專利名稱：牛羊等反芻動物口蹄疫o、a型雙價滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中牛羊等反芻動物口蹄疫疫苗領(lǐng)域，特別是一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗。
背景技術(shù)：
口蹄疫是世界上最重要的動物疫病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類疫病之首，素有″政治經(jīng)濟病″之稱，世界各國極為重視，是廣泛研究和防制的重點。2000年以來已消滅口蹄疫的日本、韓國、蒙古、英國、法國、荷蘭、愛爾蘭等國家口蹄疫卷土重來，而與我國毗鄰的許多周邊國家除了有O型口蹄疫流行外，A型口蹄疫流行占已鑒定病毒型的94％。這不僅給全世界畜牧業(yè)經(jīng)濟造成了巨大損失，引起了全球性恐慌，也對我國畜牧業(yè)健康、穩(wěn)定、持續(xù)地發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅?？谔阋卟《緦傩NA病毒科，病毒基因組具有小RNA病毒準(zhǔn)種的特性，壓力選擇導(dǎo)致病毒在毒力和抗原性方面極易變異。根據(jù)交叉保護試驗已確定了O、A、C、Asia I、SAT I、SAT II、SAT III等7個血清型，型間無交叉保護，型內(nèi)不同毒株之間的遺傳變異可導(dǎo)致抗原差異?？谔阋呤鞘澜缧詡魅静。鲊餍械难逍图岸局暧捎谏鲜鲈虼嬖谥^大差異，因此，均紛紛研制適合于自己國家的疫苗，以預(yù)防和控制口蹄疫這一世界性疫病的流行。綜觀國際上防制口蹄疫的成功經(jīng)驗，用安全、高效、優(yōu)質(zhì)的雙價或多價滅活疫苗對易感動物進行預(yù)防接種是多血清型口蹄疫綜合防制中最有效的措施之一。在滅活疫苗的研制方面，國際上具有代表性的疫苗生產(chǎn)工藝是″選擇適宜的制苗毒株，通過BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)法增殖病毒；用二乙烯亞胺(BEI)對病毒抗原進行滅活；用物理或化學(xué)方法濃縮、純化抗原；用礦物油或鋁膠佐劑配制疫苗″。我國目前還沒有同時預(yù)防O、A兩型口蹄疫的滅活疫苗。過去研制的牛口蹄疫O-A型雙價弱毒疫苗存在反應(yīng)率高(30％)、反應(yīng)重，對幼牛、羊及有些品種的牛不能使用等缺點，特別是1歲以下的牛應(yīng)用后可引起心肌炎而死亡，另外該弱毒對豬是一種強毒，存在潛在威脅。由于與我國毗鄰的周邊國家O型和A型口蹄疫大肆流行，研制出同時預(yù)防O、A兩型口蹄疫的高效、安全、可靠的疫苗是預(yù)防口蹄疫急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可同時預(yù)防牛羊等反芻動物O、A兩型口蹄疫的高效、安全、可靠的雙價滅活疫苗，用于牛羊等反芻動物O、A型口蹄疫的免疫預(yù)防和緊急接種的牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗，其特征在于由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原和佐劑按下述重量百分比含量配制而成抗原，由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58或O/china/99、A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，抗原占疫苗總量的50～65％，這三株毒株已于2002年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其中毒株-OA/58的保藏編號為CGMCC No.0872，毒株-AF/72的保藏編號為CGMCC No.0873，毒株-O/china/99的保藏編號為CGMCC No.0874；佐劑，由75％白油、7％吐溫、18％司班80混合高壓滅菌制成，佐劑占疫苗總量的50～35％。
上述含量原料按照下述工藝方法和順序制備而成a、制苗材料的制備；b、病毒的增殖；c、病毒滅活的程序，包括c.1過濾；c.2滅活；c.3安檢；c.4菌檢；d、疫苗配制程序采用一步乳化法，即先配制佐劑，其中18％司班80、7％吐溫、75％白油，取占疫苗總量35～50％的佐劑加入到乳化器中，不斷攪拌，然后在攪拌下緩慢加入占疫苗總量65～50％的抗原，該抗原由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58或O/china/99、A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，待抗原與佐劑攪勻后，一次性通過均質(zhì)機乳化而成；e、疫苗檢驗，包括e.1、物理性狀檢查；e.2、無菌檢驗；e.3、安全檢驗；e.4、效力檢驗。
本疫苗對口蹄疫易感動物牛、羊、豬安全，適用于不同品種、各種年齡的牛和羊。成年牛免疫劑量為4ml/頭、犢牛和成年羊均為2ml/頭(只)、羔羊1ml/只。對牛O、A型口蹄疫的免疫保護率分別為91.3％和100％。經(jīng)PD50測定，免疫牛對O/china/99毒株攻擊的PD50為0.593ml，每劑疫苗含6.75個PD50；對OA/58毒株攻擊的PD50為0.634ml，每劑疫苗含6.31個PD50；對AF/72毒株攻擊的PD50為0.736ml，每劑疫苗含5.43個PD50。該疫苗對羊O、A型口蹄疫的免疫保護率均為100％。疫苗一次接種有效免疫持續(xù)期6個月。2～8℃下保存期12個月。安全性和免疫效力達到國際同類產(chǎn)品先進水平。該疫苗采用的毒種通過對制苗細胞的適應(yīng)性及毒力測定、免疫原性及抗原廣譜性分析、核苷酸序列分析等多項試驗選定。疫苗制備結(jié)合我國實際，借鑒了國內(nèi)外同類疫苗先進技術(shù)，采用BHK-21傳代細胞濃縮培養(yǎng)法繁殖病毒、BEI(二乙烯亞胺)滅活和油佐劑乳化。疫苗區(qū)域試驗對不同年齡的黃牛、水牛、奶牛、牦牛、西門塔爾牛共計6507頭預(yù)防接種，疫苗中試對285049頭不同年齡的黃牛、水牛和2462只不同年齡的羊只進行預(yù)防接種，確證疫苗安全有效。
(四)實施例實施例1、一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗，由已滅活的O型病毒抗原OA/58、A型病毒抗原AF/72(各占疫苗總量的25％)，與佐劑(由75％白油、7％吐溫、18％司班80混合高壓滅菌制成，占疫苗總量的50％)共同配制而成，通過下述工藝方法和順序?qū)崿F(xiàn)。
1、毒種選擇1.1、A型毒種為1972年分離的牛源舌皮毒，代號為AF/72，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所鑒定為A型口蹄疫病毒。將該毒種1∶10000倍稀釋后，接種無口蹄疫A型血清抗體的黃牛，應(yīng)于24～48小時內(nèi)出現(xiàn)口蹄疫次發(fā)性水泡病損；將牛舌皮毒種1∶10稀釋后接種2～3日齡乳鼠，應(yīng)于2～4日內(nèi)出現(xiàn)明顯的麻痹癥狀并最終死亡，傳至2～5代均可在22小時內(nèi)致乳鼠發(fā)病死亡；該毒種對牛的半數(shù)感染量(ID50)為10-7.0；適應(yīng)到乳鼠的毒種對乳鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-7.0；用該毒種適應(yīng)BHK-21細胞，在7～12代之內(nèi)收獲病毒的時間應(yīng)縮短到12小時以內(nèi)，并且TCID50應(yīng)≥10-7.5。經(jīng)核苷酸序列分析，該毒種與周邊國家及我國50～60年代牛源A型口蹄疫分離毒株的同源性在91％以上，在遺傳學(xué)分類上屬相同的基因亞型。
1.2、O型毒種為1958年分離的牛源舌皮毒，代號為OA/58經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所鑒定為O型口蹄疫病毒。該毒種1∶10000倍稀釋后，接種無口蹄疫O型血清抗體的黃牛，應(yīng)于24～48小時內(nèi)出現(xiàn)口蹄疫次發(fā)性水泡病損；將牛舌皮毒種1∶10稀釋后接種2～3日齡乳鼠，應(yīng)于2～4日內(nèi)出現(xiàn)明顯的麻痹癥狀并最終死亡，傳至2～5代均可在22小時內(nèi)致乳鼠發(fā)病死亡；該毒種對牛的半數(shù)感染量(ID50)為10-8.33；適應(yīng)到乳鼠的毒種對乳鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-7.7；用該毒種適應(yīng)BHK-21細胞，在3～10代之內(nèi)收獲病毒的時間應(yīng)縮短到12小時以內(nèi)，并且TCID50應(yīng)≥10-8.5。經(jīng)核苷酸序列分析，該毒種與我國50～60年代牛源O型口蹄疫分離毒株的同源性在90％以上，與O/china/99同源性在86％以上，在遺傳學(xué)分類上均屬相同的基因型。通過細胞中和試驗分析該毒種與O/china/99毒株抗原關(guān)系密切(r值大于0.94)。
2、增殖病毒的程序2.1制苗材料的制備制苗材料為BHK-21單層細胞，細胞種子由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，細胞制備所用犢牛血清經(jīng)檢查應(yīng)無口蹄疫病毒抗體，每批血清均應(yīng)過濾除菌、無菌檢驗；各種營養(yǎng)液配制及BHK-21細胞的制備按一般組織培養(yǎng)方法進行；
2.2、病毒的增殖用15L轉(zhuǎn)瓶BHK-21細胞通過濃縮培養(yǎng)法增殖制苗用病毒抗原，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速為10轉(zhuǎn)/小時；在培養(yǎng)過程中鏡檢轉(zhuǎn)瓶細胞CPE，當(dāng)達到90％時即可收獲病毒液，在-15℃下凍結(jié)保存；TCID50應(yīng)≥10-7.5。
3、病毒滅活的程序3.1、過濾將凍結(jié)的O、A型制苗病毒液分別融化、組批、混合，經(jīng)60目銅紗網(wǎng)過濾除細胞碎片，用7.5％NaHCO3調(diào)PH至7.6，并加200u/ml青、鏈霉素；3.2、滅活給已過濾的O、A型病毒液分別加入BEI，使其濃度達到2mmol/L，在37℃溫室或發(fā)酵罐夾套水浴循環(huán)升溫至30℃，將溫室或發(fā)酵罐夾套水浴的溫度調(diào)至30℃，并在30℃下O型病毒持續(xù)滅活24小時、A型病毒持續(xù)滅活26小時，其間每2小時搖振1次，滅活終止期加入2％硫代硫酸鈉阻斷或不阻斷，抽樣并置8℃冷庫或發(fā)酵罐冰鹽水保溫待檢；3.3、安檢取2～4日齡乳鼠4～5只，頸背部皮下接種滅活病毒液0.2ml/只，每組設(shè)健康對照組2只，接種后與母鼠同罐飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天，接種與對照乳鼠均應(yīng)全部健活；3.4、菌檢按中華人民共和國獸藥典進行，應(yīng)無細菌生長；4、疫苗配制程序采用一步乳化法，即先配制佐劑，其中18％司班80、7％吐溫、75％白油，共占疫苗總量50％，加入到乳化器中，不斷攪拌，然后在攪拌下緩慢加入占疫苗總量50％的抗原，該抗原由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，待抗原與佐劑攪勻后，一次性通過均質(zhì)機乳化而成；5、疫苗檢驗5.1、物理性狀檢查該疫苗為礦物油乳劑型，外觀呈白色或淡粉紅色略帶粘滯性流體。乳劑4000rpm離心15分鐘應(yīng)不分層。37℃下存放15日應(yīng)無破乳現(xiàn)象，吸入內(nèi)徑1mm的1ml吸管中，垂直下滴每分鐘不少于13滴；5.2、無菌檢驗按中華人民共和國獸藥進行，應(yīng)無細菌生長；5.3、安全檢驗用購至非疫區(qū)的1歲內(nèi)查無口蹄疫血清抗體的健康小黃牛2頭，肌肉接種疫苗10ml/頭，觀察10天，應(yīng)不出現(xiàn)口蹄疫癥狀；5.4、效力檢驗1)保護率測定按擬定使用劑量肌肉注射10頭查無口蹄疫血清抗體的民敏感成年黃牛，免疫30天后，分成2組，一組用10000ID50的O型口蹄疫同源牛舌皮強毒(OA/58或O/china/99)攻擊，另一組用10000ID50的A型口蹄疫同源牛舌皮強毒(AF/72)攻擊，同時設(shè)O、A型病毒攻擊對照牛各3頭。攻擊方法為按0.2ml/頭劑量分兩點(每點0.1ml)舌皮內(nèi)注射。攻擊后12日內(nèi)每日觀察，以舌面以外其它部位不出現(xiàn)次發(fā)性病損為保護，反之為不保護。若對照牛3/3發(fā)病，免疫牛4/5或以上保護為效檢合格；若對照牛2/3發(fā)病，免疫牛5/5保護為效檢合格。
2)PD50測定將30頭黃牛隨機分成2批，每批15頭，各批又分成3組，每組5頭，各批第1組接種使用劑量的疫苗、第2組接種1/4劑量的疫苗、第3組接種1/10劑量的疫苗。免疫后21天，第一批各組用10000ID50的O型口蹄疫同源牛舌皮強毒(OA/58或O/china/99)、第二批各組用10000ID50的A型口蹄疫同源牛舌皮強毒(AF/72)分別進行攻擊。另設(shè)O、A型病毒對照牛各2頭。攻擊方法為每頭舌面皮內(nèi)接種2個點，每點0.1ml，觀察8天。攻毒牛舌面以外的其它部位出現(xiàn)病損為不保護，否則為保護，對照牛則至少3蹄出現(xiàn)病損。根據(jù)每組保護動物數(shù)量，用Reed-Muench氏法計算該疫苗對攻擊毒株的PD50，應(yīng)≥3PD50。
實施例2一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗，由已滅活的O型病毒抗原OA/58、A型病毒抗原AF/72(各占疫苗總量的25％)，與佐劑(由75％白油、7％吐溫、18％司班80混合高壓滅菌制成，占疫苗總量的50％)共同配制而成，通過下述工藝方法和順序?qū)崿F(xiàn)。
1、毒種選擇1.1、A型毒種選擇與實施例1相同1.2、O型毒種選擇O/china/99為1999年分離的牛源舌皮毒，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所鑒定為O型口蹄疫病毒。將該毒種1∶10000倍稀釋后，接種無口蹄疫O型血清抗體的黃牛，應(yīng)于24～48小時內(nèi)出現(xiàn)口蹄疫次發(fā)性水泡病損；將牛舌皮毒種1∶10稀釋后接種2～3日齡乳鼠，應(yīng)于24小時內(nèi)出現(xiàn)明顯的麻痹癥狀并最終死亡，傳至2～5代均可在14小時左右致乳鼠發(fā)病死亡；該毒種對牛的半數(shù)感染量(ID50)為10-9.5；適應(yīng)到乳鼠的毒種對乳鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-8.3；用該毒種適應(yīng)BHK-21細胞，在3～7代之內(nèi)收獲病毒的時間應(yīng)縮短到10小時以內(nèi)，并且TCID50應(yīng)≥10-8.5。經(jīng)核苷酸序列分析，該毒種在遺傳學(xué)分類上屬″泛亞型″毒株群，與國際上發(fā)表的泛亞型毒株的VP1基因核苷酸序列同源性在95％以上；在PK15細胞上連傳60代后，主要免疫基因的核苷酸序列與傳代前相比同原性為99.22％，說明該毒種的遺傳性能穩(wěn)定。通過細胞中和試驗分析該毒種與我國50～60年代牛源O型口蹄疫分離毒株抗原關(guān)系密切(r值大于0.92)。
2、增殖病毒的程序2.1制苗材料的制備制苗材料為BHK-21單層細胞，細胞種子由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，細胞制備所用犢牛血清經(jīng)檢查應(yīng)無口蹄疫病毒抗體，每批血清均應(yīng)過濾除菌、無菌檢驗；各種營養(yǎng)液配制及BHK-21細胞的制備按一般組織培養(yǎng)方法進行；2.1病毒的增殖用15L轉(zhuǎn)瓶BHK-21細胞通過濃縮培養(yǎng)法增殖制苗用病毒抗原，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速為10轉(zhuǎn)/小時；在培養(yǎng)過程中鏡檢轉(zhuǎn)瓶細胞CPE，當(dāng)達到90％時即可收獲病毒液，在-15℃下凍結(jié)保存；TCID50應(yīng)≥10-7.5。
3、病毒滅活的程序3.1、過濾將凍結(jié)的O、A型制苗病毒液分別融化、組批、混合，經(jīng)60目銅紗網(wǎng)過濾除細胞碎片，用7.5％NaHCO3調(diào)PH至7.8，并加200u/ml青、鏈霉素；3.2、滅活給已過濾的O、A型病毒液分別加入BEI，使其濃度達到2mmol/L，在37℃溫室或發(fā)酵罐夾套水浴循環(huán)升溫至30℃，將溫室或發(fā)酵罐夾套水浴的溫度調(diào)至30℃，并在30℃下O型病毒持續(xù)滅活24小時、A型病毒持續(xù)滅活26小時，其間每4小時搖振1次，滅活終止期加入2％硫代硫酸鈉阻斷或不阻斷，抽樣并置2℃冷庫或發(fā)酵罐冰鹽水保溫待檢；
3.3、安檢取2～4日齡乳鼠4～5只，頸背部皮下接種滅活病毒液0.2ml/只，每組設(shè)健康對照組2只，接種后與母鼠同罐飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天，接種與對照乳鼠均應(yīng)全部健活；3.4、菌檢按中華人民共和國獸藥典進行，應(yīng)無細菌生長。
4、疫苗配制程序采用一步乳化法，即先配制佐劑，其中18％司班80、7％吐溫、75％白油，共占疫苗總量35％，加入到乳化器中，不斷攪拌，然后在攪拌下緩慢加入占疫苗總量65％的抗原，該抗原由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原0/china/99A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，待抗原與佐劑攪勻后，一次性通過均質(zhì)機乳化而成。
5、疫苗檢驗5.1、物理性狀檢查該疫苗為礦物油乳劑型，外觀呈白色或淡粉紅色略帶粘滯性流體。乳劑4000rpm離心15分鐘應(yīng)不分層。37℃下存放15日應(yīng)無破乳現(xiàn)象，吸入內(nèi)徑1mm的1ml吸管中，垂直下滴每分鐘不少于13滴；5.2、無菌檢驗按中華人民共和國獸藥進行，應(yīng)無細菌生長；5.3、安全檢驗用購至非疫區(qū)的1歲內(nèi)查無口蹄疫血清抗體的健康小黃牛2頭，肌肉接種疫苗10ml/頭，觀察10天，應(yīng)不出現(xiàn)口蹄疫癥狀。
5.4、效力檢驗同實施例1.
權(quán)利要求
1.一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗，其特征在于由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原和佐劑按下述重量百分比含量配制而成抗原，由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58或O/china/99、A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，抗原占疫苗總量的50～65％，這三株毒株已于2002年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其中毒株-OA/58的保藏編號為CGMCC No.0872，毒株-AF/72的保藏編號為CGMCC No.0873，毒株-O/china/99的保藏編號為CGMCC No.0874；佐劑，由75％白油、7％吐溫、18％司班80混合高壓滅菌制成，佐劑占疫苗總量的50～35％。上述含量原料按照下述工藝方法和順序制備而成a、制苗材料的制備；b、病毒的增殖；c、病毒滅活的程序，包括c.1過濾；c.2滅活；c.3安檢；c.4菌檢；d、疫苗配制程序采用一步乳化法，即先配制佐劑，其中18％司班80、7％吐溫、75％白油，取占疫苗總量35～50％的佐劑加入到乳化器中，不斷攪拌，然后在攪拌下緩慢加入占疫苗總量65～50％的抗原，該抗原由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58或O/china/99、A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，待抗原與佐劑攪勻后，一次性通過均質(zhì)機乳化而成；e、疫苗檢驗，包括e.1、物理性狀檢查；e.2、無菌檢驗；e.3、安全檢驗；e.4、效力檢驗。
全文摘要
一種牛羊等反芻動物口蹄疫O、A型雙價滅活疫苗，由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原和佐劑按下述重量百分比含量配制而成抗原，由已滅活的O型口蹄疫病毒抗原OA/58或O/china/99、A型口蹄疫病毒抗原AF/72等量混合而成，抗原占疫苗總量的50～65％，佐劑，由75％白油、7％吐溫、18％司班80混合高壓滅菌制成，佐劑占疫苗總量的50～35％；本疫苗對口蹄疫易感動物牛、羊、豬安全，適用于不同品種、各種年齡的牛和羊，對牛O、A型口蹄疫的免疫保護率分別為91.3％和100％。對羊O、A型口蹄疫的免疫保護率為100％，一次接種有效免疫持續(xù)期6個月，安全性和免疫效力達國際同類產(chǎn)品先進水平。
文檔編號A61P31/14GK1520883SQ03103300
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者張永光, 王永錄, 方玉珍, 蔣守田 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所