檢測(cè)pkd1基因突變的擴(kuò)增引物、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體涉及常染色體顯性多囊腎病致病基因 PKDl 突變檢測(cè)的擴(kuò)增引物組、試劑盒以及使用該引物組和試劑盒檢測(cè)檢測(cè)PKDl基因突變的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 成人多囊腎病（polycystic kidney disease, PKD)是最常見的遺傳性腎病，人群 發(fā)病率約在1/400~1/1000,多為常染色體顯性遺傳，少部分為常染色體隱性遺傳。常染 色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)主要表 現(xiàn)為雙腎多發(fā)性進(jìn)行性囊泡，引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease, ESRD)最常見的遺傳病因，約占全部ESRD的10%，還可累及全身多個(gè)器官，如肝囊 月中、高血壓、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤等。遺傳學(xué)研宄表明ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突變引起，大 約80%~85%患者的致病基因?yàn)镻KD1，導(dǎo)致I型多囊腎病，10%~15%患者的致病基因?yàn)?PKD2,導(dǎo)致II型多囊腎病。遺傳性多囊腎病是以雙腎形成多個(gè)進(jìn)行性增大囊腫為主要特征 的單基因遺傳病，PKDl基因突變是造成成人多囊腎病的主要病因，且其患者較PKD2患者發(fā) 病早、臨床癥狀更嚴(yán)重。目前對(duì)ADPKD尚無特異的治療措施，只有一些對(duì)癥治療和延緩多囊 腎病向ESRD進(jìn)展的干預(yù)措施。對(duì)患者進(jìn)行基因檢測(cè)有助于明確診斷、直系親屬預(yù)后判斷， 并為再次生育產(chǎn)前檢測(cè)提供依據(jù)。PKDl位于人16ql3. 3,基因長(zhǎng)52kb，含46個(gè)外顯子，編碼 區(qū)長(zhǎng)度12906bp，在16號(hào)染色體上存在6個(gè)同源的假基因，與PKDl外顯子1至外顯子33序 列相比同源性高達(dá)97. 7%。PKDl基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，突變種類多，可能涉及整個(gè)基因，沒有突變 熱點(diǎn)，且80%以上的致病突變都發(fā)生在基因的多拷貝區(qū)（外顯子1~33)，因此特異性檢測(cè) PKDl基因突變較為困難。直到2001年，Rossetti等才聯(lián)合LR-PCR、巢式PCR及單鏈構(gòu)象多 態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP)分析，第一次全面報(bào)道了高加索 人PKDl基因突變的情況。隨后有研宄者建立了基于變性高效液相色譜技術(shù)的突變篩查方 法，可以提高突變的檢出率，但兩種方法存在的影響因素較多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，準(zhǔn)確性較低。 目前，對(duì)巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接Sanger測(cè)序是常用的PKD基因診斷方法，雖然該方法更為 準(zhǔn)確，但測(cè)序工作量巨大、效率低，且存在PCR脫靶現(xiàn)象，限制了該方法的大規(guī)模臨床應(yīng)用。
[0003] 在現(xiàn)有技術(shù)中為了解決檢測(cè)PKDl基因突變效率低下的問題，研宄者們作了大量 的嘗試。蕭畔等（中國(guó)ADPKD患者PKDl基因突變位點(diǎn)檢測(cè)，《山東醫(yī)藥》，2007年，第47卷 第21期，1-2頁(yè)）僅對(duì)PKDl基因的12、14、21外顯子片段進(jìn)行了擴(kuò)增，該方法并不具備完全 檢測(cè)PKDl基因突變的效果。TW201339309A公開了一種檢測(cè)PKDl基因突變的引物組和試劑 盒，但其在擴(kuò)增PKDl基因過程中所需要使用的引物組多達(dá)幾十組，雖然較為準(zhǔn)確，但方法 過于繁瑣，反應(yīng)體系需要后續(xù)純化，必須結(jié)合DHPLC進(jìn)行后續(xù)處理，檢測(cè)成本過高、效率低。 張樹忠等（應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)漢族人I型多囊腎致病基因突變，《中華醫(yī)學(xué)遺 傳學(xué)雜志》，2006年，第23卷第03期，283-288頁(yè)）采用的方法與TW201339309A類似，也有 類似的缺陷。
[0004] US7553644B2也公開了一種檢測(cè)PKDl基因突變的方法，但該方法中擴(kuò)增PKDl基因 過程中所需要使用的引物組也過多，方法過于繁瑣，檢測(cè)效率低。CN104531883A公開了一種 檢測(cè)PKDl基因突變的試劑盒和檢測(cè)方法，涉及一種含有5對(duì)引物的引物組，該檢測(cè)方法中 測(cè)序采用的是第二代測(cè)序（next-generation sequencing, NGS)技術(shù)，該技術(shù)具有高通量、 快速、準(zhǔn)確和成本低的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多樣本、多個(gè)基因、多外顯子的同時(shí)檢測(cè)，但該方法采用 的NGS技術(shù)具有GC含量偏好性，尤其是不能得到PKDl外顯子1的有效數(shù)據(jù)。并且NGS技 術(shù)具有讀序短的特點(diǎn)，擴(kuò)增的LR-PCR產(chǎn)物必須片段化得到短序列后方可進(jìn)行建庫(kù)，為提高 通量每個(gè)樣本需要獨(dú)立建庫(kù)，大大提升了檢測(cè)成本。由于PKDl基因長(zhǎng)度大以及方法自身的 限制，最后該方法只檢測(cè)到外顯子1之外的PKDl基因的外顯子和部分的內(nèi)含子內(nèi)含子，該 范圍并不能完全覆蓋已報(bào)道的致病位點(diǎn)；因此CN104531883A的檢測(cè)方法和引物序列組并 不能全面地反映出所檢測(cè)樣品中的所有PKDl基因突變，該方法所得到的假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果 和漏檢的可能較大。因此本領(lǐng)域仍然需要一種能高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)PKDl基因突變、并 且所需引物組較少的方法。
[0005] 第三代測(cè)序技術(shù)基于納米孔采用單分子讀取技術(shù)，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度和巨 大的應(yīng)用潛能；在建庫(kù)階段不需要對(duì)DNA進(jìn)行片段化處理，也不需要PCR擴(kuò)增步驟，進(jìn)一步 降低了測(cè)序成本。第三代測(cè)序技術(shù)以太平洋生物技術(shù)公司（Pacific Biosciences)PacBio RS II單分子實(shí)時(shí)（Single Molecular Real Time, SMRT)測(cè)序技術(shù)為代表，該單分子測(cè)序技 術(shù)是一種完全新型的測(cè)序技術(shù)，具有讀長(zhǎng)超長(zhǎng)、準(zhǔn)確度高、GC偏向性小等特點(diǎn)，這一技術(shù)簡(jiǎn) 稱PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)，可以在一天之內(nèi)完成從樣品制備到測(cè)序和讀取序列的全過程，非 常適合臨床快速診斷的要求。PacBio SMRT測(cè)序解決了第二代測(cè)序幾大困擾：變異檢測(cè)假陽(yáng) 性高，稀有突變被淹沒，建庫(kù)階段無需擴(kuò)增可直接對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序，有效避免了建庫(kù)擴(kuò) 增偏好性和GC偏好性，可輕松跨越GC含量異常（過高或過低）及高度序列重復(fù)的區(qū)域，實(shí) 現(xiàn)序列覆蓋的完整性和均一性，長(zhǎng)讀長(zhǎng)（平均讀長(zhǎng)達(dá)IOKbp-HKbp)特性可以直接對(duì)長(zhǎng)片段 進(jìn)行測(cè)序，無需打斷成小片段再進(jìn)行測(cè)序。因此，PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)可以對(duì)LR-PCR產(chǎn) 物進(jìn)行直接測(cè)序，而不需要片段化處理和再次PCR擴(kuò)增，而且采用引物標(biāo)簽技術(shù)，不需要對(duì) 每個(gè)樣本單獨(dú)建庫(kù)，可以顯著提高檢測(cè)通量，降低單個(gè)樣品的檢測(cè)成本。目前還未有將將長(zhǎng) 鏈PCR(Long-range PCR，LR-PCR)技術(shù)和PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)結(jié)合，并將其應(yīng)用于單基因 遺傳病基因診斷的研宄，更沒有將PacBioSMRT應(yīng)用于常染色體顯性多囊腎病基因診斷領(lǐng) 域的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)PKDl基因突變方法，所述方法利用PKDl基因的序列信息設(shè) 計(jì)9對(duì)PCR標(biāo)簽引物，應(yīng)用長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)靶向擴(kuò)增PKDl基因，同時(shí)在擴(kuò)增產(chǎn)物加上標(biāo)簽， PCR產(chǎn)物純化、混合后直接建單一 SMRTBell文庫(kù)，應(yīng)用PacBio RS II測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，通過 生物信息學(xué)分析獲得PKDl基因突變信息。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于PCR特異性擴(kuò)增檢測(cè)PKDl基因突變的引物組，該組PCR引 物共9對(duì)，所述一對(duì)PCR標(biāo)簽引物由標(biāo)簽和擴(kuò)增待測(cè)目的序列的PCR引物組合而成，即在 每一對(duì)PCR標(biāo)簽引物的5'端分別具有正向標(biāo)簽和反向標(biāo)簽。9對(duì)引物分別如下：用于擴(kuò)增 PKDl基因外顯子1和內(nèi)含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向引物如SEQ ID NO: 2所示；用于擴(kuò)增PKDl基因內(nèi)含子1到外顯子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 3 所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于擴(kuò)增PKDl基因外顯子7到外顯子13的引物，其 正向引物如SEQ ID NO: 5所示，反向引物如SEQ ID NO: 6所示；用于擴(kuò)增PKDl基因內(nèi)含子 12到外顯子15的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示； 用于擴(kuò)增PKDl基因外顯子15到內(nèi)含子21的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向 引物如SEQ ID NO: 10所示；用于擴(kuò)增PKDl基因內(nèi)含子21到內(nèi)含子26的引物，其正向引物 如SEQ ID NO: 11所示，反向引物如SEQ ID NO: 12所示；用于擴(kuò)增PKDl基因內(nèi)含子26到內(nèi) 含子34的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示，反向引物如SEQ ID NO: 14所示；用于擴(kuò) 增PKDl基因內(nèi)含子34到內(nèi)含子41的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示，反向引物如 SEQ ID NO: 16所示；用于擴(kuò)增PKDl基因內(nèi)含子39到外顯子46的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 17所示，反向引物如SEQ ID NO: 18所示。優(yōu)選的PCR引物如表1所示，擴(kuò)增片段1 大小為2281bp，擴(kuò)增片段2大小為4037bp，擴(kuò)增片段3大小為3904bp，擴(kuò)增片段4大小為 4398bp，擴(kuò)增片段5大小為4358bp，擴(kuò)增片段6大小為3202bp，擴(kuò)增片段7大小為3910bp， 擴(kuò)增片段8大小為2641bp，擴(kuò)增片段9大