用于臨床。解決辦法國(guó)內(nèi)外普遍用戊二醛，碳化二亞胺等作偶聯(lián)劑，將小分子抗原偶聯(lián)于BSA或KLH成大分子蛋白，增強(qiáng)其抗原性。但前提是1.足夠的抗原，2.性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，3.偶聯(lián)蛋白不改變?cè)锌乖男再|(zhì)。然而對(duì)一些稀有的，分子量較小，半衰期較短的抗原，如某些激素及其代謝產(chǎn)物，某些腫瘤標(biāo)志物等，給抗原純化及抗體制備帶來(lái)困難?；蚬こ炭捎行У亟鉀Q這一問(wèn)題，如用一般的表達(dá)系統(tǒng)可以解決稀有蛋白的生產(chǎn)制備問(wèn)題，但不能解決小分子肽的免疫原性問(wèn)題，因?yàn)橐灾苽淇贵w為目的的小分子肽表達(dá)并純化后仍需與大分子載體進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)過(guò)程極為煩瑣、復(fù)雜，且偶聯(lián)反應(yīng)不易控制。

發(fā)明內(nèi)容
噬菌體展示技術(shù)自1985年由G.P.Smith建立以來(lái)，在生物學(xué)許多領(lǐng)域帶來(lái)了巨大影響，被譽(yù)為生命科學(xué)中又一次技術(shù)上的重大突破。噬菌體展示技術(shù)是將外源基因插入噬菌體的基因組中，使產(chǎn)物與其衣殼蛋白融合表達(dá)，外源肽的結(jié)構(gòu)與功能通過(guò)活病毒的形式表現(xiàn)出來(lái)?；诖嗽?，大多數(shù)研究者將此技術(shù)應(yīng)用于隨機(jī)肽文庫(kù)的構(gòu)建、表位文庫(kù)的構(gòu)建及人源抗體庫(kù)的構(gòu)建等，通過(guò)文庫(kù)提供的大量結(jié)構(gòu)與功能的信息，實(shí)現(xiàn)了高通量篩選，在研究分子間相互作用，新藥設(shè)計(jì)，尋找新配體，尋找并制備人源單抗等方面提供了全新的策略。用于噬菌體展示技術(shù)的噬菌體主要包括M13、fd、fl等，它們的親緣關(guān)系、基因組組織形式、病毒大小與形態(tài)相近，都是柔性桿狀病毒，長(zhǎng)1μm，直徑6nm，有98％的核苷酸序列同源，基因組包括6407～6408個(gè)堿基，編碼10個(gè)不同蛋白，其中與噬菌體展示有關(guān)的蛋白是基因VIII(g8)所編碼的主要外殼蛋白pVIII(major coat protein)，大約有2700個(gè)左右的拷貝，圍繞噬菌體呈螺旋管狀排列，蛋白的C端與DNA結(jié)合，N端暴露于病毒顆粒的表面，基因III(g3)所編碼的次要外殼蛋白pIII(minorcoat protein)，參與構(gòu)成噬菌體外殼的尾端，其C端錨定在外殼上，N端游離于噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒約含3～5個(gè)cpIII的拷貝。當(dāng)外源基因插入到噬菌體基因組的基因VIII或基因III的5’端時(shí)，外源蛋白或多肽則以蛋白融合的形式被表達(dá)，分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔，切除信號(hào)肽后，融合在外殼蛋白N端的外源肽被展示在噬菌體顆粒表面。
為了解決抗原制備和免疫原性問(wèn)題，為體外診斷試劑的研制，小肽的藥代動(dòng)力學(xué)研究及隨機(jī)肽文庫(kù)的構(gòu)建建立了通用技術(shù)平臺(tái)。利用免疫學(xué)的基本原理，我們?cè)O(shè)想絲狀噬菌體是一種細(xì)菌病毒，是顆粒性抗原，如果把它作為一種載體，理論上應(yīng)當(dāng)具有很強(qiáng)的免疫原性，把cTnI基因插入到噬菌體基因組的基因VIII或基因III的5’端，使其與基因VIII或基因III融合，最終cTnI將以蛋白融合的形式被表達(dá)并展示在噬菌體顆粒表面，以此為免疫原免疫動(dòng)物，制備抗體。如果這種設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)，則可將抗原的制備和抗原的免疫原性問(wèn)題一步解決，為抗體的制備提供了新的途徑，同時(shí)也為體外診斷試劑盒的研制建立了全新的技術(shù)平臺(tái)。本研究成功地將人心肌肌鈣蛋白及其抗原表位展示于絲狀噬菌體顆粒表面，并以此為免疫原免疫新西蘭白兔，得到了高滴度的抗體，實(shí)現(xiàn)了預(yù)期目標(biāo)。
本發(fā)明的技術(shù)方案為1.將抗原與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面，并用展示有抗原及抗原表位的噬菌體顆粒為免疫原制備抗體。
2.將人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將人心肌肌鈣蛋白抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面。用展示有人心肌肌鈣蛋白及其表位的噬菌體顆粒為免疫原制備cTnI抗體。
3.一種pIII型噬菌體展示載體。載體含LacZ啟動(dòng)子-Pelb引導(dǎo)序列-XcmI PCR產(chǎn)物克隆位點(diǎn)及多克隆位點(diǎn)-M13噬菌體包膜蛋白III基因部分序列，利用XcmI雙酶切用以克隆PCR產(chǎn)物，用多克隆位點(diǎn)插入外源抗原基因，外源抗原基因表達(dá)后在Pelb的引導(dǎo)下定位于細(xì)胞周質(zhì)腔，用輔助噬菌體超感染，將外源抗原展示于M13絲狀噬菌體的尾部。將人心肌肌鈣蛋白I基因插入多克隆位點(diǎn)，基因表達(dá)后在Pelb的引導(dǎo)下定位于細(xì)胞周質(zhì)腔，用輔助噬菌體VCSM13超感染，將cTnI展示于M13絲狀噬菌體的尾部。
4.一種pVIII型噬菌體展示載體。載體含LacZ啟動(dòng)子-cTnI95～108基因-M13噬菌體包膜蛋白VIII基因部分序列，用輔助噬菌體VCSM13超感染，將cTnI95～108展示于M13絲狀噬菌體的表面。
5.將展示有抗原或抗原表位的噬菌體顆粒作免疫原，免疫動(dòng)物制備抗體，將展示有cTnI及cTnI95～108的噬菌體顆粒作免疫原，免疫新西蘭白兔獲得cTnI抗體。
四.
具體實(shí)施例方式
1.噬菌體展示載體的構(gòu)建pCOMB3第二個(gè)克隆位點(diǎn)的切除
pCOMB3用NheI+XbaI雙酶切，可見272bp條帶，切除上述片段后，將剩余大片段回收，自連后轉(zhuǎn)化并抽提質(zhì)粒，分別用NheI，XbaI，SpeI，XhoI及XhoI+SpeI酶切檢查，結(jié)果顯示XbaI，NheI無(wú)酶切，SpeI，XhoI可見單酶切條帶，酶切位點(diǎn)正確。
片段插入及鑒定pET-28(a)+(中國(guó)藥科大學(xué)生物技術(shù)研究中心儲(chǔ)存)作模板PCR擴(kuò)增后，可見550bp條帶，回收片段后與相同酶切的Pa載體連接，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，1.5％瓊脂糖電泳條帶出現(xiàn)在Pa之后。隨機(jī)挑選10個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢查，其中9個(gè)出現(xiàn)550bp條帶，陽(yáng)性率90％。SpeI+XhoI雙酶切檢查，可見550bp及3800bp條帶。XcmI單酶切可見在540bp及3810bp位置出現(xiàn)條帶。質(zhì)粒送生工測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期序列一致，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pFD5。
pFD5的構(gòu)建如圖1。
2.人心肌肌鈣蛋白I-pIII噬菌體展示pFD5-cTnI表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定以含cTnI的pMD-18T為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與載體pFD5經(jīng)SpeI+XhoI雙酶切，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶使兩個(gè)片段通過(guò)粘性末端相連，轉(zhuǎn)化至XL1-Blue。隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，分別用PCR及SpeI+XhoI雙酶切等方法作鑒定。其中有9個(gè)克隆出現(xiàn)630bp條帶，酶切鑒定出現(xiàn)3800bp及630bp兩條帶。陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。
pFD5-cTnI的構(gòu)建如圖2。
cTnI蛋白的表達(dá)陽(yáng)性菌落擴(kuò)增后，經(jīng)ITPG誘導(dǎo)，培養(yǎng)基及細(xì)胞周質(zhì)均檢測(cè)到cTnI蛋白抗原活性，表達(dá)量周質(zhì)大于培養(yǎng)基(圖3)。
cTnI的噬菌體展示由于經(jīng)反復(fù)多次傳代的宿主菌可能會(huì)發(fā)生變異，對(duì)輔助噬菌體感染不敏感，從15個(gè)單菌落中，只篩選到3株對(duì)輔助噬菌體敏感的XL1-Blue宿主菌。通過(guò)輔助噬菌體的復(fù)蘇及擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)定，VCSM13的滴度為1.1×1012PFU/ml。pFD5-cTnI質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化對(duì)輔助噬菌體敏感的XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用VCSM13超感染，擴(kuò)增后用PEG8000進(jìn)行純化，并用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原性，結(jié)果顯示OD＝0.1770。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cTnI蛋白的相對(duì)展示量為5ng/ml。3.人心肌肌鈣蛋白I抗原表位-pVIII噬菌體展示PC89-cTnI95-108表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定用含酶切位點(diǎn)EcoRI的T1及酶切位點(diǎn)BamHI的T2退火，得到含EcoRI及BamHI酶切位點(diǎn)的寡聚核苷酸雙鏈，與經(jīng)EcoRI+BamHI雙酶切的PC89，用T4連接酶通過(guò)粘性末端相連后，轉(zhuǎn)化至XL1-Blue。通過(guò)藍(lán)白斑篩選，得到約40％的藍(lán)色克隆。隨機(jī)挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，分別用PCR及EcoRI+BamHI雙酶切等方法作鑒定。其中有3個(gè)轉(zhuǎn)化子在450bp位置擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，酶切鑒定未出現(xiàn)預(yù)期的50bp條帶。陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。
PC89-cTnI95-108的構(gòu)建如圖4。
cTnI95-108的分泌表達(dá)陽(yáng)性菌落擴(kuò)增后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)基及細(xì)胞周質(zhì)均檢測(cè)到cTnI95-108抗原活性，表達(dá)量周質(zhì)大于培養(yǎng)基(圖5)。
cTnI95-108的噬菌體展示PC89-cTnI95-108質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化對(duì)輔助噬菌體敏感的XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用VCSM13超感染，擴(kuò)增后用PEG 8000進(jìn)行純化，并用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原性，結(jié)果顯示OD＝1.7210。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cTnI95-108的相對(duì)展示量為96ng/ml。
4 cTnI抗體的產(chǎn)生PC89-cTnI95-108質(zhì)粒及pFD5-cTnI質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落接種Amp+Tet雙抗LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，加入1012PFU的VCSM13進(jìn)行超感染，超感染后的噬菌體用40g/L的PEG 8000及30g/L的NaCl純化2次，調(diào)整噬菌體濃度為0.25mg/ml，加佐劑制成油包水乳劑，免疫新西蘭白兔，加強(qiáng)免疫5次后用ELISA方法測(cè)定抗體滴度，結(jié)果顯示pIII組1號(hào)兔及2號(hào)兔抗體滴度均為1.300，pVIII組1號(hào)兔抗體滴度為1∶900，2號(hào)兔滴度為1∶1800，對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性結(jié)果(圖6)。兔血清用半飽和硫酸銨沉淀粗提，沉淀用適量PBS溶解后，采用Sephedex G-200凝膠層析分離純化免疫球蛋白G(IgG)，收集合并第一峰，濃縮后測(cè)定蛋白濃度為76.50mg/ml。
五.


圖1.PFD5載體的構(gòu)建。
圖2.PFD5-cTnI表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖3.cTnI基因的表達(dá)。
圖4 PC89-cTnI95-108表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖5.cTnI95-108的表達(dá)。
圖6.抗體滴度。
權(quán)利要求
1.一種用噬菌體展示技術(shù)展示抗原用以制備單克隆抗體及多克隆抗體的方法。其特征在于將抗原與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面，并用展示有抗原及抗原表位的噬菌體顆粒為免疫原制備抗體。
2.一種用噬菌體展示技術(shù)展示人心肌肌鈣蛋白抗原及其抗原表位用以制備cTnI單克隆抗體及多克隆抗體的方法。其特征在于將人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將人心肌肌鈣蛋白抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面。用展示有人心肌肌鈣蛋白及其表位的噬菌體顆粒為免疫原制備cTnI抗體。
3.一種pIII型噬菌體展示載體。其特征在于載體含LacZ啟動(dòng)子-Pelb引導(dǎo)序列-XcmI PCR產(chǎn)物克隆位點(diǎn)及多克隆位點(diǎn)-M13噬菌體包膜蛋白III基因部分序列，利用XcmI雙酶切用以克隆PCR產(chǎn)物，用多克隆位點(diǎn)插入外源抗原基因，外源抗原基因表達(dá)后在Pelb的引導(dǎo)下定位于細(xì)胞周質(zhì)腔，用輔助噬菌體超感染，將外源抗原展示于M13絲狀噬菌體的尾部。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述噬菌體展示載體，其特征在于將人心肌肌鈣蛋白I基因插入多克隆位點(diǎn)，基因表達(dá)后在Pelb的引導(dǎo)下定位于細(xì)胞周質(zhì)腔，用輔助噬菌體VCSM13超感染，將cTnI展示于M13絲狀噬菌體的尾部。
5.一種pVIII型噬菌體展示載體。其特征在于載體含LacZ啟動(dòng)子-cTnI95～108基因-M13噬菌體包膜蛋白VIII基因部分序列，用輔助噬菌體VCSM13超感染，將cTnI95～108展示于M13絲狀噬菌體的表面。
6.一種用噬菌體展示技術(shù)直接制備抗體的方法，其特征在于將展示有抗原或抗原表位的噬菌體顆粒作免疫原，免疫動(dòng)物制備抗體。將展示有cTnI及cTnI95～108的噬菌體顆粒作免疫原，免疫新西蘭白兔獲得cTnI抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。利用噬菌體展示技術(shù)原理將外源抗原基因與絲狀噬菌體III基因蛋白融合展示于噬菌體顆粒尾部，將抗原表位與絲狀噬菌體VIII基因蛋白融合展示于絲狀噬菌體顆粒表面。用展示有外源抗原及抗原表位的噬菌體顆粒為免疫原制備抗體。該技術(shù)拓寬了噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用范圍，同時(shí)也為抗體的制備提供了新途徑。保護(hù)范圍1.一種用噬菌體展示技術(shù)展示抗原用以制備單克隆抗體及多克隆抗體的方法。2.一種用噬菌體展示技術(shù)展示人心肌肌鈣蛋白抗原及其抗原表位用以制備cTnI單克隆抗體及多克隆抗體的方法。3.一種pIII型噬菌體展示載體pFD5。4.一種噬菌體展示融合表達(dá)載體pFD5－cTnI。5.一種pVIII型噬菌體展示融合表達(dá)載體PC89－cTnI
文檔編號(hào)C12P21/00GK1485432SQ0313179
公開日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者沈子龍, 吳國(guó)球 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)