專(zhuān)利名稱(chēng):羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重組疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物重組疫苗,尤其涉及羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗 及其制備方法,屬于羊口蹄疫病毒重組疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù):
口蹄疫作為重大動(dòng)物疫病不僅嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展,而且會(huì)引起人們對(duì)食 品安全的擔(dān)憂(yōu)等一系列社會(huì)問(wèn)題。疫苗免疫仍然是有效防控口蹄疫的主要手段之一。但 目前使用的疫苗大多是采用病原體研制的滅活疫苗,生產(chǎn)此類(lèi)疫苗不僅需要防止病原體逃 逸的高級(jí)別生物安全生產(chǎn)車(chē)間,而且需要區(qū)分疫苗免疫和自然感染動(dòng)物。此外,病毒滅活不 完全有引起疫苗毒株流行的危險(xiǎn),曾經(jīng)在歐洲發(fā)生過(guò)由病毒滅活不徹底引起田間FMD流行 的事例。再者,當(dāng)口蹄疫流行時(shí),疫苗免疫牛羊等反芻動(dòng)物雖然不出現(xiàn)臨床癥狀,但容易形 成持續(xù)感染動(dòng)物,有可能成為下次流行的潛在危險(xiǎn)源。值得引起重視的是,羊感染口蹄疫病 毒并不出現(xiàn)典型的臨床癥狀,不易被發(fā)現(xiàn),作為傳染源到處流動(dòng),極大地威脅易感動(dòng)物的安 全,有口蹄疫病毒“貯存庫(kù)”之稱(chēng)。2001年英國(guó)口蹄疫大流行的疫源是典型的無(wú)癥狀感染口 蹄疫羊的流動(dòng)導(dǎo)致疫情大暴發(fā),造成450萬(wàn)動(dòng)物被撲殺,經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)103億美元,因此,對(duì) 羊口蹄疫的防控不容忽視。目前,除我國(guó)上海復(fù)旦大學(xué)鄭趙鑫教授研制的豬口蹄疫病毒0 型重組疫苗申獲了專(zhuān)利,并獲得農(nóng)業(yè)部辦法的“一類(lèi)新獸藥證書(shū)”外,沒(méi)有查閱到有關(guān)羊口 蹄疫病毒Asail型多表位重組疫苗的專(zhuān)利信息。因此,研制價(jià)廉、安全、高效的羊反芻動(dòng)物 口蹄疫新型疫苗對(duì)提升我國(guó)口蹄疫防控能力,保護(hù)畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展,保障農(nóng)民增收、 促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)快速穩(wěn)定發(fā)展等具有重要意義?,F(xiàn)代免疫學(xué)、基因組學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,為研制分子疫 苗奠定了基礎(chǔ)。但是,以小分子靶標(biāo)抗原為基礎(chǔ)的疫苗組裝體系以及最大化模擬自然感染 免疫的能力依然是小分子表位疫苗研究的瓶頸。早在20世紀(jì)80年代初,研究者發(fā)現(xiàn)口蹄 疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,并能抵抗同源病毒攻擊。1982年,Bittle 等發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白部分短肽(表位),能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此后, 研究者紛紛采用化學(xué)合成肽或基因工程技術(shù)研究分子疫苗。研究最為廣泛的是用口蹄疫 病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位(140-160和200-213氨基酸序列)構(gòu)建基因工程亞單 位疫苗和DNA疫苗及合成肽,除了美國(guó)UBI公司研制的豬口蹄疫病毒0型合成肽已經(jīng)商品 化外,所有其他分子疫苗雖然能誘導(dǎo)小動(dòng)物模型(小鼠、豚鼠)及部分本動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性抗 體,保護(hù)動(dòng)物抵抗病毒攻擊。但大規(guī)模本動(dòng)物試驗(yàn)均以失敗告終(攻毒保護(hù)率達(dá)不到國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)),主要是由于研制的小分子抗原不能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)水平的中和抗體,有些即使能 產(chǎn)生一定水平的保護(hù)性抗體,但持續(xù)時(shí)間短,不能滿(mǎn)足疫病防控的需要。另外,研制的病毒 顆粒樣衣殼蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的保護(hù)性抗體,免疫動(dòng)物能夠抵抗同源病毒的攻 擊,但是該抗原的低產(chǎn)量和高成本限制了該疫苗的應(yīng)用。近來(lái),人們通過(guò)增加T細(xì)胞表位和 外源載體蛋白以加強(qiáng)抗原遞呈能力、增加分子量、促進(jìn)B細(xì)胞成熟分化等手段來(lái)提高疫苗 的免疫原性,增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力、提升外周血循環(huán)抗體的水平和持續(xù)時(shí)間,雖然在某種程度上明顯提高了抗原的免疫原性,但是多次免疫后能產(chǎn)生高水平的外源載體蛋白抗體,反而 影響了靶標(biāo)抗原的免疫效果;另外,由于研究者采用的T細(xì)胞表位不是通用性表位,即不能 被所有宿主動(dòng)物的主要組織相容性復(fù)合物(MHC分子)識(shí)別,故并不能誘導(dǎo)所有動(dòng)物產(chǎn)生免 疫應(yīng)答。近年來(lái),以主要免疫因子如IFN-Y、IL-2等與抗原表位小分子偶聯(lián)構(gòu)建的表位疫 苗成為表位疫苗研究的新突破點(diǎn),但對(duì)本動(dòng)物的免疫效果并不理想。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種口蹄疫病毒多表位基因;本發(fā)明的目的之二是提供一種口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白的融合基因;本發(fā)明的目的之三是提供一種羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗,該疫苗含 有由上述口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白融合基因所表達(dá)的重組蛋白;本發(fā)明的目的之四是提供上述羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗的制備方 法;本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種口蹄疫病毒多表位基因,其堿基序列為SEQ ID NO :1所示;所編碼的氨基酸 序列為SEQ ID NO 2所示。一種口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白的融合基因,由SEQ IDN0 1所示的堿基 序列和羊IgG重鏈區(qū)基因組成;本發(fā)明利用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)以及相關(guān)技術(shù)分析Asial型口蹄疫病毒 的全基因組序列(JS/05株,GenBank accession number ),采用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)、設(shè) 計(jì)和篩選優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和輔助表位基因。本發(fā)明選取口蹄疫病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋 白基因VP1上的兩個(gè)免疫原性B細(xì)胞表位(136-160aa,198-21 laa)進(jìn)行適當(dāng)串聯(lián)即 136-160aa-linker-198-211aa,為了防止相鄰表位相互連接形成新的表位,本發(fā)明采用 一種全新高效的接頭(GGSSGG)連接相鄰的表位,避免不同表位連接后形成新表位,保護(hù) 天然表位的結(jié)構(gòu)和功能,以保證表位的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。為了增加表位的效價(jià),將 兩個(gè)表位的串聯(lián)體重復(fù)一次;為了提高表位的免疫原性即效價(jià),將表位重復(fù)串聯(lián)一次,即 B1-B2-B1-B2,得到復(fù)合表位基因(SEQ ID N0:1)。本發(fā)明采用RT-PCR擴(kuò)增羊IgG重鏈基因,陽(yáng)性擴(kuò)增子與復(fù)合表位基因融合后插入 表達(dá)載體pPRO-EXTb構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pESIG。這種融合蛋白稱(chēng)為“抗體化抗原分子”。其 中羊IgG重鏈區(qū)基因通過(guò)增加小分子表位的分子量使其完全抗原化,增強(qiáng)靶標(biāo)抗原的免疫 原性,另外,通過(guò)MHC分子與IgG分子Fc端的高效結(jié)合促進(jìn)靶標(biāo)抗原的遞呈,不僅增加了靶 標(biāo)抗原的免疫原性,同時(shí)延長(zhǎng)了靶標(biāo)抗原的半衰期,保證了免疫后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)血清高效價(jià) 抗體水平。本發(fā)明提供了羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗,該重組疫苗包括以下組 分口蹄疫病毒多表位基因和羊IgG重鏈區(qū)基因的融合基因所編碼的蛋白以及口蹄疫病毒 3D蛋白;一種制備上述羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗的方法,包括(1)制備口蹄 疫病毒多表位基因和羊IgG重鏈區(qū)基因的融合基因蛋白;(2)制備口蹄疫病毒3D蛋白;(3) 分別將步驟(1)和步驟(2)所制備的蛋白稀釋后,混和均勻,加入佐劑,乳化,即得。
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優(yōu)選的,步驟(3)中將步驟(1)和步驟(2)所制備的蛋白稀釋后按照等體積比例 混合均勻,再加入與混合物體積相同的佐劑進(jìn)行乳化。其中,口蹄疫病毒3D蛋白基因的堿基序列為SEQ ID NO :3所示,所推導(dǎo)的氨基酸 序列為SEQ ID NO 4所示;基于傳統(tǒng)疫苗和目前分子疫苗的諸多缺點(diǎn)和不足,本發(fā)明采用全新的免疫學(xué)理 論,采用分子設(shè)計(jì)、基因操作、蛋白質(zhì)工程及相關(guān)技術(shù)構(gòu)建羊口蹄疫Asial型多表位重組疫 苗。本發(fā)明疫苗在設(shè)計(jì)上既考慮B細(xì)胞的功能,又兼顧T輔助細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的輔助功能及 T細(xì)胞的細(xì)胞免疫功能。最主要的是選用了能被絕大多數(shù)動(dòng)物MHC分子識(shí)別的T細(xì)胞表位 即通用型表位,克服MHC分子的異質(zhì)性限制,加強(qiáng)MHC分子對(duì)抗原的遞呈能力和水平。另 外,Thl細(xì)胞表位能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明采用宿主動(dòng)物自身蛋白分子(IgG)作為 載體蛋白,不僅增大了小分子靶標(biāo)抗原的分子量,使其完全抗原化,明顯增強(qiáng)了靶標(biāo)抗原的 免疫原性,延長(zhǎng)了半衰期,而且最大程度降低了副反應(yīng)。載體蛋白IgG作為主要免疫成分能 被MHC分子有效識(shí)別,促進(jìn)抗原的遞呈能力和水平。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和本動(dòng)物免疫效力實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶標(biāo)抗原的免疫原性,即誘 導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體和細(xì)胞免疫能力,以及抵抗病毒攻擊的能力(PD50測(cè)定),全面評(píng)價(jià) 抗原的免疫效力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本發(fā)明羊Asial表位疫苗能產(chǎn)生全面的免疫保護(hù)反應(yīng),即 注射免疫羊不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體,同時(shí)也能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,有效保護(hù)動(dòng) 物抵抗口蹄疫病毒強(qiáng)毒攻擊。
圖1本發(fā)明羊口蹄疫病毒Asial多表位重組疫苗免疫豚鼠后血清抗體效價(jià)消長(zhǎng)曲 線(xiàn)圖;C為PBS對(duì)照,EC1為表位載體蛋白,EC1T為表位載體蛋白-3D,IV為滅活疫苗。圖2本發(fā)明羊口蹄疫病毒Asial多表位重組疫苗免疫羊只后血清抗體效價(jià)消長(zhǎng)曲 線(xiàn)圖;C為PBS對(duì)照,EC1為表位載體蛋白,EC1T為表位載體蛋白-3D。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的,并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗的制備(1) 口蹄疫多表位基因設(shè)計(jì)和合成選用Asial型口蹄疫病毒JS/05毒株全基 因組序列(GenBank accession number :EF149009. 1)進(jìn)行多表位的設(shè)計(jì),即選取主要結(jié) 構(gòu)蛋白基因VP1上的兩個(gè)免疫原性B細(xì)胞表位(136-160aa,198-211aa)進(jìn)行適當(dāng)串聯(lián)即 136-160aa-linker-198-211aa,為了防止相鄰表位相互連接形成新的表位,在相鄰表位之 間加入接頭GGSSGG最大化減小相鄰表位之間的影響,以保證表位的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。 為了增加表位的效價(jià),將兩個(gè)表位的串聯(lián)體重復(fù)一次,S卩136-160aa-linker-198-211aa-l inker-136-160aa-l inker-198-21 laa。為了將該多表位融合基因插入重組表達(dá)載體,在該融 合基因的兩端引入酶切位點(diǎn),即5’端-BamHl,3’端-EcoRl,插入pUC_18載體即為重組質(zhì)粒pUC-E。復(fù)合多表位基因序列為T(mén)ACGGAGAAGAATCCTCGCGGCGTGGTGATCTCGCCGCCCTTGCACGCAGAGTGAACAACCGGCTGCCC ACTTCCGGTGGCTCTAGCGGCGGTCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTGGGGTGGTTCTAG CGGCGGTTACGGAGAAGAATCCTCGCGGCGTGGTGATCTCGCCGCCCTTGCACGCAGAGTGAACAACCGGCTGCCCA CTTCCGGTGGCTCTAGCGGCGGTCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTGG(SEQ ID NO 1)所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示(2)引物設(shè)計(jì)和目的基因的擴(kuò)增參考羊IgG 序列(Genbank accession number :X69797)設(shè)計(jì)特異性引物。 即上游,5-GGGGAATTC(EcoRl)GCCTCAACAACACCCCCGAAA-3 下游,5-GGGCTCGAG (Xhol) TTTACCCGGAGGCTTA GAGATCGAC-3??俁NA的提取及PCR擴(kuò)增用RNA提取試劑盒(Qigen)分別從羊新鮮脾臟中提取總 RNA。用one step RNA PCR試劑盒(Takara,Japan)擴(kuò)增目的基因總反應(yīng)體積為50 yl,包 # 1 u llOXone step RNAPCR buffer, 10 u 1 MgC12,5u 1 dNTPs, 1 u 1 RNase inhibitor, 1 u 1 AMVRTase XL, 1 U 1 AMV Optimized Taq,1 ii 1 上游引物,1 ii 1 下游引物,5 ii 1RNA,加 無(wú)離子水20iU。按以下條件擴(kuò)增,50°C反轉(zhuǎn)錄30min ;94°C熱變性5min ;94°C,lmin ;60°C, lmin ;72°C,lmin ;30個(gè)循環(huán)。用DNA純化回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物,并插入pMD_18T載體 (Takara, Dalian, China)進(jìn)行測(cè)序鑒定。(3)多表位_載體蛋白融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建上述(1)和(2)所目的基因分別用BamHl/EcoRl, EcoRl/Xhol酶切,純化回收后, 插入事先用BamHl/Xhol線(xiàn)性化的表達(dá)質(zhì)粒pPK(1HTb (購(gòu)自Invitrogen),構(gòu)建重組表達(dá)體 pESIG.;(3)富集T細(xì)胞表位的口蹄疫病毒基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建參考(1)述Asial型口蹄疫病毒JS/05株的基因組序列合成引物上游 5-GCTCCATGG(Ncol)AT GGATTGATAGTTGACACCAGAGAT-3 ;下游 5-GCTAAGCTT(HindiII)TGCGT CACCGCACACGGCGTTC-3。參照(2)所述反應(yīng)條件擴(kuò)增口蹄疫病毒3D基因,擴(kuò)增產(chǎn)物插入 PMD-18T構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-3D,經(jīng)生物公司(Takara,Dalian, China)測(cè)序驗(yàn)證目的基因的 正確性。用Ncol/Hindlll將目的基因3D從測(cè)序正確的陽(yáng)性重組體切割下來(lái)插入表達(dá)載體 pET30a (購(gòu)自Novagen),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30_3D。(4)多表位融合抗原和3D蛋白的表達(dá)和純化重組多表位抗原和3D抗原的表達(dá)按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版第15章進(jìn)行, 科學(xué)出版社,2002年8月。融合蛋白的純化參照試劑公司手冊(cè)進(jìn)行(Novagen,TB273Rev. A 0603)。(5)疫苗制備用PBS變性液將純化的重組多表位抗原稀釋成濃度為0. 8mg/ml,3D蛋白稀釋為 0.4mg/ml。兩種蛋白溶液等體積(0.5ml 0. 5ml)混勻后,加入等體積(lml) 206佐劑,用 乳化機(jī)進(jìn)行乳化(先低速攪拌,慢慢調(diào)高轉(zhuǎn)速,總時(shí)間不超過(guò)2min)制備成疫苗(油包水)。 以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。(6)疫苗的無(wú)菌檢測(cè)
取適當(dāng)量的疫苗接種瓊脂斜面、肉湯和肝湯培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)7天,以瓊脂斜面未 見(jiàn)菌落,液體清亮為合格,否則為不合格產(chǎn)品。另外,用BABL/c小鼠檢測(cè)疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的 安全性,即選用5只BABL/c小鼠,每只注射0. 5ml疫苗,觀察72小時(shí)內(nèi)是否出現(xiàn)不良反應(yīng), 以未出現(xiàn)臨床癥狀為合格。試驗(yàn)例1本發(fā)明重組疫苗的免疫效力試驗(yàn)為了驗(yàn)證本發(fā)明重組疫苗的免疫原性,在動(dòng)物模型豚鼠及本動(dòng)物牛羊身上進(jìn)行了 疫苗的免疫效力實(shí)驗(yàn)。(1)選取健康豚鼠(250_300g)20只,分成4組,每組5只豚鼠。分別為表位載體蛋 白組(SEQ ID NO :1+羊IgG重鏈區(qū)),表位載體蛋白-3D組(口蹄疫病毒多表位基因和載 體蛋白的融合基因所編碼的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白),滅活疫苗組(實(shí)施例1所制備 的滅活疫苗),PBS對(duì)照組。每只豚鼠經(jīng)腹股溝注射抗原制劑1ml (300 y g),一免28天后同 劑量加強(qiáng)免疫。分別予免疫前1天,免疫后7,14,28及加強(qiáng)免疫后14天采血,用全病毒作 為包被抗原,采用間接ELISA測(cè)定循環(huán)抗體效價(jià),結(jié)果如表1所示,首免后血清抗體隨時(shí)間 延長(zhǎng)而上升,到28天達(dá)最高,加強(qiáng)免疫后,表位載體蛋白組上升幅度不明顯,但表位載體蛋 白-3D組血清抗體明顯升高,說(shuō)明重組抗原能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體,但抗體水平 低于全病毒滅活抗原的水平。令人鼓舞的是,加強(qiáng)免疫豚鼠能夠抵抗1000個(gè)50%豚鼠感染 劑量的攻擊,100%保護(hù)。圖2能明顯反應(yīng)各注苗組血清抗體效價(jià)消長(zhǎng)情況隨免疫次數(shù)及時(shí) 間的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。表1重組蛋白免疫豚鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果
~^抗體效價(jià)
0天7天14天2丨天28天14天(二免)
表位-載體蛋白 0.077±0.005 0.064±0.003 0.437±0.29 0.571±0.161 0.76±0.16 0.772士 0.288 表位-載體蛋白-3D 0.71±0.023 0.08士0.123 0.352±0.098 0.614±0.225 0.54±0.265 0.732±0.295 滅活疫苗0.065±0.028 0.339±0.033 0.833士0.209 0.969±0.243 3.04±0.038 3.27±0.068
PBS0.07±0.003 0.09±0.044 0.07±0.025 0.144±0.036 0.1±0.024 0.105±0.039(2)重組抗原在羊體的免疫效力試驗(yàn)選用口蹄疫病毒特異性抗體和非結(jié)構(gòu)蛋白 抗體均為陰性羊6只(4月齡),分成3組,每組兩只,分別注射PBS(C),表位載體蛋白(EC1), 表位載體蛋白-3D(EC1T)。免疫羊只在一免后30天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。定期采血(免疫前、一 免疫后30天及加強(qiáng)后14天),用液相阻斷ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)。如表2所示,多表位 重組抗原能夠誘導(dǎo)高水平保護(hù)性中和抗體,尤其是加強(qiáng)免疫后血清抗體水平高達(dá)1 180, 且隨時(shí)間延長(zhǎng)及免疫次數(shù)增加血清抗體效價(jià)呈現(xiàn)出正相關(guān)(圖2),具有良好的應(yīng)用前景。表2多表位重組抗原免疫羊血清抗體效價(jià)
0079]8590950080]<210>20081]<211>960082]<212>PRT0083]<213>artifical sequence0084]<400>20085]Tyr Gly GluGluSerSer ArgArg Gly AspLeuAlaAlaLeuAlaArg0086]1510150087]Arg Val AsnAsnArgLeuProThr Ser GlyGlySerSerGlyGlyArg0088]2025300089]Arg Lys GinGlulielieAlaPro Glu LysGinThrTrpGlyGlySer0090]3540450091]Ser Gly GlyTyrGlyGluGluSer Ser ArgArgGlyAspLeuAlaAla0092]5055600093]Leu Ala ArgArgValAsnAsnArg Leu ProThrSerGlyGlySerSer0094]657075800095]Gly Gly ArgArgLysGinGlulielie AlaProGluLysGinThrTrp0096]8590950097]<210>30098]<211>14100099]<212>DNA0100]<213>Foot-and_mouthdiseasevirus0101]<220>0102]<221>CDS0103]<222>(1). . (1410)0104]<223>0105]<400>30106]gga ttg atagttgacaccagagatgtt gaggagcgcgtgcatgtcatg0107]Gly Leu lieValAspThrArgAspVal GluGluArgValHisValMet0108]1510150109]cgc aaa accaagctcgcacccactgtg gcacacggtgtgtttaaccct0110]Arg Lys ThrLysLeuAlaProThrVal AlaHisGlyValPheAsnPro0111]2025300112]gaa ttc gggcctgccgccttgtccElclC clclclgacccgcgcctggatgaa0113]Glu Phe GlyProAlaAlaLeuSerAsn LysAspProArgLeuAspGlu0114]3540450115]gga gtt gtcctcgatgaagccatettc tcccacaagggagacaca0116]Gly Val ValLeuAspGluAlaliePhe SerLysHisLysGlyAspThr0117]505560
48
96
144
192
9
aagatgtctgaggaggacgcgctgtcccgccgctgcgetgccgac240
LysMetSerGluGluAspLysAlaLeuSerArgArgCysAlaAlaAsp
65707580
tacgcgtegcgtctgcacagegtgctgggtacggcaaacgccccactg288
TyrAlaSerArgLeuHisSerValLeuGlyThrAlaAsnAlaProLeu
859095
ageatetacgaggcaattaagggcgtcgacggacttgacgccatggaa336
SerlieTyrGluAlalieLysGlyValAspGlyLeuAspAlaMetGlu
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權(quán)利要求
一種口蹄疫病毒多表位基因,其特征在于其堿基序列為SEQID NO1所示。
2.由權(quán)利要求1所述口蹄疫病毒多表位基因所編碼的蛋白質(zhì),其特征在于其氨基酸 序列為SEQ ID NO 2所示。
3.—種口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白的融合基因,其特征在于由權(quán)利要求1所 述的口蹄疫病毒多表位基因和羊IgG重鏈區(qū)基因連接組成。
4.羊口蹄疫病毒Asial型多表位重組疫苗,其特征在于,包括以下組分權(quán)利要求3所 述融合基因編碼的蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白。
5.一種制備權(quán)利要求4所述重組疫苗的方法,包括(1)將權(quán)利要求3所述的融合基因 表達(dá)得到重組蛋白;(2)制備口蹄疫病毒3D蛋白;(3)分別將步驟(1)和步驟(2)所制備的 蛋白稀釋后,混和均勻,加入佐劑,乳化,即得。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于步驟(3)中將步驟(1)和步驟(2)所制 備的蛋白稀釋后按照等體積比例混合均勻,再加入與混合物體積相同的佐劑進(jìn)行乳化。
7.權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒多表位基因在制備預(yù)防或治療口蹄疫藥物中的用途。
8.權(quán)利要求3所述的融合基因在制備預(yù)防或治療口蹄疫藥物中的用途。
9.按照權(quán)利要求7或8所述的用途,其特征在于所述的口蹄疫是羊口蹄疫。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重組疫苗及其制備方法。該重組疫苗包括以下組分口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白的融合基因所編碼的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白;其制備方法包括分別將口蹄疫病毒多表位基因和載體蛋白的融合基因所表達(dá)蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白稀釋后,混和均勻,加入佐劑,乳化,即得。動(dòng)物模型和動(dòng)物免疫效力實(shí)驗(yàn)表明,本發(fā)明羊Asia1表位重組疫苗能產(chǎn)生全面的免疫保護(hù)反應(yīng),注射免疫羊不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體,同時(shí)也能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,本發(fā)明重組疫苗能有效保護(hù)動(dòng)物抵抗口蹄疫病毒強(qiáng)毒攻擊。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101864434SQ20091025936
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者叢國(guó)正, 常惠蕓, 林彤, 獨(dú)軍政, 王景鋒, 邵軍軍, 高閃電 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所