專利名稱：：鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法及其檢測套組的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及利用巢式聚合酶鏈式反應(nestedPCR)鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法及其檢測套組。
背景技術：
：結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)為革蘭氏陽性細菌中分枝桿菌屬(mycobacterium)的一個成員，而非結(jié)核性分枝桿菌(Nontuberculousmycobacterium)，或禾爾為非典型分枝桿菌(atypicalmycobacterium);非結(jié)核性分枝桿菌(mycobacteriumotherthantuberculosis)貝ll是分枝桿菌屬中除了結(jié)核桿菌以外細菌的統(tǒng)稱。其中的鳥型結(jié)核菌(Mycobacteriumaviumcomplex)廣泛的自艾滋病患的檢體被分離到后，非結(jié)核性分枝桿菌才受到重視。肺結(jié)核為世界上主要的致命性傳染疾病，目前有三分之一的人口患有肺結(jié)核，其中兩千萬人系活動性肺結(jié)核，超過五千萬人受到多重抗藥性的結(jié)核菌所感染，肺結(jié)核已成為HIV帶原者主要致死的原因且快速致死率高達百分之八十。肺結(jié)核由于結(jié)核分枝桿菌所引起，該病菌通過飛沫傳染并導致肺部不可逆的破壞，亦可能引發(fā)影響包括骨頭、關節(jié)、肝臟、脾臟、消化道及腦部等多重器官的系統(tǒng)性疾病，而貧窮、營養(yǎng)失衡及人口過多是肺結(jié)核持續(xù)存在且能廣泛分布的主因。過去以并用抗生素來控制肺結(jié)核，而現(xiàn)今多重抗藥性的結(jié)核菌株對抗生素的并用以及數(shù)量具有高度的耐受程度。在較為極端的病例中，以手術移除感染的部位是有其必要性。傳統(tǒng)而言，以觀察臨床征狀、胸部X光檢査為基礎以及痰液或組織抹片的確認仍是診斷肺結(jié)核的"黃金準則"。非結(jié)核性分枝桿菌在環(huán)境中普遍存在且種類繁多，目前超過九十余種。該菌可引發(fā)移生(colonization)、感染及院內(nèi)假性群突發(fā)(psudo-outbreak)，數(shù)據(jù)顯示因非結(jié)核性分枝桿菌所引起院內(nèi)突發(fā)感染的頻率正逐步增加，而正確且高標準地消毒醫(yī)療儀器以及正確且高標準地使用無菌藥劑或藥品可防止多數(shù)院內(nèi)感染的最佳法則，因為非結(jié)核性分枝桿菌并不會從院內(nèi)消失，且其感染能力正持續(xù)增加中，故所有院內(nèi)感染的情況均需考慮到是否為非結(jié)核性分枝桿菌所引起，且小心監(jiān)控以確認可能的突發(fā)感染。分析菌株的種類及檢體來源可協(xié)助確認菌群的重要性，一旦懷疑發(fā)生突發(fā)(out-break)或假性群突發(fā)，分生技術應可迅速確認來源及確定適當?shù)目刂拼胧ＷC據(jù)顯示，非結(jié)核性分枝桿菌所引發(fā)的院內(nèi)傳染正逐步增加，且所導致的狀況已由無害的移生轉(zhuǎn)變成具侵害性的感染。此外，非結(jié)核性分枝桿菌亦可造成微生物檢體的污染而導致不必要的治療及可能有害的診斷步驟。Rimyon(1959)曾依照菌落生長速度及菌落光照之后的顏色變化，將非結(jié)核性分枝桿菌分為以下四群第一群生長緩慢的光照產(chǎn)色菌(photochromogens)，即培養(yǎng)的菌落經(jīng)照光后成黃色。其中包括M.kansasii(坎薩斯分枝桿菌)、M.marinum、M.simiae、M.asiaticum等致病菌，以M.kansasii(坎薩斯分枝桿菌)為最常見。第二群生長緩慢的黑暗產(chǎn)色菌(scotochromogens)，即培養(yǎng)的菌落未經(jīng)照光即成黃色。其中包括M.scroflaceu、M.xenopi、Mszulgai、M.flavscens等致病菌，及M.gordonae非致病菌，以M.scrofblaceum為最常見。第三群生長緩慢的非光照產(chǎn)色菌(nonchromogens),即培養(yǎng)的菌落經(jīng)照光亦不改變顏色。其中包括M.aviumcomplex(鳥型分枝桿菌)、M.malmoense、M.shimoidei等可能致病菌及M.gastri、M.terrae、M.trivialez等非致病菌，M.aviumcomplex(鳥型分枝桿菌)為最常見。第四群生長迅速的分枝桿菌(rapid-growing)。其中包括M.fortuitum、M.chelonae畫abscessus、M.clelollac—chelonae等可能致病菌及M.phlei、M.smegmatis、M.vaccac、M.flavescens等非致病菌。最近，針對推定的結(jié)核性分枝桿菌或非結(jié)核性分枝桿菌所引起的院內(nèi)突發(fā)感染均采用分生技術來確認菌種來源及傳染模式。核酸探針(DNAprobe)、聚合酶鏈式反應分析(PCR)以及液態(tài)培養(yǎng)基對結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌具有較高敏感度且快速的診斷效能。然而在快速診斷技術敏感度的增加，與其專一性的增加并無相關，舉例來說，使用LightCycler(LC)儀器進行實時聚合酶鏈式反應分析(real-timePCRassay)提供一種快速、具敏感性及專一性檢測結(jié)核性分枝桿菌的工具，而PCT專利申請案(PCTpatentapplication)WO2007034118揭露了利用real-timePCR技術可檢測出可能存在于生物性檢體中屬于結(jié)核性分枝桿菌菌株的方法，其方法包括以PCR引物對(pairofprimers)進行放大反應、以屬于hsp65基因的FRET核酸探針進行專一性結(jié)合，最后檢測熒光強度。因無法充分支應儀器設置與保養(yǎng)所需的經(jīng)費，使得以LC儀器對結(jié)核性分枝桿菌進行例行性的診斷至今仍有其限制。韓國專利申請案KR20030075315揭露了利用多巢式聚合酶鏈式反應(multiple-nestedPCR)同步快速檢測TubercleBacillus(TB)及nontuberculousMycobacteria(NTM)的方法，此方法雖較傳統(tǒng)的PCR成功地增加其放大DNA片段的專一性，但需要對目標序列有更多的了解才能達成。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，其利用單工(uniplex)、復工(duplex)及多任務(multiplex)PCR技術進行擴增放大，再與連接著熒光微珠的TB和/或NTM核酸探針進行雜合反應，進而快速篩選出具感染力的TB和/或NTM的檢體。同步或分開使用高效且具菌種專一性的引物可擴增放大針對個別病原株(如同結(jié)核性分枝桿菌(TB)、鳥型分枝桿菌(MAC)、坎薩斯分枝桿菌(MK)及生長迅速的分枝桿菌(RGM))多個可供診斷的區(qū)域。本發(fā)明涉及TB和NTM所擁有rpoB基因的引物及探針，由上述各病原菌中分離出該基因后，以一個或多個由TB及NTM所設計的引物對在同一反應管中利用uniplex，duplex及multiplexPCR進行擴增放大作用，之后以探針進行雜合反應，再以Luminex儀器系統(tǒng)進行菌株種類的鑒別。此步驟將PCR產(chǎn)物與連接著熒光微珠的核酸探針進行雜合反應，可確認產(chǎn)物中的核酸序列以及通過連接著熒光微珠的核酸探針鑒別TB及NTM。PCR技術可將少量的細菌DNA增加至可提供分析的數(shù)量，適于使用在生長緩慢的菌種。近年來，以16SrRNA，23SrRNA及gene或在16S-23SrRNA間的三明治區(qū)域，該區(qū)域的特征在于位在不同TB基因兩端具高度保存的區(qū)域，而非位在不同TB基因中段具多型性或多變性區(qū)域的PCR技術檢測TB。這些區(qū)域可通過PCR擴增放大，而后用限制酶切割以進行鑒定。許多菌種利用PCR技術進行比較及鑒定，如PCR-限制片段長度多樣性(PCR曙restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)或巢式PCR。PCR-RFLP不僅可使用在鑒定不同的NTM，亦可判別NTM對rifampin是否具有抗藥性。本發(fā)明揭露PCR產(chǎn)物進一步可利用限制酶分析(如PCR-RFLP或PCR-單核苷酸多樣性(PCR-singlenucleotidepolymorphism,PCR-SNP))檢測菌株對rifampin是否具有抗藥性。利用與PCR產(chǎn)物相對應且連接獨特熒光微珠的核酸探針和PCR產(chǎn)物進行雜合反應可解析混合且經(jīng)擴增放大的PCR產(chǎn)物。雜合微珠通過液相反應來檢測PCR產(chǎn)物，而此方法在多任務形式(multiplexformat)下讓最大敏感性能夠有效地進行。10個帶有不同病原菌DNA的仿造及臨床的檢體可作為高效率的實例，這些檢體可萃取DNA，且可用于multiplexPCR液相微珠的檢測，這樣的分析可正確檢測病原的存在與否。這些病原菌包括結(jié)核分枝桿菌(TB)及非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，NTM依照Rimyon倫永氏群組分類法由光照產(chǎn)色菌、黑暗產(chǎn)色菌及非光照產(chǎn)色菌所組成，在此，NTM進一步包括鳥型分枝桿菌、坎薩斯分枝桿菌及生長迅速的分枝桿菌。Uniplex、duplex及multiplexPCR用于決定每個引物對對病原菌的效能，其結(jié)果亦可展現(xiàn)出每個引物對對鑒別TB及NTM的個別效果，使用于TB及NTM間的引物對并不會發(fā)生交叉干擾的情況。專門名詞定義(Termdefinition)核酸(nucleicacid)以共價鍵結(jié)方式連接至少兩個自然發(fā)生或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷或核糖核苷所形成的序列。報告者(reporter)一種化學官能團或基團，能以適當?shù)臋z測系統(tǒng)予以辨識，特別是帶有檢測官能團的檢測分子在進行分子分離之時或之后。其包括多種酵素、熒光物質(zhì)、冷光物質(zhì)、生物性冷光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、使用在多種正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positronemissiontomography)的正電子放射金屬(positronemittingmetals)。上述所舉出的酵素范例包括辣根過氧化酶(horseradishperoxidase)、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適合的熒光物質(zhì)包括傘形酮(umbelliferone)、熒光黃(fluorescein)、異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪氨熒光黃(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯(dansylchloride)或藻紅蛋白(phycoerythrin);冷光物質(zhì)的范例包括有色微球體(coloredmicrospheres,CMS)或發(fā)光氨(luminol);生物性冷光物質(zhì)的范例包括冷光酶(luciferase)、冷光素(luciferin)及水母素(aequorin)以及適當放射性物質(zhì)的范例包括碘-125、碘-131、銦-111或鐯-99。Reporter可依前案所揭示的技術采直接或間接的方式進行連接或結(jié)合，例如美國專利案US4741,900揭露金屬離子可連結(jié)在用作診斷、具目標專一性辨識的抗體上。依據(jù)不同標的的形式(核酸或抗原)，連接者可為核酸片段或抗體(或其抗體片段)。禾示的基因(targetgene)本發(fā)明關于核苷酸序列包含具高度專一性的寡核苷酸引物，其依TB及NTM的基因特定的部份進行合成及雜合反應，而基因特定的部份具有SEQIDNO:1-4的序列。此外，本發(fā)明亦提供新的核酸探針序列SEQIDNO:5-8，用作檢測巢式PCR產(chǎn)物，因此，此核酸序列可檢測TB或NTM的存在與否。本發(fā)明提供的引物對用在巢式PCR反應以檢測經(jīng)純化的核酸混合物檢體中是否有TBrpoB基因的存在，而核酸混合物檢體由可能受感染的樣本中萃取而來。巢式PCR(nestedPCR)包括兩階段式的聚合酶鏈式反應，第一階段應用外部(outer)引物對對特定第一標的核苷酸序列(firsttargetnucleotidesequence)進行擴增放大，第二階段應用內(nèi)部或巢式(innerornested)引物對對較小的第二標的核苷酸序列(secondtargetnucleotidesequence)進行擴增放大，而第二標的核苷酸序列在第一標的核苷酸序列之間，且標的核苷酸序列系為TB基因的待測區(qū)段。弓I物對的標記(labeledprimers)引物對在nestedPCR系用來進行第一或第二階段擴增放大反應，而引物對上的標記則作為直接檢測經(jīng)擴增放大的產(chǎn)物。使用在引物對上的標記包括熒光分子、放射性分子、呈色受質(zhì)、生物素(biotin)、吖啶酯類化合物(acridiniumester)及氨甲酰吖啶類化合物(acridinium-9-carboxamide)。以生物素作標記已是公開的信息，如同熒光分子及放射性分子標記在寡核苷酸及核苷酸中。本發(fā)明內(nèi)部引物對系以生物素進行標記。若使用生物素進行標記，則以經(jīng)連接可檢測標記的親和素(avidin)或鏈霉親和素(streptavidin)進行檢測，而可檢測標記為酵素，如horseradishperoxidase,供作連接的酵素可由商業(yè)化公司如VectorLaboratories取得。鏈霉親和素與生物素間具有高度親和力，洗去未與生物素結(jié)合的鏈霉親和素，在horseradishperoxidase存在下，j吏用光致發(fā)光受質(zhì)(luminescence-emissionsubstrate)及緩沖液并以Luminometer進行銜則。簡言之，通過檢測化學發(fā)光的波長及強度可以進行鑒定及定量。本發(fā)明提供一種用于鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的檢測套組，其包含a.由SEQIDNO:1及SEQIDNO:2所組成的結(jié)核分枝桿菌引物對；b.由SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；c.SEQIDNO:5的結(jié)核分枝桿菌的核酸探針；d.SEQIDNO:6、7、8的非結(jié)核分枝桿菌的核酸探針，其中各引物對中具有意義的引物連接到可檢測的標記上，各核酸探針連接到另一可檢測的標記上。本發(fā)明中可檢測的標記選自于熒光物質(zhì)、冷光物質(zhì)、放射線物質(zhì)或呈色物質(zhì)。本發(fā)明中可檢測的標記若為生物素，該檢測套組可進一步包含親和素或鏈霉親和素與共軛物所形成的復合物。本發(fā)明中共軛物為酵素或光敏物質(zhì)。本發(fā)明亦提供一種用于檢測鳥型分枝桿菌的檢測套組，其包含a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:6所示，對鳥型分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。本發(fā)明進一步提供一種用于檢測坎薩斯分枝桿菌的檢測套組，其包a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:7所示，對坎薩斯分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。本發(fā)明更進一步提供一種用于檢測快速生長結(jié)核分枝桿菌的檢測套組，其包含a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:8所示，對快速生長結(jié)核分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。圖1顯示臨床檢體經(jīng)uniplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，MAC61,71,72,73及74代表鳥型分枝桿菌檢體。圖2顯示臨床檢體經(jīng)duplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，MAC61，71,72，73及74代表鳥型分枝桿菌檢體。圖3顯示臨床檢體經(jīng)multiplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針進行雜合反應，并以Liiminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，MAC61，71，72,73及74代表鳥型分枝桿菌檢體。圖4顯示臨床檢體經(jīng)uniplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，K-El1,K-F2，K-F14,K-F15及K-F22代表坎薩斯分枝桿菌檢體。圖5顯示臨床檢體經(jīng)duplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，K-E11,K-F2,K-F14，K-F15及K-F22代表坎薩斯分枝桿菌檢體。圖6顯示臨床檢體經(jīng)multiplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，K-E11，K-F2，K-F14,K-F15及K-F22代表坎薩斯分枝桿菌檢體。圖7顯示臨床檢體經(jīng)uniplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，RGM1,RGM2，RGM3，RGM4andRGM5代表生長迅速的分枝桿菌檢體。圖8顯示臨床檢體經(jīng)duplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針進行雜合反應，并以Lmninex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，RGMl，RGM2,RGM3,RGM4andRGM5代表生長迅速的分枝桿菌檢體。圖9顯示臨床檢體經(jīng)multiplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針進行雜合反應，并以Luminex儀器進行分析的結(jié)果。TB代表結(jié)核性分枝桿菌檢體，RGMl,RGM2,RGM3,RGM4andRGM5代表生長迅速的分枝桿菌檢體。具體實施例方式惟以下所述者，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明實施的范圍，舉凡依本發(fā)明所述特征及精神，均應包括于本發(fā)明的權利要求范圍內(nèi)。材料及方法1.引物與探針(1)Tbcl與TbcR5—TB菌的引物對。(2)NTM-M5與NTM-RM3—NTM菌的引物對。(3)TB探ff—AfycoZnafcfen'MW^Zercw/os7'j的探f"f。(4)MAC探ft——i^co6""en'M附"v/ww的探牽十。(5)MK探針一聊coZ)acten'wwfcmsos/z'的探針。(6)RGM探針_RapidGrowersMycobacterium的探針。2.臨床檢體(1)AfycoZ>""m'ww^^ercw/os7.-y(TB)(2)71^co6acfen.簡av/ww(MAC)(3)AfycoZ^"m'調(diào)fc3"sos77(MK)(4)RapidGrowersMycobacterium(RGM)3.純化臨床檢體DNA:(1)取lml—倍磷酸緩沖溶液(PBS)于微量管(eppendorf)中，用括取環(huán)(loop)刮取菌落，與PBS中混合均勻后加防爆夾，旋轉(zhuǎn)振動(vortex)一下，于80-90。C加熱30分鐘。(2)之后靜置至室溫，離心10000g，5分鐘。倒掉上清液，加入400ltd的TE(Tris10mM，pH-8.0，EDTAlmM)以及50|ul的溶菌酶(lysozyme)10mg/ml，vortex—下，放入37"C水浴1小時。G)取出樣本，加入70|ul的10%SDS以及6pi的蛋白酶K(proteinaseK)10mg/ml，vortex—下，放入6(TC水浴10分鐘。(4)取出sample,加入100|id冰的5MNaCl，并反轉(zhuǎn)數(shù)次，再加入80|il的溴化十六烷基三甲基銨(CTAB，cetyltrimethylammoniumbromide)/NaCl，并反轉(zhuǎn)數(shù)次，放入65r水浴IO分鐘。(5)加等體積的三氯甲烷/異戊醇(chloroform/isoamylalcohol(24:1)，并反轉(zhuǎn)數(shù)次，離心10000g，5分鐘，取上清液至新的eppendorf中。(6)加入500iul的異丙醇(isopropanol)，并放于-20。C冰箱中30分鐘。之后離心14000g，20分鐘，倒掉上清液。(7)加入500|111冰的70%酒精，離心14000g，5分鐘，倒掉上清液，烘干，加入50(J無菌水。4.PCR反應(1)取0.2mlPCR專用tube，加入以下的物質(zhì):反應劑體積DNAljil(3ng/(il)反應混合液49jal**反應混合液包含以下的物質(zhì)反應劑體積10x聚合酵素延長緩沖液5^1引物Tbcl(lO[iM)lpl引物TbcR5(lO(iM)lpl(生物素標記)引物NTM-M5(lOpM)(生物素標記)弓I物NTM-脂3(10,1(J核苷酸(2.5mM)2.5plTaqDNApolymerase(2U/V1)0.25(ilddH2037.25jil(2)待加完上述所列物質(zhì)并混合均勻之后，便開始以下的擴增放大程序。擴增放大程序溫度時間循環(huán)數(shù)(numberofcycle)195°C5分鐘1個循環(huán)95°C30秒265°C30秒30個循環(huán)72°C60秒14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>5.雜合反應(1)取5plPCR產(chǎn)物，加入l(Hil二次水，混合均勻，在95"反應10分鐘。(2)之后加入各的TB微珠探針(microsphereprobe)與MAC微珠探針或是MK微珠探針或是RGM微珠探針以及33^1的1.5倍TMAC，4.5M氯化四甲基銨(tetramethylammoniumchloride)，0.15%SDS，75mMpH8.0Tris-HCl，6mMpH8.0EDTA)。(3)混合均勻后在46'C反應1小時。6.檢測反應(1)將完成雜合反應的反應物離心14000rpm，2分鐘，去除上清液。(2)力卩入50]li1的1倍TMAC(3Mtetramethylammoniumchloride,0.1%SDS，50mMpH8.0Tris-HCl，4mMpH8.0EDTA)清洗，再離心14000rpm，2分鐘，去除上清液。(3)重復步驟(2)。(4)將1mg/ml的鏈霉親合素畫藻紅蛋白(streptavidin-phycoerythrin，SA-PE)以l:250的比例稀釋于1倍TMAC，再加入50^1于樣品中混合均勻，避光震蕩搖晃呈色10分鐘。(5)將樣品注入96孔盤中，進行Luminex的測試。結(jié)果1.將10個AfycoZ^cfen'wwaWwm(MAC)的臨床檢體以單工(uniplex)與復工(duplex)PCR反應以及與勵e簡/as7i(TB)DNA所做的多任務(multiplex)PCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針一起進行Luminex測試，其結(jié)果如圖l-圖3所示。(1)在UniplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針一起進行雜合反應并通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MAC檢體不會有信號；而MAC探針會對MAC檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖l)。(2)在duplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針一起進行雜合反應并通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MAC檢體不會有信號；而MAC探針會對MAC檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖2)。(3)在multiplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MAC探針一起進行雜合反應并通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MAC檢體不會有信號；而MAC探針會對MAC檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖3)。2.將10個A:"raa^7(MK)的臨床檢體以uniplex與duplexPCR反應以及與聘cokzcfen'wm/w6^rw/ow、(TB)DNA所做的multiplexPCR反應的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針一起進行Luminex測試，其結(jié)果如圖4-圖6所示。(1)在UniplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MK檢體不會有信號；而MK探針會對MK檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖4)。(2)在duplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MK檢體不會有信號；而MK探針會對MK檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖5)。(3)在multiplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和MK探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對MK檢體不會有信號；而MK探針會對MK檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖6)。3.將10個iqp/dgrawera辟co6ac,en'wm(RGM)的臨床檢體以uniplex與duplexPCR反應以及與聊coZ(3c^讀/由腦/0*(TB)DNA所估々的multiplexPCR反應之PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針一起進行Luminex測試，其結(jié)果如圖7-圖9所示。(1)在UniplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對RGM檢體不會有信號；而RGM探針會對RGM檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖7)。(2)在duplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對RGM檢體不會有信號；而RGM探針會對RGM檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖8)。(3)在multiplexPCRreaction的PCR產(chǎn)物與TB探針和RGM探針一起進行雜合反應并通過通過Luminex測試，其結(jié)果顯示TB探針只會對TB檢體有信號，對RGM檢體不會有信號；而RGM探針會對RGM檢體有信號，對TB檢體不會有信號(如圖9)。序列表<110>亞洲基因科技股份有限公司<120>鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法及其檢測套組<130>9P04032-TW<160>8<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis(MTB)<221>primer—bind<222>(1).,(2力<400>1cgtacggtcggcgagctgatccaa24<210>2<211>25<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis(MTB)<220><221>primer—bind<222>(1)..(2;)<400>2ttgacccacaagcgccgactgtcgg25<210>3<211>25<212>DNA<213>非結(jié)核分枝桿菌Nontuberculousmycobacterium(NTM)<221>primer—bind<222>h)-.(2f)<400>3ggagcggatgaccacccaggacgtc25<210>4<211>25<212>DNA<213>非結(jié)核分枝桿菌Nontuberculousmycobacterium(NTM)<221>primer—bind<222>(1)..(2§")<400>4cagcgggttgttctggtccatgaac2518<210>5<211>17<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis<221>Probe<222>(i)..(n)<400>5caaaaccagatccgggt17<210>6<211>20<212>DNA<213>鳥型分枝桿菌Mycobacteriumaviumcomplex<221>Probe<222>(I)..(20)<400>6gccatcacgccgcagaccct20<210>7<211>21<212>DNA<213>坎薩斯分枝桿菌Mycobacteriumkansasii<221>Probe<222>(1)..(21)<400>7atccgcccggtggtcgccgcc<210>8<211>21<212>DNA<213>快速生長結(jié)核分豐支桿菌Rapid-GrowingMycobacteriumtuberculosis<221>Probe<222>(1)..(21)<400>8tcggaaccagccagctgtcgc權利要求1.一種用于鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的檢測套組，其特征在于包含a.由SEQIDNO1及SEQIDNO2所組成的結(jié)核分枝桿菌引物對；b.由SEQIDNO3及SEQIDNO4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；c.SEQIDNO5的結(jié)核分枝桿菌的核酸探針；d.SEQIDNO6、7、8的非結(jié)核分枝桿菌的核酸探針，其中各引物對中具有意義的引物連接到可檢測的標記上，各核酸探針連接到另一可檢測的標記上。2.如權利要求1所述的檢測套組，其特征在于可檢測的標記選自于熒光物質(zhì)、冷光物質(zhì)、放射線物質(zhì)或呈色物質(zhì)。3.如權利要求1所述的檢測套組，其特征在于可檢測的標記為生物素，該檢測套組可進一步包含親和素或鏈霉親和素與共軛物所形成的復合物。4.如權利要求1所述的檢測套組，其特征在于共軛物為酵素或光敏物質(zhì)。5.如權利要求1所述的檢測套組，其特征在于非結(jié)核分枝桿菌依倫永氏分類法選自由以下所組成的群組光照產(chǎn)色菌、黑暗產(chǎn)色菌、非光照產(chǎn)色菌及快速生長結(jié)核分枝桿菌。6.如權利要求5所述的檢測套組，其特征在于非結(jié)核分枝桿菌選自以下所組成的群組鳥型分枝桿菌、坎薩斯分枝桿菌及快速生長結(jié)核分枝桿菌。7.—種用于檢測鳥型分枝桿菌的檢測套組，其特征在于包含a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:6所示，對鳥型分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。8.—種用于檢測坎薩斯分枝桿菌的檢測套組，其特征在于包含a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:7所示，對坎薩斯分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。9.一種用于檢測快速生長結(jié)核分枝桿菌的檢測套組，其特征在于包a.SEQIDNO:3及SEQIDNO:4所組成的非結(jié)核分枝桿菌引物對；及b.如SEQIDNO:8所示，對快速生長結(jié)核分枝桿菌具專一性的核酸探針，其中所述的核酸探針連接到可檢測的標記上。全文摘要本發(fā)明涉及鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法及其檢測套組，利用巢式聚合酶鏈式反應(nestedPCR)鑒別結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)與非結(jié)核性分枝桿菌(nontuberculousmycobacterium)的方法及其檢測套組。文檔編號C12N15/11GK101560568SQ200910135228公開日2009年10月21日申請日期2009年4月16日優(yōu)先權日2008年4月16日發(fā)明者周錦生申請人:亞洲基因科技股份有限公司