一種檢測znf644基因突變的試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測ZNF644基因突變的試劑盒及檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高度近視（Hi曲Myopia,HM)又稱病理性近視（PathologicalMyopia,PM)或惡性 近視（Mali即antmyopia),是指屈光度為-6. 0DW上，很多已達(dá)-8. 0DW上，伴有高度眼軸 延長的一種屈光不正。送種眼軸的進(jìn)行性延長除造成視功能的嚴(yán)重?fù)p害外，還常伴有其他 眼底的退行性改變?nèi)缃暬⌒伟?、豹紋狀眼底，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮，黃斑部改變，周邊部視 網(wǎng)膜格子樣變性等。還伴發(fā)其他嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，比如視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性、青光眼等， 是致盲的重要原因之一。
[0003] 高度近視病因、發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，有家族性并有明顯的遺傳傾向，患病率高，有 種族差異。高度近視最常見的遺傳方式是常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為兒童學(xué)齡（前）期出 現(xiàn)近視，近視度數(shù)進(jìn)行性增加，眼底視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變逐年加重。在中國，研究人員對(duì)中國 四川一個(gè)常染色體顯性遺傳的高度近視患病家系進(jìn)行研究，在鋒指蛋白644狂incFinger Protein644,ZNF644)基因的上鑒定了八個(gè)突變；c. 725C〉T、c. 821A〉T、2091A〉G、2156A〉G、 2180C〉G、2238G〉A(chǔ)、4138C〉G、4718G〉A(chǔ)。
[0004] 鑒于目前，對(duì)高度近視的治療方法很有限且效果不顯著，該基因突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn) 對(duì)于遺傳性高度近視患者的早期診斷，及早干預(yù)，延緩病程，減少視力喪失具有非常重要的 意義。
[0005]目前，針對(duì)W上ZNF644的常見突變的檢測方法主要為基因測序法，基因測序法雖 然準(zhǔn)確，但需要昂貴的儀器設(shè)備、操作繁瑣、耗時(shí)長、成本高等，不適合臨床推廣。因此，需要 開發(fā)出快速、準(zhǔn)確、簡單、低成本的突變檢測方法及試劑盒，W滿足臨床上對(duì)ZNF644基因突 變檢測的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種檢測ZNF644基因4種突變（C. 725C>T、2091A〉G、2238G> A、4718G〉A(chǔ))的方法及試劑盒，針對(duì)每一種突變，通過采用一組特異性PCR引物對(duì)待測樣本 進(jìn)行擴(kuò)增，檢測是否產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，W及條帶的大小判斷該突變的基因型，使得ZNF644 基因突變的檢測更快速、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[000引所述檢測ZNF644基因突變的試劑盒包括如下引物：
[0009] 突變位點(diǎn)C. 725C>T野生型特異性上游引物：
[0010]沈QIDNO. 1 ;5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCG-3'，3' 端第二個(gè)堿基C和第Η個(gè)堿基C 為硫化修飾堿基；
[0011] 突變位點(diǎn)C. 725C>Τ突變型特異性上游引物：
[0012]沈QIDNO. 2 ;5'-TGTACCTGAGGAAATTCCCA-3'，3'端第二個(gè)堿基C和第Η個(gè)堿基C 為硫化修飾堿基；
[0013] 突變位點(diǎn)C.725C>T通用下游引物：
[0014]SEQIDNO. 3 :5, -ATCTGAAAACGCCTTAAGTGGA-3';
[0015] 突變位點(diǎn)2091A〉G野生型特異性上游引物：
[0016]沈QIDNO. 4 ;5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACA-3'，3' 端第二個(gè)堿基C和第Η個(gè)堿 基A為硫化修飾堿基；
[0017] 突變位點(diǎn)2091A〉G突變型特異性上游引物：：
[0018]沈QIDNO. 5 ;5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACG-3'，3' 端第二個(gè)堿基C和第Η個(gè)堿 基A為硫化修飾堿基；
[0019] 突變位點(diǎn)2091A〉G通用下游引物：
[0020]SEQIDNO.6:5,-GTTGATCCAAATGTTCGCTTC-3';
[0021] 突變位點(diǎn)2238G>A野生型特異性上游引物：
[0022]沈QIDNO. 7 ;5'-AGGAGAGCTGTTTTGATTGC-3'，3'端第二個(gè)堿基G和第Η個(gè)堿基T 為硫化修飾堿基；
[0023] 突變位點(diǎn)2238G>A突變型特異性上游引物：
[0024]沈QIDNO.8;5'-AGGAGAGCTGTTTTGATTGT-3'，3'端第二個(gè)堿基G和第Η個(gè)堿基T 為硫化修飾堿基；
[00巧]突變位點(diǎn)2238G>A通用下游引物：
[0026]SEQIDNO. 9 :5,-AATTGCCCTAAAACATTTGTGC-3,；
[0027] 突變位點(diǎn)4718G〉A(chǔ)野生型特異性上游引物：
[0028]沈QIDNO. 10 ;5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTC-3'，3' 端第二個(gè)堿基T和第Η個(gè) 堿基C為硫化修飾堿基；
[0029] 突變位點(diǎn)4718G〉A(chǔ)突變型特異性上游引物：
[0030]沈QIDNO. 11 ;5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTT-3'，3' 端第二個(gè)堿基T和第Η個(gè) 堿基C為硫化修飾堿基；
[0031] 突變位點(diǎn)4718G〉A(chǔ)通用下游引物：
[0032]SEQIDNO. 12 ;5, -CAGCCATTAATAAACTGTTGC-3，。
[0033] 上述試劑盒中還包括本領(lǐng)域常規(guī)PCR組件；高保真DM聚合酶P化酶，含有硫酸鎮(zhèn) 的Pfu緩沖液，dNTPs。
[0034] 上述試劑盒中還包括4個(gè)檢測位點(diǎn)的陽性對(duì)照突變質(zhì)粒和野生型陰性對(duì)照質(zhì)粒。 所述4個(gè)檢測位點(diǎn)的陽性對(duì)照突變質(zhì)粒均未本領(lǐng)域常規(guī)方法針對(duì)已知野生型或突變型序 列構(gòu)建，分別為pGEM-T質(zhì)粒載體插入包含ZNF644基因C.725C>T、2091A〉G、2238G>A、 4718G〉A(chǔ)的突變序列。
[0035] 本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測檢測ZNF644基因突變的方法，所述方法是 W待測基因組DNA為模板，采用試劑盒引物對(duì)待測基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增 的結(jié)果判斷待測基因組DNA的ZNF644基因中是否含有C.725C>T、2091A〉G、2238G>A、 4718G〉A(chǔ)四種突變：
[0036] 針對(duì)C. 725C>T位點(diǎn)的判定；分別用野生型特異性上游引物和通用下游引物，突 變型特異性上游引物和通用下游引物分兩管進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果只有野生型特異性上游引 物和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物499bp，則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)镃. 725C >T野生型，如果只有突變型特異性上游引物和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物499bp， 則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)镃.725C>T突變純合子，如果兩個(gè)反應(yīng)均出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物 499bp，則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)镃. 725C>T雜合子；
[0037] 針對(duì)2091A〉G位點(diǎn)的判定；分別用野生型特異性上游引物和通用下游引物，突變 型特異性上游引物和通用下游引物分兩管進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果只有野生型特異性上游引物 和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物26化P，則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)?091A〉G野 生型，如果只有突變型特異性上游引物和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物26化P，則表明 待測基因的ZNF644基因?yàn)?091A〉G突變純合子，如果兩個(gè)反應(yīng)均出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物26化P，則表 明待測基因的ZNF644基因?yàn)?091A〉G雜合子；
[0038] 針對(duì)2238G>A位點(diǎn)的判定；分別用野生型特異性上游引物和通用下游引物，突變 型特異性上游引物和通用下游引物分兩管進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果只有野生型特異性上游引物 和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物6(K)bp，則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)?238G>A 野生型，如果只有突變型特異性上游引物和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物6(K)bp，則表 明待測基因的ZNF644基因?yàn)?238G>A突變純合子，如果兩個(gè)反應(yīng)均出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物6(K)bp， 則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)?238G>A雜合子；
[0039] 針對(duì)4718G〉A(chǔ)位點(diǎn)的判定；分別用野生型特異性上游引物和通用下游引物，突變 型特異性上游引物和通用下游引物分兩管進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果只有野生型特異性上游引物 和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物353bp，則表明待測基因的ZNF644基因?yàn)?718G〉A(chǔ)野 生型，如果只有突變型特異性上游引物和通用下游引物的反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物353bp，則表明 待測基因的ZNF644基因?yàn)?718G〉A(chǔ)突變純合子，如果兩個(gè)反應(yīng)均出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物353bp，則表 明待測基因的ZNF644基因?yàn)?718G〉A(chǔ)雜合子。
[0040] 優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增條件為；95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性20砂，退火溫度分別 為；2091A〉G和 4718G〉A(chǔ)為 56°C、C. 725C>T為 60°C、2238G>A為 62°C，退火 20 砂，72°C 延伸30砂，共35個(gè)循環(huán)，最后72Γ延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后采用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行純化 和電泳鑒定。
[0041] 下面結(jié)合原理對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[004引本發(fā)明所述的檢測ZNF644基因突變的試劑盒中包括常規(guī)PCR組件，4組特異性引 物；所述特異性引物每一組對(duì)應(yīng)一個(gè)突變類型，包括兩條序列特異性引物（分別對(duì)應(yīng)野生 型和突變型）和一條通用引物。其中突變位點(diǎn)C.725C>T的兩條序列特異性上游引物的 序列分別具有SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示核巧酸序列，所述通用引物具有SEQIDNo. 3 所示核巧酸序列；突變位點(diǎn)2091A〉G的兩條序列特異性上游引物的序列分別具有SEQID No.