Brca1和brca2基因突變的多重pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因突變檢測領(lǐng)域，尤其設(shè)及基因突變多重PCR檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] BRCA1和BRCA2是兩個具有抑制惡性腫瘤發(fā)生的基因，在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、 遺傳物質(zhì)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長方面有重要作用。已發(fā)現(xiàn)的BRCA1和BRCA2的突 變有數(shù)百種之多，有些與遺傳性乳腺癌和卵巢癌有關(guān)?？偨Y(jié)BRCA1和BRCA2基因突變相關(guān) 的癌癥的終身風(fēng)險顯示，有BRCA1基因突變者患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險分別是50% -85% 和15% -45%，有BRCA2基因突變者患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險分別是50 % -85 %和 10% -20%。與普通婦女相比，運(yùn)些都是很高的患癌幾率。
[0003] 由于BRCA1和BRCA2基因的突變對家族性乳腺癌、卵巢癌的發(fā)生有一定的聯(lián)系，所 W檢測BRCA1和BRCA2的突變基因?qū)ο嚓P(guān)癌癥的診斷、預(yù)防和治療有重要的臨床意義。另 夕F，由于BRCA1和BRCA2的突變眾多，檢測運(yùn)些突變對于相關(guān)基因的研究十分有意義，例如 對于基因多態(tài)性分析和家族進(jìn)化史研究。
[0004] 目前，普遍應(yīng)用的BRCA基因突變檢測方法主要為限制小片段長度多態(tài)性分析法 (RFLP法）和DNA直接測序法。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的方法，該方法存在 W下缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測周期長、成本高、存在第一輪酶切不完全導(dǎo)致的假陽性、非閉 管操作、易于污染、難W滿足臨床檢測要求。DNA直接測序法存在W下缺點(diǎn)：檢測周期較長、 成本高、非閉管操作、難W避免交叉污染、通量不高。另外，DNA直接測序的靈敏度較低，雜 合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)，通常需要 多次重復(fù)測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法也難適用于臨床檢測。 陽0化]也有已公開專利使用PCR方法來檢測乳腺癌易感基因突變，例如專利"檢測乳腺 癌易感基因突變的多重PCR試劑盒及其制備方法"（授權(quán)公告號：CN101200766B)。但是， 該專利所用的多重PCR僅限定在BRCA1和BRCA2基因部分外顯子上的部分突變位點(diǎn)上，而 運(yùn)明顯不能覆蓋BRCA1和BRCA2基因遍布在多個外顯子上的上百種突變，因此該專利在使 用上有較大局限。
[0006] 因此，本領(lǐng)域需要可用于高靈敏度、高通量、低成本檢測BRCA1和BRCA2基因突變 的方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了提供可用于高靈敏度、高通量、低成本檢測BRCA1和BRCA2突 變的方法和試劑盒。本發(fā)明主要是利用多重PCR技術(shù)對BRCA1和BRCA2基因編碼區(qū)進(jìn)行捕 獲富集，然后通過高通量測序技術(shù)測定富集后的編碼區(qū)序列，最終通過生物信息學(xué)分析高 通量測序數(shù)據(jù)，從而發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的突變情況及其頻率。 陽00引因此，本發(fā)明提供了一種檢測BRCA1和BRCA2突變的方法，所述方法包括
[0009] 1)捕獲進(jìn)行第一輪特異性多重PCR反應(yīng)，使用189對引物對樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增， 所述189對PCR引物分兩個試管進(jìn)行反應(yīng)，第一個試管引物95對（SEQIDNO. 5-SEQID NO. 194)，第二個試管引物94對（SEQIDNO. 195-SEQIDNO. 382)，每個上游引物的5'端添 加序列SEQIDNO. 1 :
[0010] "ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC"，每個下游引物的 5' 端添加序列沈Q IDNO. 2 :"GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA";
[0011] 2)建庫：進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，使用PCR引物對：上游引物沈QIDNO. 3:"AATGAT ACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC"，下游引物沈QIDNO. 4:
[0012] "CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT"對步驟 1)獲得的 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增；
[0013] 3)測序，對步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；
[0014] 4)分析，對步驟3)獲得的測序結(jié)果進(jìn)行分析，完成全編碼區(qū)的突變檢測。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種BRCA1和BRCA2基因突變多重PCR檢測試劑盒，所述試劑盒 包括：兩套PCR引物和PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液（例如，來自KAPA2G化St熱啟動多重擴(kuò)增試劑 盒）；
[0016] 所述的兩套PCR引物，第一套PCR引物包括189對PCR引物，分兩組，第一組包括 引物 95 對（SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 194)，第二組包括引物 94 對（SEQIDNO. 195-SEQID NO. 382)，每個上游引物的5'端添加沈QIDNO. 1 :
[0017] "ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC"序列，每個下游引物的 5' 端添加沈Q IDNO. 2 :"GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA"序列； 陽0化]第二套PCR引物的上游引物序列沈QIDNO. 3是：
[0019] "AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC"，下游引物序列沈QID NO. 4 是
[0020] "CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT"。
[002U 在本發(fā)明的試劑盒中，所述第一套為特異性多重PCR引物，所述第二套PCR引物是 一對常規(guī)PCR引物，在其5'端帶有測序序列。
[0022] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括蒸饋水。
[0023] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的試劑盒中，第一套引物的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系 按如下比例配制：第一套PCR引物10份、PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液（例如PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶 液）12. 5份、DNA模板3份、水4. 5份。
[0024] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二套PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按如下比例配制：第二套 PCR引物2. 5份、PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液（例如PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液）7. 5份、第一輪PCR回收 產(chǎn)物5份、水4. 5份。
[0025] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測方法和試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] 1)成本低廉；
[0027] 2)對待檢測樣品要求量低，可對血漿和血清中的極低DNA樣品進(jìn)行分析；
[00測扣地毯式引物設(shè)計，可實(shí)現(xiàn)全編碼區(qū)突變檢測，不但能對已知突變進(jìn)行分析，還能 發(fā)現(xiàn)新的突變；
[0029] 4)靈敏度高；
[0030] 5)檢測時間短，結(jié)合高通量測序技術(shù)，可短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)全編碼區(qū)突變檢測。
[0031] 本發(fā)明的試劑盒可用于高靈敏度、高通量、低成本檢測BRCA突變，協(xié)助臨床醫(yī)生 實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個體化治療，降低治療風(fēng)險W及患者負(fù)擔(dān)。
[0032] 應(yīng)當(dāng)理解，前述大體的描述和后續(xù)詳盡的描述均為示例性說明和解釋，并不應(yīng)當(dāng) 用作對本發(fā)明所要求保護(hù)內(nèi)容的限制。
【附圖說明】
[0033] 參考隨附的附圖，本發(fā)明更多的目的、功能和優(yōu)點(diǎn)將通過本發(fā)明實(shí)施方式的如下 描述得W闡明，其中：
[0034] 圖1 :第二輪PCR反應(yīng)經(jīng)過2 %瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 通過參考示范性實(shí)施例，本發(fā)明的目的和功能W及用于實(shí)現(xiàn)運(yùn)些目的和功能的方 法將得W闡明。然而，本發(fā)明并不受限于W下所公開的示范性實(shí)施例；可W通過不同形式來 對其加W實(shí)現(xiàn)。說明書的實(shí)質(zhì)僅僅是幫助相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員綜合理解本發(fā)明的具體細(xì)節(jié)。
[0036] 本發(fā)明提供了一種檢測BRCA1和BRCA2突變的方法，雖然在某些情況下，對運(yùn)些基 因的檢測對于相關(guān)癌癥的診斷、預(yù)防和治療有重要的輔助意義，但運(yùn)些基因的突變不是必 然導(dǎo)致所述疾病的發(fā)生，因此對運(yùn)些基因的檢測并不設(shè)及疾病的診斷或治療方法。另外，本 發(fā)明的檢測突變的方法還可W有許多其他用途，例如進(jìn)行基因多態(tài)性分析和家族進(jìn)化史研 究。本發(fā)明的方法還可W用于非特定對象的樣品研究，例如對混合血液制品進(jìn)行檢測。
[0037] 在本發(fā)明中，序列沈QIDNO. 5-SEQIDNO. 382兩兩配對形成189對第一套PCR 引物，即沈QIDNO. 5 和沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 7 和沈QIDNO. 8......沈QIDNO. 381 和SEQIDNO. 382分別配對形成189個引物對。
[0038] 在本發(fā)明中，所述189對第一套PCR引物分兩組，第一組包括引物95對（SEQID NO. 5-SEQIDNO. 194)，第二組包括引物 94 對（SEQIDNO. 195-SEQIDNO. 382)，運(yùn)是經(jīng) 過發(fā)明人通過計算機(jī)模擬并進(jìn)行試驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整的結(jié)果，運(yùn)樣使得避免了引物之間的交叉反 應(yīng)，使得提高PCR的效率和質(zhì)量。
[0039] 在本發(fā)明中，每個上游引物的5'端添加序列SEQIDNO.r'ACACTCTTTCCCTACACGA CGCTCTTCCGATCTTAC"，每個下游引物的 5'端添加序列沈QIDNO. 2"GTGACTGGAGTTCAGACGT GTGCTCTTCCGATCTGTA"，上下游引物所添加的共有序列是第二輪PCR反應(yīng)引物的結(jié)合位置。
[0040] 在本發(fā)明中，第二套PCR引物的上游引物序列是：SEQIDNO. 3"AATGATACGGCGACC ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC"，
[0041] 下游引物序列是沈QIDNO.rCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGT TCAGACGT"，其中下游下劃線部分序列是barcode序列，用于區(qū)分多個樣本。
[0042] 在本發(fā)明