專利名稱：：Cyp2d6基因突變檢測液相芯片及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及CYP2D6基因突變檢測液相芯片及檢測方法。
背景技術(shù)：
：他莫昔芬(TAM，tamoxifen,又名三苯氧胺)是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似。雌激素進入乳腺癌細胞內(nèi)后，能與雌激素受體(ER，estrogenreceptor)結(jié)合，促進腫瘤細胞的DNA和m_RNA的合成，刺激腫瘤細胞生長。而TAM進入細胞內(nèi)能與雌激素競爭結(jié)合雌激素受體，阻止雌激素作用的發(fā)揮，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。TAM治療屬于乳腺癌內(nèi)分泌治療(endocrinetreatment)的其中一種，而另一種常用的內(nèi)分泌治療藥物是芳香酶抑制劑類藥物(aromataseinhibitors)0但芳香酶抑制劑只適用于絕經(jīng)后的ER陽性乳腺癌患者，因此此類患者可根據(jù)個體情況從TAM或芳香酶抑制劑中選擇一種；而對于絕經(jīng)前的ER陽性乳腺癌患者，TAM仍是輔助治療的首選。TAM是一種前體藥物，在受人體代謝前的藥物活性并不強，進入人體經(jīng)CYP450酶系代謝后會產(chǎn)生兩種代謝產(chǎn)物——4-hydroxy-TAM和endoxifen，它們的藥物活性(與ER的結(jié)合能力)均大幅高于TAM，活性最強的endoxifen甚至是TAM活性的100倍。CYP2D6是TAM代謝生成活性產(chǎn)物的主要限速酶，大量的研究已經(jīng)證明，接受TAM治療的患者其血液中活性代謝產(chǎn)物的濃度與患者CYP2D6的基因型以及是否服用抑制CYP2D6活性的藥物密切相關(guān)。CYP2D6酶活性減弱的患者他們血液中的代謝產(chǎn)物的濃度與正?；颊呦啾蕊@著降低。目前國外已進行了大量針對CYP2D6基因型和TAM治療效果之間關(guān)系的研究，其中大部分研究結(jié)果表明，CYP2D6*4純合子(能導(dǎo)致CYP2D6酶活性的喪失，主要流行于歐美國家)的攜帶者接受長期的TAM治療，其無疾病生存期(DFS，diease-freesurvival)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS，relapse-freesurvival)均顯著低于CYP2D6野生型純合子攜帶者。在亞洲國家，CYP2D6等位基因型分布與歐美國家差異很大，中國主要流行的CYP2D6缺陷型為CYP2D6*10(能導(dǎo)致CYP2D6酶活性的降低，但并非完全喪失)，而CYP2D6*5也占有一定的比例，而CYP2D6*4卻低于1%。目前針對中國CYP2D6等位基因型分布與TAM療效關(guān)系的研究主要是XuY對CYP2D6*10的研究報告。XuY得出的結(jié)論是CYP2D6*10純合子同樣能降低TAM代謝產(chǎn)物在血液中的濃度，并導(dǎo)致患者DFS的下降。基于以上研究的結(jié)論，美國FDA于2006年建議患者在接受TAM治療前首先對CYP2D6的基因型進行檢測，特別是絕經(jīng)后的ER陽性乳腺癌患者，芳香酶抑制劑并不受CYP2D6的酶活性影響，所以這類患者如果被檢測為CYP2D6功能減弱等位基因攜帶者，接受芳香酶抑制劑治療會更有效。CYP2D6基因的兩種正?；蛐蜑镃YP2D6*1和CYP2D6*2，其中CYP2D6*2為C2850T突變。五種國內(nèi)常見突變基因型為CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重復(fù)突變。CYP2D6*3為A2549del缺失突變，CYP2D6*4為C100T和G1846A共同突變，CYP2D6*5為整個基因缺失突變，CYP2D6*10為C100T突變，此外還有整個基因的重復(fù)突變。目前國內(nèi)外的檢測CYP2D6基因突變的產(chǎn)品，如AmershamBioscience(GEhealthcare)的CodeLinkP450，Roche的AmpliChipCYP450Test等，主要建立在傳統(tǒng)固相芯片的基礎(chǔ)上，價格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。而其它以PCR為基礎(chǔ)的檢測基因突變的技術(shù)，如直接測序法，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測，這些技術(shù)存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點。而聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進行一種突變的檢測，耗時費力。液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時具備了快速準確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點。我們采用液相芯片技術(shù)可以同時檢測多種基因突變，實現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供CYP2D6基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP2D6基因的兩種正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五種國內(nèi)常見突變基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重復(fù)(GeneDuplication)突變。一種CYP2D6基因突變檢測液相芯片，包括有(A).針對CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突變位點的ASPE引物每種ASPE引物由3’端的針對目的基因突變位點的特異性引物序列和5’端的tag序列組成，所述特異性引物序列分別為:SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、和SEQID20；所述tag序列選自SEQIDNO.1-10中的任3種序列；(B).分別包被有特異的anti-tag序列的3種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.21SEQIDN0.30中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增具有CYP2D6C2850T、以及CYP2D6Deletion突變位點的CYP2D6基因目標(biāo)序列的擴增引物。優(yōu)選地，擴增引物包括有SEQIDNO.37及SEQIDNO.38，和SEQIDNO.41及SEQIDNO.42；更優(yōu)選地，還包括有可使擴增效果更好的用于巢式PCR的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32。優(yōu)選地，所述(A)中ASPE引物為針對CYP2D6C2850T的野生型和突變型由SEQIDNO.7和SEQIDNO.17組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.18組成的序列、及針對CYP2D6Deletion的由SEQIDNO.10和SEQIDNO.20組成的序列。優(yōu)選地，還包括(D)針對CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、和/或CYP2D6Dulplicatio突變位點的ASPE引物，每種ASPE引物由3，端的針對目的基因突變位點的特異性引物序列和5’端的tag序列組成，所述特異性引物序列為針對CYP2D6C100T的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；針對CYP2D6G1846A的SEQIDNO.13及SEQIDN0.14；針對CYP2D6A2549del的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、和針對CYP2D6Dulplicatio的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.19組成的序列中的一組或多組；所述tag序列選自SEQIDNO.1-10中的序列，該所選tag序列與(A)中所選tag序列不相同；還包括與(D)中ASPE引物對應(yīng)的包被有特異的anti-tag序列的種微球，所述anti-tag序列與(D)中的所選的對應(yīng)tag序列互補配對；還包括用于擴增具有CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、CYP2D6Dulplication中一個或多個突變位點的CYP2D6基因目標(biāo)序列的擴增引物，優(yōu)選地，所述擴增引物為SEQ而.31-32以及針對〔￥206C100T的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、針對CYP2D6G1846A的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、針對CYP2D6A2549del的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和針對CYP2D6Dulplication的SEQIDNO.39及SEQIDN0.40中的一組或多組。更優(yōu)選地，所述(D)中，ASPE引物為針對CYP2D6C100T的野生型和突變型由SEQIDNO.1和SEQIDNO.11組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.12組成的序列、針對CYP2D6G1846A的野生型和突變型由SEQIDNO.3和SEQIDNO.13組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.14組成的序列、針對CYP2D6A2549del的野生型和突變型由SEQIDN0.5和SEQIDNO.15組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.16組成的序列、和針對CYP2D6Dulplication由SEQIDNO.9和SEQIDNO.19組成的序列中的一組或多組。本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP2D6基因突變進行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對CYP2D6基因突變檢測的方法，主要包括以下步驟(1)PCR擴增待測樣品DNA；(2)PCR擴增產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(4)將對應(yīng)ASPE引物tag序列的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進行雜交反應(yīng)；(5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(6)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.所述CYP2D6基因突變檢測液相芯片可針對CYP2D6C2850T、CYP2D6Dulplication,CYP2D6Deletion的突變位點同時檢測，具有非常好的信號-噪聲比，與測序法的吻合率高達100%，比同類相關(guān)的產(chǎn)品具有更高的特異性和準確率。tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE序列的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。2.本發(fā)明設(shè)計的ASPE特異性引物序列具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別的基因型。本發(fā)明所設(shè)計的各種特異性ASPE引物，能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)，且各種引物、探針之間基本不存在非特異性結(jié)合。3.本發(fā)明還可進一步同步對CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、和/或CYP2D6A2549del突變位點進行檢測，提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征，從而使檢測的靈敏度進一步得到提高，檢測結(jié)果更加準確可靠。同時，多種ASPE特異性引物的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。具體實施例方式實施例1CYP2D6基因突變檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE引物CYP2D6基因的兩種正?；蛐蜑镃YP2D6*1和CYP2D6*2，其中CYP2D6*2為C2850T突變。五種國內(nèi)常見突變基因型為CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重復(fù)突變。CYP2D6*3為A2549del缺失突變，CYP2D6*4為C100T和G1846A共同突變，CYP2D6*5為整個基因缺失突變，CYP2D6*10為C100T突變，此外還有整個基因的重復(fù)突變。針對CYP2D6基因的兩種正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五種國內(nèi)常見突變基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重復(fù)突變分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“Tag+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表1ASPE引物序列(Tag+特異性引物序列)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>每條ASPE引物包括兩個部分，5’端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列，3’端為針對突變型或野生型的特異性序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/LTrisBuffer配制成lOOpmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計的ASPE特異性引物序列，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物序列可能形成的二級結(jié)構(gòu)，選擇的十種tag序列及其微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示表2微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>選擇的十種微球購自美國Luminex公司，將anti-tag序列包被與微球上。anti-tag序列與微球之間連接有5-10個T的間隔臂序，即在每個anti-tag序列前加上一段5-10個T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的anti-tag序列用ddH20配成lOOnmol/ml的貯存液。所述間隔臂為用于將anti-tag與微球表面間隔開來或是將anti-tag置于親水性環(huán)境中的序列。通過在anti-tag序列與微球之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個T(使用其它的間隔臂的實驗結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略)。微球包被的過程如下分別取5X106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配M10ng/ml白勺EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(_自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02%的Tween-20洗滌一次，再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0),lmmol/LEDTA中，2_8°C避光保存。三、擴增出具有突變位點的目標(biāo)序列的引物CYP2D6基因的兩種正?；蛐蜑镃YP2D6*1和CYP2D6*2，五種國內(nèi)常見突變基因型為CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重復(fù)突變。利用Primer5.0設(shè)計六對引物(見表3)，使用巢式PCR檢測C100T、G1846A、A2549del和C2850T的位點突變，首先通過SEQN0.31-32引物序列擴增出同時含有C100T、G1846A、A2549del和C2850T的片段，進而通過SEQNO.33-SEQNO.38擴增出3條含有突變位點的目標(biāo)序列，SEQNO.39-SEQNO.42進行多重PCR擴增出2條含有突變位點的目標(biāo)序列。表3擴增出具有突變位點的目標(biāo)序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2運用CYP2D6基因突變檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2XTm雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>過濾后貯存于4°C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。一、樣本的DNA提取參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，得到待檢測的DNA。二、待測樣品的PCR擴增利用Primer5.0設(shè)計六對引物，分兩管進行PCR反應(yīng)，一管為巢式PCR，使用SEQNO.31-32擴增同時含C100T、G1846A、A2549del和C2850T位點的片段，然后分別采用SEQNO.33-34擴增含C100T位點片段，采用SEQNO.35-36擴增含G1846A位點片段，采用SEQNO.37-38擴增含A2549de1和C2850T位點片段，產(chǎn)物大小分別為343bp、257bp、69lbp；另一管為多重PCR—步擴增，如有CYP2D6重復(fù)突變，則SEQN0.39-40可擴增到3.2kb片段，否則無擴增產(chǎn)物；如有CYP2D6*5突變，則SEQN0.41-42可擴增到3.5kb片段，否則無擴增產(chǎn)物。引物序列(SEQN0.31-42)見上表3。首先配制巢式PCR引物工作液分別各取SEQN0.31-38的引物貯存液100ul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為巢式PCR引物工作液。巢式PCR反應(yīng)體系如下10X緩沖液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL)8ul模板DNA(10ng/ul)lulddH2031.5ul_共50ulPCR擴增程序為:95°C3min；94°C30s，66°C30s，72°C3.5min,10個循環(huán)，94°C30s,56°C30s，72°C45s，25個循環(huán)；72°ClOmin；4°C保存?zhèn)溆谩Ｅ渲贫嘀豍CR引物工作液分別各取SEQNO.39-42的引物貯存液lOOul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下10X緩沖液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各25pmol/mL)4ul模板DNA(10ng/ul)lulddH2035.5ul_共50ulPCR擴增程序為95°C3min；94°C20s,60°C30s,72°C3.5min，30個循環(huán)；72°ClOmin；4°C保存?zhèn)溆?。三、PCR產(chǎn)物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細步驟如下1.各取巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物和多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物3.75ul，混勻，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37°C孵育15min。80°C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用上述設(shè)計的位點特異性引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取C100T-W、C100T-M、G1846A-W、G1846A-M、A2549del-W、A2549del-M、C2850T-W、C2850T-M、Dulplication和Deletion相應(yīng)的ASPE引物C存液10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下10X緩沖液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各lOOumol/L)IulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)Iul酶切處理的PCR擴增產(chǎn)物5ulddH2010.ul_共20ulPCR程序為96°C2min；94°C30s,58°Clmin，72°C2min，30個循環(huán)；4°C保存?zhèn)溆?。五、雜交反應(yīng)1.根據(jù)設(shè)計的ASPE引物，選擇相應(yīng)的最優(yōu)的十種微球(微球濃度均為2.5XIO5個/ml)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同時每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應(yīng)的ASPE引物5’端的tag序列特異結(jié)合；2.分別取Iul每種編號的微球于1.5ml的微量離心管中；3.微球于≥IOOOOg離心l_2min；4.棄去上清，微球重懸于IOOul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的ddH20；6.取5_25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH20補足至50ul；7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于彡3000g離心2_5min；9.去上清，將微球重懸于75ul的IXTm雜交緩沖液中；10.微球于彡3000g離心2-5min；11將微球重懸于75ul的IXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE)；12.37°C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結(jié)果如表4和表5所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求1.每個位點需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI；2.NETMFI=樣品MFI-PCR陰性對照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.滿足以上兩個條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗對每個檢測位點的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的CYP2D6基因多態(tài)性，實驗數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為變異型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的CYP2D6基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達到100%。可見本發(fā)明所提供的CYP2D6基因SNP檢測液相芯片能夠準確地檢測出CYP2D6基因的SNP類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表4樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例3CYP2D6C2850／、CYP2D6Deletion基因突變檢測液相芯片對臨床樣本的檢測[Ol28]使用CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突變檢測液相芯片對血清樣品卜20進行檢測，ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、擴增引物、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表6樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7樣本CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突變分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從實施例2和實施例3的結(jié)果可見，實施例3中只含有CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突變液相芯片檢測結(jié)果與實施例2的一致。實施例4不同的ASPE引物的液相芯片對CYP2D6基因突變的檢測一、液相芯片制備的設(shè)計(Tag序列及Anti-Tag序列的選擇)以CYP2C9基因CYP2D6*2(C2850T)位點突變的檢測液相芯片為例，針對C2850T的野生型和突變型設(shè)計ASPE引物3’端的特異性引物，而ASPE引物5’端的Tag序列則選自SEQIDNO.I-SEQIDNO.10中的6條，相應(yīng)的，包被于微球上的與對應(yīng)tag序列互補配對的anti-tag序列選擇SEQIDN0.21-SEQIDΝ0·30。具體設(shè)計如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、擴增引物、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表8液相芯片制備的設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設(shè)計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對血清樣品21-40進行檢測，檢測結(jié)果如下表9樣本檢測結(jié)果(MFI)與基因多態(tài)性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其它針對不同的SNP位點的液相芯片，ASPE引物運用不同的Tag序列，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司<120>CYP2D6基因突變檢測液相芯片及檢測方法<160>42<170>PatentInversion3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aaacaaacttcacatctcaataat24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2tcaatcataatctcataatccaat24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>3ttactcaaaatctacactttttca24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4aatcatacctttcaatcttttaca24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5aatcctttttactcaattcaatca24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7ctatcttcatatttcactat<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8aatctacaaatccaataatcteat24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9ctacaaacaaacaaacattatcaa24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10cttttcatcttttcatctttcaat24<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>11cagggggcctggtgg15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>12cagggggcctggtga15<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>13ggcgaaaggggcgtcc16<210>14<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>14ggcgaaaggggcgtct16<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>15gggtcccaggtcatcct17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16gggtcccaggtcatccg17<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17cttcaatgatgagaacctgc20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18cttcaatgatgagaacctgt20<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>19atggcgtttcatacttat18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20gccagcacgttgacacct18<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21attattgagatgtgaagtttgttt24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>22attggattatgagattatgattga24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>23tgaaaaagtgtagattttgagtaa24<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>24tgtaaaagattgaaaggtatgatt24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>25tgattgaattgagtaaaaaggatt24<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>26gtatgtattgtatgtagttaattg24<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>27gtttatagtgaaatatgaagatag24<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>28atgagattattggatttgtagatt24<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>29ttgataatgtttgtttgtttgtag24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>30attgaaagatgaaaagatgaaaag24<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31ccgaccaggcccctccaccg20<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32cggccctgacactccttcttgc22<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>33gcaggttcactcacagcag19<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>34cctggtcgaagcagtatgg19<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>35gctggagcagtgggtgac18<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>36cctgaggaagcgagggtc18<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>37tccaggtgaacgcagagc18<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38aggaggtcaggcttacagg19<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39cctcagcctcgtcacctcac20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>40cacgtgcagggcacctagat20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>41ccgggcacctgtactcctca20<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>42catgagctaaggcacccagac2權(quán)利要求一種CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有(A).針對CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突變位點的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別為SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、SEQIDNO.20；所述tag序列選自SEQIDNO.1-10中的任3種序列；(B).分別包被有特異的anti-tag序列的3種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增具有CYP2D6C2850T以及CYP2D6Deletion突變位點的CYP2D6基因目標(biāo)序列的擴增引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物包括有SEQIDNO.37及SEQIDNO.38，SEQIDNO.41及SEQIDNO.42。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物還包括有用于巢式PCR的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述(A)中ASPE引物分別為針對CYP2D6C2850T的野生型和突變型由SEQIDNO.7和SEQIDNO.17組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.18組成的序列、及針對CYP2D6Deletion的由SEQIDN0.10和SEQIDNO.20組成的序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，還包括有(D)針對CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、和/或CYP2D6Dulplication突變位點的ASPE引物，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因突變位點的特異性引物序列和5’端的tag序列組成，所述特異性引物序列為針對CYP2D6C100T的SEQIDN0.11及SEQIDNO.12、針對CYP2D6G1846A的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、針對CYP2D6A2549del的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、和針對CYP2D6Dulplication的SEQIDN0.19中的一組或多組；所述tag序列選自SEQIDN0.1-10中的序列，該所選tag序列與(A)中所選tag序列不相同；(E)與(D)中ASPE引物對應(yīng)的包被有特異的anti-tag序列的種微球，所述anti-tag序列與(D)中的所選的對應(yīng)tag序列互補配對；所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；(F):用于擴增具有CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、CYP2D6Dulplication中個或多個突變位點的CYP2D6基因目標(biāo)序列的擴增引物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述(D)中，ASPE引物分別為針對CYP2D6C100T的野生型和突變型由SEQIDNO.1和SEQIDNO.11組成的序列及由SEQIDN0.2和SEQIDN0.12組成的序列、針對CYP2D6G1846A的野生型和突變型由SEQIDN0.3和SEQIDN0.13組成的序列及由SEQIDN0.4和SEQIDN0.14組成的序列、針對CYP2D6A2549del的野生型和突變型由SEQIDN0.5和SEQIDN0.15組成的序列及由SEQIDN0.6和SEQIDN0.16組成的序列、和針對CYP2D6Dulplication由SEQIDN0.9和SEQIDN0.19組成的序列中的一組或多組。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述(F)中擴增引物，包括SEQNO.31和SEQNO.32、以及針對CYP2D6ClOOT的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、針對CYP2D6G1846A的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、針對CYP2D6A2549del的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和針對CYP2D6Dulplication的SEQIDNO.39及SEQIDNO.40中的一組或多組。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的CYP2D6基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個T。9.一種CYP2D6基因突變檢測的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-8任一項所述液相芯片，主要包括以下步驟(1)PCR擴增待測樣品DNA;(2)PCR擴增產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(4)將對應(yīng)ASPE引物tag序列的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進行雜交反應(yīng)；(5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(6)通過熒光檢測儀檢測。全文摘要本發(fā)明提供了一種CYP2D6基因突變檢測液相芯片，包括有針對CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突變位點的ASPE引物；分別包被有特異的anti-tag序列的3種微球；針對CYP2D6C2850T和CYP2D6Deletion突變位點的擴增引物。所述CYP2D6基因突變檢測液相芯片可針對CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突變位點同時檢測，具有非常好的信號-噪聲比，與測序法的吻合率高達100％，比同類相關(guān)的產(chǎn)品具有更高的特異性和準確率。文檔編號C12Q1/68GK101824467SQ200910214370公開日2010年9月8日申請日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者何嘉英,曾濤,朱澤堯,李國強,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司