專利名稱：一種利用加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵提高氧化葡萄糖桿菌生物量的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種利用加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵提高 氧化葡萄糖桿菌生物量的方法。
背景技術：
米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病藥物。它是從 桿菌肉湯培養(yǎng)基中發(fā)現的一種新型腸道α -葡萄糖苷酶抑制劑，是1-脫氧野尻霉素的母體 修飾產物，屬于N-取代-1-脫氧野尻霉素類型，結構與葡萄糖相似。盡管用化學合成的方 法能夠制備米格列醇，但化學全合成法制備米格列醇的步驟較多，米格列醇分子中含有的 四個手性中心也給化學合成帶來了很大的困難。目前生產規(guī)模大多采用生物合成來制備米 格列醇。米格列醇的生物合成法據文獻報道大致有二條路線一是先由野尻霉素或ι-脫 氧野尻霉素產生菌進行發(fā)酵，制備獲得野尻霉素或ι-脫氧野尻霉素，然后再經過化學合成 方法獲得米格列醇，這是最原始的途徑；二是應用氧化葡萄糖酸菌轉化制備米格列醇關鍵 中間體N-取代-1-脫氧野尻霉素，其主要通過化學合成-生物轉化-化學合成的方法來制 備，工藝路線見說明書附圖。US4266025, ΕΡ0477160, USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生產方法，即
化學合成結合生物催化的方法。但由于菌體活力不高，導致生物催化時間過長，造成生產成 本高，生產周期長，給工業(yè)化生產帶來很大的障礙。由于微生物酶的高效專一性，省略了化學合成過程中為達到專一地改造某個目的 基團必須進行的加入和脫除保護基團的步驟，大大簡化了制備過程，提高了反應收率。氧 化葡萄糖酸桿菌用于轉化特定底物制備1-脫氧野尻霉素及其衍生物具有很多優(yōu)點1)轉 化液經離心除去菌體，無需分離純化出中間體，就可進行下一步合成；2)無需基團保護， 成本大大降低，且避免因去除保護劑而造成的回收率下降；3)中間體6-(取代胺基)-6-脫 氧-α -L-山梨呋喃糖具有較高的溶解度和穩(wěn)定性，不易被降解。但還沒有對于轉化機理的 報道，可以肯定是，氧化葡萄糖桿菌中含有參與該轉化反應的生物酶或酶系，氧化葡萄糖桿 菌的催化能力與其含有的生物酶系的數量和活力有直接關系。目前，米格列醇雖然已經實現工業(yè)化生產，但由于菌種活力低，利用微生物將 1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇轉化為呋喃型葡萄糖胺時轉化效率低，轉化時間長，勞動強 度大，生產成本高。傳統(tǒng)菌種選育主要采用誘變育種的方法，誘變的方法歷史悠久，過去一 直依賴誘變的方法來提高產量，目前大多數生物發(fā)酵工業(yè)生產仍然在使用這些方法。但是 這種方法具有相當大的隨機性，而且菌種若長期使用誘變劑處理，其活力會逐漸下降。目前，還沒有利用加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵提高氧化葡萄糖桿菌生物量的方法的 相關文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵提高氧化葡萄糖桿菌生 物量的方法，通過在培養(yǎng)基中加入合適的氧載體，提供一種氧載體發(fā)酵體系，在沒有添加其 它物質，沒有額外能源消耗的條件下，大幅提高了培養(yǎng)基中的溶解氧濃度，從而使發(fā)酵生物 量大幅度提高，并且并不會影響該菌種的催化能力。本發(fā)明采用氧化葡萄糖桿菌為微生物菌種，經過菌種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)離心分離得 到菌絲體，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氧載體、表面活性劑，其具體步驟如下具體步驟和方法如下⑴菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在20-30°C，150-220rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-30小時。其中，菌種培養(yǎng)基含有山梨醇50_80g/L，酵母膏10_40g/L，磷酸二氫鉀0. 5_2g/ L0⑵發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到添加氧載體、表面活性劑的pH為7. 0的發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在20-30 V，150-220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時后，離心收集菌體。其 中，發(fā)酵培養(yǎng)基含有山梨醇50-80g/L，酵母膏10-40g/L，磷酸二氫鉀0. 5_2g/L ；培養(yǎng)基中氧載體為正己烷或者正十二烷，氧載體與培養(yǎng)基的體積比為 5-50 1000。正己烷或正十二烷在這里是一種與水不互相溶解、對微生物沒有毒害、具有 較高溶解氧能力的氧載體；同時為了降低培養(yǎng)基的粘度，進一步提高溶解氧的水平，本培養(yǎng) 基加入表面活性劑為吐溫-80、硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或多種，每升培養(yǎng)基中 含有表面活性劑0. 2-2g，優(yōu)選吐溫-80。離心采用高速冷凍離心機，IOOOOrpm離心15分鐘。對所得到的菌絲體進行生物催化驗證將步驟⑵中得到的菌絲體以1 1的比例加入到pH為6. 0的6%的N-羥乙基 葡萄糖胺，在20°C，200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在 甲醇乙醇氨水體積比為4 3 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色觀察、分析結^ ο上述過程中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基pH的調節(jié)均采用常用的5%氫氧化鈉溶液 調節(jié)；由于催化的底物N-羥乙基葡萄糖胺為堿性，需要用濃鹽酸調節(jié)pH至6. 0左右。本發(fā)明通過加入氧載體和表面活性劑，使發(fā)酵體系具有氧傳遞速度快，具有泡沫 生成少，剪切力小等優(yōu)點，可以顯著提高氧化葡萄糖桿菌的生物量，最高生物量可以達到未 加入氧載體發(fā)酵得到生物量的2倍，菌體的生物催化能力得到增強。
具體實施例方式實施例1(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在25°C，150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氫鉀 0. 5g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，pH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采 用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶，裝液量為50毫升，在25°C，200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)40小時后，用高速冷凍離心機，IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體4. 8克。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為70%。實施例2(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子養(yǎng)基中，在25°C，150rpm恒溫振蕩 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二 氫鉀 0. 5g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，20ml/吐溫-80L經過過濾除 菌的正己烷，PH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶，裝液量為50 毫升，在25°C，200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40小時后，用高速冷凍離心機，IOOOOrpm離 心15分鐘，收集菌體得到菌體7. 2克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌體4. 8克多 50%。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為75%。實施例3(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氫鉀2g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇60g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，30ml/L經過過濾除菌的正 己烷，PH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶，裝液量為50毫升， 在30°C，220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，用高速冷凍離心機，IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體7. 8克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌體4. 8克多62. 5%。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為65%。實施例4(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇60g/L，酵母膏15g/L，磷酸 二氫鉀 1. 5g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇60g/L，酵母膏15g/L，磷酸二氫鉀1. 5g/L，0. 5g/L的吐溫-80，40ml/ L經過過濾除菌的正己烷，pH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶， 裝液量為50毫升，在22°C，220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38小時后，用高速冷凍離心機， IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體8. 1克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌 體4. 8克多68. 8%。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為70%。實施例5(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏10g/L，磷酸 二氫鉀 0. 5g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇50g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，lg/L的吐溫-80，50ml/L 經過過濾除菌的正己烷，pH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶， 裝液量為50毫升，在22°C，220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38小時后，用高速冷凍離心機， IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體6. 9克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌 體4. 8克多44% ο(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為60%。實施例6(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氫鉀2g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氫鉀2g/L，1. 5g/L的吐溫-80，40ml/ L經過過濾除菌的正己烷，pH7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶， 裝液量為50毫升，在22°C，220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38小時后，用高速冷凍離心機， IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體9. 9克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌 體4. 8克多106%。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為75%。實施例7(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。種子培養(yǎng)基的組成和含量為山梨醇70g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氫鉀 1. 5g/L。(2)發(fā)酵培養(yǎng)將經過培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成和含量為山梨醇70g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氫鉀1. 5g/L，2. Og/L的吐溫-80，50ml/ L經過過濾除菌的正己烷，pH為7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)方式采用搖瓶培養(yǎng)，即采用500毫升三角瓶， 裝液量為50毫升，在^°C，200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45小時后，用高速冷凍離心機， IOOOOrpm離心15分鐘，收集菌體得到菌體9. 4克，比未加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵收集的菌 體4. 8克多95. 8%。(3)生物催化稱取離心得到的菌絲體2克，稱取N-羥乙基葡萄糖胺2克，以濃鹽酸調節(jié)pH至 6. 0并加入純化水33毫升，使?jié)舛葹?%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中轉化15小時，取樣，離心，上清液點硅膠板，在甲醇乙醇氨水體積比為 4:3: 3的層析液中層析，吹干，在碘瓶中顯色，結果顯示，轉化率約為75%。


附圖1應用氧化葡萄糖酸菌轉化制備米格列醇關鍵中間體N-取代-1-脫氧野尻霉素 的工藝路線圖，其中(I)為1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇，(II)為呋喃型葡萄糖胺，(III) 為米格列醇。
權利要求
1.一種提高氧化葡萄糖桿菌生物量的發(fā)酵方法，以葡萄糖氧化桿菌為微生物菌種，經 過菌種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)離心分離得到菌絲體，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氧載體、表面活性 劑，其具體步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將氧化葡萄糖桿菌菌種接種到pH為7. 0的種子培養(yǎng)基中，在20-30°C，150-220rpm恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-30小時；(2)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(1)中得到的種子培養(yǎng)液接種到添加氧載體、表面活性劑的PH為7. 0的發(fā)酵培 養(yǎng)基中，在20 30°C，150 220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 48小時后，離心收集菌 體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于氧載體為正己烷或者正十二烷。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于氧載體與培養(yǎng)基的體積比為5-50 1000。
4.根據權利要求1步驟(1)所述的方法，其特征在于菌種培養(yǎng)基含有山梨醇 50-80g/L，酵母膏 10-40g/L，磷酸二氫鉀 0. 5_2g/L。
5.根據權利要求1步驟( 所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基含有山梨醇50-80g/ L、酵母膏10-40g/L、磷酸二氫鉀0. 5-2g/L。
6.根據權利要求1步驟( 所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中加入表面活性劑為 吐溫-80、硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或多種。
7.根據權利要求1步驟( 所述的方法，其特征在于每升培養(yǎng)基中含有表面活性劑 0.2-2g。
8.根據權利要求1步驟( 所述的方法，其特征在于其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中加入表 面活性劑為吐溫-80。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用加入氧載體的培養(yǎng)基發(fā)酵提高氧化葡萄糖桿菌生物量的方法。通過在培養(yǎng)基中加入合適的氧載體，提供一種氧載體發(fā)酵體系，在沒有添加其它物質，沒有額外能源消耗的條件下，大幅提高了培養(yǎng)基中的溶解氧濃度，從而使發(fā)酵生物量大幅度提高。
文檔編號C12N1/38GK102086445SQ200910246200
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權日2009年12月4日
發(fā)明者王欽超, 肖月華, 趙志全 申請人:山東新時代藥業(yè)有限公司