專利名稱：雙峰駝h-fabp蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝H-FABP蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heartfatty acid-binding protein, H-FABP)，又稱 FABP3,編碼該蛋白的基因是目前FABPs家族中研究較多的一種類型，主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表達。不同物種的H-FABP基因編碼區(qū)具有較高的同源性，這不僅表現(xiàn)在所編碼的氨基酸上，還表現(xiàn)在DNA序列上，其外顯子和內(nèi)含子個數(shù)以及相應(yīng)外顯子的大小相同，但物種間相應(yīng)內(nèi)含子大小差異較大。當(dāng)前，已有多個物種的H- FABP基因被克隆和定位，其中人類的H-FABP基因被定位在I號染色體p32 p33，小鼠的H- FABP基因被定位于4號染色體上，1999年，Gerbens等通過與人H-FABP基因的cDNA噬菌斑雜交，分離出了含豬H-FABP基因的Y 2噬菌體，確定了豬H-FABP基因的結(jié)構(gòu)特征， 并初步將其定位在豬6號染色體上。Zhang等對大鼠H- FABP基因進行了克隆和序列結(jié)構(gòu)分析，表明大鼠H- FABP基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，共編碼133個氨基酸 ，通過熒光原位雜交(FISH)技術(shù)將其定位于5q36。
H-FABP較特異地存在于心肌組織中，紅骨骼肌、主動脈壁的平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、胃腺體的壁細胞和睪丸間質(zhì)細胞中亦有，少量存在于腎臟、白骨骼肌、腎上腺、腦，但肝臟、脂肪組織內(nèi)無H-FABP分布。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白約占心臟全部可溶性蛋白質(zhì)的 4% 8%。H-F A B P與心肌細胞內(nèi)的長鏈脂肪酸和有機化合物-輔酶A酯誘導(dǎo)體的疏水部分相結(jié)合，將其從細胞質(zhì)膜向酯化和氫化部位運輸，從而進入能量代謝體系氧化分解最終生成三磷酸腺苷(ATP )，為心肌收縮提供能量，并調(diào)節(jié)脂肪酸對各種代謝酶、受體和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、基因表達的影響，保護細胞膜和酶不受高濃度游離脂肪酸及其C ο A衍生物的影響血管細胞內(nèi)的H-FABP能與細胞色素P450表氧化酶、脂氧化酶的產(chǎn)物結(jié)合調(diào)節(jié)血管張力。H-FABP的基因表達依賴于升高的脂肪酸代謝，許多生理實驗表明增加脂肪酸的攝入與代謝可引起H-FABP及其mRNA表達升高;H_FABP蛋白及其mRNA的組織分布相平行。 H-FABP能及早發(fā)現(xiàn)超急期AMI (急性心肌梗塞)患者。對于鑒別出需急診住院、冠狀動脈造影、介入治療的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛發(fā)病6h內(nèi)的患者的早期診斷和預(yù)后判斷有很大幫助。H-FABP如與傳統(tǒng)的標(biāo)記物cTnl、CK-MB結(jié)合起來一起檢測，早期檢測 H-FABP，恢復(fù)期檢測cTnl。有利于篩選出有心臟事件高風(fēng)險的患者，不僅便于采取積極的治療策略，還可節(jié)約患者開支和實驗室資源，H-FABP與cTnl合理互補監(jiān)測也許是將來一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。
在動物方面H-FABP基因遺傳變異方面的報道較少，至今尚未發(fā)現(xiàn)克隆獲得雙峰駝H-FABP基因編碼蛋白序列以及對動物H-FABP基因進化規(guī)律研究的報道。H-FABP在細胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進細胞攝取脂肪酸，因此，通過對H-FABP從基因、蛋白質(zhì)和抑制劑等多方面的研究，必然會為心血管疾病的預(yù)防和治療帶來新的希望。
雙峰駝有較強的耐旱和沉積脂肪能力，尤其是在水草充足的季節(jié)，駝峰能在短時間內(nèi)沉積大量脂肪，很適合進行脂類代謝研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙峰駝H-FABP蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法，H-F A B P是一種使細胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進細胞攝取脂肪酸的蛋白質(zhì)，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，H-FABP能及早發(fā)現(xiàn)超急期AMI (急性心肌梗塞)患者。對于鑒別出需急診住院、冠狀動脈造影、介入治療的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛發(fā)病6h內(nèi)的患者的早期診斷和預(yù)后判斷有很大幫助。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實現(xiàn)的一種雙峰駝H-FABP蛋白基因， 該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進一步優(yōu)化或/和改進上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中46-661位的序列。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實現(xiàn)的一種雙峰駝H-FABP蛋白基因的重組蛋白。
下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進一步優(yōu)化或/和改進上述重組蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。
上述重組蛋白為具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
上述重組蛋白通過設(shè)計一對引物從雙峰駝H-FABP蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實現(xiàn)的一種雙峰駝H-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進行第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進行組織總RNA提取； 第二步，引物設(shè)計及合成，引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；第三步，RT-PCR擴增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴增的DNA片段進行RT-PCR擴增；第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴增的DNA片段進行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細胞，將感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進行PCR擴增，對擴增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 將單菌落放入培養(yǎng)基中進行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進行回收。
本發(fā)明參考其它物種H-FABP基因序列，克隆測序獲得雙峰駝H-FABP基因的cDNA 序列，并對不同物種H-FABP基因的CDS序列進行同源性比較，旨在了解和驗證H-FABP基因的結(jié)構(gòu)特點，為今后研究H-FABP基因與雙峰駝脂類代謝的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。H-FABP如與傳統(tǒng)的標(biāo)記物cTnl、CK-MB結(jié)合起來一起檢測，早期檢測H-FABP，恢復(fù)期檢測cTnl。有利于篩選出有心臟事件高風(fēng)險的患者，不僅便于采取積極的治療策略，還可節(jié)約患者開支和實驗室資源，H-FABP與cTnl合理互補監(jiān)測是將來一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。


附圖1為雙峰駝H-FABP基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。
附圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用H-FABP蛋白氨基酸同源性比較。
附圖3為不同物種H-FABP氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步描述實施例1，一種雙峰駝H-FABP蛋白基因，該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。通過以雙峰駝肝臟組織中總RNA為模板，參考牛、人、鼠等物種的H-FABP蛋白基因的同源序列設(shè)計引物，進行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列，獲得的雙峰駝H-FABP蛋白基因 cDNA 序列見 SEQ ID NO.1。
可根據(jù)實際需要，對上述雙峰駝H-FABP蛋白基因作進一步優(yōu)化或/和改進 雙峰駝H-FABP蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中46-661位的序列。在SEQID NO.1中，RT-PCR產(chǎn)物長度為708bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中46-48位為起始密碼子 ATG,659-661位為終止密碼子TGA，46-661位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS)。
實施例2，一種雙峰駝H-FABP蛋白基因的重組蛋白。
可根據(jù)實際需要，對上述雙峰駝H-FABP蛋白基因的重組蛋白作進一步優(yōu)化或/和改進重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。將雙峰駝H-FABP蛋白基因cDNA 序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見SEQ ID NO. 2。
重組蛋白為具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
通過設(shè)計一對引物從雙峰駝H-FABP蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
實施例3，一種雙峰駝H-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進行 第一步，總RNA提取1、組織分離(Isolation)從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于一 70°C保存，拿回實驗室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用O. 1%的DEPC水沖洗.由于未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用O. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用O. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加O.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2 )組織總RNA提取取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15_30°C溫育5分鐘。 加O. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2_3分鐘。4°C 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加O. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000g 離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，4°C 7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。
(3)組織總RNA的鑒定通過分光光度計上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小時，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液(2XTBE，13% 菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2 — 3分鐘。點樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
第二步，引物設(shè)計及合成根據(jù) GenBanK 發(fā)表的牛(Accession No: FJ756345.1)、人(Accession No: AK314122.1)、馬(Accession No: NM_001163885.1)等物種的 H-FABP 蛋白基因 mRNA 序列 ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計如下引物用于以雙峰駝H-FABP蛋白cDNA為模版的PCR擴增，以獲得雙峰駝H-FABP蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT 第三步，RT-PCR擴增按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer, lul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻 速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR 擴增條件97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進行30次循環(huán)； 72°C延伸10分鐘，4°C保存。
第四步，蛋白基因的克隆1、PCR擴增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg 離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液， 靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
2、回收片段同T載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。
3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從一70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細胞，冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。 加400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上，平板含0. 1%(V/V) 的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時。
4、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進行擴增。PCR產(chǎn)物同Marker—起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0. 1%(V/V)的青霉素鈉(lOOmg/ ml)，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。
5質(zhì)粒的回收質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細菌沉淀。細菌沉淀不夠時可再加一次菌液離心。在細菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2 液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒 掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
6、質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I 和Hin d II1.保證目的片段中無這兩種酶的切點。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul, Hin d III lul，10XK Buffer 2ul, DNA ( lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時。瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實施例4，重組質(zhì)粒的測序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測序。
實施例5，雙峰駝H-FABP蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建1、雙峰駝H-FABP蛋白基因編碼序列同源性比較在GenBank上搜索并獲得牛、人、鼠、豬等17種動物的H-FABP蛋白基因編碼蛋白序列， 將其同克隆測序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進行序列同源性比較(見附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與牛H-FABP蛋白氨基酸序列同源性為91. 00%ο
2、H-FABP蛋白基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建在GenBank上搜索并獲得牛、人、鼠等17種物種的19條H-FABP蛋白基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹 (見附圖3)。結(jié)果顯示雙峰駝H-FABP蛋白基因同馬的親緣關(guān)系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝H-FABP蛋白基因。
序列表<110>新疆旺源駝奶實業(yè)有限公司〈120〉雙峰駝H-FABP蛋白的蛋白編碼序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 708〈212〉 DNA 〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 Icgcttcttct gtagcctctg ctttctcggc ctagcccagc ctcaccatgg tggacgcgtt60cgtgggcacc tggaagctag tggacagcaa gaatttcgat gactacatga agtcactagg120tgtgggtttt gctaccaggc aggtgggcaa catgactaag cctaccacaa tcatcgaagt180gaatggggac acaatcaccg taaaaacgca aagcaccttc aagaacacgg caatcagctt240caagctggga gtggagttcg atgagacaac agcagatgac aggaaggtca aggtgagtca300aggagggggt catggggaag ggaaggccct gaaagggaat aggatggcgc cctattatgg360caccttgacg gagaagagag acctgggaga gctgccatac gaggaccagc tgatgcaggc420tggcagctct cagaagacag ctgaaggccc ctccccgggc caggcagcca tggtgaacca480gacatcctgc ggggctaggc tggagtccac tgtgacgctg gatggaggca aacttgtcca540cctgcagaag tggaatggac aagagtcaac acttgtgcgg gaactcgttg atgggaaact600catcctgacg ctcacccatg gcagtgtagt tagcactcgc acttatgaga aagaggcatg660aggtcaataa agcagagcca aggcccctcg gaaaaaaaaa aaaaaaaa708〈210〉 2 〈211〉 204 〈212〉 PRT〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 2MVDAFVGTWK LVDSKNFDDY MKSLGVGFAT RQVGNMTKPT TIIEVNGDTI TVKTQSTFKN60TAISFKLGVE FDETTADDRK VKVSQGGGHG EGKALKGNRM APYYGTLTEK RDLGELPYED120QLMQAGSSQK TAEGPSPGQA AMVNQTSCGA RLESTVTLDG GKLVHLQKffN GQESTLVREL180VDGKLILTLT HGSWSTRTY EKEA204〈210〉 3 〈211〉 2權(quán)利要求
1.一種雙峰駝H-FABP蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝H-FABP蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中46-661位的序列。
3.一種含有權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝H-FABP蛋白基因的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白為具有SEQID NO. 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計一對引物從雙峰駝 H-FABP蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計一對引物從雙峰駝H-FABP蛋白中得到雙峰駝肌球蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝H-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進行第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進行組織總RNA提取；第二步，引物設(shè)計及合成，引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGTGGACGCGTTCGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；第三步，RT-PCR擴增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴增的DNA片段進行RT-PCR擴增；第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴增的DNA片段進行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細胞，將感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進行PCR擴增，對擴增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 將單菌落放入培養(yǎng)基中進行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進行回收。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝H-FABP蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。本發(fā)明參考其它物種H-FABP基因序列，克隆測序獲得雙峰駝H-FABP基因的cDNA序列，并對不同物種H-FABP基因的CDS序列進行同源性比較，旨在了解和驗證H-FABP基因的結(jié)構(gòu)特點，為今后研究H-FABP基因與雙峰駝脂類代謝的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。H-FABP如與傳統(tǒng)的標(biāo)記物cTnI、CK-MB結(jié)合起來一起檢測，早期檢測H-FABP，恢復(fù)期檢測cTnI。有利于篩選出有心臟事件高風(fēng)險的患者，不僅便于采取積極的治療策略，還可節(jié)約患者開支和實驗室資源，H-FABP與cTnI合理互補監(jiān)測是將來一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。
文檔編號C12N15/10GK103014003SQ20121047825
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者陳鋼糧 申請人:新疆旺源駝奶實業(yè)有限公司