專利名稱：煙草普通花葉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)進(jìn)行病樣檢測的方法，尤其是一種煙草普通花葉病毒病環(huán)介導(dǎo) 等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。
背景技術(shù)：
煙草普通花葉病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)在世界各煙區(qū)都普遍發(fā)生，在 20世紀(jì)60年代以前，是我國煙草危害最重的病毒病，至今在南方煙區(qū)和東北煙區(qū)仍為煙草 主要病毒病害。病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，給我國煙草生產(chǎn)造成了重大的 經(jīng)濟(jì)損失。因此開發(fā)新的技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測TMV，加強(qiáng)漂浮育苗苗期檢疫以及栽培 土壤環(huán)境的監(jiān)測，對預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國煙草生產(chǎn)的健康持續(xù)發(fā)展具有 重要意義。目前用于煙草病毒檢測的方法主要有生物學(xué)診斷、電子顯微鏡、酶聯(lián)免疫吸附技 術(shù)(ELISA)以及分子生物學(xué)等方法生物學(xué)方法主要是鑒別寄主反應(yīng)或指示植物等，這種 僅僅以鑒別寄主反應(yīng)或指示植物為依據(jù)的方法，雖曾廣泛運(yùn)用，卻由于其檢測速度慢、受環(huán) 境和季節(jié)影響較大等諸多因素限制而運(yùn)用較少。電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察到病毒 粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長；酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)雖具簡便、快速等優(yōu) 點(diǎn)，但靈敏度較差，且存在非特異性反應(yīng)；上述三種方法均不能快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測煙草 普通花葉病毒。近年來發(fā)展起來的以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的病毒檢測方法主要有RT-PCR 法以及PCR微量板雜交等檢測方法，克服了上述三種方法的缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)了 煙草普通花葉病毒的相對快速、準(zhǔn)確檢測。由于常規(guī)的PCR檢測需要昂貴的PCR儀，凝膠電 泳和成像系統(tǒng)等大大限制了這些檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由Notomi等發(fā)明的。該技術(shù)針對目的基因的6個(gè) 區(qū)段，設(shè)計(jì)4條特異引物并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在一定溫度下對核酸進(jìn) 行等溫?cái)U(kuò)增。LAMP是一種新式恒溫核酸擴(kuò)增方法，采用能特異識別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4 條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(B st DNA polymerase)，在恒溫條件(60 650C )，進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，在45 60min的時(shí)間里其擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9 IOltl個(gè)數(shù) 量級。在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生莖——環(huán)結(jié)構(gòu)，引物與其雜交啟動新一輪核酸合成。最近幾年已 開始應(yīng)用于生物致病病原的檢測。到目前為止，尚未見利用LAMP技術(shù)檢測煙草普通花葉病 毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
(發(fā)明目的)本發(fā)明的目的是提供一種煙草普通花葉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方 法，以實(shí)現(xiàn)能對煙草普通花葉病毒進(jìn)行快速、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，克服已有技術(shù)的 不足。具體地說，本發(fā)明將TMV基因組中的保守核酸序列——衣殼蛋白基因作為靶DNA，針 對該基因的保守區(qū)段設(shè)計(jì)了 4條特異引物，然后利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在
3恒定溫度下對目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對TMV的快速和高靈敏檢測。本發(fā)明所述的煙草普通花葉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，包括如下步驟1)提供兩對用于檢測煙草普通花葉病毒的LAMP引物序列，即長度分別為45bp、 44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，依次命名為上游引物1、下游引物1、上游引物2和下 游引物2 ；上述兩對LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下上游引物1 :5，-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3，下游引物1 :5，-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3，上游引物2 :5，-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3，下游引物2 :5，-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3，2).提供一種煙草普通花葉病毒的LAMP檢測方法，即首先從待檢測樣品中制備反 應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)反 應(yīng)混合物的顏色顯示對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。本發(fā)明所提供的TMV檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)靈敏度高。對TMV的檢測極限可低至IO1個(gè)拷貝，對TMV檢測的靈敏比普通 PCR方法高10倍以上。(2)特異性強(qiáng)。所用的特異引物根據(jù)TMV主要衣殼蛋白基因中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)， 特異性超過常規(guī)PCR。(3)檢測時(shí)間短。2-3個(gè)小時(shí)便可獲得檢測結(jié)果，比現(xiàn)有最快捷的PCR檢測法節(jié)省 3-5個(gè)小時(shí)。(4)儀器要求寬松。不需要普通PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只要一 個(gè)水浴鍋或金屬浴就能完成檢測反應(yīng)。(5)操作簡單、結(jié)果明顯。整個(gè)檢測過程不涉及復(fù)雜儀器或設(shè)備(稍具分子生物學(xué) 基礎(chǔ)的人員即可完成操作)；檢測結(jié)果清晰明顯，直接用眼睛觀察就可以判斷。(6)對人和環(huán)境安全。檢測過程中不使用有毒試劑，對人和環(huán)境都非常安全。(7)低成本。LAMP檢測總成本大大低于現(xiàn)有最廉價(jià)的PCR檢測方法?？傊?，該方法具有比普通PCR檢測方法更高的特異性、靈敏性和便捷性，可以替代 煙草普通花葉病毒的生物學(xué)、電子顯微鏡和PCR檢測法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明根據(jù)以下步驟即可進(jìn)行TMV病毒的檢測，具體包括以下四個(gè)步驟(1)制備待檢樣品的LAMP反應(yīng)模板取0. 2克樣品，采用北京蓋寧金諾生物技術(shù) 有限公司組織基因組RNA提取試劑盒(GALEN BI0PHARM)進(jìn)行提取組織的RNA，并將制備的 RNA 稀釋為 0. 2 μ g/ μ L ；(2)配制LAMP反應(yīng)體系取上述制備的RNA模板1 μ L，加入到如下反應(yīng)體系中 反轉(zhuǎn)錄酶1. 6U，引物上游引物1和下游引物1各1. 6 μ Μ，引物上游引物2和下游引物2 各 0. 2 μ Μ，四種 dNTP 各 1. 5mM, MgCl2 8mM, Betaine 1M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM，，(NH4)2SO4 IOmM, Triton X-100 0. l%,Bst DNA 聚合酶 8U，加入雙蒸水使反應(yīng)體系的 總體積達(dá)到25 μ L ；(3)按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行LAMP反應(yīng)63°C保溫60分鐘，然后80°C保溫5分鐘；
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(4)檢測結(jié)果顯色及判斷LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入染料為分子生物 學(xué)應(yīng)用的可使核酸顯色的花青素類染料(如SYBR Green、GelRed, GelGreen, GoldView , GeneFinder 等)，然后用眼睛觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯示綠色則表示該樣品 的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陽性，如果顯示橙黃色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒 檢測結(jié)果為陰性。下面通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。為了建立TMV的LAMP檢測方法，首先要選擇TMV所具有的特異核苷酸序列，然后 進(jìn)行LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成。研究表明TMV的主要衣殼蛋白基因(GenBank注冊號為 AJ239099)，可以作為TMV的特征核苷酸序列，用于TMV的鑒定和檢測。在確定主要衣殼蛋 白基因作為TMV檢測的特異核苷酸序列之后，就可以根據(jù)該基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò) 增的引物。LAMP 引物的設(shè)計(jì)首選軟件 PrimerExplore 4. O (http//primerexplorer. jp/ elamp4. 0. 0/index. html)，也可以使用常用的引物設(shè)計(jì)軟件(如Primer Primier 5. 0或 Omiga 2.0)按照LAMP引物的設(shè)計(jì)要求進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用軟件PrimerExplore 4. O在線 設(shè)計(jì)的TMV主要衣殼蛋白基因的LAMP引物如下上游引物1 :5，-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3，下游引物1 :5，-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3，上游引物2 :5，-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3，下游引物2 5，-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3，按照上述引物序列進(jìn)行LAMP引物的合成(可由商業(yè)的DNA合成公司合成，如上海 生物工程公司)。合成制備TMV主要衣殼蛋白基因的LAMP擴(kuò)增引物之后，就可以進(jìn)行TMV的LAMP 檢測了。其LAMP檢測方法包括反應(yīng)模板的制備、LAMP反應(yīng)體系、LAMP反應(yīng)程序和擴(kuò)增結(jié)果 的判斷。LAMP檢測反應(yīng)所用的RAN模板可以用常規(guī)的組織核酸提取方法制備，也可用商品 化的組織RNA提取試劑盒制備。本發(fā)明中采用北京蓋寧金諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司超純總 RNA提取試劑盒(GALEN BI0PHARM)進(jìn)行樣品RAN的提取，詳細(xì)操作步驟參見該試劑盒的使 用說明書。制備LAMP反應(yīng)RNA模板后，即可進(jìn)行TMV的LAMP反應(yīng)檢測，為此，首先要配制 出具有最佳擴(kuò)增效率和檢測特異性的反應(yīng)體系，本發(fā)明中的LAMP反應(yīng)中的引物、dNTP和 Betaine (甜菜堿)、Mg2+的濃度均做了優(yōu)化，它們的最佳濃度分別是引物上游引物1和下 游引物1各1. 6 μ Μ，引物上游引物2和下游引物2各0. 2 μ Μ，四種dNTP各1. 5mM, Betaine IM0最終確定的反應(yīng)體系為引物上游引物1和下游引物1各1.6 μ M，引物上游引物2和下 游引物 2 各 0. 2 μ Μ，四種 dNTP (dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)各 1. 5mM, MgCl28mM, Betaine (甜 菜堿)1M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4 1 OmM, Triton X-100 0.1%，反轉(zhuǎn) 錄酶1. 6U，待檢樣品RNA模板1 μ L，Bst DNA聚合酶8U。按照上述體系要求配制反應(yīng)混合 物，混勻后分裝到無菌Eppendorf管中(規(guī)格為200 μ L)，然后加入雙蒸水使各Eppendorf 管中反應(yīng)體系的總體積達(dá)到25 μ L。在反應(yīng)程序中，擴(kuò)增溫度過高(如70°C )或過低(如60°C )均不利于LAMP反 應(yīng)獲得最佳效果，本發(fā)明提供的引物和采用本發(fā)明確定的反應(yīng)體系時(shí)，其擴(kuò)增溫度為
5620C _64°C，最佳的反應(yīng)溫度為63°C。另外，反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)產(chǎn)物量也有較大影響，在反應(yīng) 時(shí)間少于45分鐘時(shí)，無法觀測到反應(yīng)產(chǎn)物，為保證LAMP反應(yīng)產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物便于觀測，本 發(fā)明中反應(yīng)時(shí)間確定為1個(gè)小時(shí)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)在80°C保溫5分鐘以滅活DNA聚合 酶。所以，進(jìn)行LAMP檢測時(shí)，需將上述含有反應(yīng)體系的Eppendorf管放入水浴鍋或金屬浴 中，63°C保溫1個(gè)小時(shí)，然后80°C保溫5分鐘。LAMP反應(yīng)結(jié)束后，即可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入核酸染料進(jìn)行檢測結(jié)果的判斷，本發(fā)明 中使用的核酸染料為廈門百維信生物科技有限公司商品化生產(chǎn)的GeneFinder 。在反應(yīng)產(chǎn) 物中加入100倍稀釋的GeneFinder 2 μ L，用眼睛觀察所測試樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果 顯示綠色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陽性，如果顯示橙黃色則表示該樣 品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陰性。實(shí)施例1用LAMP方法檢測煙草植株的TMV首先按照本發(fā)明提供的LAMP引物序列合成用于TMV檢測的LAMP引物上游引物1、 下游引物1、上游引物2和下游引物2。然后根據(jù)以下步驟進(jìn)行TMV病毒的檢測。 (1)制備待檢樣品的LAMP反應(yīng)模板取待檢葉片0. 1克，采用北京蓋寧金諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司超純總RNA提取試 劑盒(GALEN BI0PHARM)進(jìn)行組織RNA的提取和純化，具體提取和純化步驟參見該試劑盒的 操作說明書。(2)配制LAMP反應(yīng)體系取上述制備的DNA模板1 μ L，加入到如下反應(yīng)體系中引物上游引物1和下游引 物1各1.6口11，引物上游引物2和下游引物2各0.2 4 11，四種(1^13((^丁卩、dTTP、dGTP和 dCTP)各 1. 5mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜菜堿)1M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM,， (NH4)2SO4 IOmM, Triton X-100 0. 1%, BstDNA 聚合酶 8U ；反轉(zhuǎn)錄酶 1.6U，加入雙蒸水使反 應(yīng)體系的總體積達(dá)到25 μ L。(3)按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行LAMP反應(yīng)630C保溫60分鐘，然后80°C保溫5分鐘。(4)判斷LAMP檢測結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入100倍稀釋的GeneFinder 2 μ L，然后用眼睛觀 察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯示綠色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果 為陽性，如果顯示橙黃色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陰性。利用上述方法已經(jīng)完成了取自山東、云南、東北的50份煙草樣品的檢測，檢測結(jié) 果顯示，凡是經(jīng)TMV的PCR檢測方法確定為陽性的樣品，LAMP檢測方法均能檢測到TMV的存 在；而其中三份經(jīng)TMV的PCR檢測方法確定為陰性的樣品，用LAMP檢測方法卻檢測出TMV 的存在，后來把PCR檢測方法的循環(huán)數(shù)增加到40，從這兩份樣品中又檢測到了 TMV，這說明 PCR檢測方法可能會出現(xiàn)漏檢的情況，這也反映出該LAMP檢測方法比PCR檢測方法具有更 高的靈敏度和可靠性。實(shí)施例2用于TMV檢測的LAMP方法和PCR方法的靈敏度測定及比較用TMV主要衣殼蛋白基因(TCP)特異的PCR引物(正向引物 5，-CCATCACAGTTCGTGTTCTTG-3，和反向引物5，-TAGCGTCTAACGTTTCGGCAG-3，)擴(kuò)增 TMV 主 要衣殼蛋白基因的全長序列，并構(gòu)建到載體PDEST32中，獲得含有TMV TCP基因全長的質(zhì)粒PDEST32-TCP，然后測定質(zhì)粒濃度并作10倍的梯度稀釋。將上述稀釋后的質(zhì)粒用作LAMP反應(yīng)的模板分別進(jìn)行擴(kuò)增，用凝膠電泳分析LAMP 的反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的LAMP檢測方法對TMV的檢測極限為IO1個(gè)拷貝的病毒 粒子。同時(shí)，將上述梯度稀釋的質(zhì)粒用作PCR反應(yīng)的模板，利用煙草TMV主要衣殼 蛋白基因特異的PCR引物(正向引物5’ -CCATCACAGTTCGTGTTCTTG-3，和反向引物 5’ -TAGCGTCTAACGTTTCGGCAG-3’)，按照如下反應(yīng)程序分別進(jìn)行擴(kuò)增95°C 變性 5min，1 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 45s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 7min ；然后在2%的瓊脂糖凝膠電泳上分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR方法對TMV的檢測 極限為IO3個(gè)拷貝病毒粒子。所以，本發(fā)明所提供的煙草普通花葉病毒LAMP檢測方法比目前用于該病毒檢測 的PCR方法靈敏度高100倍。
權(quán)利要求
一種煙草普通花葉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，包括如下步驟1)提供兩對用于檢測煙草普通花葉病毒的LAMP引物序列，即長度分別為45bp、44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，上游引物1和下游引物1、上游引物2和下游引物2，上述兩對LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下上游引物15’ GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT 3’下游引物15’ AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT 3’上游引物25’ CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG 3’下游引物25’ GATTCGAACCCCTCGCTTTA 3’2)提供一種煙草普通花葉病毒的LAMP檢測方法，即首先從待檢測樣品中制備反應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)反應(yīng)混合物的顏色顯示對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增引物的上游引 物1和下游引物1各1 2 μ M，擴(kuò)增引物的上游引物2和下游引物2各0. 1 0. 4 μ M，dATP、 dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0· 8 2. 0mM，MgCl2 1 16mM，Betaine 0· 1 3· 0M，Tris-HCl 1· 0 200mM, KCl 0. 1 200mM，MgSO4 1 20mM，(NH4)2SO4 1 200mM，Triton X-1000· 01% 6%，待檢樣品DNA Ifg lmg，Bst DNA聚合酶0. 1 100U，反轉(zhuǎn)錄酶0. 1 80U。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.2 2. OmM。
4 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述反應(yīng)體系為引物上游引物1和下游引物1 各1. 6 μ Μ，引物上游引物2和下游引物2各0. 2 μ Μ，四種dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP) 各 1.5mM，MgCl2 8mM，甜菜堿 1M，Tris-HCl 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM, TritonX-1000. 1 %，反轉(zhuǎn)錄酶 1. 6U。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所述擴(kuò)增反應(yīng)程序中擴(kuò)增溫度在60°C 70°C之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)程序63°C保溫60分鐘，然 后80°C保溫5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的LAMP檢測結(jié)果判斷方法LAMP反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入10 10000倍稀釋的染料，然后在陽光下觀察被測樣品LAMP反 應(yīng)產(chǎn)物的顏色，如果是綠色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陽性，如果是橙 黃色則表示該樣品的煙草普通花葉病毒檢測結(jié)果為陰性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的染料為分子生物學(xué)應(yīng)用的可使核酸顯色的 花青素類染料，包括但不限于 SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM、GeneFinder 等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種煙草普通花葉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，包括步驟1)提供兩對用于檢測煙草普通花葉病毒的LAMP引物序列，即長度分別為45bp、44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，上游引物1、下游引物1、上游引物2和下游引物2，上述兩對LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下上游引物15’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’下游引物15’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’上游引物25’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’下游引物25’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’還包括步驟2)提供一種煙草普通花葉病毒的LAMP檢測方法，即首先從待檢測樣品中制備反應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)反應(yīng)混合物的顏色顯示對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。
文檔編號C12R1/94GK101899530SQ200910229910
公開日2010年12月1日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者劉艷華, 張興偉, 牟建民, 王鳳龍, 王志德, 申莉莉, 錢玉梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所