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      利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法

      文檔序號:563217閱讀:310來源:國知局
      專利名稱:利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法
      技術領域
      本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領域,具體涉及一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸
      和蛋白飼料添加劑的方法。
      背景技術
      微藻中含有脂肪酸、蛋白質和碳水化合物等多種營養(yǎng)成分,是一種很好的可再生 資源。隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)中脂肪酸含量可高達50 %左右,二十二碳六烯 酸(DHA)的含量可占到脂肪酸含量的50%左右。提取脂肪酸的藻渣中蛋白質含量大幅提 高,高達46%左右,同時還有殘存的多不飽和脂肪酸,是一種很好的蛋白質飼料資源。隱甲 藻(Crypthecodinium cohnii)制備脂肪酸以及藻體作為水產(chǎn)餌料的安全性已經(jīng)被廣泛認 可。如何最大限度的利用發(fā)酵生產(chǎn)微藻中的多不飽和脂肪酸和蛋白質資源是一個需要解決 的問題。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足,提供一種利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法,本發(fā)明方法不僅可以生產(chǎn)多不飽 和脂肪酸以及DHA,而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣,具有經(jīng)濟可行性,而且可以變藻 渣為寶,實現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
      本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn) —種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法,包括如下步驟
      (1)低溫保存的隱甲藻經(jīng)擴大培養(yǎng)制得微藻種子液;將微藻種子液接種到滅菌后 的發(fā)酵培養(yǎng)基,在20 3(TC下發(fā)酵,通氣量為0. 5 1. 5vvm,當糖濃度低于5g/L時,終止 發(fā)酵,得到發(fā)酵液; (2)分離步驟(1)得到的發(fā)酵液后,洗滌并干燥不溶物,得到藻體; (3)將藻體進行壓榨提取,得到粗品油,經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪
      酸精煉油; (4)壓榨后的藻渣粉碎后作為飼料添加劑。 步驟(1)所述擴大培養(yǎng)是將低溫保存的隱甲藻經(jīng)試管和搖瓶逐級放大,在20 3(TC條件下,分別培養(yǎng)24 60小時,制得微藻種子液。試管和搖瓶培養(yǎng)階段均采用和發(fā)酵 培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基,制得微藻種子液;
      步驟(1)所述發(fā)酵是在氣升式反應器中進行。 步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)基采用Porphyridium培養(yǎng)基,組成如下人造海水500mL, 蒸餾水400mL,土壤水lOOmL,胰蛋白胨lg/L,酵母粉lg/L g,葡萄糖30g/L。
      所述的人造海水組成如下NaCl 18g/L, MgS04 7H20 2. 44g/L, KC1 0. 6g/L, NaN03l. 00g/L, CaCl2 2H20 0. 3g/L, KH2P040 . 05g/L, Tris 1. 00g/L, NH4C1 0. 267g/L, VB12 1. 5 X 10—7g/L,金屬離子溶液10mL,螯合鐵離子溶液3mL。
      所述的金屬離子溶液組成如下H3B03 0 . 3 2 46g/100mL, CoCl2 6H20 1. 215X 10—4g/100mL, MnCl2 6H20 4. 320 X 10—5g/100mL, ZnCl2 3. 150 X 10—3g/100mL,濃硫酸 lmL, (NH4)6Mo7024 4H20 3. 119X 10—3g/100mL。所述的螯合鐵離子溶液組成如下0. lmol/L HC1 50mL, FeCl3 6H20
      0. 081g/100mL,蒸餾水50mL, Na2EDTA 1. 000g/100mL。 步驟(1)所述接種的接種量為5 10%。 步驟(2)所述分離為采用離心分離或板框壓濾。 步驟(2)所述干燥為采用噴霧干燥或冷凍干燥。 步驟(2)所述洗滌為洗滌不溶物3 5次。 步驟(1)所述的滅菌是將發(fā)酵培養(yǎng)基在115t:下滅菌30分鐘。步驟(1)所述的低溫為4。C、-20。C、-8(TC或-196。C。 步驟(1)所述發(fā)酵時,當糖濃度低于10g/L時,將碳源以及氮源以流加方式進行補
      加,延長了藻類對數(shù)生長期,可以有效地提高藻體濃度,降低下游工藝的生產(chǎn)成本。 步驟(1)所述的隱甲藻為Crypthecodinium cohnii。例如ATCC30556或者其馴化菌株。 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術所具有的優(yōu)點和有益效果 1.利用一種異養(yǎng)微藻,隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)在氣升式反應器中發(fā) 酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸,可以降低機械攪拌反應器的剪切力對藻生長和產(chǎn)脂肪酸的影響, 具有設備結構簡單、節(jié)能和節(jié)省投資等優(yōu)點。 2.采用流加工藝,延長藻類對數(shù)生長期,可以有效地提高藻體濃度,降低下游工藝 的生產(chǎn)成本。 3.通過壓榨進行多不飽和脂肪酸的提取,工藝簡單可行。
      4.壓榨后的藻渣經(jīng)粉碎后可以用作蛋白質飼料添加劑。
      具體實施例方式
      本發(fā)明實施例所用培養(yǎng)基采用Porphyridium培養(yǎng)基,組成如下人造海水500mL, 蒸餾水400mL,土壤水lOOmL,胰蛋白胨lg/L,酵母粉lg/Lg,葡萄糖30g/L。
      人造海水組成如下:NaCl 18g/L, MgS04 7H20 2. 44g/L, KC1 0. 6g/L,關03 1. 00g/L, CaCl2 2H20 0. 3g/L, KH2P04 0. 05g/L, Tris 1. 00g/L, NH4C1 0. 267g/L, VB12 1. 5X 10—7g/L,金屬離 子溶液lOmL,螯合鐵離子溶液3mL。 金屬離子溶液組成如下:H3B03 0. 3246g/100mL, CoCl2 6H20 1. 215 X 10—4g/100mL, MnCl2 *6H20 4. 320X 10—5g/100mL, ZnCl2 3. 150X 10—3g/100mL,硫酸lmL, (NH4)6Mo7024 *4H203. 119X 10—3g/100mL。 螯合鐵離子溶液組成如下0. lmol/L HC1 50mL, FeCl3 6H20 0. 081g/100mL,蒸餾 水50mL, Na2EDTA 1. 000g/100mL。
      實施例1 利用微藻在氣升式反應器中發(fā)酵同時生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法,具體如下 (1)微藻種子液制備-80。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng)試管和搖瓶逐級放大,采用Porphyridium培養(yǎng)基,在2(TC條件下,試管和搖瓶階段分別 培養(yǎng)48小時,制得微藻種子液; (2)發(fā)酵10L氣升式反應器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基), 在115t:下滅菌30分鐘,冷卻至25t:,將制好的微藻種子液以5%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng) 基,控制溫度25°C,通入無菌空氣0. 5vvm,發(fā)酵60小時后,當葡萄糖濃度低于10g/L時, 分兩次加入總量為500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和蛋白胨,120小時藻體含量達到 35. 3g/L,當糖濃度低于5g/L時,終止發(fā)酵,得到發(fā)酵液; (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進行離心分離、洗滌不溶物3次,收集不溶物,將收 集的藻體進行噴霧干燥,得到186克干燥藻體; (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進行壓榨提取,經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油352克,含DHA 36. 5% ; (5)壓榨后的藻渣632.5克,蛋白質含量46. 1 % ,經(jīng)粉碎可以作為蛋白質飼料添加 劑。 實施例2 利用微藻在氣升式反應器中發(fā)酵同時生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法,具體如下 (1)微藻種子液制備-196 。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng)試管和搖瓶逐級放大,采用Porphyridium培養(yǎng)基,在25。C條件下,試 管和搖瓶階段分別培養(yǎng)40小時,制得微藻種子液; (2)發(fā)酵10L氣升式反應器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基), 在115t:下滅菌30分鐘,冷卻至28t:,按照5%接種量接入種子液,控制溫度28t:,通入無 菌空氣1. Ovvm,發(fā)酵54小時后,當葡萄糖濃度低于10g/L時,分兩次補加500g/L碳源以及 100g/L酵母抽提物和蛋白胨,108小時藻體含量達到34. 2g/L,當糖濃度低于5g/L時,終止 發(fā)酵; (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進行離心分離,并洗滌不溶物5次,收集不溶物藻 體,將收集的藻體進行噴霧干燥,得到179克干燥藻體; (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進行壓榨提取,經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油338克,含DHA 33. 4% ; (5)壓榨后的藻渣約632克,蛋白質含量約47.2%,經(jīng)粉碎可以作為蛋白質飼料添 加劑。 實施例3 利用微藻在氣升式反應器中發(fā)酵同時生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法,具體如下 (1)微藻種子液制備4。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng) 試管和搖瓶逐級放大,采用Porphyridium培養(yǎng)基,在3(TC條件下,試管和搖瓶階段培養(yǎng)24 小時,制得微藻種子液; (2)發(fā)酵10L氣升式反應器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基), 在115t:下滅菌30分鐘,冷卻至30°C ,按照10%接種量接入種子液,控制溫度30°C ,通入無 菌空氣1. 5vvm,發(fā)酵48小時后,分兩次加入總量為500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和
      5蛋白胨,84小時藻體含量達到36. 2g/L,當糖濃度低于5g/L時,終止發(fā)酵; (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進行離心分離,并洗滌不溶物3次,收集不溶物藻
      體。將收集的藻體進行噴霧干燥,得到191克干燥藻體; (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進行壓榨提取,經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油308克,含DHA 28. 5% (5)壓榨后的藻渣約667克,蛋白質含量約45.5%,經(jīng)粉碎可以作為蛋白質飼料添 加劑。
      權利要求
      一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法,其特征在于,包括如下步驟(1)低溫保存的隱甲藻經(jīng)擴大培養(yǎng)制得微藻種子液;將微藻種子液接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基,在20~30℃下發(fā)酵,通氣量為0.5~1.5vvm,當糖濃度低于5g/L時,終止發(fā)酵,得到發(fā)酵液;(2)分離步驟(1)得到的發(fā)酵液后,洗滌并干燥不溶物,得到藻體;(3)將藻體進行壓榨提取,得到粗品油,經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油;(4)壓榨后的藻渣粉碎后作為飼料添加劑。
      2. 根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)所述的隱甲藻為 Crypthecodiniumcohnii 。
      3. 根據(jù)權利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(1)所述擴大培養(yǎng)是將低溫保存的 隱甲藻經(jīng)試管和搖瓶逐級放大,在20 3(TC條件下,分別培養(yǎng)24 60小時,制得微藻種子 液。
      4. 根據(jù)權利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(1)所述發(fā)酵是在氣升式反應器中進行。
      5. 根據(jù)權利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)基采用 Porphyridium培養(yǎng)基,組成如下人造海水500mL,蒸餾水400mL, 土壤水lOOmL,胰蛋白胨 lg/L,酵母粉lg/Lg,葡萄糖30g/L。
      6. 根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)所述接種的接種量為5 10%。
      7. 根據(jù)權利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(2)所述分離為采用離心分離或板框 壓濾。
      8. 根據(jù)權利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(2)所述干燥為采用噴霧干燥或冷凍 干燥。
      9. 據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(2)所述洗滌為洗滌不溶物3 5次。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法。本發(fā)明利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)在氣升式生物反應器中發(fā)酵同時生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑,包括微藻種子液制備、發(fā)酵、藻體收集和干燥、多不飽和脂肪酸的提取幾個步驟。本發(fā)明方法得到的精煉油中DHA含量達36.5%,提取多不飽和脂肪酸后微藻渣(干)蛋白質含量達到46.3%,本發(fā)明方法不僅可以生產(chǎn)多不飽和脂肪酸以及DHA,而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣,具有經(jīng)濟可行性,而且可以變藻渣為寶,實現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
      文檔編號C12P7/64GK101717800SQ20091019373
      公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月6日 優(yōu)先權日2009年11月6日
      發(fā)明者朱明軍, 梁世中, 王菊芳, 郭星 申請人:華南理工大學;江西泰成生物科技有限公司
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