專(zhuān)利名稱：從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含木素纖維素材料使用發(fā)酵生物產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
由于化石燃料的有限儲(chǔ)備和對(duì)排放溫室氣體的憂慮，人們?cè)絹?lái)越著眼于使用可再 生的能源。生物燃料(主要是乙醇)和其他來(lái)自淀粉和糖的發(fā)酵產(chǎn)物的商業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)著手 進(jìn)行，但生產(chǎn)成本相對(duì)而言仍然高昂，這主要是因?yàn)楣攘：吞穷?lèi)作物是昂貴的原料。因此， 關(guān)注已轉(zhuǎn)向較低廉的木素纖維素原料(即，生物質(zhì))，如農(nóng)業(yè)殘余物、草等等。本領(lǐng)域中描述了從含木素纖維素材料產(chǎn)生生物燃料的方法，通常包括預(yù)處理、水 解和發(fā)酵步驟。基于木素纖維素的方法太過(guò)昂貴，因此仍有改進(jìn)上述方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括a)預(yù)處理含木素纖維素材料；b)制備經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)熱處理的蒸餾酒糟的漿料；c)用一種或多種纖維素分解酶水解所述漿料；d)用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了 DDG和酶劑量對(duì)于水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(pre-treated corn stover, PCS)的作用。圖2顯示了 DDG和酶劑量對(duì)于PCS糖轉(zhuǎn)化率的作用。圖3顯示了在酶水解前添加DDG對(duì)于乙醇產(chǎn)量(yield)的作用。發(fā)明詳述蒸惱酒糟(Distiller’s Grain(DG))蒸餾酒糟(DG)是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語(yǔ)，并通常指在谷粒(cereal grains)已經(jīng) 發(fā)酵并蒸餾后遺留的，脫醇發(fā)酵(de-alcoholized fermentation)殘余物。蒸餾酒糟(DG) 包括任何種類(lèi)的谷粒，如，但不僅限于，玉米、小麥和稻，并通常源自干磨燃料(dry mill fuel)或產(chǎn)生飲用醇方法(beverage alcohol process) 0在發(fā)酵過(guò)程中，去除了大部分淀 粉，而剩余的蒸餾酒糟通常具有較高纖維量，并含有干燥的酵母細(xì)胞和高度可消化的蛋白 質(zhì)。更具體而言，富含淀粉材料起初由水解酶(通常為α -淀粉酶和葡萄糖淀粉酶) 降解為可發(fā)酵的糖類(lèi)，使用合適的發(fā)酵生物，所述糖類(lèi)被直接或間接轉(zhuǎn)化為所期望的發(fā)酵 產(chǎn)物。液體發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，通常從經(jīng)發(fā)酵的醪液(通常稱為“啤酒醪液(beer mash)“ 中，例如，通過(guò)蒸餾回收，其將所期望的發(fā)酵產(chǎn)物與其他液體和/或固體中分離。剩余部分， 稱為“全釜餾物(whole stillage)”，經(jīng)脫水并分離為固相和液相，例如，通過(guò)離心進(jìn)行。所 述固相稱作“濕蒸餾酒糟(wet distiller，s grain) ”(或“濕餅(wet cake)”)，而所述液相(上清)稱作“稀釜餾物(thin stillage)”。濕蒸餾酒糟(WDG)可經(jīng)干燥以提供“蒸餾 干酒糟(distiller，s dried grain) (DDG) ”，其通常用作動(dòng)物飼料中的營(yíng)養(yǎng)物。稀釜餾物 通常經(jīng)蒸發(fā)得到冷凝液和糖漿或亦可直接再循環(huán)到稱作“回流(backset)”的漿料罐中。冷 凝液可送至甲烷轉(zhuǎn)化器(methanator)中，并隨后排出或再循環(huán)到漿料罐中。所述糖漿主要 由少量糊精和不可發(fā)酵的糖類(lèi)組成，可將糖漿混入DDG或在干燥前添加至濕蒸餾酒糟中以 產(chǎn)生 DDG/S (具有可溶物的蒸溜干酒糟(distillers dried grain with solubles)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈和經(jīng)熱處理的蒸餾干酒糟(DDG)在水解 前合并，可增加糖產(chǎn)量，改善糖轉(zhuǎn)化率并獲得較高的乙醇產(chǎn)量。實(shí)施例1和2提供了這些改 進(jìn)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。此外，可減少用于水解的酶劑量，得到方法成本的總體下降。相應(yīng)地，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，涉及從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法， 其包括a)預(yù)處理含木素纖維素材料；b)制備經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)熱處理的蒸餾酒糟的漿料；c)用一種或多種纖維素分解酶水解所述漿料；d)用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。所述含木素纖維素材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。蒸餾酒糟(DG) 如上定義，但優(yōu)選選自蒸餾干酒糟(DDG)、具有可溶物的蒸餾干酒糟(DDG/S)和濕蒸餾酒糟 (WDG)。根據(jù)本發(fā)明，蒸餾酒糟的熱處理可使用任何合適方法進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，熱 處理可以，例如，在約60°C以上(above)進(jìn)行10分鐘到48小時(shí)，如約80°C以上進(jìn)行5分鐘 到24小時(shí)，如在約IOO0C以上進(jìn)行1分鐘到12小時(shí)，如在約121°C進(jìn)行10秒到6小時(shí)，如 在約121°C進(jìn)行10到30分鐘，如約15分鐘。例如，熱處理可在高壓滅菌器中在壓力下進(jìn) 行。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)能夠確定合適的熱處理?xiàng)l件以打開(kāi)蒸餾酒糟的結(jié)構(gòu)。通過(guò)打開(kāi) 蒸餾酒糟的結(jié)構(gòu)，釋放能夠阻遏(block)木質(zhì)素的化合物。對(duì)木質(zhì)素的阻遏使得木質(zhì)素對(duì) 水解酶和/或發(fā)酵生物發(fā)酵能力的抑制減少。據(jù)信，阻遏化合物包括肽和脂肪。經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料可為未經(jīng)洗滌或經(jīng)洗滌的，或可為經(jīng)洗滌和未經(jīng)洗 滌的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的組合。所述材料可為以任何合適方式解毒的經(jīng)預(yù)處理 的含木素纖維素材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料可占步驟b) 中漿料的 5-30wt. %，優(yōu)選 10-25wt. %0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料可占步驟b)的漿料中總 固體(TS)的5以上至90wt. %，優(yōu)選IO-SOwt. %。在一個(gè)實(shí)施方案中，蒸餾酒糟可占經(jīng)預(yù) 處理的含木素纖維素材料的0. 1以上-40wt. %，如l-30wt. %。步驟b)中的TS% (即，經(jīng) 預(yù)處理的含木素纖維素材料和蒸餾酒糟)通常在l_20wt. %，優(yōu)選2-15wt. %的范圍內(nèi)。除乙醇外其他發(fā)酵產(chǎn)物的實(shí)例可見(jiàn)于下面的“發(fā)酵產(chǎn)物”部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟C)的水解和步驟d)的發(fā)酵作為同時(shí)水解和發(fā)酵方 法步驟(SSF方法)，或混合水解和發(fā)酵方法步驟(HHF方法)進(jìn)行。水解、SSF或HHF可使 用纖維素分解酶或半纖維素分解酶，或其組合進(jìn)行。然而，亦可存在其他水解酶。纖維素分 解酶、半纖維素分解酶和其他水解酶的實(shí)例可見(jiàn)于下面的“酶”部分。步驟d)、SSF或HHF中使用的發(fā)酵生物通常為微生物來(lái)源的，優(yōu)選酵母來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces) 的菌株。然而，也涵蓋例如細(xì)菌來(lái)源的發(fā)酵生物。發(fā)酵生物的非窮盡列表可見(jiàn)于下面的“發(fā) 酵生物”部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是生物燃料，如，特別是醇，如乙醇或 丁醇。通常，發(fā)酵或SSF在25°C -40°C，如29°C -35°C，如30°C -34°C，如約32°C的溫度下進(jìn) 行。pH通常為pH3-8，優(yōu)選4-6。此外，發(fā)酵可進(jìn)行1到120小時(shí)，優(yōu)選8_96小時(shí)。水解根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)熱處理的蒸餾酒糟在水性漿料 (aqueous slurry)中一起水解。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解以酶法使用水解酶或水解酶 混合物進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明待發(fā)酵的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料由一種或多種水解酶(根 據(jù)酶命名法為EC3類(lèi))，優(yōu)選一種或多種選自下組的糖酶來(lái)水解纖維素酶、半纖維素酶或 淀粉酶，如α-淀粉酶、產(chǎn)麥芽糖(maltogenic)淀粉酶或β-淀粉酶。亦可存在蛋白酶。用于水解的酶能夠直接或間接將糖聚合物(例如纖維素和/或半纖維素)轉(zhuǎn)化為 可發(fā)酵的糖，后者可發(fā)酵為期望的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述糖酶具有纖維素分解酶活性。合適的糖酶描述于下 面“酶”部分。半纖維素聚合物可通過(guò)半纖維素酶和/或酸水解發(fā)生分解以釋放其五碳糖或六 碳糖組分。六碳糖(己糖)，如，葡萄糖、半乳糖和甘露糖，可通過(guò)合適的發(fā)酵生物(包括酵 母)容易地發(fā)酵為，例如，乙醇、丙酮、丁醇、甘油、檸檬酸、富馬酸等。優(yōu)選用于乙醇發(fā)酵的 是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種的酵母，優(yōu)選針對(duì)高水平乙醇(即，多至例 如約10、12、15或20vol. %或更多乙醇)有抗性的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料使用半纖維素酶，優(yōu)選木聚糖酶、 酯酶、纖維二糖酶或其兩種或更多的組合進(jìn)行水解。水解亦可在半纖維素酶和/或纖維素酶，以及任選地上面提及的一種或多種其他 酶活性的組合的存在下進(jìn)行。所述酶處理可在合適的水性環(huán)境中在可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的條件下進(jìn) 行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解在對(duì)所述酶最佳的條件下進(jìn)行。合適的工藝時(shí)間，溫度和pH條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。優(yōu)選的，水解 在20-70°C，優(yōu)選25到60°C，特別為約50°C的溫度進(jìn)行。水解優(yōu)選在pH 4_8，優(yōu)選pH 5-7 的PH范圍內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，水解進(jìn)行6到96小時(shí)，優(yōu)選12到48小時(shí)，特別是大約24小時(shí)。發(fā)酵從木素纖維素來(lái)源的材料對(duì)含木素纖維素材料的發(fā)酵可以任何合適方式進(jìn)行。合適的條件取決于發(fā)酵生 物、底物和所期望的產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定什么是合適的發(fā)酵條件。合適條 件的實(shí)例如上和如下給出。根據(jù)本發(fā)明，步驟c)中的水解和步驟d)中的發(fā)酵可同時(shí)進(jìn)行 (SSF方法)或作為混合方法進(jìn)行(HHF方法)。含木素纖維素材料(牛物質(zhì))本發(fā)明的上下文中涵蓋任何合適的含木素纖維素材料。含木素纖維素材料可為 任何含有木素纖維素的材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料含有至少 50wt%，優(yōu)選至少70wt%，更優(yōu)選至少90wt%木素纖維素?？衫斫獾氖呛舅乩w維素材料 也可包含其它組分，如纖維質(zhì)材料，如纖維素、半纖維素，且也可包含組分如糖類(lèi)，如可發(fā)酵糖和不可發(fā)酵糖。含木素纖維素材料通常見(jiàn)于，例如，植物的莖、葉、莢、殼/皮和穗軸或樹(shù)的葉、枝、 木材。含木素纖維素材料也可為，但不僅限于，草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固 體廢物，廢紙，以及紙漿和紙廠殘余物。在本文中可理解的是含木素纖維素材料可為植物細(xì) 胞壁材料的形式，其在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料是玉米纖維、稻草、松木、刨花、甘蔗 渣、紙和紙漿加工廢物、玉米秸桿、玉米穗軸、硬木如楊木和樺木、軟木、谷物秸稈如麥秸、柳 枝稷(switch grass)、芒屬(Miscanthus)、稻殼、城市固體廢物(MSW)、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公 室用紙，或其混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料為玉米秸桿或玉米穗軸。在另一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料為玉米纖維。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含 木素纖維素材料為柳枝稷。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料為甘蔗渣。SSF、HHF 和 SHF在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，水解和發(fā)酵作為同時(shí)水解和發(fā)酵步驟(SSF)進(jìn)行。 通常這意味組合的/同時(shí)水解和發(fā)酵在對(duì)所述發(fā)酵生物合適，優(yōu)選最佳的條件(例如，溫度 和/或pH)下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解步驟和發(fā)酵步驟作為混合水解和發(fā)酵(HHF)進(jìn)行。HHF 通常以單獨(dú)的部分水解步驟開(kāi)始，并以同時(shí)水解和發(fā)酵步驟結(jié)束。單獨(dú)的部分水解步驟為 酶法纖維素糖化步驟，通常在對(duì)所述的水解酶合適，優(yōu)選最佳的條件(例如，在較高溫度) 下進(jìn)行。后續(xù)的同時(shí)水解和發(fā)酵步驟通常在對(duì)發(fā)酵生物合適的條件(常常在比所述單獨(dú)水 解步驟更低的溫度)下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解和發(fā)酵步驟也可作為單獨(dú)的水解和發(fā)酵步驟進(jìn)行，其 中所述水解在起始發(fā)酵之前已經(jīng)完成。這常常稱作“SHF”。發(fā)酵生物術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”指任何適于產(chǎn)生所期望的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細(xì)菌和真菌生 物，包括酵母和絲狀真菌。所述發(fā)酵生物可為C6或C5發(fā)酵生物，或其組合。C6和C5發(fā)酵 生物在本領(lǐng)域均眾所周知。根據(jù)本發(fā)明合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⒖砂l(fā)酵的糖(如葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、 甘露糖或阿拉伯糖)直接或間接發(fā)酵，即轉(zhuǎn)化為所期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的實(shí)例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces) 白勺，牛寺另Oi酉良(Saccharomyces cerevisiae) ^C^^i'f## (Saccharomyces uvarum)的菌株，畢赤酵母屬(Pichia)，優(yōu)選樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株 如樹(shù)干畢赤酵母CBS 5773或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假絲酵母屬 (Candida)的菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，阿糖發(fā)酵假絲酵母(Candida arabinofermentans),ii^f ESjix^if^fiJ (Candida diddensii), Candida sonorensis,^Ρ^ 塔假絲酵母(Candida shehatae)，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假絲酵 母(Candida boidinii)的菌株。其它發(fā)酵生物包括漢遜酵母屬(Hansenula)，特別是多形 漢遜酵母(Hansenula polymorpha)或異常漢遜酵母(Hansenula anomala)；克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)，特別是脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),特別是粟酒裂殖酵 母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌發(fā)酵生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)，特別是大腸桿 菌(Escherichia coli)的菌株，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，特別是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌(Zymomonas mobilis)的菌株，發(fā)酵細(xì)菌屬(Zymobacter)，特別是棕櫚發(fā)酵細(xì) 菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，特別是產(chǎn)酸克雷伯 氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌屬(Leuconostoc)，特別是腸膜明串
胃(Leuconostoc mesenteroides)白勺胃 _，M (Clostridium)， 1W M Mi^ B.^.
菌(Clostridium butyricum)的菌株，腸桿菌屬(Enterobacter),特另Il是產(chǎn)氣腸桿 胃(Enterobacter aerogenes)白勺胃_，以 H^Mil If IifiS (Thermoanaerobacter)白勺 菌株，特別是嗜熱厭氧菌BGlLl (Appl. Microbiol. Biotech. 77 61-86)和乙醇熱厭氧 If 胃(Thermoanarobacter ethanolicus)(Thermoanaerobacter
thermosaccharoIyticum)或 Thermoanaerobacter mathrani 的菌株。還想至Ij的是乳桿菌 屬(Lactobacillus)以及谷氨酸棒狀桿菌 R(Corynebacterium glutamicum R)，熱葡糖苷 酶芽孢桿菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵生物為C6糖發(fā)酵生物，例如，釀酒酵母的菌株。對(duì)于發(fā)酵木素纖維素來(lái)源材料，涵蓋了 C5糖發(fā)酵生物。多數(shù)C5糖發(fā)酵生物也發(fā) 酵C6糖。C5糖發(fā)酵生物的實(shí)例包括畢赤酵母，例如樹(shù)干畢赤酵母菌種的菌株。C5糖發(fā)酵 細(xì)菌也是已知的。而且，一些釀酒酵母菌株發(fā)酵C5(和C6)糖。實(shí)例為能夠發(fā)酵C5糖的 酵母屬菌種的經(jīng)遺傳修飾的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology, p. 1852—1859 禾口 Karhumaa 等，2006，Microbial Cell Factories 5 18 禾口 Kuyper 等，2005，F(xiàn)EMS Yeast Research 5 :925_934 中涉及的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述發(fā)酵生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中從而使得每ml發(fā)酵培 養(yǎng)基的中活的發(fā)酵生物(如酵母)計(jì)數(shù)為IO5至1012，優(yōu)選IO7至IOltl的范圍內(nèi)，特別是約 5X107。商業(yè)上可得到的酵母包括，例如RED STAR 和ETHANOL RED 酵母(可由 Fermentis/Lesaffre，USA得到)、FALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA得到)、SUPERSTART 和THERMOSACC 新鮮酵母(可由Ethanol Technology，WI，USA得到)、BI0FERM AFT和XR(可 由 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA 得到)、GERT STRAND(可由 Gert Strand AB，Sweden 得到)以及 FERMIOL(可由 DSM Specialties 得到)。根據(jù)本發(fā)明能夠自可發(fā)酵的糖類(lèi)，包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖和/或 阿拉伯糖產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物，優(yōu)選在準(zhǔn)確的條件下以特定的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)。 當(dāng)將所述發(fā)酵生物導(dǎo)入/添加入所述發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種的發(fā)酵生物經(jīng)過(guò)許多階段。起初， 生長(zhǎng)并未發(fā)生。該期間稱為“遲滯期”，且可看作適應(yīng)期。在下一個(gè)稱為“指數(shù)期”的階段， 生長(zhǎng)速率逐漸增加。在一段最大生長(zhǎng)的時(shí)間之后，生長(zhǎng)速率停止，且所述發(fā)酵生物進(jìn)入“穩(wěn) 定期”。又一段時(shí)間后所述發(fā)酵生物進(jìn)入“死亡期”，其間活細(xì)胞數(shù)減少。發(fā)酵產(chǎn)物術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵產(chǎn)物”意指使用發(fā)酵生物通過(guò)包括發(fā)酵步驟的方法生成的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明所涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(lèi)(例如，乙醇、甲醇和丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙 酸、衣康酸、乳酸和葡萄糖酸)；酮類(lèi)(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如， H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶類(lèi)；維生素(例如，核黃素、B12和β-胡蘿 卜素)；以及激素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙 醇，即可飲用的中性酒；或工業(yè)乙醇或在可消費(fèi)醇類(lèi)工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品 工業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的產(chǎn)品。優(yōu)選的啤酒類(lèi)型包括愛(ài)兒 啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、黑啤酒(porter)、陳貯啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、 麥芽酒(malt liquor)、發(fā)泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、{氐醇啤酒 (low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer) 或清淡啤酒(light beer)。所用 的
優(yōu)選發(fā)酵方法包括醇類(lèi)發(fā)酵方法。根據(jù)本發(fā)明所得的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，可優(yōu)選用作生物燃 料。然而，如果其為乙醇，其亦可用作飲用乙醇。發(fā)酵木素纖維素來(lái)源的糖類(lèi)如上所提及，不同種類(lèi)的發(fā)酵生物可用于發(fā)酵源自含木素纖維素材料的糖類(lèi)。發(fā) 酵通常由酵母、細(xì)菌或絲狀真菌進(jìn)行，包括上面“發(fā)酵生物”部分中提及的那些。如果目標(biāo) 產(chǎn)物是C6可發(fā)酵糖，所述條件通常類(lèi)似于眾所周知的淀粉發(fā)酵條件。然而，如果目標(biāo)產(chǎn)物 是發(fā)酵C5糖類(lèi)(例如，木糖)或C6和C5可發(fā)酵糖類(lèi)的組合，發(fā)酵生物和/或發(fā)酵條件可 有所不同。細(xì)菌發(fā)酵可在與通常在20-40的溫度進(jìn)行的常規(guī)酵母發(fā)酵相比較高的溫度，如高 至75°C，例如，40-70°C，如50-60°C進(jìn)行。然而，亦已知在低至20°C的溫度進(jìn)行的細(xì)菌發(fā)酵。 發(fā)酵通常在3到7，優(yōu)選pH3. 5到6，如約pH5的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。發(fā)酵通常進(jìn)行24-96小時(shí)?；厥赵诎l(fā)酵之后，可自發(fā)酵漿料中分離發(fā)酵產(chǎn)物?？烧麴s漿料以提取期望的發(fā)酵產(chǎn) 物，或可自發(fā)酵漿料中通過(guò)微濾或膜過(guò)濾技術(shù)提取期望的發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘?，可通過(guò)提餾 (stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物?；厥辗椒ㄔ诒绢I(lǐng)域?yàn)楸娝苤?。酶在本發(fā)明方法的語(yǔ)境中，即使未特別提及，應(yīng)理解酶是以有效量使用。纖維素分解酶在發(fā)酵、水解、SSF或HHF過(guò)程中，可存在一種或多種纖維素分解酶。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素分解酶”應(yīng)理解為包括纖維二糖水解酶(EC3. 2. 1. 91)， 例如，纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)和β -葡 糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)。對(duì)上述酶進(jìn)一步的描述參見(jiàn)下面的相關(guān)部分。對(duì)纖維素的消化可需要數(shù)種類(lèi)型的酶協(xié)同作用才能產(chǎn)生效果。通常需要至少三 類(lèi)酶來(lái)將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2. 1.4)，其隨機(jī)剪切纖維素鏈；纖維 二糖水解酶(EC 3.2. 1.91)，其自纖維素鏈末端切割纖維二糖單元，以及β-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)，其將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在這三類(lèi)涉及纖維素生物降解 的酶中，纖維二糖水解酶是降解天然晶體纖維素的關(guān)鍵酶。在本文中，術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解 酶I”定義為纖維素1，4-β -纖維二糖糖苷酶(亦稱為外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶 或1，4-β纖維二糖水解酶)活性，如酶分類(lèi)EC 3.2. 1.91所定義，其通過(guò)將纖維二糖從糖 鏈的非還原末端釋放來(lái)催化纖維素和纖維四糖中l(wèi)，4-i3-D-葡萄糖苷鍵的水解。對(duì)術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶Π活性”的定義是相同的，只是纖維二糖水解酶II自糖鏈的還原末端進(jìn) 攻。所述纖維素分解酶可包含糖結(jié)合模塊(CBM)，其增強(qiáng)該酶與含木素纖維素纖維的 結(jié)合，并增加該酶催化活性部分的效率。CBM定義為在對(duì)糖有活性的酶中鄰接的氨基酸序 列，其帶有具糖結(jié)合活性的謹(jǐn)慎折疊(discreet fold)。關(guān)于CBM進(jìn)一步的信息參見(jiàn)CAZy 互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器(見(jiàn)上)或 Tomme 等(1995)于 Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler 禾口 Penner 編)，Cellulose-binding domains -classification and properties, pp. 142-163, American Chemical Society, Washington。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶或纖維素分解酶可為PCT/2008/065417中 描述的纖維素分解制備物，該文件通過(guò)提述并入本文。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素 分解制備物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)，優(yōu)選為公開(kāi)于WO 2005/074656 中的。所述纖維素分解制備物可進(jìn)一步包括β-葡糖苷酶，如源自木霉屬(Trichoderma)、 曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)菌株的β -葡糖苷酶，包括在 W02008/057637 (Novozymes)中公開(kāi)的具有β -葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述纖維素分解制備物亦可包括CBH II，優(yōu)選土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纖 維二糖水解酶II (CEL6A)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶制備物也可包含纖維素 酶制備物，優(yōu)選源自里氏木霉(Trichoderma reesei)或特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens) 的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素分解活性可源自真菌來(lái)源，如木霉屬的菌株，優(yōu)選 里氏木霉菌株；或腐質(zhì)霉屬的菌株，如特異腐質(zhì)霉的菌株，或金孢子菌屬(Chrysosporium) 的菌株，優(yōu)選 Chrysosporium Iucknowense 的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶制備物包括WO 2005/074656中公開(kāi)的具 有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)；纖維二糖水解酶，如土生梭孢霉纖維二糖水解酶 II (CEL6A) ； β -葡糖苷酶(例如，公開(kāi)于W02008/057634的融合蛋白)，以及纖維素分解酶， 例如，源自里氏木霉的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶為商業(yè)上可得到的產(chǎn)品CELLUCLAST 1. 5L 或 CELLUZYME (來(lái)自 Novozymes A/S, Denmark)或 ACCELERASE 1000 (來(lái)自 Genencor Inc.，USA)。可添加纖維素酶用于水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。所述纖維素酶可以 0. 1-100 FPU每克總固體(TS)，優(yōu)選0. 5-50 FPU每克TS，特別為1-20 FPU每克TS范圍內(nèi) 的劑量添加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將至少0. Img纖維素分解酶每克總固體(TS)，優(yōu)選至少 3mg纖維素分解酶每克TS，如5-10mg纖維素分解酶每克TS用于水解。內(nèi)切葡聚糖酶(EG)內(nèi)切葡聚糖酶(E. C. No. 3. 2. 1. 4)催化下述物質(zhì)中1，4_β -D-糖苷鍵的內(nèi)水解纖 維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉、在混合β-1，3-葡聚 糖如谷類(lèi)β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β _1，4鍵，以及其它含有纖維素部分的植物材料。 其官方名稱為內(nèi)-l，4-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但在本說(shuō)明書(shū)中使用其簡(jiǎn)稱內(nèi)切葡 聚糖酶。內(nèi)切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據(jù)Ghose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257_268 的方法確定。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶可源自木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉的菌 株；腐質(zhì)霉屬的菌株，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉的菌株；或金孢子菌屬的菌株，優(yōu)選Chrysosporium Iucknowense 的菌株。纖維二糖水解酶(CBH)術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”意指1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 91)， 其在纖維素、纖維寡糖或任何含有β -1，4-連接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β -D-葡糖 苷鍵的水解，自鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶的實(shí)例為上面提及的，包括來(lái)自里氏木霉、特異腐質(zhì)霉的CBH I和 CBH II ；來(lái)自土生梭孢霉的CBH II纖維二糖水解酶(CELL6A)。纖維二糖水解酶活性可根據(jù)由Lever等，1972，Anal. Biochem. 47 :273_279和由 van Tilbeurgh 等，1982，F(xiàn)EBS Letters 149 152-156 ；van Tilbeurgh 禾口 Claeyssens， 1985,FEBS Letters 187 :283_288描述的方法來(lái)確定。所述Lever等的方法適用于評(píng)估玉 米秸桿中纖維素的水解，而van Tilbeurgh等的方法適用于對(duì)于熒光二糖衍生物確定纖維 二糖水解酶的活性。β -葡糖苷酶一種或多種β-葡糖苷酶(有時(shí)稱為“纖維二糖酶”)可在水解、發(fā)酵、SSF或HHF 過(guò)程中存在。術(shù)語(yǔ)“ β -葡糖苷酶”意指β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末 端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，及β-D-葡萄糖的釋放。就本發(fā)明而言，葡糖苷 酶的活性根據(jù)由Venturi等，2002，J. Basic Microbiol. 42 :55_66描述的基本方法確定， 只是如本文所述使用不同的條件。一單位的葡糖苷酶活性定義為自4mM對(duì)-硝基苯 酚-β-D-吡喃葡糖苷作為底物在100mM檸檬酸鈉，0.01%TWEEN 20中在5(rC，pH 5 每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾的對(duì)-硝基苯酚。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β-葡糖苷酶為真菌來(lái)源的，例如木霉屬、曲霉屬或 青霉屬的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgll基因 編碼的β-葡糖苷酶(參見(jiàn)EP 562003的圖1)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β -葡 糖苷酶源自米曲霉(根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus)(根據(jù)WO 02/095014的實(shí)施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生)，或黑曲霉(1981， J. Appl. 3 157-163)。纖維素分解增強(qiáng)活性術(shù)語(yǔ)“纖維素分解增強(qiáng)活性”在本文中定義為增強(qiáng)具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì) 對(duì)木素纖維素來(lái)源材料的水解的生物活性。就本發(fā)明而言，通過(guò)測(cè)量與具有相等總蛋白加 載量但沒(méi)有纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/g PCS中的纖維素)的對(duì)照水 解相比，在如下條件下由于纖維素分解蛋白對(duì)木素纖維素來(lái)源材料(例如經(jīng)預(yù)處理的含木 素纖維素材料)的水解而發(fā)生的還原糖的增加或纖維二糖和葡萄糖總量的增加來(lái)測(cè)定纖 維素分解增強(qiáng)活性l-50mg總蛋白質(zhì)/g PCS(經(jīng)預(yù)處理的玉米秸)中纖維素，其中總蛋白 質(zhì)由80-99. 5% w/w纖維素分解蛋白/g PCS中的纖維素和0. 5-20% w/w纖維素分解增強(qiáng) 活性蛋白組成，在50°C進(jìn)行1-7天。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽通過(guò)降低達(dá)到相同程度水解所需的纖維素分解酶量來(lái)增強(qiáng)具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)所催化的對(duì)木素纖維素來(lái)源材料的水解，所述纖 維素分解酶量的降低優(yōu)選至少0. 1倍、更優(yōu)選至少0. 2倍、更優(yōu)選至少0. 3倍、更優(yōu)選至少 0. 4倍、更優(yōu)選至少0. 5倍、更優(yōu)選至少1倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至 少5倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、更優(yōu)選至少30倍、最優(yōu)選至少50倍、甚至最 優(yōu)選至少100倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解和/或發(fā)酵是在存在與具有增強(qiáng)活性的多肽組合 的纖維素分解酶的情況下進(jìn)行的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)活性的多肽是家族 GH61A多肽。WO 2005/074647披露了來(lái)自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的 多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656披露了來(lái)自桔橙嗜熱霉(Thermoascus aurantiacus) 的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽及其多核苷酸。美國(guó)申請(qǐng)
發(fā)明者李鑫, 馬茲·P·T·史密斯 申請(qǐng)人:諾維信公司