專利名稱：細(xì)小病毒rep和cap蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)小病毒載體的生產(chǎn)，特別是重組腺伴隨病毒(rAAV)在昆蟲細(xì)胞中 的生產(chǎn)，包含本發(fā)明的構(gòu)建體的桿狀病毒表達(dá)載體，以及包含這類桿狀病毒表達(dá)載體的細(xì) 胞。
背景技術(shù)：
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)因其作為真核克隆和表達(dá)載體的應(yīng)用而眾所周知(King，L. Α.， and R. D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system，，，Chapman and Hall, United Kingdom ；0' Reilly, D. R. , et al. ,1992. Baculovirus Expression Vectors :A Laboratory Manual. New York :ff. H. Freeman.)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括所表達(dá)蛋白 幾乎總是可溶的、正確折疊的和具有生物學(xué)活性的等。其他優(yōu)點(diǎn)包括蛋白表達(dá)水平高、生產(chǎn) 更快、適于表達(dá)大分子量蛋白以及適于大規(guī)模生產(chǎn)。然而，在使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲 細(xì)胞生物反應(yīng)器中大規(guī)模或連續(xù)生產(chǎn)異源蛋白時(shí)，生產(chǎn)水平的不穩(wěn)定——也稱為傳代效應(yīng) (passage effect)——是一個(gè)主要障礙。此效應(yīng)至少部分是由桿狀病毒DNA中的重復(fù)同源 序列之間的重組造成的。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也已被成功地用于生產(chǎn)重組腺伴隨病毒(AAV)載體(Urabe et al.，2002，Hum. Gene Ther. 13 1935-1943 ；US 6，723，551 和 US 20040197895)。AAV 可能被 認(rèn)為是用于人類基因治療的最有前途的病毒載體之一。AAV具有有效感染人類分裂細(xì)胞和 非分裂細(xì)胞的能力，AAV病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組的單個(gè)染色體位點(diǎn)上，并且最重 要的是，盡管AAV存在于許多人中，但其從未與任何疾病有關(guān)。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，重組腺伴隨 病毒(rAAV)在對(duì)血友病B、惡性黑素瘤、囊性纖維化、I型高脂蛋白血癥和其他疾病的基因 治療臨床試驗(yàn)中正被評(píng)價(jià)。為克服哺乳動(dòng)物AAV生產(chǎn)系統(tǒng)的問題，Urabe et al. (2002，見上文)開發(fā)出了一 種昆蟲細(xì)胞中的AAV生產(chǎn)系統(tǒng)。為在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生AAV，必須進(jìn)行一些修飾以獲得三種 AAV殼體蛋白(VP1、VP2和VP3)的正確化學(xué)計(jì)量比，這倚賴于將交替使用兩個(gè)剪接受體位 點(diǎn)和次優(yōu)利用不能被昆蟲細(xì)胞精確復(fù)制的VP2的ACG起始密碼子相結(jié)合。為在昆蟲細(xì)胞中 模仿殼體蛋白的正確化學(xué)計(jì)量比，Urabe et al. (2002，見上文)使用一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建 體被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)不需剪接就能表達(dá)全部三種VP蛋白的單個(gè)多順反子信使并且其中最上游 起始密碼子被替換為次優(yōu)起始密碼子ACG。W02007/046703公開了，通過最優(yōu)化在昆蟲細(xì)胞 中生產(chǎn)的AAV殼體蛋白的化學(xué)計(jì)量比，進(jìn)一步提高了基于桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV載體的感染 性的生產(chǎn)力。為在最初由Urabe et al. (2002，見上文)開發(fā)的AAV昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá) AAV R印蛋白，使用一個(gè)含有兩個(gè)獨(dú)立R印表達(dá)單元(一個(gè)用于R印78，一個(gè)用于R印52)的 重組桿狀病毒構(gòu)建體，其中所述兩個(gè)表達(dá)單元每個(gè)分別在獨(dú)立的昆蟲細(xì)胞啟動(dòng)子即Δ IEl 和 PolH 啟動(dòng)子的控制下。然而，Kohlbrenner et al. (2005，Mol. Ther. 12 1217-25 ； W02005/072364)報(bào)道了 Urabe et al.所用的用于表達(dá)兩種Rep蛋白的桿狀病毒構(gòu)建體存在固有的不穩(wěn)定性。通過打斷Urabe的原始載體中的兩個(gè)Rep基因的回文方向和設(shè)計(jì)用于 表達(dá)R印52和R印78的兩種獨(dú)立的桿狀病毒載體，Kohlbrenner et al. (2005，見上文)增加 了所述載體的傳代穩(wěn)定性。然而，盡管兩個(gè)獨(dú)立的桿狀病毒-Rep構(gòu)建體的R印78和R印52 穩(wěn)定地在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)至少超過5代，rAAV載體的產(chǎn)量仍然比Urabe et al. (2002，見上 文)設(shè)計(jì)的原始桿狀病毒-Rep構(gòu)建體低5-10倍。在申請(qǐng)W02007/148971中，本發(fā)明人通過使用R印78和R印52蛋白的單條編碼序 列顯著地提高了在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV載體的穩(wěn)定性，在所述序列中對(duì)R印78蛋白使用了 一個(gè)次優(yōu)起始密碼子，該密碼子被掃描核糖體部分跳過以使翻譯起始也可發(fā)生在更下游的 R印52蛋白的起始密碼子上。國際專利申請(qǐng)WO 2007/084773公開了一種在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV的方法，其中 感染性病毒顆粒的生產(chǎn)通過相對(duì)于VP2和VP3補(bǔ)加VPl而增加。補(bǔ)加可以通過以下方式實(shí) 現(xiàn)向所述昆蟲細(xì)胞引入包含表達(dá)VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的殼體載體，并另外向所述 昆蟲細(xì)胞引入表達(dá)VPl的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以在同一殼體載體上或者在不同 載體上。然而，在昆蟲細(xì)胞中大規(guī)模(商業(yè)化)生產(chǎn)細(xì)小病毒載體仍然需要進(jìn)一步提高。因 此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供允許細(xì)小病毒載體穩(wěn)定和高產(chǎn)量(大規(guī)模)生產(chǎn)的手段和方法，以 及允許導(dǎo)致完整空殼顆粒比增大(即更大比例的完整顆粒)的生產(chǎn)的手段和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組細(xì)小病毒病毒體的方法。使用這類方法可使得以增加的 生產(chǎn)滴度來生產(chǎn)這類病毒體。使用所述方法可替代地或額外地使得生產(chǎn)具有更大比例的完 整顆粒，即更有利的完整空殼比或總體完整比。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組細(xì)小病毒病毒體的方法，所述方法包括步驟(a)提供包含一種或多種核酸構(gòu)建體的昆蟲細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含(i)包含轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列以至少一條細(xì)小病毒末端反向重 復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼；(ii)包含編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的第一表達(dá)盒，所述核苷酸序列可 操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述R印蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第一啟動(dòng)子；(iii)包含編碼細(xì)小病毒殼體蛋白的核苷酸序列的第二表達(dá)盒，所述核苷酸序列 可操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述殼體蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第二啟動(dòng)子；(b)在有助于所述Rep和所述殼體蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)(a)中定義的細(xì)胞；和(c)任選地回收所述重組細(xì)小病毒病毒體；其中所述第一和第二表達(dá)盒存在于單個(gè)核酸構(gòu)建體上，并且其中所述第一和第二 表達(dá)盒在以等摩爾量存在于所述昆蟲細(xì)胞中時(shí)，可產(chǎn)生的編碼Rep蛋白的mRNA與編碼殼體 蛋白的mRNA的水平比至少為0. 5，該水平比通過在轉(zhuǎn)染后24和72小時(shí)之間的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR確定。本發(fā)明還提供了 _包含上文定義的第一和第二表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體，其中(a)所述第一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子或
54xHsp27EcRE+ 最小 Hsp70 啟動(dòng)子；(b)所述第一啟動(dòng)子為4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH 啟動(dòng)子；(c)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為plO啟動(dòng)子、Δ El啟動(dòng)子 或El啟動(dòng)子；(d)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子；(e)所述第一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為Δ El啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子； 或者(f)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子；并且其中所述第一表達(dá)盒任選地包含增強(qiáng)子元件；_上文定義的昆蟲細(xì)胞；以及_ 一種試劑盒，其包含(a)包含上文定義的第一和第二表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體；以及(b)包含編碼轉(zhuǎn)基因多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核苷酸序列以 至少一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼，所述轉(zhuǎn)基因可操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng) 所述轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。


圖1示出構(gòu)建pVD118(新)的示意圖。圖2示出構(gòu)建pVD118(新)+HRl的示意圖。圖3示出構(gòu)建pVD165的示意圖。圖4示出構(gòu)建pVD165+HRl的示意圖。圖5示出構(gòu)建pVD165+4xEcRE CAP的示意圖。圖6示出構(gòu)建pVD165+4*EcRE Rep78的示意圖。圖7示出構(gòu)建pVD165+A IElCAP的示意圖。圖 8 示出構(gòu)建 Δ IElCap+pPolh Rep (pVD190)的示意圖。圖9示出構(gòu)建plOCap+pPolh Rep的示意圖。圖10示出構(gòu)建pVD194的示意圖。圖 IlA 示出在以桿狀病毒比 1 1和 5 1 (C = Bac. VD88 Bac. VD84 Bac. VD43分別以5 1 1)感染后3天，Bac. VD194表達(dá)的Cap和R印蛋白的蛋白質(zhì)印跡分 析。圖IlB示出圖IlA中分析的相同生產(chǎn)的病毒滴度。本發(fā)明的定義^X本文中所用的術(shù)語“可操作地連接”是指多核苷酸(或多肽)元件在一種功能關(guān) 系上的連接。當(dāng)一段核酸被置于與另一段核酸序列具有一種功能關(guān)系的位置時(shí)，它就是“可 操作地連接”的。例如，如果一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列影響一段編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它就與所述編 碼序列可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意味著，相連接的DNA序列通常是連續(xù)的，并在有必要 將兩段蛋白編碼區(qū)域連接起來時(shí)，所述相連接的DNA序列是連續(xù)的且在閱讀框中?！氨磉_(dá)控制序列”是指一段調(diào)控與之可操作地相連的一段核苷酸序列表達(dá)的核酸
6序列。當(dāng)一段表達(dá)控制序列控制和調(diào)控一段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時(shí)，所述表達(dá) 控制序列就與所述核苷酸序列“可操作地連接”。因此，一段表達(dá)控制序列可包括啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前的起始密碼子、內(nèi)含子 剪接信號(hào)和終止密碼子。術(shù)語“表達(dá)控制序列”在最低限度上意圖包括一段為了影響表達(dá) 而存在的序列，也可包括其他有利組件。例如，前導(dǎo)序列和融合伙伴序列(fusion partner sequence)也是表達(dá)控制序列。該術(shù)語還可包括將框內(nèi)外不想要的可能的起始密碼子從序 列中除去的核酸序列設(shè)計(jì)。其還可包括將不想要的可能的剪接位點(diǎn)除去的核酸序列設(shè)計(jì)。 其包括指導(dǎo)添加PolyA尾的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，所述polyA尾即為位于mRNA的 3’末端的一串腺嘌呤殘基，該序列被稱為polyA序列。其還可被設(shè)計(jì)成可增加mRNA的穩(wěn)定 性。昆蟲細(xì)胞中影響轉(zhuǎn)錄和翻譯穩(wěn)定性的表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子)以及實(shí)現(xiàn)翻譯的序列 (如Kozak序列)是已知的。表達(dá)控制序列具有調(diào)節(jié)與之可操作地連接的核苷酸序列從而 降低或提高表達(dá)水平的性質(zhì)。本文所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，，是指這樣一段核酸片段，所述核酸 片段具有控制一條或多條編碼序列的轉(zhuǎn)錄的作用，它位于所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的 轉(zhuǎn)錄方向上游，并且可通過存在的DNA依賴性RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其 他DNA序列來進(jìn)行結(jié)構(gòu)性識(shí)別，所述其他DNA序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制 子和激活子蛋白結(jié)合位點(diǎn)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可直接或間接起到調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄量 作用的任何其他核苷酸序列?！敖M成型”啟動(dòng)子是一種在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù) 組織中具有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子為例如通過使用化學(xué)誘導(dǎo)物來進(jìn)行生理或發(fā)育 調(diào)控的啟動(dòng)子?！敖M織特異性”啟動(dòng)子僅在特定的組織或細(xì)胞類型中具有活性。“序列同一性”和“序列相似性”可以根據(jù)兩條序列的長度使用全局或局部比對(duì)算 法通過比對(duì)兩條肽序列或兩條核苷酸序列確定。長度相似的序列優(yōu)選使用在整個(gè)長度上進(jìn) 行最佳比對(duì)序列的全局比對(duì)算法(例如Needleman Wunsch)進(jìn)行比對(duì)，而長度顯著不同的 序列優(yōu)選使用局部比對(duì)算法(例如Smith Waterman)進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)序列(例如用缺省參數(shù) 通過GAP或BESTFIT程序進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí))至少共有某一最小百分比的序列同一性(如 下文定義)時(shí)，它們就可稱為是“大體同一的”或“基本相似的”。GAP采用Needleman和 Wimsch全局比對(duì)算法對(duì)兩條序列在其整個(gè)長度(全長)上進(jìn)行比對(duì)，并使匹配數(shù)最大，使 空位數(shù)最小。全局比對(duì)適合用于在兩序列具有相似長度時(shí)確定序列同一性。通常采用GAP 缺省參數(shù)，空位生成罰分=50(核苷酸)/8(蛋白質(zhì))，空位擴(kuò)展罰分=3(核苷酸)/2(蛋 白質(zhì))。針對(duì)核苷酸，采用的缺省計(jì)分矩陣為nwsgapdna，針對(duì)蛋白質(zhì)采用的缺省計(jì)分矩陣 為 Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)?？梢岳糜?jì)算機(jī)程序通過序列 比對(duì)和計(jì)分來確定序列同一性百分比，所述計(jì)算機(jī)程序例如GCG Wisconsin Package，版本 10. 3 (可購自 Accelrys Inc.，9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA)，或者使 用開放源碼軟件例如版本2. 10. O的EmbossWIN中的程序“needle” (使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用的是與上文GAP相同的參 數(shù)或者是默認(rèn)設(shè)置(同時(shí)適用于“needle”和“water”并且同時(shí)適用于蛋白和DNA比對(duì)，默 認(rèn)空位開放罰分是10.0，且默認(rèn)空位擴(kuò)展罰分是0.5;蛋白的默認(rèn)打分矩陣是機(jī)0%1111162， DNA的是DNAFull)。如果序列大體上具有不同的總長度，優(yōu)選局部比對(duì)例如使用SmithWaterman算法的局部比對(duì)?；蛘?，可以通過使用FASTA、BLAST等算法搜索公共數(shù)據(jù)庫確定 相似性或同一性的百分比。本發(fā)明的編碼細(xì)小病毒Cap和/或Rep蛋白的核苷酸序列也可按照它們分別與核 苷酸序列SEQ ID NO 20、22、24和1-4在溫和或優(yōu)選地在嚴(yán)格雜交條件下的雜交能力來定 義。本文定義的嚴(yán)格雜交條件是下述的條件具有至少約25個(gè)核苷酸，優(yōu)選約50個(gè) 核苷酸、75個(gè)核苷酸或100個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選約200個(gè)或更多核苷酸的核酸序列在約 650C的溫度下和在含約IM鹽的溶液，優(yōu)選6xSSC溶液或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶 液中可以進(jìn)行雜交；并且，在65°C下和含約0. IM或更少的鹽的溶液，優(yōu)選0. 2xSSC溶液或 任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中進(jìn)行漂洗。優(yōu)選地，雜交過夜進(jìn)行，即進(jìn)行至少10 小時(shí)，并優(yōu)選地進(jìn)行至少1小時(shí)的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常會(huì)使具有約 90%或更高序列同一性的序列特異性地雜交。本文定義的溫和條件是下述的條件至少有50個(gè)核苷酸，優(yōu)選約200個(gè)或更多核 苷酸的核酸序列在約45°C的溫度下和含約IM鹽的溶液，優(yōu)選6xSSC溶液或任何其他含有相 當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中可以進(jìn)行雜交；并且，在室溫下和含約IM鹽的溶液，優(yōu)選6xSSC溶液 或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中進(jìn)行漂洗。優(yōu)選地，雜交過夜進(jìn)行，即進(jìn)行至少10 小時(shí)，并優(yōu)選地進(jìn)行至少1小時(shí)的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常會(huì)使具有最 高至50%序列同一性的序列特異性地雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修改這些雜交條件，以特 異性地識(shí)別同一性在50%和90%之間的序列?！拜d體”是用于將過客核酸序列(即DNA或RNA)轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的核酸分子(一 般是DNA或RNA)。三種常見類型的載體包括質(zhì)粒、噬菌體和病毒。載體優(yōu)選為病毒。同 時(shí)含啟動(dòng)子和多核苷酸可以可操作地連接于其中的克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域中公知的。 這類載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，可市購自諸如Stratagene (La Jolla, Calif.)和 PromegaBiotech (Madison, Wis.)等供應(yīng)商。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，需要去除、添 加或改變所述克隆的5'和/或3'非翻譯部分以除去額外的可能不合適的可變翻譯起始 密碼子或可在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平干涉或減少表達(dá)的其他序列?；蛘?，可以將共有的核糖體結(jié) 合位點(diǎn)插入緊靠起始密碼子的5’端以增強(qiáng)表達(dá)?！安《据d體”是指包含下列中的一些或全部的載體編碼基因產(chǎn)物的病毒基因、控 制序列和病毒包裝序列?！凹?xì)小病毒載體”可定義為包含將送遞至宿主細(xì)胞(在體內(nèi)(in vivo)、離體(ex Vivo)或在體外(in vitro))中的多核苷酸的重組產(chǎn)生的細(xì)小病毒或細(xì)小病毒顆粒。細(xì)小 病毒載體的實(shí)例包括例如腺伴隨病毒載體。在本文中，細(xì)小病毒載體構(gòu)建體是指包含病毒 基因組或其部分并包含轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。編碼酶的核苷酸序列與宿主細(xì)胞的密碼子選擇的適應(yīng)度可表示為密碼子適應(yīng)指 數(shù)(CAI)。密碼子適應(yīng)指數(shù)在本文中被定義為在具體的宿主細(xì)胞或生物體中，一個(gè)基因的 密碼子選擇相對(duì)于高表達(dá)基因的密碼子選擇的相對(duì)適應(yīng)度的量度。每個(gè)密碼子的相對(duì)適應(yīng) 度⑷是每個(gè)密碼子的使用相對(duì)于相同氨基酸的豐度最高的密碼子的使用的比值。CAI指 數(shù)被定義為這些相對(duì)適應(yīng)度值的幾何平均值。不包括非同義密碼子和終止密碼子(依賴于 遺傳密碼)。CAI值介于0到1之間，此值越高表明豐度最高的密碼子的比例越大(參見
8Sharp and Li, 1987,Nucleic AcidsResearch 15 :1281_1295 ；另見Jansen et al. ,2003, Nucleic Acids Res. 31(8) :2242_51)。術(shù)語“報(bào)告物”(或報(bào)告基因或蛋白)主要用于指編碼可見標(biāo)記蛋白的核苷酸序 列，例如綠色熒光蛋白(GFP)、eGFP、其他熒光蛋白、螢光素酶、分泌型堿性磷酸酶(SEAP)、 ⑶S等等，以及nptll標(biāo)記物等等。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及細(xì)小病毒——特別是依賴病毒例如感染性人類或猿猴AAV——和其組 成部分(例如細(xì)小病毒基因組)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中作為誘導(dǎo)和/或表達(dá)核酸的載體的 用途。具體而言，本發(fā)明涉及用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)這類細(xì)小病毒載體時(shí)對(duì)這類病毒載體生產(chǎn)力 的改進(jìn)。這里的生產(chǎn)力涵蓋生產(chǎn)滴度的增加以及所生成產(chǎn)物的質(zhì)量的改善，例如總體完 整比(包含核酸的顆粒數(shù)目的量度)改善的產(chǎn)物。也就是說，終產(chǎn)物具有的完整顆粒的比 例可能增加，這里的完整是指顆粒含有核酸。細(xì)小病毒科的病毒為小DNA病毒。細(xì)小病毒科可分為兩個(gè)亞科感染脊椎動(dòng) 物的細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)和感染無脊椎動(dòng)物(包括昆蟲)的濃核病病毒亞科 (Densovirinae)。細(xì)小病毒亞科的成員在本文中被稱為細(xì)小病毒，并且包括依賴病毒屬。 從依賴病毒屬的屬名就可推知，依賴病毒屬的成員的獨(dú)特性在于，它們通常需要與輔助病 毒例如腺病毒或皰疹病毒一起共感染來在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行生產(chǎn)性感染。依賴病毒屬包括 AAV——AAV通常感染人類(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長類動(dòng)物(例如，血清 型1和4)——和感染其他溫血?jiǎng)游锏南嚓P(guān)病毒(例如，牛、犬、馬和羊腺伴隨病毒)。細(xì)小 病毒和其他細(xì)小病毒科成員相關(guān)的進(jìn)一步信息在Kenneth I. Berns, ‘‘ Parvoviridae =The Viruses and Their Replication, " Fields Virology,第 69 章(3d Ed. 1996)中有記載。 為方便起見，本文將參照AAV對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步舉例說明和描述。但應(yīng)理解的是，本發(fā)明 并不限于AAV，本發(fā)明同樣可應(yīng)用于其他細(xì)小病毒。所有已知的AAV血清型的基因組結(jié)構(gòu)都非常相似。AAV基因組是長度小于約5000 個(gè)核苷酸(nt)的線性單鏈DNA分子。末端反向重復(fù)序列(ITR)位于非結(jié)構(gòu)復(fù)制(Itep)蛋 白質(zhì)和結(jié)構(gòu)(VP)蛋白質(zhì)獨(dú)特的編碼核苷酸序列的側(cè)翼。VP蛋白質(zhì)(VP1、VP2和VP3)形成 殼體。末端145個(gè)核苷酸自身互補(bǔ)，并排布成可形成能量穩(wěn)定的分子內(nèi)雙鏈體的結(jié)構(gòu)，所述 雙鏈體形成T形發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)起到病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)的作用，充當(dāng)細(xì)胞DNA聚 合酶復(fù)合物的引物。在wtAAV感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，R印基因(即R印78和R印52)分別由 P5啟動(dòng)子和P19啟動(dòng)子表達(dá)，所表達(dá)的兩種Rep蛋白都在該病毒基因組的復(fù)制中起作用。 該R印ORF中的剪接事件實(shí)際上導(dǎo)致四種R印蛋白(即R印78、R印68、Rep52和R印40)的 表達(dá)。然而，已證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，編碼R印78和R印52蛋白的未剪接的mRNA足以 產(chǎn)生AAV載體。在昆蟲細(xì)胞中，Rep78和R印52蛋白也足以產(chǎn)生AAV載體。本文的“重組細(xì)小病毒或AAV載體”(或“rAAV載體”)是指包含以至少一條細(xì)小 病毒或AAV末端反向重復(fù)序列(ITR)為側(cè)翼的一條或多條目的多核苷酸序列、目的基因或 “轉(zhuǎn)基因”的載體。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因以ITR為側(cè)翼，在所述轉(zhuǎn)基因的每一側(cè)各一個(gè)。當(dāng)這種rAAV載體存在于表達(dá)AAV rep和cap基因產(chǎn)物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆蟲宿 主細(xì)胞中時(shí)，其可被復(fù)制并包裝到有感染力的病毒顆粒中。當(dāng)rAAV載體整合至更大的核酸 構(gòu)建體中時(shí)(如染色體中或另一個(gè)載體如用于克隆或轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；驐U狀病毒中)，則所述 rAAV載體通常被稱為在AAV包裝功能和必要輔助功能的存在下可通過復(fù)制和殼體化被“拯 救”出來的“前載體”。本發(fā)明涉及一種在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)包含重組細(xì)小病毒(rAAV)載體的重組細(xì)小病 毒(rAAV)病毒體的方法。在第一方面中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組細(xì)小病毒病毒體的方法，所述方法包括 步驟(a)提供包含一種或多種核酸構(gòu)建體的昆蟲細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含(i)包含轉(zhuǎn) 基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列以至少一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè) 翼；(ii)包含編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的第一表達(dá)盒，所述核苷酸序列可操作 地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述Rep蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第一啟動(dòng)子；(iii)包含編碼細(xì) 小病毒殼體蛋白的核苷酸序列的第二表達(dá)盒，所述核苷酸序列可操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所 述殼體蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第二啟動(dòng)子；(b)在有助于所述Rep和所述殼體蛋白 表達(dá)的條件下培養(yǎng)(a)中定義的細(xì)胞；和(c)任選地回收所述重組細(xì)小病毒病毒體。在所 述昆蟲細(xì)胞中，所述第一和第二表達(dá)盒優(yōu)選存在于單個(gè)核酸構(gòu)建體上。所述第一和第二表達(dá)盒在以等摩爾量存在于所述昆蟲細(xì)胞中時(shí)，優(yōu)選產(chǎn)生的編碼 Rep蛋白的mRNA與編碼殼體蛋白的mRNA的水平比為至少約0. 5、至少約0. 75、至少約1. 0、 至少約1. 5、至少約2. 0、至少約5. 0或至少約10. 0。編碼Rep和殼體的mRNA水平優(yōu)選通過 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、RNA印跡或本領(lǐng)域中已知用于RNA定量的其他方法確定。優(yōu)選，編碼R印和殼體的mRNA的所述水平比在昆蟲細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染后24、30、36、40、 44或46小時(shí)至轉(zhuǎn)染后72、66、60、54、52或50小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生。更優(yōu)選，編碼R印和殼體 的mRNA的所述水平比至少在昆蟲細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)前后的2或1小時(shí)產(chǎn)生?；蛘?，所述第一和第二表達(dá)盒在以等摩爾量存在于昆蟲細(xì)胞中時(shí)，優(yōu)選產(chǎn)生的Rep 蛋白與殼體蛋白的水平比為至少約0. 5、至少約0. 75、至少約1. 0、至少約1. 5、至少約2. 0、 至少約5. 0或至少約10. 0。優(yōu)選，Rep和殼體蛋白水平在定量免疫測(cè)定(如ELISA或定量 蛋白質(zhì)印跡)中使用抗Rep和殼體蛋白的參照抗體確定。優(yōu)選，Rep和殼體蛋白的水平比在 昆蟲細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染后24、30、36、40、44或46小時(shí)至轉(zhuǎn)染后72、66、60、54、52或50小時(shí)的時(shí) 間點(diǎn)產(chǎn)生。更優(yōu)選，Rep和殼體蛋白的水平比在昆蟲細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)前后的2或1 小時(shí)中產(chǎn)生。用于定量測(cè)得AAV Rep和殼體蛋白水平的合適參照抗體有例如可獲自PROGEN Biotechnik GmbH的抗AAV_r印的小鼠單克隆抗體克隆303. 9，或抗AAV VP1/VP2/VP3的小 鼠單克隆抗體克隆Bi。在本發(fā)明的方法中，所述第一和第二表達(dá)盒存在于單個(gè)核酸構(gòu)建體上。兩表達(dá)盒 存在于單個(gè)核酸構(gòu)建體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞將同時(shí)表達(dá)Rep蛋白和殼體蛋白。只 有在昆蟲細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Rep蛋白和殼體蛋白才會(huì)導(dǎo)致細(xì)小病毒病毒體的形成。另一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)是，在所述第一和第二表達(dá)盒位于單個(gè)構(gòu)建體時(shí)，可以控制最低需要的所述R印蛋白與 所述殼體蛋白的表達(dá)比。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是，所述細(xì)胞中還可以存在包含編碼R印蛋白的核苷酸序 列的另一核酸構(gòu)建體。
在本發(fā)明的一種方法中，所述第一表達(dá)盒(ii)的核苷酸序列可優(yōu)選地僅包含一 個(gè)含編碼Rep78和Rep68蛋白中至少一種的核苷酸序列的開放閱讀框。也就是說，一種或 多種Rep蛋白將由單個(gè)開放閱讀框編碼，不是由兩個(gè)或多個(gè)開放閱讀框編碼。換句話說，所 述第一表達(dá)盒將一般不具有兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的編碼相同或不同Rep蛋白的開放閱讀框。然 而，為了避免歧義，單個(gè)開放閱讀框可能能夠編碼不止一種蛋白，例如2種、3種或4種蛋白。以上所有都可以同樣適用于VPl、VP2和VP3蛋白，即這些蛋白的兩種或全部都可 方便地由單個(gè)開放閱讀框編碼。一般，在本發(fā)明的一種方法中，包含編碼VPl、VP2和VP3殼體蛋白的核苷酸序列的 至少一個(gè)開放閱讀框或者包含含編碼R印78和Rep68蛋白中至少一種的核苷酸序列的開放 閱讀框的至少一個(gè)開放閱讀框不包含人工內(nèi)含子(或者源自人工內(nèi)含子的序列)。也就是 說，至少用于編碼Rep或VP蛋白的開放閱讀框?qū)⒉话斯?nèi)含子。人工內(nèi)含子是指不是 天然出現(xiàn)在腺伴隨病毒Rep或Cap序列中的內(nèi)含子，例如已被設(shè)計(jì)使得可在昆蟲細(xì)胞中進(jìn) 行功能性剪接的內(nèi)含子。因此，該情況中的人工內(nèi)含子涵蓋野生型昆蟲細(xì)胞內(nèi)含子。本發(fā)明 的表達(dá)盒可包含天然的截短的內(nèi)含子序列(天然是指天然出現(xiàn)在腺伴隨病毒中的序列)， 這類序列意欲不落在本文定義的人工內(nèi)含子的含義內(nèi)。在本發(fā)明中，一個(gè)可能性是，含編碼VPl、VP2和VP3殼體蛋白的核苷酸序列的開放 閱讀框以及/或者含編碼Rep78和Rep68蛋白中至少一種的核苷酸序列的開放閱讀框不包 含人工內(nèi)含子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含所述轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列也與第一和第二表 達(dá)盒在同一核酸構(gòu)建體上。這樣的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞均包含3條核苷酸序列中的 每一條，這是細(xì)小病毒病毒體生產(chǎn)需要的。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Rep蛋白殼體蛋白的比值越大，完整病毒體與空殼病毒體 的比值越大。術(shù)語“完整病毒體”是指包含細(xì)小病毒載體的病毒體顆粒。術(shù)語“空殼病毒 體”是指不含細(xì)小病毒載體的病毒體顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，完整病毒體與 空殼病毒體的比值為至少1 100，更優(yōu)選至少1 10，甚至更優(yōu)選至少1 1。甚至更優(yōu) 選的是，檢測(cè)不到空殼病毒體，最優(yōu)選不存在空殼病毒體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道怎樣確定 所述完整病毒體與空殼病毒體的比值，例如以(總殼體-基因組拷貝數(shù))除基因拷貝數(shù)，因 為每個(gè)病毒體應(yīng)僅存在一個(gè)基因組拷貝。相反，Rep蛋白殼體蛋白的比值越大，空殼病毒 體與總病毒體(即完整病毒體+空殼病毒體)的比值越小。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道如何確 定這類比值。例如，空殼病毒體與總殼體的比值可通過以總細(xì)小病毒顆粒的量(即細(xì)小病 毒顆粒的數(shù)目)除基因組拷貝的量(即基因組拷貝數(shù))進(jìn)行確定，其中每ml中基因組拷貝 的量可通過定量PCR測(cè)量，每ml中總細(xì)小病毒顆粒的量以酶免疫測(cè)定(如來自Progen)測(cè) 量。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，空殼病毒體與總病毒體的比值小于100 1，更優(yōu)選 小于10 1，甚至更優(yōu)選小于1 1。甚至更優(yōu)選的是，檢測(cè)不到空殼病毒體，最優(yōu)選不存 在空殼病毒體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述R印與所述殼體蛋白的表達(dá)比受下列一種或多種因 素的調(diào)節(jié)(a)所述第一啟動(dòng)子與所述第二啟動(dòng)子一樣強(qiáng)，或者比所述第二啟動(dòng)子更強(qiáng)，這 由報(bào)告基因表達(dá)(如螢光素酶或SEAP)或者RNA印跡確定；(b)與所述第二表達(dá)盒相比，在 所述第一表達(dá)盒中存在更多和/或更強(qiáng)的增強(qiáng)子元件；(c)與編碼所述殼體蛋白的核苷酸序列相比，編碼所述細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列具有更高的密碼子適應(yīng)指數(shù)；(d)所述 細(xì)小病毒Rep蛋白的溫度優(yōu)化；以及/或者(e)與相應(yīng)野生型Rep蛋白相比，氨基酸序列中 有一個(gè)或多個(gè)變化的變體Rep蛋白，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸變化導(dǎo)致Rep功能活性的 增加，這一點(diǎn)通過檢測(cè)所述昆蟲細(xì)胞中的AAV生產(chǎn)的增加進(jìn)行評(píng)估。生成、選擇和/或篩選 具有增加的R印功能活性的變體R印蛋白(這一點(diǎn)通過檢測(cè)昆蟲細(xì)胞中的AAV生產(chǎn)的增加 進(jìn)行評(píng)估)可通過以下途徑獲得改變US20030134351中描述的方法的昆蟲細(xì)胞，以獲得與 哺乳動(dòng)物中的AAV生產(chǎn)相比功能增加的變體Rep蛋白。在本文中與相應(yīng)野生型Rep蛋白相 比氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)改變的變體Rep蛋白可理解為包括與相應(yīng)野生型Rep蛋白的 氨基酸序列相比，在變體氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入和/或缺失的Rep 蛋白。所述第一啟動(dòng)子與所述第二啟動(dòng)子一樣強(qiáng)或者比所述第二啟動(dòng)子更強(qiáng)是指，在編 碼R印蛋白的核苷酸序列比編碼殼體蛋白的核苷酸序列更多的情況下，可使用相等強(qiáng)度的 啟動(dòng)子，這是因?yàn)榕c殼體蛋白的表達(dá)相比，R印蛋白的表達(dá)將會(huì)增加；而在編碼R印和編碼 殼體蛋白的核苷酸序列的量相似的情況下，可將更強(qiáng)的啟動(dòng)子用于表達(dá)Rep蛋白而非用于 表達(dá)殼體蛋白。啟動(dòng)子強(qiáng)度可通過在本發(fā)明的方法中使用的條件下獲得的表達(dá)來確定。在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一啟動(dòng)子或所述第二啟動(dòng)子選自PolH啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子、堿 性蛋白啟動(dòng)子(basic proteinpromoter)、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或Δ El啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子，或任 何其他晚期或極晚期桿狀病毒基因啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，所述第一啟動(dòng)子選自PolH啟動(dòng)子、 PlO啟動(dòng)子或堿性蛋白啟動(dòng)子，且其中所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子，或任何 其他早期或晚期桿狀病毒基因啟動(dòng)子。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PlO 啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子或4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子 為PolH啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子， 第二啟動(dòng)子為ΡΙΟ、ΔΕΙ或El啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一 啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為ΔΕ1或El啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核 酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為ΔΕ1或El啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子。最 優(yōu)選地，本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為ΔΕ1啟動(dòng)子。“增強(qiáng)子元件”或“增強(qiáng)子”意圖定義一段增強(qiáng)啟動(dòng)子活性(即增加所述啟動(dòng)子下游 序列的轉(zhuǎn)錄速率)的序列，與啟動(dòng)子不同，增強(qiáng)子并不具有啟動(dòng)子活性，并且通常可不依賴 于其相對(duì)啟動(dòng)子的位置(即啟動(dòng)子的上游或下游)而起作用。增強(qiáng)子元件在本領(lǐng)域中為公 知的?？捎糜诒景l(fā)明的增強(qiáng)子元件(或其部分)的非限制性實(shí)例包括桿狀病毒增強(qiáng)子和在 昆蟲細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子元件。優(yōu)選地，所述增強(qiáng)子元件在細(xì)胞中使與啟動(dòng)子可操作地連 接的基因的mRNA表達(dá)與不存在所述增強(qiáng)子元件時(shí)該基因的mRNA表達(dá)相比增加至少25%， 更優(yōu)選地至少50 %，再更優(yōu)選地至少100 %，最優(yōu)選地至少200 %。mRNA表達(dá)可通過例如定 量RT-PCR測(cè)定。本文優(yōu)選使用一種增強(qiáng)子元件以增強(qiáng)細(xì)小病毒R印蛋白的表達(dá)。因此，在另一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)盒包含至少一個(gè)桿狀病毒增強(qiáng)子元件和/或至少一個(gè)蛻 皮激素應(yīng)答元件。優(yōu)選地，所述增強(qiáng)子元件選自hrl、hr2、hr3、hr4和hr5。
細(xì)小病毒R印蛋白的密碼子優(yōu)化在下文中更詳細(xì)地論述。 細(xì)小病毒R印蛋白的溫度優(yōu)化是指關(guān)于昆蟲細(xì)胞可生長的溫度以及R印起作用的
溫度的最佳條件。R印蛋白例如可在37°C下有最佳活性，而昆蟲細(xì)胞可在28°C下最佳生長。
Rep蛋白有活性并且昆蟲細(xì)胞生長的溫度可為30°C。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述優(yōu)化溫
度超過 27、28、29、30、31、32、33、34 或 35°C并且 / 或者小于 37、36、35、34、33、32、31、30 或
29°C。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，所述完整病毒體空殼病毒體的比值還可以通過弱 化Cap表達(dá)而增大，例如借助較弱的啟動(dòng)子，如與中度至高度Rep表達(dá)相比。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選為昆蟲細(xì)胞相容的載體?！袄ハx細(xì)胞相容的載體”或 “載體”可理解為能夠生產(chǎn)性轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染昆蟲或昆蟲細(xì)胞的核酸分子。示例性生物學(xué)載 體包括質(zhì)粒、線性核酸分子和重組病毒。只要是昆蟲細(xì)胞相容的，任何載體都可使用。所 述載體可以整合進(jìn)昆蟲細(xì)胞基因組中，但所述載體在昆蟲細(xì)胞中的存在并不需要是永 久的，瞬間游離載體也包括在內(nèi)。所述載體可以用已知的任何方法例如細(xì)胞化學(xué)處理、 電穿孔或感染來導(dǎo)入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是桿狀病毒、病毒載體或質(zhì) 粒。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是桿狀病毒，即所述核酸構(gòu)建體是桿狀病 毒表達(dá)載體。桿狀病毒表達(dá)載體及它們的使用方法在例如Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods forBaculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas AgriculturalExperimental Station Bull.No.7555, College Station, Tex. ；Luckow. 1991. In Prokop et al. , Cloning and Expression of Heterologous Genes in InsectCells with Baculovirus Vectors ' Recombinant DNA Technology andApplications, 97-152 ；King,L.A. and R. D. Possee,1992, The baculovirusexpression system,Chapman and Hall, United Kingdom ；0' ReilIy, D. R. , L. K. Miller,V.A.Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors :ALaboratory Manual, New York ；W.H.Freeman and Richardson,C. D. ,1995,Baculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology, volume 39 ；US 4, 745, 051 ；US2003148506 ；和 WO 03/074714 中有所描述。為生產(chǎn)重組細(xì)小病毒(rAAV)載體而在昆蟲細(xì)胞中應(yīng)用的核酸構(gòu)建體數(shù)目在本發(fā) 明中沒有限制。例如，可以依照本發(fā)明的方法應(yīng)用1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)分離的構(gòu)建體， 以在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。如果應(yīng)用2個(gè)構(gòu)建體，那么一個(gè)構(gòu)建體可包含含轉(zhuǎn)基因的以至 少一條細(xì)小病毒ITR序列為側(cè)翼的核苷酸序列，并且另一個(gè)構(gòu)建體可包含第一和第二表達(dá) 盒。如果應(yīng)用3個(gè)構(gòu)建體，那么一個(gè)構(gòu)建體可包含含轉(zhuǎn)基因的以至少一條細(xì)小病毒ITR序 列為側(cè)翼的核苷酸序列，另一個(gè)構(gòu)建體可包含所述第一和第二表達(dá)盒，并且剩下的一個(gè)構(gòu) 建體可包含編碼Rep蛋白的其他核苷酸序列，任選進(jìn)行了密碼子優(yōu)化、AT優(yōu)化或者GC優(yōu)化， 目的是使重組最少或者阻止重組，如下文所述。編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，在本文中可理解為編碼非結(jié)構(gòu)R印蛋白的 核苷酸序列，所述非結(jié)構(gòu)R印蛋白對(duì)于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)小病毒載體而言是必需的且充 分的，例如R印78或R印68，以及/或者R印52或R印40蛋白。細(xì)小病毒核苷酸序列優(yōu)選來 自依賴病毒，更優(yōu)選來自人或猿腺伴隨病毒(AAV)，最優(yōu)選來自通常感染人(如血清型1、2、 3A、3B、4、5和6)或靈長類(如血清型1和4)的AAV。編碼細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序 列的一個(gè)實(shí)例在SEQ ID No. 5中給出，它描繪了 AAV血清型2的序列基因組中編碼R印蛋白的一部分。R印78編碼序列包括核苷酸11-1876，R印52編碼序列包括核苷酸683-1876， 還分別描述于SEQ ID No. 5和7中。應(yīng)理解R印78和R印52蛋白的精確分子量，以及翻譯 起始密碼子的精確位置，可能隨細(xì)小病毒的不同而有所不同。然而，技術(shù)人員懂得如何識(shí)別 AAV-2以外的其他細(xì)小病毒核苷酸序列的相應(yīng)位置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)盒包含編碼細(xì)小病毒R印52或40蛋白的氨 基酸序列的核苷酸序列以及/或者編碼細(xì)小病毒Rep78或68蛋白的氨基酸序列的核苷酸 序列。細(xì)小病毒Rep蛋白優(yōu)選為腺伴隨病毒(AAV)R印蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有不超過一種類型核苷酸序列的昆蟲細(xì) 胞，所述核苷酸序列含有編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的單個(gè)開放閱讀框。所述單個(gè)開放閱讀框 優(yōu)選編碼一種或多種細(xì)小病毒Rep蛋白，所述開放閱讀框更優(yōu)選編碼所有的細(xì)小病毒Rep 蛋白，所述開放閱讀框最優(yōu)選編碼全長R印78蛋白，優(yōu)選至少R印52和R印78蛋白在昆蟲 細(xì)胞中都可由此開放閱讀框表達(dá)。本文中可理解的是，所述昆蟲細(xì)胞可含有超過一個(gè)的拷 貝的單一類型核苷酸序列，例如在多拷貝游離載體中超過一個(gè)的拷貝的單一類型核苷酸序 列，但是這些拷貝基本上是一個(gè)或者同一核酸分子的多個(gè)拷貝，或至少是編碼一個(gè)或同一 Rep氨基酸序列的核酸分子，例如只是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而相互不同的核酸分子。只存在 單一類型的編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核酸分子避免了含有Rep序列的不同類型載體中可能 存在的同源序列之間的重組，所述重組會(huì)產(chǎn)生影響細(xì)小病毒在昆蟲細(xì)胞中的生產(chǎn)水平(的 穩(wěn)定性)的缺陷型Rep表達(dá)構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)盒包含多于一條編碼細(xì)小病毒Rep 蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選地，(ii)的核苷酸序列包含含編碼R印78和Rep68蛋白中至少一 種的核苷酸序列的開放閱讀框。所述核苷酸序列優(yōu)選是相同血清型。更優(yōu)選地，所述核苷酸 序列之間的不同之處在于它們可以是密碼子優(yōu)化的、AT優(yōu)化的或者GC優(yōu)化的，以使重組最 少或者阻止重組。所述第一表達(dá)盒優(yōu)選包含兩條編碼細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序列，即 第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的共同氨基酸序列的第一和第 二核苷酸序列的差異通過下列一種或多種手段最大化(即，使核苷酸同一性最小化)a)改 變編碼細(xì)小病毒Rep共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的密碼子偏好；b)改變編碼細(xì)小病 毒Rep共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的密碼子偏好；c)改變編碼共同氨基酸序列的第 一核苷酸序列的GC含量；以及d)改變編碼共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的GC含量。 密碼子優(yōu)化可基于本發(fā)明方法使用的昆蟲細(xì)胞的密碼子選擇進(jìn)行，所述昆蟲優(yōu)選草地貪夜 娥(Spodoptera frugiperda)，所述密碼子選擇可獲自密碼子選擇數(shù)據(jù)庫(參見如http:// www. kazusa. or. jp/codon/)。合適的用于密碼子優(yōu)化的計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員可 獲得的(參見如 Jayaraj et al.，2005，Nucl. AcidsRes. 33 (9) :3011_3016 ；以及在互聯(lián)網(wǎng) 上)?；蛘?，所述優(yōu)化可使用相同的密碼子選擇數(shù)據(jù)庫手工完成。編碼細(xì)小病毒R印52蛋白的第一表達(dá)盒核苷酸序列可定義為如下核苷酸序列a)其編碼包含與SEQ ID N0. 6的氨基酸序列具有至少50 %、60 %、70 %、80 %、 88%、89%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；b)其與SEQ ID N0. 1-5的任一條核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、 81%、82%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的序列同一性；c)其互補(bǔ)鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；
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d)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，序列與(C)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。編碼細(xì)小病毒R印78蛋白的第一表達(dá)盒核苷酸序列可定義為如下核苷酸序列a)其編碼包含與SEQ ID NO. 8的氨基酸序列具有至少50 %、60 %、70 %、80 %、 88%、89%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；b)其與SEQ ID NO. 7的11-1876位的核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、 81%、82%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的序列同一性；c)其互補(bǔ)鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；d)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，序列與(C)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼對(duì)于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)小病毒載體而言所需的且 充分的細(xì)小病毒R印蛋白。在其他細(xì)小病毒的Rep蛋白編碼序列中消除Rep78和Itep52翻譯起始位點(diǎn)之外的 可能的錯(cuò)誤翻譯起始位點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，消除在昆蟲細(xì)胞中可被識(shí)別的推定剪 接位點(diǎn)也如此。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于翻譯所述細(xì)小病毒R印78蛋白的起始密碼子是次優(yōu) 起始密碼子。次優(yōu)起始密碼子優(yōu)選是實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍的起始密碼子。本文中的部分外 顯子跳躍可理解為指，至少部分核糖體不在R印78蛋白的次優(yōu)起始密碼子而在更下游的起 始密碼子起始翻譯，由此，優(yōu)選地，更下游的起始密碼子是R印52蛋白的起始密碼子。次優(yōu) 起始密碼子優(yōu)選在所述核苷酸序列在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍。優(yōu)選地，使 用桿狀病毒表達(dá)時(shí)，次優(yōu)起始密碼子在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍，從而優(yōu)選在感染 后約20-40小時(shí)，更優(yōu)選在感染后約30-40小時(shí)，在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的R印78和R印52的摩 爾比范圍為1 10到10 1、1 5到5 1或1 3到3 1。R印78和R印52的摩爾 比可通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，優(yōu)選地使用可識(shí)別R印78和Rep52兩者的共有表位的單克隆抗 體，或使用例如小鼠抗-R印抗體(303. 9，Progen, Germany ；1 50稀釋)。本文使用的術(shù)語“次優(yōu)起始密碼子”不僅指三核苷酸起始密碼子自身，還指它的背 景。因此，次優(yōu)起始密碼子可由在次優(yōu)背景例如非Kozak背景中的“最優(yōu)”ATG密碼子組成。 然而，更優(yōu)選三核苷酸起始密碼子自身是次優(yōu)(即不是ATG)的次優(yōu)起始密碼子。本文中 的次優(yōu)可理解為指所述密碼子與在同樣背景中的正常ATG密碼子相比，在翻譯起始方面的 效率較低。優(yōu)選地，次優(yōu)密碼子的效率低于同樣背景下的正常ATG密碼子的效率的90%、 80%、60%、40%或20%。技術(shù)人員清楚用于比較翻譯起始的相對(duì)效率的方法本身。優(yōu)選的 次優(yōu)起始密碼子可從ACG、TTG、CTG和GTG中選擇。更優(yōu)選為ACG。編碼細(xì)小病毒R印蛋白 的核苷酸序列，在本文中可理解為編碼對(duì)于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)小病毒載體而言是必需的 且充分的非結(jié)構(gòu)R印蛋白的核苷酸序列，所述非結(jié)構(gòu)Rep蛋白例如R印78和R印52蛋白。還可以用編碼甲硫氨酸的不同密碼子替換序列中的其他ATG，使得從這類ATG開 始翻譯的可能性減小。為在昆蟲細(xì)胞中正確的表達(dá)而對(duì)包括例如野生型細(xì)小病毒序列在內(nèi)的前述 編碼核苷酸序列進(jìn)行多種修飾可通過應(yīng)用公知的遺傳工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)，如Sambrook and Russell (2001) “ Molecular Cloning :ALaboratory Manual (第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York 中所描述的。本令頁 域的技術(shù)人員了解對(duì)能夠增加編碼蛋白產(chǎn)量的編碼區(qū)的多種進(jìn)一步修飾。這些修飾都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。編碼細(xì)小病毒殼體(Cap)蛋白的核苷酸序列在本文中可理解為包括編碼細(xì)小病 毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3中的一種或多種的核苷酸序列。所述細(xì)小病毒核苷酸序列優(yōu)選 來自依賴病毒，更優(yōu)選地來自人或猿腺伴隨病毒(AAV)，最優(yōu)選地來自通常感染人類(如血 清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長類(如血清型1和4)的AAV。編碼細(xì)小病毒殼體蛋白的 核苷酸序列的實(shí)例在SEQ ID No 20,22和24中給出。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，(iii)的核苷酸序列包含編碼VP1、VP2和VP3殼體蛋白 的核苷酸序列的開放閱讀框。編碼殼體蛋白的序列可以多種形式存在。例如可使用分別針 對(duì)殼體蛋白VP1、VP2和VP3中的每一種的各獨(dú)立的編碼序列，其中每條編碼序列可操作地 連接于用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列。然而，更優(yōu)選地，所述第二表達(dá)盒包含含編 碼全部三種細(xì)小病毒仏々力￥ 1、￥ 2和￥ 3殼體蛋白的單個(gè)開放閱讀框的核苷酸序列，其中 VPl殼體蛋白翻譯的起始密碼子是非ATG的次優(yōu)起始密碼子，例如如Urabe et al. (2002， 見上文)和W02007/046703中所述。VPl殼體蛋白的次優(yōu)起始密碼子可如上文對(duì)于R印78 蛋白的定義。VPl殼體蛋白的次優(yōu)起始密碼子更優(yōu)選可選自ACG、TTG、CTG和GTG，其中CTG 和GTG是最優(yōu)選的。在第二表達(dá)盒中所含的用于表達(dá)殼體蛋白的核苷酸序列還可含有如 W02007/046703所述的一種或多種修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉對(duì)VP編碼區(qū)的能夠增加VP 和病毒體的產(chǎn)量或具有其他所需效果的多種進(jìn)一步修飾，所述其他所需效果例如為改變病 毒體的向性或減少病毒體的抗原性。這些修飾都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VPl表達(dá)與VP2和VP3表達(dá)相比增加。VPl表達(dá)的增加可 通過補(bǔ)充VP1、通過向昆蟲細(xì)胞中導(dǎo)入包含VPl核苷酸序列的單個(gè)載體實(shí)現(xiàn)，這已被記載于 WO 2007/084773 中。在本發(fā)明的上下文中，“至少一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列”可理解意為 一個(gè)回文序列，其含有大部分互補(bǔ)、對(duì)稱排列的也稱為“A”、“B”和“C”區(qū)的序列。ITR的功 能為作為復(fù)制起點(diǎn)——一個(gè)在復(fù)制中具有“順式”作用的位點(diǎn)，即作為反式作用復(fù)制蛋白如 R印78 (或R印68)的識(shí)別位點(diǎn)，所述反式作用復(fù)制蛋白識(shí)別所述回文結(jié)構(gòu)和所述回文結(jié)構(gòu) 內(nèi)部的特定序列。所述ITR序列對(duì)稱性的一個(gè)例外是所述ITR的“D”區(qū)。它是獨(dú)特的(在 一個(gè)ITR內(nèi)無互補(bǔ)序列)。單鏈DNA的切開發(fā)生在A區(qū)和D區(qū)之間的結(jié)合處。它是新DNA 合成起始的區(qū)域。D區(qū)通常位于所述回文結(jié)構(gòu)的一側(cè)并為核酸復(fù)制步驟提供方向性。在哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的細(xì)小病毒通常含有兩個(gè)ITR序列。然而，可以設(shè)計(jì)一種ITR，使結(jié)合位 點(diǎn)在A區(qū)的兩條鏈上，并使D區(qū)對(duì)稱分布，在所述回文結(jié)構(gòu)的每一側(cè)各一個(gè)。因此在雙鏈環(huán) 形DNA模板(如質(zhì)粒)上，R印78或R印68輔助的核酸復(fù)制在兩個(gè)方向上進(jìn)行，且單個(gè)ITR 序列足以進(jìn)行環(huán)形載體的細(xì)小病毒復(fù)制。因此，一個(gè)ITR核苷酸序列可用于本發(fā)明的上下 文中。然而，優(yōu)選地使用兩個(gè)或其他偶數(shù)個(gè)規(guī)則的ITR。最優(yōu)選地，使用兩個(gè)ITR序列。一 種優(yōu)選的細(xì)小病毒ITR是AAV ITR0出于安全原因，可能希望構(gòu)建一種在第二種AAV的存在 下在最初引入細(xì)胞后不能再繁殖的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體。通過使用如US2003148506 所述的具有嵌合ITR的rAAV可提供這種在受者中限制不希望的載體繁殖的安全機(jī)制。就以另外的元件為側(cè)翼的序列而言，術(shù)語“以......為側(cè)翼”在本文中是指
相對(duì)于所述序列在上游和/或下游，即5’和/或3’，存在一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼元件。術(shù)語 “以......為側(cè)翼”不是意在指序列必須連續(xù)。例如，在編碼轉(zhuǎn)基因的核酸和側(cè)翼元件之間可具有間隔序列。以兩個(gè)其他元件(例如ITR)為“側(cè)翼”的序列表示一個(gè)元件位于所述序 列的5’，另一元件位于所述序列的3’;然而，在其間可具有間隔序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案 中，在(i)的核苷酸序列的任一側(cè)以細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含轉(zhuǎn)基因(編碼目的基因產(chǎn)物)的以至少一條細(xì)小病 毒ITR序列為側(cè)翼的核苷酸序列優(yōu)選整合到在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的重組細(xì)小病毒(rAAV)載 體的基因組中。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的基因產(chǎn)物。優(yōu) 選地，包含所述轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列以兩條細(xì)小病毒(AAV) ITR核苷酸序列為側(cè)翼，其中所 述轉(zhuǎn)基因位于兩條細(xì)小病毒(AAV) ITR核苷酸序列之間。優(yōu)選地，如果編碼目的基因產(chǎn)物的 核苷酸序列(用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá))位于兩個(gè)規(guī)則ITR之間或位于用兩個(gè)D區(qū)進(jìn)行 改造的ITR的任一側(cè)時(shí)，那么它將會(huì)整合到在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體 中?？捎糜诒景l(fā)明以在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組AAV病毒體的AAV序列可源自任何AAV 血清型的基因組。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上有明顯的同源性的基因組 序列，提供一系列相同的遺傳功能，產(chǎn)生在物理上和功能上基本等價(jià)的病毒體，并通過幾乎 相同的機(jī)制進(jìn)行復(fù)制和裝配。對(duì)于各種AAV血清型的基因組序列和對(duì)基因組相似度的綜 述，參見如 GenBank 登錄號(hào) U89790 ；GenBank 登錄號(hào) J01901 ；GenBank 登錄號(hào) AF043303 ； GenBank 登錄號(hào) AF085716 ;Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71 6823-33) ；Srivastava et al. (1983,J. Vir. 45 555-64) ；Chlorini et al. (1999，J. Vir. 73 1309-1319) ；Rutledgeet al. (1998, J. Vir. 72 309-319)和 Wu et al. (2000，J. Vir. 74 :8635_47)。AAV 血清型 1、2、 3、4和5是用于本發(fā)明上下文中的AAV核苷酸序列的優(yōu)選來源。優(yōu)選地，用于本發(fā)明上下文 中的AAV ITR序列源自AAVl、AAV2和/或AAV4。同樣，Rep (R印78/68和R印52/40)編碼 序列優(yōu)選源自AAVl、AAV2和/或AAV4。然而，用于本發(fā)明上下文的編碼VP1、VP2和VP3殼 體蛋白的序列可獲自已知的42種血清型中的任一種，更優(yōu)選獲自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通過例如殼體穿梭(capsid shuffling)技術(shù)和AAV殼體 文庫獲得的新開發(fā)的AAV樣顆粒，或者獲自新設(shè)計(jì)、開發(fā)或進(jìn)化的ITR。AAV Rep和ITR序列在大多數(shù)血清型中是特別保守的。各種AAV血清型的R印78 蛋白有例如超過89%的同一性，AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之間在基因組水平的總核苷酸 序列的同一性為約 82% (Bantel-Schaal et al. , 1999, J. Virol. ,73(2) :939_947)。另外， 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)AAV顆粒方面，已知許多AAV血清型的Rep序列和ITR與其他血清 型的相應(yīng)序列是有效交叉互補(bǔ)的(即功能替代的)。US2003148506報(bào)道了，在昆蟲細(xì)胞中， AAV Rep和ITR序列與其他AAV Rep和ITR序列也是有效交叉互補(bǔ)的。已知AAV VP蛋白決定了 AAV病毒體的細(xì)胞向性。不同AAV血清型的VP蛋白編碼 序列的保守性明顯比R印蛋白和基因的要低。R印和ITR序列與其他血清型的相應(yīng)序列交 叉互補(bǔ)的能力可使得產(chǎn)生假型rAAV顆粒，該顆粒包含一種血清型(如AAV3)的殼體蛋白和 另一種AAV血清型(如AAV2)的R印和/或ITR序列。這種假型rAAV顆粒是本發(fā)明的一 部分。經(jīng)修飾的“AAV”序列也可用于本發(fā)明的上下文中，如用于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV 載體。這種經(jīng)修飾的序列例如包括與AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或 AAV9至少有約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或更
17高核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如具有約75-99%核苷酸序列同一性的序列)的序 列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAVITR、Rep或VP序列。盡管在許多方面，AAV5與其他AAV血清型相似，但它與其他人和猿AAV血清型的 不同比其他已知的人和猿血清型的要大。因此，rAAV5與其他血清型在昆蟲細(xì)胞中的生產(chǎn) 不同。當(dāng)使用本發(fā)明的方法來生產(chǎn)rAAV5時(shí)，優(yōu)選一種或多種構(gòu)建體(總之在超過一種構(gòu) 建體的情況下)含有含AAV5 ITR的核苷酸序列、含AAV5 R印編碼序列的核苷酸序列(即 含AAV5 Rep78的核苷酸序列)。這種ITR和R印序列可根據(jù)需要被修飾，以在昆蟲細(xì)胞中 有效生產(chǎn)rAAV5或假型rAAV5載體。例如可修飾Rep序列的起始密碼子，可修飾或除去VP 剪接位點(diǎn)，和/或可修飾VPl起始密碼子和附近核苷酸，從而提高rAAV5載體在昆蟲細(xì)胞中 的生產(chǎn)。因此本文上面定義的包含所述轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列可含有編碼至少一個(gè)用于在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的“目的基因產(chǎn)物”的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆蟲細(xì)胞 中復(fù)制的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中。在本發(fā)明的上下文中應(yīng)理解，表達(dá)所述“目的基因 產(chǎn)物”的特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。任何核苷酸序列都可被整合，以隨后在以根 據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)?？删幋a例如蛋白 的核苷酸序列可表達(dá)出RNAi試劑，即能夠進(jìn)行RNA干擾的RNA分子，例如shRNA(短發(fā)夾 RNA)或siRNA (短干擾RNA)。“ siRNA"指小干擾RNA，它是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒的短雙鏈 RNA(Elbashir et al.，2001，Nature411494-98 ；Caplen et al.，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-47)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含所述轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列可含有兩個(gè) 編碼核苷酸序列，每一個(gè)都編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的基因產(chǎn)物。編碼目的基 因產(chǎn)物的兩個(gè)核苷酸序列的每一個(gè)的位置都可使其可被整合到在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的重組 細(xì)小病毒(rAAV)載體中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的產(chǎn)物可以是治療性基因產(chǎn)物。治療性基因產(chǎn)物可以 是多肽或RNA分子(siRNA)或其他基因產(chǎn)物，所述其他基因產(chǎn)物在靶細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可提供 想要的治療效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的細(xì)胞或補(bǔ)足遺傳缺陷(如導(dǎo)致酶 活性不足)。治療性多肽基因產(chǎn)物的實(shí)例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL，優(yōu)選為 LPL S447X;參見WO 01/00220)、載脂蛋白Al、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)、視網(wǎng)膜 色素變性GTP酶調(diào)節(jié)因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和細(xì)胞因子或白細(xì)胞介素例如IL-10、膽 色素原脫氨酶(PBGD)、神經(jīng)營養(yǎng)因子例如源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)以 及丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(AGT)。替代地或者額外地，作為另一基因產(chǎn)物，本文上面定義的包含所述轉(zhuǎn)基因的核苷 酸序列還可包含編碼用作標(biāo)記蛋白的多肽的核苷酸序列，以評(píng)估細(xì)胞轉(zhuǎn)化和表達(dá)。用于此 目的的合適的標(biāo)記蛋白有例如熒光蛋白GFP和選擇性標(biāo)記基因HSV胸苷激酶(用于對(duì)HAT 培養(yǎng)基選擇)、細(xì)菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(用于對(duì)潮霉素B選擇)、Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 (用于對(duì)G418選擇)和二氫葉酸還原酶(DHFR)(用于對(duì)甲氨蝶呤選擇)、CD20 (低親和性 神經(jīng)生長因子基因)。獲得這些標(biāo)記基因的來源和其使用方法見Sambrook and Russel，見 上文。另外，本文上面定義的包含所述轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列可包含編碼可用作故障保險(xiǎn)機(jī) 制的多肽的又一核苷酸序列，在認(rèn)為必要時(shí)，所述多肽使得可以用由本發(fā)明的重組細(xì)小病 毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞來治愈受試者。這種通常被稱為自殺基因的核苷酸序列編碼能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)的蛋白，所述有毒物質(zhì)能夠殺死所述蛋白在其中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞。這種自殺基因的合適的實(shí)例包括例如大腸桿菌(E.coli)胞嘧啶脫氨酶基因或單純皰 疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水痘帶狀皰疹病毒的胸苷激酶基因之一，在這些實(shí)例中，更昔洛韋可 用作殺死受試者中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的前藥(參見例如Clair et al.，1987，Antimicrob. Agents Chemother. 31 :844_849)。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)目的基因產(chǎn)物可以是AAV蛋白，特別是R印蛋白，如R印78 或R印68，或其功能片段。編碼R印78和/或R印68的核苷酸序列如果存在于本發(fā)明的重 組細(xì)小病毒(rAAV)載體的基因組中并在被所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，則可使 重組細(xì)小病毒(rAAV)載體整合到經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。R印78和/或R印68 在rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可通過允許經(jīng)所述重組細(xì)小病毒(rAAV)載 體引入細(xì)胞的任何其他目的基因產(chǎn)物長期或永久地表達(dá)，而有利于所述載體的某些應(yīng)用。在本發(fā)明的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中，所述至少一個(gè)編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中表達(dá)的目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列，優(yōu)選與至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞相容的表達(dá)控制序 列例如啟動(dòng)子可操作地連接。本領(lǐng)域已知許多這類啟動(dòng)子(見Sambrook and Russel，2001， 見上文)?？墒褂迷谠S多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)的組成型啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。然而，更優(yōu) 選的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的、組織特異的、細(xì)胞種類特異的或細(xì)胞周期特異的。例如，對(duì)于肝臟 特異性表達(dá)，啟動(dòng)子可選自α 1-抗胰蛋白酶(AAT)啟動(dòng)子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子、 白蛋白啟動(dòng)子、LPS (甲狀腺素結(jié)合球蛋白)啟動(dòng)子、HCR-Ap0CII雜合啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜合 啟動(dòng)子、與小鼠白蛋白基因增強(qiáng)子(Ealb)元件結(jié)合的AAT啟動(dòng)子和載脂蛋白E啟動(dòng)子。其 他實(shí)例包括用于腫瘤選擇性——特別是神經(jīng)細(xì)胞腫瘤選擇性——表達(dá)的E2F啟動(dòng)子(Parr et al.，1997，Nat. Med. 3 1145-9)或在單核血細(xì)胞中使用的 IL-2 啟動(dòng)子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med；185 2101-10)。AAV能感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。參見如Tratschin et al. (1985，Mol. Cell Biol. 5 3251-3260)和 Grimm et al. (1999，Hum. Gene Ther.叢2445_2450)。然而，人類 滑膜成纖維細(xì)胞的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)明顯比類似的鼠細(xì)胞中更有效(Jennings et al. , Arthritis Res, 3 1，2001)，且AAV的細(xì)胞向性在各血清型中不同。參見如Davidson et al. (2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :3428_3432)，該文獻(xiàn)討論了 AAV2、AAV4 和 AAV5 在哺乳動(dòng)物 CNS細(xì)胞向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面的不同。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可為任何 可被細(xì)小病毒病毒體感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如但不限于肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為人細(xì)胞。優(yōu)選地，在該構(gòu)建體中，編碼細(xì)小病毒Rep蛋白和/或細(xì)小病毒殼體蛋白的核苷 酸序列可操作地連接于用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列。這些表達(dá)控制序列應(yīng)至少包 括在昆蟲細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于在昆蟲宿主細(xì)胞中表達(dá)外 源基因的技術(shù)可用于實(shí)施本發(fā)明。在昆蟲細(xì)胞中的分子工程和多肽表達(dá)的方法學(xué)在文獻(xiàn)中 有所描述，如 Summers and Smith. 1986. A Manual ofMethods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures， Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555,CollegeStation,Tex. ；Luckow. 1991.見Prokop et al.，Cloning andExpression of Heterologous Genes in Insect Cells with BaculovirusVectors ' Recombinant DNA Technology and Applications，97—152 ；King，L. A. and R. D. Possee，1992，Thebaculovirus expression system,Chapman and Hall,United Kingdom ；0' Reilly,D. R., L. K. Miller,V. A. Luckow,1992,Baculovirus Expression Vectors :A LaboratoryManual, New York ；W. H.Freeman and Richardson, C.D·,1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39 ；US 4，745，051 ;US2003148506 和 WO 03/074714。用于轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的第一和第二構(gòu)建體中包含的核苷酸序列的合適啟動(dòng)子包 括例如多角體(PolH)、plO、p35、IE-I或Δ IE-I啟動(dòng)子，以及上面文獻(xiàn)中描述的其他啟動(dòng) 子。所述包含至少第一和/或第二表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體還可含有表達(dá)控制序列，所述 表達(dá)控制序列包含SEQ. ID NO 9的九核苷酸序列或與SEQ. ID NO 9基本同源的核苷酸序 列，并位于編碼所述細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的起始密碼子和/或編碼所述細(xì)小病 毒VPl殼體蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游。與SEQ. ID NO 9的核苷酸序列具有基 本同一性并會(huì)幫助增加所述細(xì)小病毒Rep蛋白的表達(dá)的序列為，例如，與SEQ. ID NO :9的九 核苷酸序列具有至少60 %、70 %、80 %或90 %同一性的序列。所述昆蟲細(xì)胞可為適于異源蛋白生產(chǎn)的任何細(xì)胞。所述昆蟲細(xì)胞優(yōu)選允許桿狀 病毒載體的復(fù)制并可在培養(yǎng)中維持。所述昆蟲細(xì)胞更優(yōu)選還可允許重組細(xì)小病毒載體包 括rAAV載體的復(fù)制。例如，所用細(xì)胞系可來自草地貪夜蛾、果蠅(Drosophila)細(xì)胞系， 或蚊細(xì)胞系，如白紋伊蚊(Aedes albopictus)衍生細(xì)胞系。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞或細(xì)胞系是 來自易被桿狀病毒感染的昆蟲種的細(xì)胞，包括如S2(CRL-1963，ATCC)、Se301、SeIZD2109、 SeUCRU Sf9, Sf900+、Sf2U BTI-TN-5B1-4、MG-U Tn368、HzAmU Ha2302、Hz2E5、High
Five (Invitrogen，CA，USA)和以/iresSF+ (US 6，103，526 ；Protein SciencesCorp. ,CT,
USA)。本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲細(xì)胞為用于生產(chǎn)重組細(xì)小病毒載體的昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明的方法的一種或多種核酸構(gòu)建體可穩(wěn)定地整合到昆蟲細(xì)胞的基因組中。本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何將核苷酸序列穩(wěn)定地導(dǎo)入昆蟲基因組中，以及如何識(shí)別在基因 組中有這種核苷酸序列的細(xì)胞?？赏ㄟ^例如使用含有與昆蟲基因組的區(qū)域高度同源的核苷 酸序列的載體來幫助整合到基因組中。將核苷酸序列引入基因組的另一種方法是使用特殊 序列，如轉(zhuǎn)座子。本領(lǐng)域中公知培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞中異源產(chǎn)物的生 產(chǎn)，這些例如在上面引用的有關(guān)昆蟲細(xì)胞分子工程學(xué)的參考文獻(xiàn)中有所描述(也參見 W02007/046703)。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，回收所述重組細(xì)小病毒病毒體。回收優(yōu) 選包括使用抗AAV抗體(優(yōu)選固定化抗體)對(duì)重組細(xì)小病毒(rAAV)載體(或含有所述載體 的病毒體)進(jìn)行親和純化的步驟。所述抗AAV抗體優(yōu)選為單克隆抗體。特別合適的抗體為單 鏈駝科動(dòng)物(cameloid)抗體或其片段，可例如從駱駝或美洲駝獲得(參見如Muyldermans， 2001，Biotechnol. 74 :277-302)。用于AAV親和純化的抗體優(yōu)選為與AAV殼體蛋白上的 表位特異結(jié)合的抗體，因此，所述表位優(yōu)選為在多種AAV血清型的殼體蛋白上存在的表位。 例如，所述抗體可基于與AAV2殼體特異性結(jié)合產(chǎn)生或選擇，但同時(shí)它也可與AAV1、AAV3和 AAV5殼體特異性結(jié)合。在第二方面，本發(fā)明涉及一種包含一種或多種本文上面定義的本發(fā)明表達(dá)盒的核 酸構(gòu)建體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的第一和第二表達(dá)盒，并任選包含(i)的核酸序列。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子優(yōu)選是PlO啟動(dòng)子，所述 第二啟動(dòng)子優(yōu)選是PolH啟動(dòng)子或4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子。所述第一啟動(dòng)子更優(yōu) 選可操作地連接有增強(qiáng)子，優(yōu)選HRl增強(qiáng)子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的 第一啟動(dòng)子為4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子。在又一 實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為plO、 ΔΕΙ或El啟動(dòng)子。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng) 子，所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1或El啟動(dòng)子。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的第 一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1或El啟動(dòng)子。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明 的核酸構(gòu)建體中的第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子。在另一些實(shí)施 方案中，所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子的任何其他組合是本發(fā)明的一部分。所述第一 啟動(dòng)子可選自PolH啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子、堿性蛋白啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、ΔΕ1啟動(dòng)子、El 啟動(dòng)子或任何其他晚期或極晚期桿狀病毒基因啟動(dòng)子。所述第二啟動(dòng)子可選自PolH啟動(dòng) 子、PlO啟動(dòng)子、堿性蛋白啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、ΔΕ1啟動(dòng)子、El啟動(dòng)子或任何其他晚期或 極晚期桿狀病毒基因啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，所述第一啟動(dòng)子選自PolH啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子或 堿性蛋白啟動(dòng)子，并且其中所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1啟動(dòng)子、El啟動(dòng)子或任何其他早期或晚 期桿狀病毒基因啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中所含的第一表達(dá)盒包含上文定義 的增強(qiáng)子元件。在第三方面，本發(fā)明涉及上文定義的昆蟲細(xì)胞。在第四方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含(a)包含上文定義的第一和第二表 達(dá)盒的核酸構(gòu)建體；以及(b)包含編碼轉(zhuǎn)基因多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所 述核苷酸序列以至少一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼，所述轉(zhuǎn)基因可操作地 連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體(b)包含編碼轉(zhuǎn)基因的以至少一條細(xì)小 病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼的核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)基因可操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng) 所述轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。所述試劑盒還包含昆蟲細(xì)胞以及編碼用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)桿狀病毒輔助功能 物的核酸序列。在又一方面中，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的上述方法中生產(chǎn)的一批細(xì)小病毒病毒體。 “一批細(xì)小病毒病毒體”在本文中定義為在同一輪生產(chǎn)中產(chǎn)生的所有細(xì)小病毒病毒體，任 選每容器的昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的所有細(xì)小病毒病毒體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述 一批細(xì)小病毒病毒體包含上文描述的完整病毒體總病毒體比和/或上文描述的完整病毒 體空殼比。在本說明書及其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包含”及其各種形式是以其非限制性的含義表 示包括該詞之后的項(xiàng)目，但并不排除未具體提到的項(xiàng)目。另外，用“一種”或“一個(gè)”提及的 要素不排除存在多個(gè)該要素的可能性，除非上下文明確要求有且只有一個(gè)該要素。因此“一 種”或“一個(gè)”通常是指“至少一個(gè)”。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明實(shí)施例
實(shí)施例11.1材料和方法1. 1. 1重組桿狀病毒的生成生成如下構(gòu)建體1. 1. 1. lpVD118(新)的構(gòu)建pVD118(新)是包含如下兩個(gè)表達(dá)盒的對(duì)照載體，一個(gè)表達(dá)盒包含在plO啟動(dòng)子 控制下的R印78的核苷酸序列，另一表達(dá)盒包含在多角體(PolH或pPH)啟動(dòng)子控制下的 Cap基因的核苷酸序列。pVD118(新)如圖1中所示進(jìn)行構(gòu)建。在終質(zhì)粒pVD118 (新)能 夠被制備之前，構(gòu)建前體PFastBac Dual R印78/ACG和pVD118 (lot#l)。簡(jiǎn)而言之，將質(zhì)粒 REP-ACG/PSC (專利申請(qǐng) W02007148971 ；在本文中也稱為 pVD88)pVD88 以 SpeI * XbaI 消化， 并使5’突出形成平端。將2057bp的片段從瓊脂糖凝膠分離，純化并連接至SmaI線性化的 pFastBac Dual (Invitrogen)，形成 pFastBac Dual R印78/ACG。此后,將該質(zhì)粒以 BstZ17I 和SnaBI消化，并將2537bppl0_Itep78/ACG片段分離并連接至BstZ17I線性化的pVD84，生 成pVD118(lot#l)。然而，R印78/ACG表達(dá)盒的方向是不正確的，因此通過進(jìn)行以NheI*BlpI 的消化刪除。在使5’突出形成平端后，將12431bp載體片段從凝膠中分離并純化。隨后， 將來自REP-ACG/PSC的2057bp純化片段連接至所述載體中，并將該轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)化至化學(xué) 感受態(tài)TOPlO細(xì)胞(Invitrogen)，并鋪板于含氨芐西林的板上。以NaeI * SacI對(duì)從小量制 備的培養(yǎng)物分離的DNA進(jìn)行限制性分析。正確的克隆呈現(xiàn)2204bp和12292bp大小的片段。1. 1. 1.2pVD118(新)+HRl 的構(gòu)建pVD118(新)+HRl與pVD118相同，且另外具有位于plO和多角體啟動(dòng)子之間的 hrl增強(qiáng)子，如圖2中所示進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，以引物HRl-Fw 5’ -gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3‘ (SEQ ID No 10)禾口 HRl-Rv 5，-RtatacRatcRattattRctccaatactaR-3，( SEQ ID No 11)在 AcMNPV 病毒 DNA (Protein Sciences Corporation, Meriden, USA)上進(jìn) 行的PCR產(chǎn)生了 904bp的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-TOPO載體(Invitrogen)中。 在以BstZ17I消化后，將898bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以BstZ17I切開并去磷 酸化的pVD118(新)載體中。以SpeI * EcoNI對(duì)正確克隆進(jìn)行的對(duì)照消化產(chǎn)生1269bp和 14125bp的片段。1. 1. 1. 3pVD84(+plORep) ( = pVD165)的構(gòu)建pVD165是包含如下兩個(gè)表達(dá)盒的對(duì)照載體，一個(gè)表達(dá)盒包含在plO啟動(dòng)子控制下 的起始密碼子已突變成ACG的R印78的核苷酸序列，另一表達(dá)盒包含在PolH啟動(dòng)子控制下 的Cap基因的核苷酸序列。所述表達(dá)盒在質(zhì)粒中的方向相反。PVD165如圖3中所示進(jìn)行構(gòu) 建。簡(jiǎn)而言之，以引物 polyA Fw 5，-agatct gtagtggctatggcagggc-3，(SEQ IDNo 12)和 ρIORv 5' —agatct cccggg acggacctttaattcaacccaac-3‘ (SEQ IDNo 13)在 pVD118(新) 上進(jìn)行的PCR產(chǎn)生了 2566bp的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-T0P0載體(Invitrogen) 中。在以BglII消化后，將2541bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以BglII切開并去磷 酸化的PVD84載體中。以SpeI * XbaI對(duì)正確克隆進(jìn)行的對(duì)照消化產(chǎn)生1269bp和11810bp 的片段。1. 1. 1. 4pVD165+HRl 的構(gòu)建pVD165+HRl與pVD165相同，且另外具有位于plO啟動(dòng)子下游的hrl增強(qiáng)子，如圖4中所示進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，以引物 HR1-Fw5，-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3，(SEQ ID No 10)禾口 HR1-Rv5' gtatacgatcgattattgctccaatactag-3，(SEQ ID No 11)在 AcMNPV 病毒DNA上進(jìn)行的PCR產(chǎn)生了 904bp的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-TOPO載體 (Invitrogen)中。在以BstZ17I消化后，將898bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以SmaI 切開并去磷酸化的PVD165載體中。以ClaI對(duì)正確克隆進(jìn)行的對(duì)照消化產(chǎn)生875bp、1184bp、 4160bp 和 9180bp 的片段。1. 1. 1. 5CAP上游具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的pVD165 (pVD165+4xEcRE CAP)的構(gòu)建PVD165+4xEcRE CAP類似于pVD165，但包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來代替多角體(pPH)啟 動(dòng)子。pVD165+4xEcRE CAP如圖5中所示進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，將包含4個(gè)連續(xù)的EcRE、最 小 hsp70 啟動(dòng)子(Poels et al. Insect Biochem Mol Biol 2004,34(5) :451_458)和 CAP 編碼序列部分的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子合成并連接至pCRII-平端-TOPOanvitrogen)中。在以 BstZ17I和EcoNI消化后，將375bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以BstZ17I和EcoNI 切開的PVD165載體中。以PmeI * EcoRV對(duì)正確克隆的對(duì)照消化產(chǎn)生2554bp和12116bp的 片段。1. 1. 1. 6Rep上游具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的pVD165 (pVD165+4 * EcRER印78-52)的構(gòu)建pVD165+4*EcRE R印78類似于pVD165，但包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來代替plO啟動(dòng)子。 pVD165+4*EcRE R印78如圖6中所示進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，將包含4個(gè)連續(xù)的EcRE、最 小hsp70啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子合成并連接至pCRII-平端-TOPOanvitrogen)中。在以 BstZ17I和SpeI消化后，將290bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以SmaI和SpeI切開的 PVD165載體中。以SpeI*BglII對(duì)正確克隆進(jìn)行的對(duì)照消化產(chǎn)生298bp、2376bp和11954bp 的片段。1. 1. 1. 7pVD190 構(gòu)建體(Δ IElCap+pPolh Rep)的構(gòu)建Δ IElCap+pPolh R印類似于pVD165，但包含Δ IEl啟動(dòng)子來代替pPH啟動(dòng)子， PPolH啟動(dòng)子代替plO啟動(dòng)子。Δ IEl Cap+pPolh R印如圖7和8中所示進(jìn)行構(gòu)建。至此， 以如下的方式構(gòu)建載體前體。以引物BstZ17I-A IElFw :5，-ggtcc gtatacgacgataacgccgt tggtggcg-3，(SEQ ID No : 14)和AflII-Δ IEl Rv 5'-cgacttaagacggcgaattctgcagatggc-3 ，(SEQ ID No :15)在pFBDSLR(Urabe et al. Human genetherapy 2002 ； 13 (16) :1935_1943) 上進(jìn)行PCR，形成了 181bp的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-T0P0載體(Invitrogen) 中。在以BstZ17I*AflII消化后，將165bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以BstZ17I 和AflII切開的pVD165+4xEcRE CAP載體中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒為pVD165+ Δ IElCAP,以 BstZ 171 * Af 1II進(jìn)行的對(duì)照消化應(yīng)產(chǎn)生165bp和14374bp的片段。隨后，將多角體蛋 白啟動(dòng)子克隆在PVD165+AIE1CAP中的R印表達(dá)盒之前。至此，以引物Smal-pPolhFw 5，-tctcccgggagatcatggaga taattaaaatgataac-3，(SEQ ID No 16)禾口 Spel-pPolh Rv 5' -gttactagtgagctcgtcgac-3' (SEQ ID No 17)在 pVD88 上進(jìn)行 PCR。這生成了 198bp 的 PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-T0P0載體(Invitrogen)中。在以SpeI * SmaI消 化后，將188bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以SpeI和SmaI切開的pVD165+ Δ IEl_Cap 載體中。最后，這形成了 PVD165+AIE1 CAP構(gòu)建體。1. 1. 1. 8plO-Cap-pPolh-Rep 構(gòu)建體的構(gòu)建plO_Cap+pPolh_Rep 構(gòu)建體類似于 Δ -IEl-Cap-pPolh-R印構(gòu)建體，但在 Cap表達(dá)盒的前面包含PlO啟動(dòng)子來代替Δ-ΙΕ1啟動(dòng)子，如圖9中所示進(jìn)行構(gòu)建。以引物 BstZ17I-plOFw 5' -agtatacggacctttaattcaac-3' (SEQ ID No 18)禾口 Aflll-plORv _c gacttaagagcgggccgctttcgaatc-3‘ (SEQ ID No 19)在 pFastBac Dual 上進(jìn)行的 PCR 產(chǎn)生 7 171bp的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物克隆至pCRII-平端-TOPO載體(Invitrogen)中。在以BstZ17I * AflII消化后，將160bp的片段從凝膠分離，純化并連接至以BstZ17I和AflII切開的 Δ-IEl-Cap-pPolh-Rep 構(gòu)建體中。1. 1. 1. 9pVD194(Rep78/CTG(A ATGs))的構(gòu)建通過依照SEQ ID NO :31中列出序列合成必需基因，首先構(gòu)建了具有CTG起始密碼 子而無任何內(nèi)部ATG位點(diǎn)的rep質(zhì)粒。然后使用限制性酶RsrII和XbaI從質(zhì)粒pVD88刪 除RP基因。然后使用限制性位點(diǎn)RsrII和XbaI將合成的基因連接于質(zhì)粒pVD88中，得到 PVD195。然后將pVD195以BglII消化，產(chǎn)生9297bp和2231bp的片段。將5，突出以Klenow 補(bǔ)齊，然后以SexAI消化。這可產(chǎn)生9297bp、1372和859bp的片段。然后分離859bp的片 段。通過以SpeI消化pVD165以得到14501bp的線性片段而生成所需的載體。將5’突出 以Klenow補(bǔ)齊，然后以SexAI消化，生成13600bp和901bp的片段。分離13600bp的片段。 然后將 859bp BglII (Klenow) * SexAI 片段連接至 pVD165 (SpeI (Klenow) * SexAI)，以生成 pVD194(見圖10)。以SexAI * XmaI進(jìn)行的對(duì)照消化應(yīng)產(chǎn)生13435bp和1029bp的片段。1. 1. 1. 10pVD84 的構(gòu)建為了將桿狀病毒表達(dá)載體 pFBAAVlVPmll (Urabe et al.，2002，Hum. Gene Ther. 13 =1935-1943)的起始位點(diǎn)從ACG轉(zhuǎn)換成GTG，使用如下引物進(jìn)行PCR 含BamHI位點(diǎn)的正向引物序列(AMT質(zhì)粒#169 ；SEQ ID NO 29)5，-TTAGGATCCTGTTA AGGTGGCTGCCGACGG-3’含StuI位點(diǎn)的反向引物序列(AMT質(zhì)粒#158 ；SEQ ID NO 30)5， -GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3‘
起始位點(diǎn)正向引物反向引物AMT質(zhì)粒# (Bac-toBac)AMT質(zhì)粒# (PSC)GTG169158pVD63pVD84使用引物#169和#158進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物(250bp)使用PCR純化試劑盒 (Qiagen Lot#11879372)純化并以限制性酶BamHI和StuI剪切。還將所述桿狀病毒表達(dá)載 體以BamHI和StuI消化。在以SAP(Promega Lot#17501504)將所述載體去磷酸化后，在凝 膠上同時(shí)純化插入物(具有GTG起始位點(diǎn)的Cap)和載體。在將載體和插入物連接之后，將 它們轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)DH5 α細(xì)胞(InvitrogenLot#1241753)并在含氨芐西林的LB板上 劃線。將PVD63 (Cap/GTG起始位點(diǎn))的DNA純化，并使用通過BaseClear和限制性進(jìn)行的 序列分析檢查特性。為了將具有GTG起始位點(diǎn)的Cap基因克隆到所述桿狀病毒表達(dá)載體 pPSCIO (Protein Sciences)中，將其以SmaI和AvrII從pVD63中剪切出，并連接至以EcoRV 和XbaI切開的去磷酸化表達(dá)載體中。隨后，將所述連接混合物轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)DHlO β
24細(xì)胞(invitrogenlot#1268527)中，并劃線于LB-氨芐西林板上。在使用QIApr印Spin 小量制備試劑盒(Qiagen lot#12180218)進(jìn)行小量制備DNA分離之后，通過以SphI的限 制性分析選擇一個(gè)小量制備(克隆#13)。將該克隆DNA(pVD84)以SNAP中型制備試劑盒 (Invitrogen溶液Lot#1256921和柱Lot#1259367)純化。通過對(duì)起始密碼子周圍序列分析 來檢查pVD84的特性，這通過BaseClear以及通過以BamHI和SphI的限制性分析進(jìn)行(SEQ ID NO 28)。1. 1. 1. 11重組桿狀病毒生產(chǎn)以 Protein Sciences System(Protein Sciences Corporation, Meriden, USA)產(chǎn)生重組 Bac. VD118(新)、Bac. VDl 18 (新)+HRl、Bac. VD165、Bac. VD165+HR1、Bac. VD165+4xEcRE CAP、Bac. VD165+4 * EcRE R印78、Bac. VD190 和 Bac. VD194 (pO)。通過將重組 桿狀病毒以1 100稀釋成2xl06SF+個(gè)細(xì)胞/ml對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。感染后3天，將細(xì)胞離心 并回收包含病毒的上清液。以相同的方式對(duì)后代進(jìn)行擴(kuò)增。1. 1.2rAAV 生產(chǎn)除了用兩種重組桿狀病毒代替3種外，依照Urabe et al.，2002 (見上文)產(chǎn)生成 批rAAV。一種桿狀病毒包含在CMV啟動(dòng)子控制之下并以AAV ITR為側(cè)翼的表達(dá)構(gòu)建體。另一 種桿狀病毒是包含兩個(gè)表達(dá)盒的R印-Cap桿狀病毒一個(gè)表達(dá)盒用于AAV復(fù)制基因，另一個(gè) 用于AAV殼體。在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的復(fù)制基因或殼體基因的表達(dá)通過將0. 001-luM 松甾酮ATonasterone Α)加入培養(yǎng)基中得到調(diào)節(jié)。以包含在CMV啟動(dòng)子控制之下的LPL 轉(zhuǎn)基因的桿狀病毒原種Bac. VD43p5以及不同世代的R印/Cap桿狀病毒(p3、p4或p5)進(jìn)行 不同的rAAVl生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。在每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將標(biāo)準(zhǔn)rAAVl生產(chǎn)(Bac. VD88 Bac. VD84 Bac. VD43之比為5 1 1)作為對(duì)照。1. 1. 3完整/總AAV顆粒確定為了確定完整殼體與總殼體的比，用基因組拷貝(gc)的量除以總AAV顆粒的 量。通過Q-PCR測(cè)定來測(cè)量gc/ml的量，以Progen的酶免疫測(cè)定來確定總AAV顆粒的 量(見下文)。對(duì)于Q-PCR反應(yīng)，依照生產(chǎn)商的說明書使用了 SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems, #4309155) (25 μ 1 總體積；PCR 程序10 分鐘 95°C,40 循環(huán)的 15 秒95°C和1分鐘60°C )，其中使用如下引物組之一pr59 AATGGGCGGTAGGCGTGTACMV SEQ ID NO 26pr60 AGGCGATCTGACGGTTCACTAA CMV SEQ ID NO 27該比例與如下的比例相當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)條件下使用5 1 1體積比的Bac. R印、 Bac. Cap和Bac. ITR得到的比例。1.1. 4蛋白質(zhì)印跡分析在rAAV生產(chǎn)后3天，通過加入0. IV IOx TRIS裂解緩沖液(1. 5麗aCl，0. 5M TRIS， 0. OlM MgCl, 1% TRITON X-100, ρΗ8. 5，濾器除菌)并在冰上孵育30分鐘裂解細(xì)胞。通過 在37°C下與Benzonase —起孵育15分鐘降解游離的DNA和RNA。離心細(xì)胞裂解物(1，900x g ；15分鐘；4°C )。將NuPAGE LDS樣品緩沖物(4x, Invitrogen)加入上清液樣品中，并上樣 至4-12% Bis-Tris凝膠(120V)。以10V將蛋白在PVDF膜(BioRad)上印跡30分鐘(半 干印跡(Semidryblotting))。通過以下方式進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫化學(xué)以Superblock-PBS封 閉緩沖液(PIERCE)封閉所述膜，隨后與小鼠抗R印抗體(303. 9，Progen, Germany ；稀釋度1 50)和兔抗小鼠——HRP(DAK0，稀釋度1 500)進(jìn)行孵育。通過以發(fā)光加蛋白質(zhì)印跡 底物(Roche)進(jìn)行的化學(xué)發(fā)光染色顯示R印蛋白。1. 1. 5 總 rAAVl 顆粒 ELISA每次生產(chǎn)中制備的rAAVl顆粒的總量(tp)以AAVl TitrationELISA試劑盒 (Progen,Heidelberg,Germany)確定，并且依照制造商提供的方案進(jìn)行，不同之處在于所有 樣品和對(duì)照均在粗裂解儲(chǔ)液(CLB)中預(yù)稀釋。簡(jiǎn)而言之，CLB通過以下方式制備在三天后 收集expressSF+細(xì)胞，加入IOX裂解緩沖液并在28°C下孵育1小時(shí)。在37°C下以Benzonase 處理1小時(shí)后，以1900g離心所述裂解物并將上清液在4°C下保存。為了確定每次生產(chǎn)的 粗裂解物中的總rAAVl顆粒，將所述樣品50倍預(yù)稀釋于CLB中，這是初始稀釋度。此后，在 CLB中進(jìn)行另外的250、1250和6250倍稀釋。標(biāo)準(zhǔn)種系也稀釋于CLB中。來自以Bac.VD190 生產(chǎn)的樣品僅稀釋50倍和100倍，因?yàn)闅んw蛋白的表達(dá)水平低。1.1.6使用HPLC的總顆粒分析將未知AAV-I原種注射進(jìn)入HPLC-系統(tǒng)，產(chǎn)生色譜圖中的峰?？捎肅hemstation 軟件對(duì)該峰積分，該峰代表注入的總顆粒的量。通過電子顯微鏡滴定每毫升濃縮AAV-I原 種的總顆粒的量，并設(shè)置于所述方法中。使用該標(biāo)準(zhǔn)物作為校準(zhǔn)物，可以計(jì)算未知的總顆粒 的量。另外，在注入標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的具體量的基因組拷貝時(shí)(這大致代表完整顆粒的量)，可 以估計(jì)完整顆粒和空殼顆粒的比值。1.2 結(jié)果在使用兩種桿狀病毒系統(tǒng)特別是在使用具有高Rep蛋白表達(dá)和中度Cap蛋白表達(dá) 的兩種桿狀病毒系統(tǒng)時(shí)，完整空殼AAV顆粒的比值增加詳細(xì)研究了3 種構(gòu)建體pVD165、pVD190 和 pVD194。為了對(duì)以Bac. VD165生產(chǎn)的rAAVl顆粒確定總體/完整比，在兩項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中確 定了總顆粒在粗裂解物中的濃度。這些ELISA的結(jié)果和相應(yīng)總體/完整比顯示于表1中。表1 以桿狀病毒原種Bac. VD165生產(chǎn)的rAAVl的總體/完整比。以總AAVl顆粒 ELISA確定總顆粒濃度。通過Q-PCR確定完整顆粒濃度?？傮w/完整比只能與同一實(shí)驗(yàn)中 生產(chǎn)的對(duì)照相對(duì)比。
Bac.VD165:總顆粒濃度完整顆粒農(nóng)度總體/完整比Bac.VD43(tp/ml)(gc/ml)(tp/gc)#1對(duì)照7.07E+122.05E+103451:14.91E+112.24E+092195:18.3E+115.0E+09166#2對(duì)照3.19E+131.99E+1016031:16.32E+116.33E+089985:11.30E+121.10E+091182 與對(duì)照相比，1 1生產(chǎn)的總體/完整比在兩實(shí)驗(yàn)中都增加1. 6倍。對(duì)于5 1的 生產(chǎn)，總體/完整比比對(duì)照好2. 1倍和1. 4倍。結(jié)論是，以Bac. VD165生產(chǎn)的rAAVl顆粒的總體/完整比增加。在Bac.VD190中，Cap表達(dá)盒在弱Δ IEl啟動(dòng)子的控制之下。這可能造成殼體的表 達(dá)低于以其他R印/Cap桿狀病毒進(jìn)行生產(chǎn)或者對(duì)照的情形，原因是所有這些條件下Cap表 達(dá)受強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。為了測(cè)試這種來自以Bac. VD190進(jìn)行的兩不同實(shí)驗(yàn)的假 設(shè)，確定了總顆粒濃度。結(jié)果顯示于表2中。表2 以桿狀病毒原種Bac. VD190生產(chǎn)的rAAVl的總體/完整比。以總AAVl顆粒 ELISA確定總顆粒濃度。通過Q-PCR確定完整顆粒濃度?？傮w/完整比只與同一實(shí)驗(yàn)中生 產(chǎn)的對(duì)照相對(duì)比。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組細(xì)小病毒病毒體的方法，所述方法包括步驟(a)提供包含一種或多種核酸構(gòu)建體的昆蟲細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含(i)包含轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列以至少一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核 苷酸序列為側(cè)翼；( )包含編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的第一表達(dá)盒，所述核苷酸序列可操作 地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述Rep蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第一啟動(dòng)子；(iii)包含編碼細(xì)小病毒殼體蛋白的核苷酸序列的第二表達(dá)盒，所述核苷酸序列可操 作地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述殼體蛋白在所述昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的第二啟動(dòng)子；(b)在有助于所述Rep和所述殼體蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)(a)中定義的細(xì)胞；和(c)任選地回收所述重組細(xì)小病毒病毒體；其中所述第一和第二表達(dá)盒存在于單個(gè)核酸構(gòu)建體上，并且其中所述第一和第二表達(dá) 盒在以等摩爾量存在于所述昆蟲細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生的編碼Rep蛋白的mRNA與編碼殼體蛋白的 mRNA的水平比至少為0. 5，該水平比通過在轉(zhuǎn)染后24和72小時(shí)之間的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行定量逆 轉(zhuǎn)錄PCR確定。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述R印與所述殼體蛋白的表達(dá)比受下列一種或多種因素 的調(diào)節(jié)(a)所述第一啟動(dòng)子與所述第二啟動(dòng)子一樣強(qiáng)，或者比所述第二啟動(dòng)子更強(qiáng)；(b)與所述第二表達(dá)盒相比，在所述第一表達(dá)盒中存在更多和/或更強(qiáng)的增強(qiáng)子元件；(c)與編碼所述殼體蛋白的核苷酸序列相比，編碼所述細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序 列具有更高的密碼子適應(yīng)指數(shù)；(d)所述細(xì)小病毒R印蛋白的溫度優(yōu)化；以及/或者(e)與相應(yīng)野生型Rep蛋白相比，氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)變化的變體Rep蛋白，其 中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸變化導(dǎo)致Rep功能活性的增加，這一點(diǎn)通過檢測(cè)在所述昆蟲細(xì)胞 的AAV生產(chǎn)的增加進(jìn)行評(píng)估。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中(iii)的核苷酸序列包含含編碼VP1、VP2和VP3殼體 蛋白的核苷酸序列的開放閱讀框。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含含編碼R印78和R印68蛋 白中至少一種的核苷酸序列的開放閱讀框。
5.權(quán)利要求4的方法，其中(ii)的核苷酸序列僅包含一個(gè)含編碼R印78和R印68蛋白 中至少一種的核苷酸序列的開放閱讀框。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中包含編碼VP1、VP2和VP3殼體蛋白的核苷酸序列 的至少一個(gè)開放閱讀框或者包含含編碼R印78和Rep68蛋白中至少一種的核苷酸序列的開 放閱讀框的至少一個(gè)開放閱讀框不包含人工內(nèi)含子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中包含編碼VP1、VP2和VP3殼體蛋白的核苷酸序列的開放閱 讀框并且/或者包含含編碼Rep78和Rep68蛋白中至少一種的核苷酸序列的開放閱讀框不 包含人工內(nèi)含子。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述第一啟動(dòng)子或所述第二啟動(dòng)子選自PolH啟 動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子、堿性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、El啟動(dòng)子或ΔΕ1啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第一啟動(dòng)子選自PolH啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子或堿性啟動(dòng)子，且其中所述第二啟動(dòng)子為ΔΕ1啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述第一表達(dá)盒包含至少一個(gè)桿狀病毒增強(qiáng)子 元件和/或至少一個(gè)蛻皮激素應(yīng)答元件。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述增強(qiáng)子元件選自hrl、hr2、hr3、hr4*hr5。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)小病毒ITR序列、細(xì)小病毒Rep蛋白和/ 或細(xì)小病毒Cap蛋白來自腺伴隨病毒(AAV)。
13.一種包含權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)中定義的第一和第二表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體，其中(a)所述第一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子或4xHsp27ECRE+最 小Hsp70啟動(dòng)子；(b)所述第一啟動(dòng)子為4xHsp27ECRE+最小Hsp70啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子；(c)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子、ΔEl啟動(dòng)子或El 啟動(dòng)子；(d)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為△El啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子；(e)所述第一啟動(dòng)子為PlO啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為△El啟動(dòng)子或El啟動(dòng)子；或者(f)所述第一啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子為PolH啟動(dòng)子； 并且其中所述第一表達(dá)盒任選地包含增強(qiáng)子元件。
14.一種如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)中定義的昆蟲細(xì)胞。
15.一種試劑盒，其包含(a)包含權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)中定義的第一和第二表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體；以及(b)包含編碼轉(zhuǎn)基因多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核苷酸序列以至少 一條細(xì)小病毒末端反向重復(fù)核苷酸序列為側(cè)翼，所述轉(zhuǎn)基因可操作地連接于能夠驅(qū)動(dòng)所述 轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組細(xì)小病毒病毒體在昆蟲細(xì)胞中的改進(jìn)生產(chǎn)。具體而言，本發(fā)明涉及在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組細(xì)小病毒病毒體的改進(jìn)方法，其中所述完整/空殼細(xì)小病毒病毒體的比值增加。本發(fā)明還涉及可用于基因治療的細(xì)小病毒載體的生產(chǎn)，并涉及提高細(xì)小病毒載體生產(chǎn)力的病毒Rep蛋白表達(dá)的改進(jìn)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102007209SQ200980113571
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月19日
發(fā)明者A·C·巴克爾, W·T·J·M·C·赫爾門斯, Y·諾爾得曼 申請(qǐng)人:阿姆斯特丹分子治療(Amt)股份有限公司