專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫(kù)及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體庫(kù)及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種小鼠抗人大腸癌Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建方
法。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multi-drug resistance, MDR)多為獲得性耐藥，即在治療前對(duì)藥物敏感，治療后對(duì)藥物耐受。多藥耐藥性是指不僅對(duì)使用藥物產(chǎn)生耐受，而且對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐受。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的最主要原因是瘤細(xì)胞膜過(guò)量表達(dá)一種ATP依賴(lài)性外排性泵，以減少化療藥物在細(xì)胞內(nèi)部的積累。這種ATP依賴(lài)性外排泵屬于ABC (ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族,主要 包括以下幾種⑴腫瘤多藥耐藥蛋白Ι/P-糖蛋白即為P_gp (Multi-Drug Resistancel/P-glycoprotein, MDRl/P-gp)也稱(chēng)為 ABCBl (ATP-binding cassette BI),它是 1976 年Juliano等在耐藥的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后Roninson等獲得人耐藥KB癌細(xì)胞株的MDRl基因序列[1]，P-gp也是現(xiàn)在引起腫瘤多藥耐藥性最常見(jiàn)的原因。⑵多藥耐藥相關(guān)蛋白⑶乳癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)⑷肺耐藥相關(guān)蛋白(Lung resistance related protein, LRP)0P-gp是引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的最主要原因，由多藥耐藥蛋白基因I(multi-drug resistancel, mdrl)編碼為兩個(gè)完全相同的單體組成,每個(gè)單體含有一個(gè)七次跨膜疏水區(qū)和一個(gè)ATP結(jié)合區(qū)，兩個(gè)單體組合成一個(gè)能量依賴(lài)性泵位于細(xì)胞膜上。P-gp在分解ATP供給能量的同時(shí)，可以將腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的親脂性化學(xué)藥物排到細(xì)胞外，因此一些親脂性藥物可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp外排化療藥物的功能。P-gp誘導(dǎo)的多藥耐藥腫瘤中同時(shí)檢測(cè)到高水平的蛋白激酶C (Protein Kinase C，PKC)，PKC主要通過(guò)磷酸化P_gp藥物結(jié)合位點(diǎn)的絲氨酸而增強(qiáng)其外排化療藥物的功能。第一代P-gp抑制劑為親脂性化合物，如維拉帕米、奎尼丁、環(huán)孢素A等，可作為P-gp底物，與化療藥物競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合P-gp，從而減少化療藥物外排。但是當(dāng)它們的應(yīng)用劑量達(dá)到抑制P-gp功能時(shí)有很強(qiáng)的毒副作用，這也限制了它們的臨床應(yīng)用。接著第二代P-gP抑制劑出現(xiàn)，如PSC-833 (環(huán)孢素D衍生物)和Biricodar，它們與Ρ-gp的親和力更強(qiáng)，并且沒(méi)有免疫抑制副作用；但是它們?nèi)狈μ禺愋?，同樣抑制正常組織P-gp功能，而且還抑制細(xì)胞色素P450 3A的功能進(jìn)而影響藥物代謝，因此它們的研發(fā)也受到限制。于是以tariquidar、0C144-093、zosuquidar、elacridar為代表的第三代P-gp抑制藥物應(yīng)運(yùn)而生，它們對(duì)P-gp親和力高，而且對(duì)依賴(lài)細(xì)胞色素P450 3A的藥物代謝影響很小，然而它們?cè)谶_(dá)到抑制P-gp功能劑量時(shí)，仍有一定的細(xì)胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代P-gp抑制藥物還處于臨床試驗(yàn)階段。臨床腫瘤出現(xiàn)多藥耐藥性多與P-gp有關(guān)，它已成為腫瘤化療的最主要障礙之一。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的主要手段，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，制備一種更特異的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物，在保證化療藥物抑制腫瘤組織生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常生理代謝的影響降到最低，成為可能，但是，目前還沒(méi)有抗P-gp單克隆抗體作為抑制腫瘤多藥耐藥的藥物。單克隆抗體用于抑制腫瘤多藥耐藥性有很多優(yōu)點(diǎn)如可以特異性的結(jié)合P-gp抗原表位，不會(huì)影響細(xì)胞色素P450 3A依賴(lài)的藥物代謝，小分子人源抗體在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中，既不會(huì)引起機(jī)體變態(tài)性免疫反應(yīng)，又因?yàn)榉肿恿啃≡隗w內(nèi)代謝快，對(duì)正常組織細(xì)胞影響小，有助于耐藥瘤細(xì)胞的化療等。噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌體結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，并與結(jié)構(gòu)基因融合表達(dá)于噬菌體外膜表面?，F(xiàn)在噬菌體展示系統(tǒng)有多種，如絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、Τ4噬菌體展示系統(tǒng)等。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)有很多種，Μ13絲狀噬菌體展示系統(tǒng)為其中一種，Μ13絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中的Μ13噬菌體呈長(zhǎng)絲狀，直徑6. 5nm，長(zhǎng)約900nm，內(nèi)含單鏈DNA基因組(6，407個(gè)核苷酸)，被一層長(zhǎng)圓柱狀核衣殼保護(hù)著，長(zhǎng)圓柱狀核衣殼主要由gp8蛋白組成，噬菌體的兩端為約3 5拷貝的gp3、gp6、gp7、gp9組成。M13噬菌體為溫和型噬菌體，感 染萬(wàn).coli XLl-blue菌后，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌裂解，噬菌體以出芽的方式從宿主細(xì)胞中釋放。M13噬菌體展示系統(tǒng)也主要有2類(lèi)(1)外源蛋白與主要核衣殼蛋白gp8融合表達(dá)，⑵外源蛋白與gp3蛋白融合表達(dá)。外源蛋白與gp8融合表達(dá)可以獲得高拷貝的外源蛋白，對(duì)外源蛋白起了放大作用，但過(guò)量的外源蛋白可能阻礙噬菌體再次侵染宿主菌，反而不利于淘選鑒定；外源蛋白與gp3蛋白融合表達(dá)，每個(gè)噬菌體攜帶有3 5拷貝的外源蛋白，對(duì)噬菌體結(jié)構(gòu)影響較小，有利于應(yīng)用到淘選鑒定中，獲得相對(duì)高親和力的抗體或受體。噬菌體展示技術(shù)是一種將基因型和表型統(tǒng)一起來(lái)的基因工程技術(shù)，即淘選獲得目的蛋白的同時(shí)可得到該蛋白的基因序列。現(xiàn)在M13噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)須包括以下三個(gè)要素?cái)y帶噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白基因(最常用gp3)的噬菌粒載體、輔助M13噬菌體、帶F性菌毛E. coli。首先將目的基因片段克隆到噬菌粒載體上，并轉(zhuǎn)化進(jìn)帶F性菌毛的疋coli宿主中；然后輔助M13噬菌體通過(guò)其一端由gp3、gp6、gp7組成的配體結(jié)構(gòu)與宿主菌F性菌毛結(jié)合，逐漸將其基因組釋放到宿主菌中；噬菌體在宿主菌內(nèi)復(fù)制，同時(shí)噬菌粒載體也表達(dá)與外源蛋白融合的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，噬菌體核衣殼便錯(cuò)誤地將噬菌粒載體包裝進(jìn)去，這種錯(cuò)誤包裝的噬菌體可以再次感染疋宿主菌，但不能再次擴(kuò)增出新的噬菌體。通過(guò)對(duì)釋放出的噬菌粒反復(fù)的“親和-洗脫-擴(kuò)增”過(guò)程，最終獲得表達(dá)目的蛋白的基因克隆，即完成表型與基因型的統(tǒng)一。現(xiàn)在M13噬菌體展示技術(shù)在淘選特異性的單克隆抗體得到廣泛的應(yīng)用，近年來(lái)利用噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功制備了各種單鏈抗體、Fab抗體以及完整IgG抗體。噬菌體展示技術(shù)在制備淘選單克隆抗體方面相對(duì)于雜交瘤技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)容易實(shí)現(xiàn)高通量淘選、可以制備小分子量亞單位單克隆抗體、獲得的抗體克隆株更容易長(zhǎng)期保存、易于實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)等，因此噬菌體展示技術(shù)在單克隆抗體淘選和制備中引起重大變革。在構(gòu)建M13噬菌體抗體庫(kù)過(guò)程中最常用到pComb3載體及XLl-blue宿主菌，pComb3載體具有氨節(jié)青霉素抗性并且含有兩個(gè)克隆位點(diǎn)位于gp3基因上游的IgG重鏈克隆位點(diǎn)和單獨(dú)的輕鏈克隆位點(diǎn)；XLl-blue宿主菌具有四環(huán)素抗性，本身具有F性菌毛，可被M13噬菌體感染。M13噬菌體展示技術(shù)操作簡(jiǎn)便，常用于分子生物學(xué)研究中，它不僅可以進(jìn)行高通量的抗體淘選，在研究蛋白質(zhì)之間相互作用方面也有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，并且在以后研究藥物作用靶點(diǎn)、疾病的分子病理機(jī)制等方面將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用M13噬菌體展示技術(shù)獲得特異性抗人大腸癌細(xì)胞膜表位的Fab免疫抗體庫(kù)及其的構(gòu)建方法，其中抗體庫(kù)容為2. 47X IO6CFU方法，重鏈基因是由17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物擴(kuò)增而成，輕鏈基因是由20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物擴(kuò)增而成。本發(fā)明為人P-gp跨膜區(qū)的Fab抗體庫(kù)及其構(gòu)建方法
(1)取多藥耐藥性大腸癌病理組織，勻漿后免疫小鼠，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定抗體滴度，抗體滴度大于1:512，提取總RNA并在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
(2)設(shè)計(jì)17條重鏈上游引物，見(jiàn)SEQID NO :1-17和5條重鏈下游引物，見(jiàn)SEQ ID NO:·18-22及20條輕鏈上游引物，見(jiàn)SEQ ID NO :，23-42及2條輕鏈下游引物見(jiàn)SEQ ID NO:43，44，，其中重鏈Y引物引入通ο I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)，輕鏈Y引物引入fee I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)，引物的序列見(jiàn)序列表；
(3)PCR擴(kuò)增小鼠IgG重鏈及輕鏈基因片段，擴(kuò)增條件如下
950C，3 分鐘；95°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，60 秒；55°C，30 秒；72°C，10 分鐘；30 個(gè)循環(huán)，4°C保存；
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收，于DNA親和柱中純化，得到IgG重鏈及輕鏈基因片段；
(4)重鏈Fd庫(kù)的建立將載體pComb3質(zhì)粒與重鏈Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行ZAoI、Spe I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，得重鏈Fd庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使Fd庫(kù)的克隆數(shù)達(dá)到IO5以上；
(5)輕鏈T-L庫(kù)的建立將輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，得到輕鏈T-L庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使T-L克隆數(shù)達(dá)到IO5以上；
(6)抗體庫(kù)的建立將重鏈Fd-pComb3庫(kù)質(zhì)粒與輕鏈T-L庫(kù)質(zhì)粒分別進(jìn)行油<3I、Sac I雙酶切，凝膠回收，將Fd-pComb3與L連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，多次轉(zhuǎn)化后得到Fab抗體庫(kù)，F(xiàn)ab抗體庫(kù)容量達(dá)到IO6克隆以上。本發(fā)明的Fab抗體庫(kù)即構(gòu)建完成，F(xiàn)ab抗體庫(kù)的庫(kù)容為2. 47 X 106cfu,輕鏈插入率為90%，重鏈插入率為80%，F(xiàn)ab抗體插入率為72%。本發(fā)明所構(gòu)建的Fab免疫抗體庫(kù)可利用噬菌體展示技術(shù)可篩選得到抗人大腸癌細(xì)胞任何一膜表位尤其是抗P-gp的高特異性、高親和力Fab單克隆抗體，方法簡(jiǎn)單，并且在得到Fab抗體表型信息的同時(shí)也將獲得其基因信息。利用所獲得的Fab抗體可研究人大腸癌任何一膜表位的功能，從細(xì)胞乃至分子水平尋找大腸癌的特異性診斷指標(biāo)以及靶向治療的位點(diǎn)提供依據(jù)，為制備抑制腫瘤多藥耐藥的抗體藥物提供可能；另經(jīng)過(guò)相應(yīng)抗原多個(gè)表位的多輪淘選和富集后所獲得的終極噬菌體Fab抗體庫(kù)可直接用于表達(dá)該抗原的人大腸癌的臨床診斷，其準(zhǔn)確度和靈敏度都將大幅提高，顯示出作為制備抑制腫瘤多藥耐藥的藥物的應(yīng)用前景。


圖I輕鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；
圖2重鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；
圖3 pComb3載體與重鏈經(jīng)通0 I、Spe I雙酶切，1 pComb3載體經(jīng)ZAo I、Spe I雙酶切，2 :重鏈經(jīng)沿ο I ,Spe I雙酶切；
圖 4 Fd_pComb3 質(zhì)粒和 T-L 質(zhì)粒經(jīng)ZAa I ^Sac I 雙酶切，I: Fd-pComb3 Xba I /Sac I雙酶切，2: T-L載體Xba I / Sac I雙酶切后切膠回收；
圖5 I 10號(hào)Fab克隆酶切鑒定，I 10: No. I No. 10 Fab克隆油a I / fee I 雙酶切；
圖6 11 20號(hào)Fab克隆酶切鑒定，I 10: No. 11 No. 20 Fab克隆Xba I /Sac I 雙酶切，I' 10' : No. 11 No. 20 Fab Fab 克隆 Xho I /Spe I 雙酶；
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例子進(jìn)一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容，但并不用以限制本發(fā)明。實(shí)施例I 免疫BALB/C小鼠
I、將21例耐藥大腸癌組織等量混合置于已稱(chēng)重的離心管中，然后加入適量滅菌生理鹽水，勻漿，除菌，后與弗氏不完全佐劑1:1均勻混合，即得免疫用大腸癌組織勻漿液；
2、取免疫用大腸癌組織勻漿液皮下多點(diǎn)注射(O. 2mL/10g)免疫BALB/C小鼠，在初次免疫后7天和14天同樣方法再次免疫BALB/C小鼠，末次免疫7天后眼眶取血，離心，留取上清備用；
3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定抗體滴度①用上述大腸癌組織勻漿液(100μ L/孔)包被ELISA板孔，37°C孵育2小時(shí)棄去勻漿液，用3%BSA溶液滿(mǎn)孔封閉ELISA板，37°C孵育2小時(shí)；③棄去封閉液，用TBST (Tween O. 05%)清洗I次，拍干后備用。④樣品經(jīng)倍比稀釋后各取50 μ L用于ELISA鑒定(空白對(duì)照用TBS，陰性對(duì)照用同樣稀釋的未免疫小鼠血清)，37°C孵育2小時(shí)； 棄去樣品液，TBST清洗5次，拍干；⑥每孔加入1:2000稀釋的ALP標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體100 μ L (空白對(duì)照加TBS)，37°C孵育2小時(shí)； 棄去馬抗小鼠IgG抗體，TBST清洗5次，拍干后每孔加入PNPP顯色劑100 μ L，25°C避光顯色30分鐘；⑧每孔加入2mol/L硫酸10 μ L終止反應(yīng)，得ELISA檢測(cè)結(jié)果，小鼠經(jīng)免疫后，經(jīng)ELISA檢測(cè)，血清抗體滴度均大于1:512。實(shí)施例2
獲取小鼠脾臟cDNA文庫(kù) I、提取免疫小鼠脾臟總RNA
(1)處死小鼠，取出脾臟，置于生理鹽水中，用剪刀將小鼠脾臟剪成小塊并用生理鹽水清洗，然后置于液氮中充分冷凍，冷凍好的組織塊放入預(yù)冷的離心管中，保存于_80°C，用時(shí)取出；
(2)液氮充分預(yù)冷研缽后，將50-100mg脾臟組織放入研缽中，研磨成粉末狀后，加入ImL Trizol繼續(xù)研磨至均一透明狀；
(3)將研磨液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘后，4°C，13500rpm離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；
(4)加入200μ L三氯甲烷，蓋緊離心管，用手用力震蕩15秒，至溶液充分乳化，無(wú)分層現(xiàn)象，然后室溫靜置5分鐘，4°C，13500rpm離心15分鐘；
(5)小心取出離心管，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置10分鐘，4°C，13500rpm離心10分鐘；
(6)小心棄去上清液，保留離心管底沉淀，然后向離心管中緩慢加入_20°C預(yù)冷的75%乙醇ImL,輕輕上下顛倒,清洗沉淀,4°C, 13500rpm離心5分鐘；
(7)吸凈上清液，然后打開(kāi)離心管，室溫放置干燥沉淀，用20μ L高壓滅菌的DEPC處理水溶解沉淀，待用。2、總RNA質(zhì)量檢測(cè)
先將提取的總RNA用TE (Tris-HCl-EDTA)緩沖液稀釋100倍，然后以TE緩沖液為空白對(duì)照，用核酸蛋白分析儀分別檢測(cè)260nm、280nm、320nm的吸光度值，吸光度值分別為A260 =2. 2818、A280nm=L 0393、A320nm=O. 0114，A260nm / A280nm 為 2. 19 介于 I. 8 2. 2 之間，總RNA質(zhì)量較好。3、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫(kù)
(I)將上述總RNA樣品用滅菌DEPC處理水稀釋為600ng/ μ L，即為稀釋后RNA樣品，按下表加樣
權(quán)利要求
1.一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫(kù)，其特征在于 (1)取多藥耐藥性大腸癌病理組織，勻漿后免疫小鼠，抗體滴度大于1:512，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (2)設(shè)計(jì)17條重鏈上游引物，見(jiàn)SEQID NO :1-17和5條重鏈下游引物，見(jiàn)SEQ ID NO:18-22及20條輕鏈上游引物，見(jiàn)SEQ ID NO :，23-42及2條輕鏈下游引物見(jiàn)SEQ ID NO:43，44，其中重鏈Y引物引入通ο I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)，輕鏈Y引物引入fee I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)； (3)PCR擴(kuò)增小鼠IgG重鏈及輕鏈基因片段； (4)重鏈Fd庫(kù)的建立將載體pComb3質(zhì)粒與重鏈Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行ZAoI、Spe I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，得重鏈Fd庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使Fd庫(kù)的克隆數(shù)達(dá)到IO5以上,并提取重鏈Fd-pComb3庫(kù)質(zhì)粒； (5)輕鏈T-L庫(kù)的建立將輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，得到輕鏈T-L庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使T-L克隆數(shù)達(dá)到IO5以上，并提取輕鏈T-L庫(kù)質(zhì)粒; (6)抗體庫(kù)的建立將重鏈Fd-pComb3庫(kù)質(zhì)粒與輕鏈T-L庫(kù)質(zhì)粒分別進(jìn)行油<3I 'Sac I雙酶切，凝膠回收，將Fd-pComb3與L連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，多次轉(zhuǎn)化后得到Fab抗體庫(kù)，F(xiàn)ab抗體庫(kù)容量達(dá)到IO6克隆以上。
2.一種鼠源抗人大腸癌Fab曬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法,其特征在于 (1)取多藥耐藥性大腸癌病理組織，勻漿后免疫小鼠，抗體滴度大于1:512，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (2)設(shè)計(jì)17條重鏈上游引物，見(jiàn)SEQID NO :1-17和5條重鏈下游引物，見(jiàn)SEQ ID NO:18-22及20條輕鏈上游引物，見(jiàn)SEQ ID NO :，23-42及2條輕鏈下游引物見(jiàn)SEQ ID NO:43，44，其中重鏈Y引物引入通ο I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)，輕鏈Y引物引入fee I酶切位點(diǎn)，3'引物引入I酶切位點(diǎn)； (3)PCR擴(kuò)增小鼠IgG重鏈及輕鏈基因片段； (4)重鏈Fd庫(kù)的建立將載體pComb3質(zhì)粒與重鏈Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行ZAoI、Spe I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，得重鏈Fd庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使Fd庫(kù)的克隆數(shù)達(dá)到IO5以上,并提取重鏈Fd-pComb3庫(kù)質(zhì)粒； (5)輕鏈T-L庫(kù)的建立將輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，得到輕鏈T-L庫(kù)，多次轉(zhuǎn)化后使T-L克隆數(shù)達(dá)到IO5以上，并提取輕鏈T-L庫(kù)質(zhì)粒; (6)抗體庫(kù)的建立將重鏈Fd-pComb3庫(kù)質(zhì)粒與輕鏈T-L庫(kù)質(zhì)粒分別進(jìn)行油<3I 'Sac I雙酶切，凝膠回收，將Fd-pComb3與L連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，多次轉(zhuǎn)化后得到Fab抗體庫(kù)，F(xiàn)ab抗體庫(kù)容量達(dá)到IO6克隆以上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫(kù)及其構(gòu)建方法，屬于抗體庫(kù)及其制備領(lǐng)域；本發(fā)明為取多藥耐藥性大腸癌病理組織，注射BALB/C成年小鼠，檢測(cè)抗體滴度大于1:512時(shí)，處死小鼠取脾組織，提取脾組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以此為模板，設(shè)計(jì)17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物；20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物,PCR擴(kuò)增出重鏈Fd段及輕鏈κ和λ鏈,依次克隆入pComb3載體并轉(zhuǎn)化至E.coliXL1-Blue中，成功構(gòu)建庫(kù)容為2.47×106CFU的抗P-gpFab免疫抗體，重鏈Fd段平均插入率為80%，輕鏈平均插入率為90%，F(xiàn)ab插入率為72%。
文檔編號(hào)C07K16/30GK102888658SQ201210352439
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者張學(xué)梅, 梁文波, 曹陽(yáng), 張海玉, 王清 申請(qǐng)人:大連大學(xué)