專利名稱：：一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：發(fā)酵工業(yè)是以微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵為核心的生產(chǎn)，微生物生長和繁殖的溫度是發(fā)酵反應(yīng)的基礎(chǔ)。例如.*在酒精發(fā)酵過程中，通過糖酵解途徑，酵母菌將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳。然而，此路線存在的重要問題之一是纖維素最適宜的酶解溫度在455(TC之間，而酵母的最適宜發(fā)酵溫度一般在2835"C間，這使得酵母的發(fā)酵與纖維素的酶解難以同步進(jìn)行，因此提高乙醇酵母的最適發(fā)酵溫度就成為解決這一問題的關(guān)鍵。在工業(yè)生產(chǎn)中，提高微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵溫度對于改善工藝、提高產(chǎn)量至關(guān)重要。耐高溫菌(thermophile)也稱嗜熱菌或好熱菌，目前認(rèn)為嗜熱菌包括生長跨度在4010(TC之間的細(xì)菌。嗜熱微生物具有特殊結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜、大分子物質(zhì)和遺傳物質(zhì)。嗜熱菌DNA中G+C。/。含量高達(dá)6070%，其DNA的構(gòu)型為A型，DNA相鄰堿基重疊的偏差大，有利于較多氫鍵的維持。此外，組蛋白和核小體在高溫下有聚合成四聚體甚至八聚體的趨勢，能保護(hù)裸露的DNA免受高溫降解。本課題組已經(jīng)報(bào)道了納米尺度碳材料具有與DNA分子進(jìn)行高度結(jié)合和穩(wěn)定DNA分子的作用，同時(shí)具有提高長片段PCR擴(kuò)增的作用。綜上所述，納米尺度碳材料可以保護(hù)微生物的遺傳物質(zhì)，有利于微生物在高溫下的生長繁殖，在工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)方面，有廣泛的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基能夠提高工業(yè)微生物培養(yǎng)和發(fā)酵溫度，可使發(fā)酵與其他反應(yīng)可同步進(jìn)行，改善了工藝，提高了產(chǎn)率。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基，在微生物最適培養(yǎng)基中添加納米尺度的碳材料。而且，所述的納米尺度碳材料的大小在0.1納米至1000納米之間，包括碳粉納米顆粒和納米碳球，也包括一維的碳納米管、碳納米纖維。而且，所述納米尺度碳材料的添加采取先分散在無菌的純水中，然后再稀釋到液相的微生物培養(yǎng)基中，或者直接分散在液相的微生物培養(yǎng)基中。一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，其步驟是(l)納米尺度碳材料的滅菌；(2)納米尺度碳材料的懸浮液的制備；(3)微生物培養(yǎng)基的選擇；(4)納米尺度碳材料的懸浮液的添加；(5)微生物的高溫培養(yǎng)和發(fā)酵。而且，所述納米尺度碳材料懸浮溶液的制備方法是先精確稱取已滅菌的納米尺度碳材料置于已滅菌的離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水，隨后蓋緊離心管并置于超聲波振蕩器中超聲處理，具體的超聲功率及超聲時(shí)間以納米尺度碳材料完全懸浮且在室溫下可靜止放置至少lOmin不發(fā)生聚積沉淀現(xiàn)象為準(zhǔn)。而且，所述步驟(4)中納米尺度碳材料直接添加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，并用超聲處理將其混勻。而且，所述步驟(4)中將納米尺度碳材料懸浮溶液直接加入到相應(yīng)的微生物培養(yǎng)液中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明所涉及的方法可提高工業(yè)微生物的培養(yǎng)溫度，使微生物能夠在高于其最適溫度的條件下生長，其中原核微生物(大腸桿菌)的培養(yǎng)溫度提高1(TC以上，真核微生物(解脂酵母菌)的培養(yǎng)溫度提高15'C以上。2、本發(fā)明涉及的提高微生物培養(yǎng)溫度的方法不需要復(fù)雜的遺傳操作，只要將納米尺度碳材料經(jīng)過除菌后直接加入微生物培養(yǎng)介質(zhì)即可實(shí)現(xiàn)，簡單易行，便于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。3、本發(fā)明可改變發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)條件，如利用高溫的工業(yè)酶和微生物發(fā)酵進(jìn)行的生產(chǎn)，能縮短微生物發(fā)酵時(shí)間，以及提高工業(yè)酶利用率。圖1為本發(fā)明大腸桿菌在47。C情況下的生長曲線；圖2為本發(fā)明大腸桿菌在52"C情況下的生長曲線；圖3為本發(fā)明解脂酵母菌在47'C情況下的生長曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基，是在相應(yīng)微生物最適培養(yǎng)基中添加納米尺度的碳材料，該納米尺度碳材料的大小應(yīng)該在O.l納米至1000納米之間，即包括碳粉納米顆粒和納米碳球，也包括一維的碳納米管、碳納米纖維等；該納米尺度碳材料的添加可以采取先分散在無菌的純水中，然后再稀釋到液相的微生物培養(yǎng)基中或者直接分散在液相的微生物培養(yǎng)基中。一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，步驟是-(l)納米尺度碳材料的滅菌為適合培養(yǎng)微生物的特殊需要，避免可能的其它雜菌的污染，用于制備懸浮液的納米尺度碳材料需要采用紫外照射的方法或高溫高壓的方法滅菌；此外，即使直接在培養(yǎng)基中添加納米尺度碳材料，也需要采用上述方法進(jìn)行滅菌。(2)納米尺度碳材料的懸浮液的制備納米尺度碳材料固體粉末可以用市售產(chǎn)品，屬于現(xiàn)有技術(shù)，不再詳細(xì)敘述。以配置濃度為(W/V)10mg/mL的納米尺度碳材料懸浮溶液為例，先精確稱取lOmg已滅菌的納米尺度碳材料置于已滅菌的1.5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水至體積為lmL;隨后蓋緊離心管并置于超聲波振蕩器中超聲處理一定時(shí)間，具體的超聲功率及超聲時(shí)間應(yīng)以納米材料完全懸浮且在室溫下可靜止放置至少10min不發(fā)生聚積沉淀現(xiàn)象為準(zhǔn)。(3)微生物培養(yǎng)基的選擇微生物的培養(yǎng)基是根據(jù)菌種來選擇最適的培養(yǎng)基，一般以液體的培養(yǎng)基為主，并且需要滅菌處理；納米尺度碳材料也可以直接添加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，但是需要進(jìn)行超聲處理將其混勻。(4)納米尺度碳材料的懸浮液的添加在無菌的條件下，將上述的納米尺度碳材料懸浮溶液直接加入到相應(yīng)的微生物培養(yǎng)液中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。(5)微生物的高溫培養(yǎng)和發(fā)酵根據(jù)不同微生物的培養(yǎng)條件，以高于該種微生物的培養(yǎng)溫度進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵；同時(shí)需要測定不同溫度的生長曲線，確定納米尺度碳材料添加后，微生物最適的培養(yǎng)溫度。下面通過微生物生長狀況的測定，進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果及可行性。1、將37"C過夜培養(yǎng)的微生物培養(yǎng)液吸取lmL，接種到100mL的LB培養(yǎng)基(加有不同濃度的納米尺度碳材料)的三角瓶中，進(jìn)行振蕩，使菌體混勻，然后將它們置于不同溫度的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，在不同的時(shí)間段測定光密度OD值，測定時(shí)以未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長，測其吸光光度值，并繪制以培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))為橫坐標(biāo)，菌液的實(shí)際吸收值(OD600)為縱坐標(biāo)繪制大腸桿菌的生長曲線。2、以大腸桿菌和酵母菌為培養(yǎng)對象，在培養(yǎng)基中加入不同濃度納米尺度碳材料，測定其在高溫條件的生長情況及存活率，并繪制生長曲線。(l)在47'C和52C培養(yǎng)條件下，納米尺度碳材料對大腸桿菌液體培養(yǎng)生長的影響LB培養(yǎng)基加入納米尺度碳材料(不同濃度的碳納米粉)，并以1:100的加入大腸桿菌DH5a菌液，在47'C和52'C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別測定大腸桿菌的生長曲線，結(jié)果見圖1和圖2。由生長曲線看出納米尺度碳材料可以提高原核微生物(大腸桿菌)的培養(yǎng)溫度達(dá)10。C以上。(2)大腸桿菌高溫(75°C)情況下的存活率的測定LB培養(yǎng)基加入納米尺度碳材料(濃度為O.Olmg/mL單壁納米碳管)，并接入大腸桿菌DH5a，震蕩培養(yǎng)過夜后，75'C條件下進(jìn)行2-3小時(shí)培養(yǎng)，后取50uL涂板，菌落數(shù)見表l。因此，納米尺度碳材料可以提高原核微生物(大腸桿菌DH5a)在高溫條件下的生存率。表l.大腸桿菌在75-C情況下的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)在47'C培養(yǎng)條件下，納米尺度碳材料對酵母菌生長的影響加入納米尺度碳材料(不同濃度的碳納米粉，)，在47'C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別測定解脂酵母菌的生長曲線，結(jié)果見圖3。解脂酵母菌常規(guī)培養(yǎng)溫度為28°C,納米尺度碳材料可以使其在47t:的情況下保持較高的生長速度，因此納米尺度碳材料可以提高真核微生物(解脂酵母菌)的培養(yǎng)溫度達(dá)15'C以上權(quán)利要求1、一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基，其特征在于在微生物最適培養(yǎng)基中添加納米尺度碳材料。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基，其特征在于所述的納米尺度碳材料的大小在0.1納米至1000納米之間，包括碳粉納米顆粒和納米碳球，也包括一維的碳納米管、碳納米纖維。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基，其特征在于所述納米尺度碳材料的添加采取先分散在無菌的純水中，然后再稀釋到液相的微生物培養(yǎng)基中，或者直接分散在液相的微生物培養(yǎng)基中。4、一種如權(quán)利要求1所述的提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于步驟是(l)納米尺度碳材料的滅菌；(2)納米尺度碳材料的懸浮液的制備；(3)微生物培養(yǎng)基的選擇；(4)納米尺度碳材料的懸浮液的添加；(5)微生物的高溫培養(yǎng)和發(fā)酵。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述納米尺度碳材料懸浮溶液的制備方法是先精確稱取已滅菌的納米尺度碳材料置于己滅菌的離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水，隨后蓋緊離心管并置于超聲波振蕩器中超聲處理，具體的超聲功率及超聲時(shí)間以納米尺度碳材料完全懸浮且在室溫下可靜止放置至少10min不發(fā)生聚積沉淀現(xiàn)象為準(zhǔn)。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中納米尺度碳材料直接添加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，并用超聲處理將其混勻。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中將納米尺度碳材料懸浮溶液直接加入到相應(yīng)的微生物培養(yǎng)液中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基及其制備方法，通過在微生物的培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加納米級的碳材料，實(shí)現(xiàn)微生物的高溫條件的培養(yǎng)和發(fā)酵，從而達(dá)到提高工業(yè)微生物培養(yǎng)溫度和發(fā)酵溫度的目的。本發(fā)明可提高微生物在工業(yè)生產(chǎn)中的耐高溫性能，可以在酒精工業(yè)、發(fā)酵食品工業(yè)、氨基酸核苷酸發(fā)酵工業(yè)、有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)、有機(jī)化合物微生物轉(zhuǎn)化、工業(yè)石油發(fā)酵工業(yè)以及能源開發(fā)等諸多工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。文檔編號C12P1/00GK101544961SQ20091006872公開日2009年9月30日申請日期2009年5月4日優(yōu)先權(quán)日2009年5月4日發(fā)明者劉清岱,安紅杰,婷張,張治洲,王金菊申請人:天津科技大學(xué)