專利名稱：氮應(yīng)答性早期根瘤素基因的制作方法
氮應(yīng)答性早期根瘤素基因相關(guān)申請的交叉引用本申請要求提交于2008年9月25日的美國臨時(shí)專利申請No. 61/099，％4的優(yōu)先權(quán)，將其整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及調(diào)節(jié)植物特征(例如氮使用效率(NUE))的組合物及方法。背景技術(shù)：
在下一個50年內(nèi)，由多種因素(包括增加的人群，每人使用的作物的增加，及許多環(huán)境問題)的組合將對世界作物生產(chǎn)產(chǎn)生顯著壓力。給定當(dāng)前趨勢，在此時(shí)期將必要大致雙倍世界產(chǎn)率，及付出顯著的努力應(yīng)對此經(jīng)濟(jì)上及環(huán)境上可持續(xù)的樣式的挑戰(zhàn)(Rothstein SJ Plant Cell 2007,19 =2695-2699) 0氮是植物生長的必要的元素，及被認(rèn)為是水缺乏后植物產(chǎn)率的主要控制因子(Lea PJ, Morot-Gaudry J-F Plant nitrogen, 2001, Springer, Berlin London)。高產(chǎn)率作物的產(chǎn)率相關(guān)于大量的氮肥料的應(yīng)用。這些大的氮輸入目前被估計(jì)在90百萬公噸，及成為世界作物產(chǎn)生的主要成本(Frink CR, et ah, PNAS 1999,96 1175-1180)。但是，合并入農(nóng)業(yè)作物的氮罕見超過施加的氮的40%，表明氮利用中嚴(yán)重的 ^ (Raun WR, Johnson GV Agronomy Journal 1999,91 :357-363 ；Glass ADM Critical Reviews in Plant Sciences 2003，22 :453-470)。因此，有開發(fā)有改善的氮使用效率(NUE) 的作物的緊急需要。植物生命循環(huán)中有氮使用的2個主要階段。第一是植物性階段，當(dāng)多數(shù)涉及氮同化時(shí)。第二是繁殖階段，當(dāng)涉及氮同化及再活動時(shí)。在測量NUE中，已經(jīng)數(shù)年開發(fā)出幾種定義及評估方法，那些之一是生物質(zhì)或谷粒產(chǎn)率對比供給的氮量(Good AG, et al, Trends Plant Sci2004,9 :597-605)。一般而言，此NUE可進(jìn)一步分為2部分，一種是同化效率，及其他是利用效率。為評定植物對氮的應(yīng)答的分子基礎(chǔ)及為鑒定氮-應(yīng)答性基因，幾個氮應(yīng)答的研究已采用擬南芥的微陣列基因表達(dá)譜(Wang R，et al.，Plant Cell 2000，12 1491-1509 ; Wang RC, et al. ， Plant Physiology2003,132 :556-567 ；Price J, et al. ， Plant Cell 2004,16 :2128-2150 ；Scheible WR,et al. ,Plant Physiology 2004,136 :2483-2499)。其他研究研究了在慢性氮應(yīng)激下的擬南芥的氮-應(yīng)答性基因，以及該基因的短及長期氮利用度增加后瞬時(shí)的轉(zhuǎn)錄變化(Bi YM, et al.，BMCGenomics 2007,8 :281)。而且，將用于擬南芥的指定的氮土壤生長系統(tǒng)(Bi YM, et al.，Plant Journal 2005,44 :680-692)用于分離 NLA基因，其控制擬南芥對氮限制的適應(yīng)性，及用于鑒定涉及氮應(yīng)答的額外的基因(Peng Μ, et al. ,Plant J 2007' ,50 :320-337 ；Peng MS，et al. ,Plant Molecular Biology 2007， 65 :775-797)。也已在番茄根(Wang YH, et al. ,Plant Physiol 2001,127 :345-359)及稻幼苗(Lian X，et al. ,Plant Mol Biol 2006,60 :617-631)中進(jìn)行對氮-應(yīng)答性基因的研
盡管已從以上研究鑒定許多氮-應(yīng)答性基因，至于如何使用此知識來操作基因表達(dá)以使植物更有效使用氮的報(bào)道一直以來缺少。為應(yīng)對此需要，本發(fā)明提供氮應(yīng)答性早期根瘤素基因(L0C_0s06g05010)，稱為0sEN0D93，及過表達(dá)此氮應(yīng)答性早期根瘤素基因的植物，其顯示增加的NUE，包括增加的籽產(chǎn)率，應(yīng)激耐受性，硝酸鹽水平及氨基酸水平。也提供制備所述植物的方法，或者，使用氮應(yīng)答性早期根瘤素基因的活化劑模擬過表達(dá)表型的方法。仍還提供了在公開的方法中有用的分離的核酸及蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的0sEN0D93核酸及蛋白，表達(dá)公開的核酸的載體及細(xì)胞，及特異性地結(jié)合公開的蛋白的抗體。本發(fā)明的代表性的0sEN0D93核酸包括如下核酸，所述核酸包括(a) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO=I的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸；(c) SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；(d)與SEQ ID NO :2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸；(e)核苷酸序列，其編碼包括SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白；及(f)互補(bǔ)于(a) (e)的核酸的核苷酸序列。附加地， 本發(fā)明的代表性的0sEN0D93核酸包括如下核酸，所述核酸包括(a)至少為80%同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)至少為80%同于SEQ ID NO 2的核苷酸序列；及，(c)編碼包括至少為80%同于SEQ ID N0:3的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的代表性的0sEN0D93蛋白包括如下蛋白，所述蛋白包括(a)至少80%同于SEQ ID NO 3的氨基酸序列；及(b)SEQ ID NO 3的氨基酸序列。也提供0sEN0D93過表達(dá)植物，包括單子葉及雙子葉植物，及使用本文中公開的0sEN0D93基因的核苷酸序列產(chǎn)生所述植物的方法。0sEN0D93植物的特征在于增加的 0sEN0D93的表達(dá)及增加的氮使用效率。還提供了鑒定0sEN0D93結(jié)合劑及活化劑的方法。在本發(fā)明的一方面，方法可包括(a)提供0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┰趯τ诮Y(jié)合而言足夠的條件下接觸；(c)測定測試試劑與分離的0sEN0D93蛋白的結(jié)合；及(d)選擇展示特異性結(jié)合0sEN0D93蛋白的測試試劑。在本發(fā)明的另一方面，方法可包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93蛋白的細(xì)胞；(b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定 0sEN0D93基因的表達(dá)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)基因的升高的表達(dá)的測試試劑。在本發(fā)明的另一方面，方法可包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93蛋白的植物；(b) 使植物與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定植物的硝酸鹽含量，氮攝取，側(cè)根生長，氨基酸含量，籽產(chǎn)率，或生物質(zhì)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)增加的硝酸鹽含量，增加的硝酸鹽攝取，增加的側(cè)根生長，籽產(chǎn)率，和/或增加的生物質(zhì)的測試試齊Ll。仍還提供了鑒定植物的0sEN0D93的增強(qiáng)劑的方法包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93 蛋白的細(xì)胞；(b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定0sEN0D93靶基因的表達(dá)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)基因的升高的表達(dá)的測試試劑，該基因正常經(jīng)歷0sEN0D93誘導(dǎo)。在本發(fā)明的另一方面，方法可包括(a)提供表達(dá) 0sEN0D93蛋白的植物；(b)使植物與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定植物的硝酸鹽含量，氮攝取，側(cè)根生長，氨基酸含量，籽產(chǎn)率，或生物質(zhì)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)增加的硝酸鹽含量，增加的硝酸鹽攝取，增加的側(cè)根生長，籽產(chǎn)率，和/或增加的生物質(zhì)的測試試劑。也提供使用根據(jù)本文中公開的方法鑒定的0sEN0D93結(jié)合劑及活化劑改良植物產(chǎn)率的方法。

圖IA顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的平均芽干重 (士 SD，η = 3 5)。圖IB顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的平均根干重 (士 SD，η = 3 5)。圖IC顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的如以干重所測的平均芽根比(士SD，n = 3 5)。圖ID顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的平均葉綠素含量(士 SD，n = 3 幻，表示為mg/g(鮮重)植物。圖IE顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的平均花青苷含量(士SD，η = 3 5)，表示為單元/g (鮮重)植物。圖2A顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的芽中的平均硝酸鹽含量(士 SD，n = 3 幻，表示為mg/g (鮮重)植物。圖2B顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的根中的平均硝酸鹽含量(士 SD，n = 3 幻，表示為mg/g (鮮重)植物。圖2C顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的芽中的平均總氨基酸(士 SD，n = 3 5)，表示為ymol mol/g (鮮重)植物。圖2D顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的根中的平均總氨基酸(士 SD，n = 3 5)，表示為ymol mol/g (鮮重)植物。圖2E顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的芽中的平均總可溶性蛋白(士 SD，n = 3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖2F顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的根中的平均總可溶性蛋白(士 SD，n = 3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖2G顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物中的芽中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示為植物干重的百分率。圖2Η顯示在lmM，5mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中的根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示為植物干重的百分率。圖3Α顯示在ImM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物及在ImM硝酸鹽中生長觀天、 然后是在IOmM硝酸鹽中生長2小時(shí)(誘導(dǎo))的植物中芽中的平均硝酸鹽含量(士SD，η = 3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖;3B顯示在ImM硝酸鹽中生長28天的野生型植物及在ImM硝酸鹽中生長28天、 然后是在IOmM硝酸鹽中生長2小時(shí)(誘導(dǎo))的植物中根中的平均硝酸鹽含量(士SD，η = 3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖3C顯示在IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物及在IOmM硝酸鹽中生長觀天、然后是在ImM硝酸鹽中生長2小時(shí)(降低)的植物中芽中的平均硝酸鹽含量(士SD，η=3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖3D顯示在IOmM硝酸鹽中生長28天的野生型植物及在IOmM硝酸鹽中生長28 天、然后是在ImM硝酸鹽中生長2小時(shí)(降低)的植物中根中的平均硝酸鹽含量(士SD，η =3 5)，表示為mg/g (鮮重)植物。圖4A顯示在IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物及在IOmM硝酸鹽中生長觀天，在ImM硝酸鹽中生長觀天，在IOmM硝酸鹽中、然后是在ImM硝酸鹽中生長2小時(shí)(降低)及在ImM硝酸鹽中28天然后是在IOmM硝酸鹽中2小時(shí)的植物中如通過微陣列表達(dá)分析測定的根中的0sEN0D93的相對轉(zhuǎn)錄物豐度。圖4B顯示在不同的生長階段及在野生型稻植物的不同的植物部分中0sEN0D93基因的表達(dá)。圖4C顯示在ImM硝酸鹽及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物中如使用肌動蛋白作為內(nèi)部對照通過定量實(shí)時(shí)PCR測定的芽及根中的0sEN0D93基因的相對表達(dá)水平。將表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為在ImM硝酸鹽中生長的野生型芽。圖4D顯示在ImM硝酸鹽及IOmM硝酸鹽中生長觀天的過表達(dá)0sEN0D93基因的轉(zhuǎn)基因植物中芽及根中如使用肌動蛋白作為內(nèi)部對照通過定量實(shí)時(shí)PCR測定的0sEN0D93基因的相對表達(dá)水平。將表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為在ImM硝酸鹽中生長的野生型芽。圖5A顯示在lmM，3mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物及過表達(dá)0sEN0D93 基因的轉(zhuǎn)基因植物中根中的平均總氨基酸(士 SD，n = 3 Q，表示為μπιο mol/g(鮮重) 植物。圖5B顯示在ImM，3mM及IOmM硝酸鹽中生長觀天的野生型植物及過表達(dá)0sEN0D93 基因的轉(zhuǎn)基因植物中根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示為植物干重的百分率。圖5C顯示在3mM及IOmM硝酸鹽中生長60天的野生型植物及過表達(dá)0sEN0D93基因的轉(zhuǎn)基因植物中根中的平均總氨基酸(士SD，n = 3 5)，表示為μ mol/g(鮮重)植物。圖5D顯示在3mM及IOmM硝酸鹽中生長60天的野生型植物及過表達(dá)0sEN0D93基因的轉(zhuǎn)基因植物中根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示為植物干重的百分率。圖6顯示0sEN0D93基因的基因組序列(SEQ ID NO :1)。圖 6B 顯示 0sEN0D93 基因的 cDNA 序列(SEQ ID NO :2)。圖6C顯示由0sEN0D93基因編碼的蛋白的預(yù)測的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。圖6D顯示0sEN0D93的基因組序列之內(nèi)的3個外顯子(有下劃線的)及2個內(nèi)含子的位置。圖6E顯示以氨基酸序列的0sEN0D93結(jié)構(gòu)域(有下劃線的)。圖7顯示在ImM，3mM,及IOmM硝酸鹽生長28天的野生型及過表達(dá)0sEN0D93基因的轉(zhuǎn)基因稻植物中木質(zhì)部汁液中的總氨基酸(士SD，η = 3 5)，表示為ymol/ml的木質(zhì)部汁液。有不同字母的條表示以P < 0. 05的顯著的差異(Fisher' s保護(hù)的最小顯著差異測試)。發(fā)明詳述I.OsENOD93核酸及蛋白本發(fā)明提供0sEN0D93核酸及蛋白，其變體，及其活化劑。之前描述的核酸及蛋白未教導(dǎo)如何使用用于促進(jìn)植物的氮使用效率的分子，如本文公開。
代表性的0sEN0D93核酸如SEQ ID NO 1所示，其編碼代表性的SEQ ID NO :3的 0sEN0D93蛋白。被本發(fā)明含蓋的0sEN0D93變體包括具有0sEN0D93活性的變體蛋白。在豆科植物中，早期根瘤素(ENOD)基因在根瘤發(fā)育期間表達(dá)及可介導(dǎo)根瘤器官發(fā)生(Mylona等人，1995年)。但是也已假定ENOD基因的差異作用。EN0D40顯示在根瘤起始的早期階段期間表達(dá)(Kouchi及Hata，1993年；Yang等人，1993年)及其蛋白可涉及皮質(zhì)細(xì)胞分裂(Charon等人1997)，維管束分化(Kouchi等人，1999年)及也可能在轉(zhuǎn)運(yùn)光合產(chǎn)物中作用(Kouchi及Hata, 1993年；Yang等人，1993年)。類似地，GmEN0D93的表達(dá)已見于大豆根瘤(Kouchi及Hata，1993年)及其在稻0sEN0D93a中具有同源物(Reddy等人， 1998年)，盡管其功能尚未表征。稻中本發(fā)明的0sEN0D93基因的同源性檢索表明有至少5 種具有EN0D93結(jié)構(gòu)域的家族的基因，及本發(fā)明的0sEN0D93基因編碼與0sEN0D93a具有大致98 %氨基酸序列同一性的蛋白。本發(fā)明的0sEN0D93基因由3個外顯子及2個內(nèi)含子構(gòu)成，及編碼有分子量 12424Da及10. 95的pi的116個氨基酸的蛋白(圖6C E及表6)。I.A. 0sEN0D93 核酸核酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及單鏈，雙鏈，或三鏈形式的聚合物。除非特別限制，術(shù)語含蓋含已知的與參照天然核酸具有類似性質(zhì)的天然的核苷酸的類似物的核酸。術(shù)語核酸分子或核酸也可代替基因，cDNA，mRNA，或cRNA使用。核酸可合成，或可源于任何生物來源，包括任何生物。本發(fā)明的代表性的核酸包括SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核苷酸序列及編碼有基本上相同的活性的0sEN0D93蛋白的基本上相同的序列，例如，至少50%同于SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2的序列，例如至少55%相同的；或至少60%相同的；或至少65%相同的；例如至少70%相同的；或至少75%相同的；或至少80%相同的；或至少85%相同的； 或至少90%相同的，或如至少91%相同的；或至少92%相同的；或至少93%相同的；或至少94%相同的；或至少95%相同的；或至少96%相同的；或至少97%相同的；或至少98% 相同的；或至少99%相同的序列。如本文以下所述，使用SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2的全長序列作為查詢序列，使用序列比較算法，或通過視覺觀察比較序列的最大對應(yīng)?；旧舷嗤男蛄锌蔀槎鄳B(tài)序列，即，群中的替代性序列或等位基因。等位基因差異可小至1個堿基對?；旧舷嗤男蛄幸部砂ń?jīng)誘變的序列，包括包含沉默突變的序列。突變可包括一或多個殘基變化，缺失一或多個殘基，或插入一或多個額外的殘基?；旧舷嗤暮怂嵋茶b定為與SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2的全長在嚴(yán)格條件下特異性地雜交或基本上雜交的核酸。在核酸雜交中，比較的2個核酸序列可指探針及靶。 探針是參照核酸分子，及靶是測試核酸分子，常發(fā)現(xiàn)于核酸分子的異質(zhì)的群之內(nèi)。靶序列與測試序列同義。用于雜交研究或測定的特定核苷酸序列包括與本發(fā)明的核酸分子的至少約14 40個核苷酸序列互補(bǔ)的探針序列。優(yōu)選地，探針包括14 20個核苷酸，或如果需要甚至更長,例如 30，40，50，60，100，200，300，或 500 個核苷酸或達(dá) SEQ ID NO :1，或 SEQ ID NO 2 的全長。所述片段可容易制備，例如通過片段的化學(xué)合成，通過應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)，或通過將選定的序列導(dǎo)入用于重組產(chǎn)生的重組載體。
特異性雜交指當(dāng)序列存在于復(fù)雜的核酸混合物(例如，總細(xì)胞DNA或RNA)中時(shí)， 分子僅與特定核苷酸序列在嚴(yán)格條件下結(jié)合，成雙鏈，或雜交。特異性雜交可內(nèi)藏探針及靶序列之間的錯配，取決于雜交條件的嚴(yán)格度。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)(例如DNA印跡和RNA印跡分析)中，嚴(yán)格雜交條件及嚴(yán)格雜交洗滌條件是序列-及環(huán)境-依賴性的。更長序列在更高溫度特異性地雜交。對核酸雜交的更多指導(dǎo)見于 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，1993 年，部分 1、第 2 章，Elsevier, 紐約，紐約。一般而言，高度嚴(yán)格雜交及洗滌條件選擇為以指定的離子強(qiáng)度及PH比特異性序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約低5°C。一般而言，在嚴(yán)格條件下探針將與其靶亞序列，但非其他序列特異性地雜交。Tm是50%的靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在指定的離子強(qiáng)度及pH下)。 非常嚴(yán)格條件選擇為等于特定探針的Tm。用于具有多于約100個互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的 DNA或RNA印跡分析的嚴(yán)格雜交條件之一例是在有Img的肝素的50%甲酰胺中于42°C過夜雜交。高度嚴(yán)格洗滌條件之一例是在0. IX鹽水-檸檬酸鈉(SSC)中于65°C 15分鐘。 嚴(yán)格洗滌條件之一例是在0. 2XSSC緩沖液中于65°C 15分鐘。有關(guān)SSC緩沖液的描述見 Sambrook et al. , eds. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。常常，在高嚴(yán)格度洗滌之前先通過低嚴(yán)格度洗滌去除背景探針信號。多于約100個核苷酸的雙鏈體的介質(zhì)嚴(yán)格度洗滌條件之一例是在IX SSC中于45°C 15分鐘。多于約100個核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格度洗滌之一例是在4X 6XSSC中于40°C 15分鐘。對于短探針(例如，約10 50個核苷酸)，嚴(yán)格條件一般涉及在PH 7. 0 8. 3的小于約IM Na+離子的鹽濃度，一般約0. 01 IM Na+ 離子濃度(或其他鹽)，及一般至少為約30°C的溫度。嚴(yán)格條件也可用添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來實(shí)現(xiàn)。一般而言，與在特定雜交測定中從不相關(guān)的探針觀察到的信噪比相比 2倍(或更高)的信噪比表示特異性雜交的檢測。以下是可用于鑒定基本上同于本發(fā)明的參照核苷酸序列的核苷酸序列的雜交及洗滌條件之例探針核苷酸序列優(yōu)選在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0. 5M NaPO4, ImM EDTA 中于50°C與靶核苷酸序列雜交，然后是在2XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗滌；更優(yōu)選地，探針和靶序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4, ImM EDTA中于50°C雜交，然后是在 1XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗滌；更優(yōu)選地，探針及靶序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)， 0. 5M NaPO4, ImMEDTA中于50°C雜交，然后是在0.5X SSC，0. 1% SDS中于50°C洗滌；更優(yōu)選地，探針及靶序列在十二烷基硫酸鈉(SDS)，0. 5M NaPO4, ImM EDTA中于50°C雜交，然后是在0. 1XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗滌；更優(yōu)選地，探針及靶序列在7%十二烷基硫酸鈉 (SDS) ,0. 5MNaP04, ImM EDTA 中于 50°C雜交，然后是在 0. 1XSSC，0. 1 % SDS T 65°C洗滌。2個核酸序列基本上相同的其他指標(biāo)是由核酸編碼的蛋白基本上相同，共享總體3-維結(jié)構(gòu)，或是生物學(xué)有功能的相當(dāng)體。這些術(shù)語在本文中以下進(jìn)一步定義。不在嚴(yán)格條件下彼此雜交的核酸分子，如果相應(yīng)蛋白基本上相同，則仍基本上相同。此可發(fā)生，例如， 當(dāng)2個核苷酸序列包括如被遺傳密碼允許的保守地取代的變體時(shí)。術(shù)語保守地取代的變體指具有簡并密碼子取代的核酸序列，其中一或多個選定的(或全部)密碼子的第三位置用混合的-堿基和/或脫氧肌苷殘基取代。見Batzeret al.，Nucleic Acids Res.，1991，19 :5081 ；Ohtsuka et al.，J. Biol. Chem.，1985，260 2605-2608 ；and Rossolini etal. Mol. Cell Probes, 1994，8 :91_98。本發(fā)明的核酸也包括互補(bǔ)于SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核酸?；パa(bǔ)序列是包括在堿基對之間氫鍵形成之時(shí)能與另一個配對的反平行核苷酸序列的2個核苷酸序列。本文中的術(shù)語互補(bǔ)序列指基本上互補(bǔ)的核苷酸序列，如可通過以下所示相同的核苷酸比較方法評定，或定義為能與目標(biāo)核酸段在相對嚴(yán)格條件下雜交，例如本文所述的那些?；パa(bǔ)核酸段的特定實(shí)施例是反義寡核苷酸。本發(fā)明的核酸也包括SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核酸，其表達(dá)已在不同于植物的生物中改變，以解釋植物與其他生物之間的密碼子利用的差異。例如，植物中的特異性密碼子利用不同于某些微生物中的特異性密碼子利用?？寺〉奈⑸颫RF之內(nèi)的密碼子利用與植物基因(及尤其是來自靶植物的基因)中的利用的比較將致使鑒定應(yīng)特異性地變化的ORF之內(nèi)的密碼子。一般植物進(jìn)化趨向于在單子葉植物的第三堿基位置強(qiáng)偏好核苷酸C 及G，然而雙子葉植物在此位置常使用核苷酸A或T。通過修飾基因來合并用于特定靶轉(zhuǎn)基因物種的特異性密碼子利用，將克服以下描述的就GC/AT含量及非常規(guī)剪接的許多問題。植物基因一般具有多于35%的GC含量。富含A及T核苷酸的ORF序列可在植物中導(dǎo)致幾個問題。首先，ATTTA基序被認(rèn)為導(dǎo)致信使RNA的去穩(wěn)定，及見于許多短-壽命的 mRNAs的3'端。其次，多聚腺苷酸化信號(例如AATAAA)在信使RNA之內(nèi)的不適當(dāng)?shù)奈恢贸霈F(xiàn)被認(rèn)為導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的成熟前截短。此外，單子葉植物可識別富AT序列作為剪接位點(diǎn)(見以下)。術(shù)語亞序列指包括部分更長核酸序列的核酸序列。例示亞序列是本文以上所述的探針或引物。本文所用的術(shù)語引物指包括選定的核酸分子的約8或更多脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優(yōu)選10 20個核苷酸，及更優(yōu)選20 30個核苷酸的連續(xù)的序列。本發(fā)明的引物含蓋足夠的長度及適當(dāng)?shù)男蛄械墓押塑账?，以提供本發(fā)明的核酸分子上的聚合起始。本發(fā)明的代表性的核酸也包括基本上由SEQ ID NO :1及SEQ IDNO :2構(gòu)成的核酸， 由于核酸從可正常結(jié)合所述核酸的額外的核苷酸序列分離及不含可正常結(jié)合所述核酸的額外的核苷酸序列。附加地，本發(fā)明的核酸可在整個植物中表達(dá)，或可在植物的特定部分區(qū)別表達(dá)。而且，本發(fā)明的核酸可在貫穿植物發(fā)育的不同的時(shí)間(例如植物發(fā)育的繁殖階段或植物性階段期間)(例如，圖4B中指定的發(fā)育階段及植物部分)表達(dá)。本發(fā)明也提供包括公開的核酸的載體，包括用于重組表達(dá)的載體，其中本發(fā)明的核酸運(yùn)作性連接到有功能的啟動子。當(dāng)運(yùn)作性連接到核酸時(shí)，啟動子與核酸功能性組合，以至于通過啟動子區(qū)控制及調(diào)節(jié)核酸轉(zhuǎn)錄。載體指能在宿主細(xì)胞，例如質(zhì)粒，粘粒，及病毒載體中復(fù)制的核酸。本發(fā)明的核酸可克隆，合成，改變，經(jīng)誘變，或其組合。用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組 DNA及分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所知。位點(diǎn)-特異性誘變創(chuàng)建堿基對變化，缺失，或小的插入子也為本領(lǐng)域所知。見例如，Sambrook et al. (eds. )Molecular Cloning :A Laboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ； Silhavy et al. ,Experiments with Gene Fusions,1984,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ；Glover&Hames, DNA Cloning :A Practical Approach,2nd ed. ,1995, IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York ；
10Ausubel (ed. ) Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed. , 1995, Wiley, New York。在本發(fā)明的另一方面，提供檢測編碼0sEN0D93蛋白的核酸分子的方法。所述方法可用于檢測0sEN0D93基因變體或改變的基因表達(dá)。通過本發(fā)明的方法檢測的序列可檢測， 亞克隆，測序，及通過本領(lǐng)域中熟知的任何測量使用通常應(yīng)用到特異性DNA序列檢測的任何方法進(jìn)一步評估。由此，本發(fā)明的核酸可用于克隆包括公開的序列的基因及基因組DNA。 或者，本發(fā)明的核酸可用于克隆相關(guān)的序列的基因及基因組DNA。0sEN0D93核酸分子的水平可測量，例如，使用 RT-PCR 測定。見 Chiang，J. Chromatogr. A. ,1998,806 :209_218，及該文引用的參考文獻(xiàn)。在本發(fā)明的另一方面，可進(jìn)行使用0sEND093核酸的遺傳測定用于定量特性座位 (QTL)分析及篩選遺傳變體，例如通過等位基因-特異性寡核苷酸(ASO)探針分析(Conner et al.，Proc. Natl. Acad. ScLUSA, 1983,80(1) :278-282)，寡核苷酸結(jié)扎測定(OLAs) (Nickerson et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1990,87(22) :8923-8927)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1989,86(8) :2766-2770)，SSCP/ 異源雙鏈體分析，酶錯配切割，擴(kuò)增的外顯子的直接序列分析(Kestila et al. ,Mol. Cell, 1998，1 (4) :575-582 ；Yuanet al.，Hum. Mutat.，1999，14 (5) :440-446)，等位基因-特異性雜交(Stoneking et al.，Am. J. Hum. Genet. , 1991,48(2) :370-382)，及含特異性突變的擴(kuò)增的基因組DNA的限制性分析。也可將自動化的方法應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性的大規(guī)模表征(Wang et al.，Am. J. Physiol, 1998, 274 (4Pt 2) :H1132-1140 ；Brookes, Gene, 1999， 234(2) :177-186)。優(yōu)選的檢測方法是非-電泳，包括，例如，TAQMAN 等位基因區(qū)別測定， PCR-OLA,分子信標(biāo)，閉鎖探針，及良好熒光。見Landegren等人，Genome Res.，1998年，8 769 776及該文引用的參考文獻(xiàn)。I.B. 0sEN0D93 蛋白本發(fā)明也提供分離的0sEN0D93多肽。多肽及蛋白各指由通過肽鍵連接的氨基酸單鏈構(gòu)成的化合物。代表性的0sEN0D93多肽如SEQID NO :3所示。本發(fā)明的額外的多肽包括有基本上相同的活性的0sEN0D93蛋白，例如，至少50%同于SEQ ID NO :3，例如至少
相同的；或至少60%相同的；或至少65%相同的；例如至少70%相同的；或至少75% 相同的；或至少80%相同的；或至少85%相同的；或至少90%相同的，或如至少91%相同的；或至少92%相同的；或至少93%相同的；或至少94%相同的；或至少95%相同的；或至少96 %相同的；或至少97 %相同的；或至少98 %相同的；或至少99 %相同的序列。如本文以下所述使用SEQ ID NO :3的全長序列作為查詢序列，使用序列比較算法或通過視覺觀察比較序列的最大對應(yīng)。本發(fā)明的代表性的蛋白也包括基本上由SEQ ID NO :3構(gòu)成的多肽， 由于多肽從可正常結(jié)合所述多肽額外的氨基酸序列分離及不含可正常結(jié)合所述多肽額外的氨基酸序列。本發(fā)明還含蓋由本文中公開的任一核酸編碼的多肽。本發(fā)明的多肽可包括天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，遺傳編碼的氨基酸， 非-遺傳編碼的氨基酸，及其組合。多肽可兼包括L-型及D-型氨基酸。代表性的非-遺傳編碼的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸； β -氨基丙酸；2-氨基丁酸；A-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2，4- 二氨基丁酸；鎖鏈素；2，2’ - 二氨基庚二酸；2， 3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥基賴氨酸；別-羥基賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈素；別-異亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基異亮氨酸； N-甲基纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；及鳥氨酸。代表性的衍生的氨基酸包括，例如，游離的氨基已衍生而形成胺鹽酸鹽，ρ-甲苯磺?；?，芐氧羰基，t_叔丁氧羥基，氯乙?；蚣柞；姆肿?。游離的羧基可經(jīng)衍生而形成鹽， 甲基及乙基酯或其他類型的酯或酰胼。游離的羥基可經(jīng)衍生而形成0-?；?-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可衍生而形成N-內(nèi)-芐基組氨酸。本發(fā)明也提供0sEN0D93多肽的功能片段，例如，具有類似于全長0sEN0D93蛋白的活性的片段。也提供長于公開的序列的有功能的多肽序列。例如，可將一或多個氨基酸加入多肽N-端或C-端?？稍诟鞣N應(yīng)用中采用所述額外的氨基酸，包括但不限于純化應(yīng)用。制備延長的蛋白的方法為本領(lǐng)域所知。本發(fā)明的0sEN0D93蛋白包括如下蛋白，所述蛋白包括是SEQID NO 3的保守地取代的變體的氨基酸。保守地取代的變體指包括一或多個殘基被功能性類似殘基保守取代的氨基酸的多肽。保守置換之例包括一個非-極性(疏水)殘基(例如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸)用另一非-極性(疏水)殘基置換；一個極性(親水)殘基用另一極性(親水)殘基置換，例如在精氨酸和賴氨酸之間，在谷氨酰胺和天冬酰胺之間，在甘氨酸和絲氨酸之間；一個堿性殘基(例如賴氨酸，精氨酸或組氨酸)用另一堿性殘基置換；或一個酸性殘基(例如天冬氨酸或谷氨酸)用另一酸性殘基置換。本發(fā)明的分離的多肽可使用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化及表征。 見例如，Schroder et al.，The Peptides，1965，Academic Press，New York ；Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis,2nd rev.ed.1993， Springer-Verlag, Berlin/New York ；Ausubel (ed.), Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed. ,1995,Wiley,New York。本發(fā)明還提供檢測0sEN0D93多肽的方法?？墒褂霉珟缘姆椒?，例如，測定改變的 0sEN0D93蛋白的水平，例如，誘導(dǎo)的0sEN0D93蛋白的水平。例如，方法可涉及與特異性地識別0sEN0D93蛋白的抗體進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng)。檢測所述抗體-抗原綴合物或復(fù)合物的技術(shù)為本領(lǐng)域所知，及包括但不限于離心，親和層析及其他免疫化學(xué)方法° 見例如，Ishikawa Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, 1999, Elsevier, Amsterdam/New York, United States of America ；Law, Immunoassay :A Practical Guide,1996, Taylor&Francis, London/Bristol, Pennsylvania,United States of America ；Liddell et al. ,Antibody Technology,1995,Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom ；及該文引用的參考文獻(xiàn)。Ι·C.核苷酸及氨基酸序列比較在2個或更多核苷酸或蛋白序列中的術(shù)語相同的或百分率同一性，指當(dāng)比較及比對最大對應(yīng)(如使用本文中公開的序列比較算法或通過視覺觀察之一所測)時(shí)，相同或具有指定的百分率的相同的氨基酸殘基或核苷酸的2個或更多序列或亞序列。有關(guān)核苷酸或蛋白序列，術(shù)語基本上相同指由天然存在的序列的序列通過一或多個缺失，取代，或添加的特定序列變化，其凈效應(yīng)旨在保留EN0D93核酸或蛋白的生物功能。對于2個或更多序列的比較，一般將一個序列作為參照序列，將一或多個測試序
12列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，測試及參照序列進(jìn)入計(jì)算機(jī)程序，如果必需，指定亞序列坐標(biāo)，及選擇序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法基于選定的程序參數(shù)計(jì)算指定的測試序列相對于參照序列的序列同一性百分率。比較的序列的最佳比對可，例如，通過Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math, 1981, 2 :482_489，通過 Needleman&Wunsch 的同源性比對算法，J. Mol. Biol.， 1970,48 :443-453，通過檢索 Pearson&Lipman 的相似性方法，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,85 :2444-2448,通過這些算法的計(jì)算機(jī)化的運(yùn)行(GAP，BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)，或通過視覺觀察進(jìn)行。一般見，Ausubel (ed.)，Short Protocols in Molecular Biology,3rded. , 1995, Wiley, New York。用于確定序列同一性百分率及序列相似性的優(yōu)選的算法是BLAST算法，其描述于 Altschul et al，J. Mol. Biol，1990，215 :403_410。公眾可通過 National Center for Biotechnology Information (網(wǎng)址 ncbi. nlm. nih. gov/)用進(jìn)行 BLAST 分析的軟件。BLAST 算法參數(shù)決定比對的靈敏度及速度。對于比較2個核苷酸序列，BLASTn默認(rèn)參數(shù)設(shè)置為W =11(字長)及E= 10 (期望)，及也包括使用低復(fù)雜性篩選來屏蔽具有低組成性復(fù)雜性的查詢序列的殘值。對于2個氨基酸序列的比較，BLASTp程序默認(rèn)參數(shù)設(shè)置為W = 3(字長)，E= 10(期望)，使用BL0SUM62評分矩陣，存在的空位值=11及延伸的空位值=1，及使用低復(fù)雜性篩選屏蔽具有低組成性復(fù)雜性的查詢序列的殘值。II·重組表達(dá)0sEN0D93蛋白的系統(tǒng)本發(fā)明還提供用于表達(dá)重組0sEN0D93蛋白的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可用于隨后純化和/ 或表征0sEN0D93蛋白。重組表達(dá)0sEN0D93蛋白的系統(tǒng)也可用于鑒定0sEN0D93蛋白的活化劑或靶，如本文中以下進(jìn)一步所述。表達(dá)系統(tǒng)指包括異源核酸及由異源核酸編碼的蛋白的宿主細(xì)胞。例如，異源表達(dá)系統(tǒng)可包括用包括運(yùn)作性連接到啟動子的編碼0sEN0D93蛋白的0sEN0D93核酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，或通過將0sEN0D93核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組產(chǎn)生的細(xì)胞系。表達(dá)系統(tǒng)可還包括一或多個相關(guān)于0sEN0D93功能的額外的異源核酸，例如0sEN0D93活性的靶。這些額外的核酸可作為單個構(gòu)建體或多個構(gòu)建體表達(dá)。分離的蛋白及重組產(chǎn)生的蛋白可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化及表征。見例如，Schroder et al. , The Peptides, 1965, Academic Press, New York ； Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis,2nd rev.ed.1993, Springer-Verlag, Berlin/New York ；Ausubel(ed. ), Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed., 1995，Wiley, New York。[II. A.表達(dá)構(gòu)建體用于表達(dá)0sEN0D93蛋白的構(gòu)建體可包括載體序列及0sEN0D93核苷酸序列，其中所述0sEN0D93核苷酸序列運(yùn)作性連接到啟動子序列。用于重組0sEN0D93表達(dá)的構(gòu)建體也可包括轉(zhuǎn)錄終止信號及核苷酸序列的適當(dāng)?shù)姆g需要的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知表達(dá)構(gòu)建體的制備，包括添加翻譯及終止信號序列。啟動子可為在選擇的植物細(xì)胞，植物部分，或植物中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸序列。啟動子可為天然的或類似的，或外源或異源，對于植物宿主和/或?qū)τ诒景l(fā)明的 DNA序列。當(dāng)啟動子對于植物宿主是天然的或內(nèi)源性時(shí)，期望啟動子見于向其中導(dǎo)入啟動子的天然的植物。當(dāng)啟動子對于本發(fā)明的DNA序列是外源或異源時(shí)，啟動子對于運(yùn)作性連接的本發(fā)明的DNA序列不是天然的或天然存在的啟動子。啟動子可為誘導(dǎo)性或組成性的。 其可為天然存在的，可由各天然存在的啟動子的部分組成，或可為部分或完全合成的。啟動子設(shè)計(jì)的指導(dǎo)由啟動子結(jié)構(gòu)的研究提供，例如Harley et al，Nucleic Acids Res.，1987， 15 :2343-61 ο而且，啟動子相對于轉(zhuǎn)錄開始的位置可優(yōu)化。見例如，Roberts et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76 :760_4。許多用于植物的適宜啟動子為本領(lǐng)域熟知。例如，用于植物的適宜組成性啟動子包括來自植物病毒的啟動子，例如花生黃萎病條紋花椰菜花葉病毒(PCisv)啟動子(美國專利No. 5，850，019)；來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的 35S 啟動子(Odell et al.，Nature, 1985,313 :810-812)；小球藻病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子(美國專利No. 5，563，328)及來自玄參花葉病毒(FMV)的全長轉(zhuǎn)錄物啟動子(美國專利No. 5，378，619)；來自如稻肌動蛋白(McElroy et al. (1990)Plant Cell 2 :163-171)；泛素(Christensen et al.，Plant Mol. Biol.，1989，12 :619-632 及 Christensen et al.，Plant Mol. Biol.，1992，18 :675-689) ；pEMU(Last et al. , Theor. Appl. Genet. , 1991,81 :581-588) ；MAS (Velten et al.，EMBO J, 1984,3 :2723-2730)；玉米 H3 組蛋白(Lepetit et al. , Mol. Gen. Genet. , 1992, 231 :276-285 R Atanassova et al., Plant J. ,1992,2(3) =291-300)；歐洲油菜 ALS3 (PCT 國際公開 No. WO 97/41228)基因的啟動子；及各土壤桿菌基因的啟動子(見美國專利No. 4，771，002 ；5, 102，796 ；5，182，200 ；及 5，428，147)。用于植物的適宜誘導(dǎo)型啟動子包括響應(yīng)銅的來自ACEl系統(tǒng)的啟動子(Mett et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1993，90 :4567-4571)；響應(yīng)苯磺酰胺除草安全劑的玉米 In2 基因啟動子(Hershey et al.，Mol. Gen. Genetics, 1991，227 :229-237 及 Gatz et al.， Mol. Gen. Genetics, 1994, 243 :32-38)；及來自 TnlO 的 Tet 阻遏物啟動子(Gatz et al.， Mol. Gen. Genet.，1991，227 :2四_237)。用于植物的另一誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)植物不正常響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動子。此類型的例示誘導(dǎo)型啟動子是來自留激素基因的誘導(dǎo)型啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(Schena et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88 :10421) 或新近應(yīng)用的嵌合轉(zhuǎn)錄活化子，XVE，其用于被雌二醇活化的基于雌激素受體的誘導(dǎo)性植物表達(dá)系統(tǒng)(Zuo et al. ,Plant J，2000，M :265-273)。用于植物的其他誘導(dǎo)型啟動子描述于 EP 332104，PCT國際公開No. W093/213;34及WO 97/06269o也可使用包含部分其他啟動子的啟動子及部分或完全合成的啟動子。見描述所述用于植物的啟動子的例如，M et al., Plant J.，1995，7 :661-676 及 PCT 國際公開 No. WO 95/14098。啟動子可包括，或?qū)⑿揎棡榘?，一或多個增強(qiáng)子元件，以由此提供更高水平的轉(zhuǎn)錄。用于植物的適宜增強(qiáng)子元件包括=PCisv增強(qiáng)子元件(美國專利No. 5，850，019)，CaMV 35S增強(qiáng)子元件(美國專利No. 5，106, 739和5，164，316)及FMV增強(qiáng)子元件(Maiti et al.， Transgenic Res.，1997，6 143-156)。也見 PCT 國際公開 No. W096/23898。所述構(gòu)建體可含'信號序列'或'前導(dǎo)序列'，以輔助將目的肽共-翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，例如葉綠體(或其他質(zhì)體)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或高爾基體，或分泌。例如， 可將構(gòu)建體加工為含信號肽以輔助將肽轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。信號序列已知或疑似導(dǎo)致共翻譯或翻譯后跨細(xì)胞膜肽轉(zhuǎn)運(yùn)。在真核生物中，此一般涉及分泌到高爾基體，含一些得到的糖基化。前導(dǎo)序列指當(dāng)翻譯時(shí)導(dǎo)致足以引發(fā)將肽鏈共-翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)到亞-細(xì)胞細(xì)胞器的氨基酸序列的任何序列。由此，此包括通過進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，到達(dá)液泡，質(zhì)體(包括葉綠體，線粒體，等) 靶向轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的前導(dǎo)序列。植物表達(dá)盒也可含內(nèi)含子，以至于表達(dá)需要內(nèi)含子的 mRNA處理。所述構(gòu)建體也可含5'及3'非翻譯區(qū)。3'非翻譯區(qū)是位于編碼序列下游的多核苷酸。能影響將聚腺苷酸段添加到mRNA前體3’端的多聚腺苷酸化信號序列及編碼調(diào)控信號的其他序列是3'非翻譯區(qū)。5'非翻譯區(qū)是位于編碼序列上游的多核苷酸。終止區(qū)可與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相同來源，可與本發(fā)明的序列相同來源，或可源于另一來源。方便的終止區(qū)可獲自根癌土壤桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合酶及膽脂堿合酶終止區(qū)。也見 Guerineau et al. , Mol. Gen. Genet. , 1991,262 :141-144 ；Proudfoot, Cell, 1991,64 :671-674 ；Sanfacon et al. , Genes Dev. 1991,5 :141-149 ；Mogen et al., Plant Cell,1990,2:1261-1272 ；Munroe et al.，Gene，1990，91151-158 ；Ballas etal.， Nucleic Acids Res.，1989，17 :7891-7903 ；及 Joshi et al.，Nucleic Acid Res. , 1987, 15 :9627-9639。如果適當(dāng)，可優(yōu)化載體及0sEN0D93序列而用于在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中增加的表達(dá)。 即，序列可為改善的表達(dá)使用宿主細(xì)胞-優(yōu)選的密碼子合成，或可使用以宿主-優(yōu)選的密碼子利用頻度的密碼子合成。一般而言，將增加多核苷酸的GC含量。見例如，討論宿主-優(yōu)選的密碼子利用的Campbell et al. ,Plant Physiol，1990,92 :1_11。用于合成宿主-優(yōu)選的多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所知。見例如，美國專利No. 6，320，100 ；6, 075，185 ；5, 380，831 ； 及 5，436，391，美國公開申請 No. 20040005600 和 20010003849，及 Murray et al. ,Nucleic Acids Res.，1989，17 :477_498，將它們通過引用并入本文。例如，可使目的多核苷酸靶向葉綠體用于表達(dá)。以此方式，其中目的多核苷酸不直接插入葉綠體，表達(dá)盒可附加地含編碼將目的核苷酸引導(dǎo)到葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸。所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽為本領(lǐng)域所知。見例如，Von Heijne et al.，Plant Mol. Biol. Rep., 1991,9 :104-126 ；Clark et al. J. Biol.Chem. ,1989,264 :17544-17550 ；Della-Cioppa et al. , Plant Physiol, 1987,84 :965-968 ；Romer et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993，196 :1414-1421 ；及 Shah et al.，Science，1986，233 :478-481。待革 E 向葉綠體的目的多核苷酸可為在葉綠體中表達(dá)而優(yōu)化，以解釋植物細(xì)胞核和此細(xì)胞器之間的密碼子利用的差異。以此方式，目的多核苷酸可使用葉綠體-優(yōu)選的密碼子合成。見例如，美國專利 No. 5，380，831，將它們通過引用并入本文。可將植物表達(dá)盒(即，運(yùn)作性連接到啟動子的0sEN0D93開放閱讀框)插入使DNA 轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞的植物轉(zhuǎn)化載體。所述分子可由一或多個表達(dá)盒構(gòu)成，及可組織進(jìn)多于一個載體DNA分子。例如，二元載體是利用2個非-連續(xù)的DNA載體來編碼用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的全部必要的順式-及反式作用功能的植物轉(zhuǎn)化載體(Hellens et al. , Trends in Plant Science, 2000, 5 :446-451)。植物轉(zhuǎn)化載體包括用于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的一或多個DNA載體。例如，利用包括多于一個連續(xù)的DNA段的植物轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域中的通常實(shí)踐。這些載體在本領(lǐng)域中常指二元載體。二元載體以及有輔助質(zhì)粒的載體最常用于土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中需要實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化的DNA段的尺寸及復(fù)雜性相當(dāng)?shù)卮?，及對于對分離的DNA分子分離功能有利。二元載體一般含有含T-DNA轉(zhuǎn)移需要的順式作用序列的質(zhì)粒載體(例如左邊緣及右邊緣)，加工為能在植物細(xì)胞中表達(dá)的可選擇的標(biāo)記物，及目的多核苷酸(即，經(jīng)加工以能在期望產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞中表達(dá)的多核苷酸)。也存在于此質(zhì)粒載體的是細(xì)菌復(fù)制需要的序列。順式作用序列以使有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞及在那里表達(dá)的方式排列。例如，可選擇的標(biāo)記物序列及目的序列位于左及右邊緣之間。第二質(zhì)粒載體常含介導(dǎo)T-DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的反式作用因子。此質(zhì)粒常含使植物細(xì)胞被土壤桿菌感染，及通過在邊緣序列切割及vir-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移來轉(zhuǎn)移DNA的毒力功能(Vir基因)，如本領(lǐng)域中理解(Hellens 等人，2000年)。幾種類型的土壤桿菌株(例如，LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105，等。) 可用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體不必要于通過其他方法(例如微投影，微注射，電穿孔，聚乙二醇，等)將多核苷酸導(dǎo)入植物。[II.B.宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞是可向其中導(dǎo)入本發(fā)明的異源核酸分子的細(xì)胞。代表性的真核宿主細(xì)胞包括酵母及植物細(xì)胞，以及原核生物宿主(例如大腸桿菌及芽孢桿菌)。用于功能測定的優(yōu)選的宿主細(xì)胞基本上或完全缺乏0sEN0D93蛋白的內(nèi)源性表達(dá)。可選擇宿主細(xì)胞株以實(shí)現(xiàn)重組序列表達(dá)，或以特異性方式修飾及處理基因產(chǎn)物。 例如，不同的宿主細(xì)胞具有翻譯及翻譯后處理及修飾(例如，蛋白的糖基化，磷酸化)的特征性及特異性機(jī)理?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主細(xì)胞，以確保表達(dá)的外源蛋白的期望的修飾及處理。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可用于產(chǎn)生非-糖基化的核心蛋白產(chǎn)物，及在酵母中表達(dá)將產(chǎn)生糖基化的產(chǎn)物。本發(fā)明還含蓋0sEN0D93蛋白在穩(wěn)定的細(xì)胞系中的重組表達(dá)。將異源構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞后產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系的方法為本領(lǐng)域所知。見例如，Joyner,Gene Targeting A Practical Approach, 1993,Oxford University Press,Oxford/New York。由此,轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織，及植物理解為含蓋不僅轉(zhuǎn)化處理的終產(chǎn)物，而且其轉(zhuǎn)基因后代或繁殖的形式。III· 0sEN0D93過表達(dá)植物本發(fā)明也提供包括過表達(dá)的0sEN0D93核酸或蛋白的0sEN0D93過表達(dá)植物。本發(fā)明也提供有0sEN0D93的條件性或誘導(dǎo)性表達(dá)的植物的產(chǎn)生。0sEN0D93過表達(dá)植物可以單子葉或雙子葉植物制備，例如，以玉米，高粱，小麥，葵花，番茄，十字花科植物，胡椒，馬鈴薯，棉花，稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，及油籽油菜， 蕓苔屬，紫花苜蓿，黑麥，粟，紅花，花生，蕃薯，木薯，咖啡，椰子，菠蘿，柑橘樹，可可，茶，香蕉，鱷梨，無花果，番石榴，芒果，橄欖，番木瓜，腰果，澳洲堅(jiān)果，杏仁，燕麥，蔬菜，觀賞植物， 及松柏類植物。代表性的蔬菜包括番茄，萵苣，四季豆，利馬豆，豌豆，山藥，洋蔥，及甜瓜屬成員(例如黃瓜，羅馬甜瓜，及香瓜)。觀賞植物包括但不限于，杜鵑花，八仙花，芙蓉屬植物，薔薇科植物，郁金香，水仙花，牽?；?，康乃馨，一品紅，及菊花。如本文所用，植物指全植物，植物器官(例如，葉，莖，根，等)，籽，植物細(xì)胞，繁殖體，胚胎，及后代其。植物細(xì)胞可分化或未分化(例如，愈傷組織，懸浮液培養(yǎng)細(xì)胞，原生質(zhì)體，葉細(xì)胞，根細(xì)胞，韌皮部細(xì)胞，花粉)。可進(jìn)一步在不同于0sEN0D93的座位修飾0sEN0D93過表達(dá)植物，以賦予增強(qiáng)的氮使用效率或其他目的特性。代表性的期望的特性包括改善的作物產(chǎn)率；增加的籽產(chǎn)率；增加的氨基酸含量；增加的硝酸鹽含量；增加的應(yīng)激耐受性；昆蟲抗性；廣譜除草劑耐受性； 對于由病毒，細(xì)菌，真菌，及蟲所致的疾病的抗性；及增強(qiáng)保護(hù)免于環(huán)境應(yīng)激(例如熱，冷，旱，及高鹽濃度)的機(jī)理。額外的期望的特性包括使消費(fèi)者受益的輸出特性，例如，含更多淀粉或蛋白，更多維生素，更多抗氧化劑，和/或更少反式-脂肪酸的營養(yǎng)增強(qiáng)的食品；有改善的口味，增加的貨價(jià)期，及更佳成熟特征的食品；使少環(huán)境損害地產(chǎn)生紙可能的樹；無煙堿煙草；有新色彩，芳香，及增加的壽命的觀賞植物花卉；等。再者，可根據(jù)本發(fā)明使用的期望特性包括作為用于制備，例如，用于疾病治療及疫苗接種的治療性蛋白的手段在植物中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物；織物纖維；可生物降解的塑料；用于漆，去污劑，及潤滑劑的油；等。對于賦予與改變的基因表達(dá)，硝酸鹽含量，氨基酸含量，硝酸鹽攝取，側(cè)根生長，或植物生物質(zhì)相關(guān)的特性的遺傳修飾，0sEN0D93過表達(dá)植物和第二遺傳修飾的組合可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，即，基因表達(dá)，硝酸鹽含量，氨基酸含量，硝酸鹽攝取，側(cè)根生長，或植物生物質(zhì)的變化大于由任一遺傳修飾單獨(dú)引起的變化。對于0sEN0D93過表達(dá)植物的制備，將多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞通過本領(lǐng)域中已知的幾種技術(shù)之一實(shí)現(xiàn)，包括但不限于電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化(見例如，Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. , Indianapolis, hdiana)。賦予對于毒性物質(zhì)的抗性的標(biāo)記物在從非-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的(那些不含或不表達(dá)測試多核苷酸序列的細(xì)胞)鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(已攝取及表達(dá)測試多核苷酸序列的細(xì)胞) 中有用。在本發(fā)明的一方面，基因作為標(biāo)記物有用以評定DNA導(dǎo)入進(jìn)植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)化的植物，或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，或前述之任何的細(xì)胞，組織或籽，指外源多核苷酸合并入或整合入植物細(xì)胞的植物。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化指多核苷酸構(gòu)建體被導(dǎo)入植物以至于其整合進(jìn)植物基因組及能被其后代遺傳。一般而言，植物轉(zhuǎn)化方法涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)靶植物細(xì)胞(例如，未成熟的或成熟的胚胎，懸浮液培養(yǎng)物，未分化的愈傷組織，原生質(zhì)體，等)，然后是施加最大閾值水平的適當(dāng)?shù)倪x擇(取決于可選擇的標(biāo)記物基因)，以從一組未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞質(zhì)量回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一般將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮供給的相同培養(yǎng)基及常規(guī)培養(yǎng)。隨后，放置到補(bǔ)充了最大閾值水平的選擇試劑(即，溫度和/或除草劑)的再生培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化為芽。然后將芽轉(zhuǎn)移到用于回收生根的芽或小植株的選擇性生根培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因小植株然后生長為成熟的植物及產(chǎn)生能育的籽(例如，Hiei et al,Plant J. ,1994,6 =271-282 ；Ishida et al， Nat. Biotechnol，1996，14 :745-750)。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)及方法的一般描述見于Ayres et al.，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，1994. 13 :219_239，及 Bommineni 等人，Bommineni et al. ,Maydica, 1997' ,42 :107_120。由于轉(zhuǎn)化的物質(zhì)含許多細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的及非-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞存在于任何塊的作為對象的靶愈傷組織或組織或細(xì)胞團(tuán)。殺非-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增值的能力產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。常常，去除非-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力是快速恢復(fù)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞及成功的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的限制。然后可將分子及生物化學(xué)方法用于確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植物基因組中有整合的目的核苷酸。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可通過幾種方法之一進(jìn)行，包括但不限于通過土壤桿菌將異源 DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞(土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，用附著于粒子的異源外源DNA轟擊植物細(xì)胞，及各其他非-粒子直接介導(dǎo)的方法(例如，Hiei et al.，Plant J. ,1994,6 :271-282 ； Ishida et al. ， Nat.Biotechnol, 1996,14:745-750 ；Ayres et al. ， CRC Crit. Rev. Plant Sci. , 1994,13 :219-239 ；Bommineni et al，Maydica，1997,42 :107-120)來轉(zhuǎn)移 DNA。有3種常用的用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。第一方法是土壤桿菌與培養(yǎng)的分離的原生質(zhì)體的共-培養(yǎng)。此方法要求使培養(yǎng)原生質(zhì)體及從培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生的建立的培養(yǎng)系統(tǒng)。第二方法是用土壤桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。此方法要求(a)植物細(xì)胞或組織可經(jīng)土壤桿菌轉(zhuǎn)化及(b)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織來再生為全植物。第三方法是用土壤桿菌轉(zhuǎn)化籽，頂點(diǎn)或分生組織。此方法要求微繁殖。通過土壤桿菌的轉(zhuǎn)化效率可通過使用本領(lǐng)域中已知的許多方法增強(qiáng)。例如，使天然的創(chuàng)傷應(yīng)答分子，例如乙酰丁香酮(AQ包含到土壤桿菌培養(yǎng)已顯示增強(qiáng)用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉(zhuǎn)化效率(Shahla et al. ,Plant Molec. Biol, 1987, 8:291-298)?；蛘撸D(zhuǎn)化效率可通過傷害待轉(zhuǎn)化的靶組織來增強(qiáng)。植物組織的傷害可，例如，通過打孔，浸軟，用微投射物轟擊，等實(shí)現(xiàn)。見例如，Bidney et al. ,Plant Molec. Biol, 1992，18 :301-313。在本發(fā)明的另一方面，植物細(xì)胞用載體經(jīng)粒子轟擊(即，用基因槍)轉(zhuǎn)染。粒子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法為本領(lǐng)域所知，可商購，及包括但不限于，氣體驅(qū)動的基因遞送裝置，其描述于美國專利No. 5，584，807，將其整個內(nèi)容通過引用并入本文。此方法涉及將目的多核苷酸序列包被于重金屬微粒，及在壓縮氣體的壓力下加速包被的粒子用于遞送到靶組織。其他粒子轟擊方法也可用于將異源多核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞。一般而言，這些方法涉及將目的多核苷酸序列淀積到例如金，鉬，或鎢的小的，密的粒子材料表面。將包被的粒子直接包被到任一硬的表面，例如金屬板，或到由脆性材料(例如聚酯薄膜)制成的載質(zhì)片材。然后將包被的片材向靶生物組織加速。平的片材的使用產(chǎn)生加速的粒子的均一的擴(kuò)展，其最大化在均一的條件下接受粒子的細(xì)胞的數(shù)，導(dǎo)致多核苷酸樣品被導(dǎo)入靶組織。特異性起始信號也可用于實(shí)現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更有效翻譯。所述信號包括 ATG起始密碼子及相鄰序列。在編碼目的多肽的序列的情況中，將其起始密碼子，及上游序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可無需額外的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。但是，在僅插入編碼序列，或其部分的情況中，應(yīng)提供包括ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子應(yīng)在正確的閱讀框中，以確保整個插入子的翻譯。外源翻譯元件及起始密碼子可為各種來源的， 天然的及合成的。表達(dá)效率可通過包含對于特定細(xì)胞系統(tǒng)適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)子來增強(qiáng)，所述增強(qiáng)子例如那些文獻(xiàn)中所述使用的(Scharf et al.，Results Probl. Cell Differ. , 1994,20 125)。本發(fā)明的另一方面，通過同源重組在植物基因組中修飾對應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列的至少一個基因組拷貝，如進(jìn)一步闡述于I^aszkowski等人，EMBO Journal 1988,7 4021 沈。此技術(shù)使用同源序列的性質(zhì)彼此識別及通過本領(lǐng)域中已知的處理(如同源重組)在各之間交換核苷酸序列。同源重組可在細(xì)胞內(nèi)核苷酸序列的染色體拷貝之間發(fā)生， 及通過轉(zhuǎn)化將所得的核苷酸序列拷貝導(dǎo)入細(xì)胞。由此將特異性修飾精確導(dǎo)入核苷酸序列的染色體拷貝。一方面，修飾本發(fā)明的核苷酸序列的調(diào)控元件。所述調(diào)控元件通過使用本發(fā)明的核苷酸序列或其部分作為探針篩選基因組庫容易可獲得。既有的調(diào)控元件被不同的調(diào)控元件取代，由此改變核苷酸序列的表達(dá)。已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可根據(jù)常規(guī)方式生長為植物。見例如，McCormick et al.，Plant Cell R印.，1986，5 :81-84。這些植物可然后生長，及用相同的轉(zhuǎn)化的株或不同的株任一授粉，及得到具有鑒定的期望的表型特征性的組成性表達(dá)的雜交體?？缮L2或更多代，以確保期望的表型特征性的表達(dá)穩(wěn)定維持及遺傳，然后收獲籽，以確保已實(shí)現(xiàn)期望的表型特征
18性的表達(dá)。以此方式，本發(fā)明提供具有本發(fā)明的多核苷酸(例如，穩(wěn)定合并入它們的基因組的本發(fā)明的表達(dá)盒)的轉(zhuǎn)化的籽(也稱為轉(zhuǎn)基因籽)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可對于加入的多核苷酸純合；S卩，含2個添加的序列的轉(zhuǎn)基因植物，一個序列在染色體對的各染色體的相同的座位上。純合轉(zhuǎn)基因植物可如下得到 使(自交)含加入的根據(jù)本發(fā)明的序列的獨(dú)立性分離子轉(zhuǎn)基因植物性交，使一些產(chǎn)生的籽發(fā)芽，及就相對于對照(天然的，非-轉(zhuǎn)基因)或獨(dú)立性分離子轉(zhuǎn)基因植物的增強(qiáng)的酶活性 (即，除草劑抗性)和/或增加的植物產(chǎn)率分析得到的產(chǎn)生的植物。需知，也可交配2個不同的轉(zhuǎn)基因植物來產(chǎn)生含2種獨(dú)立地分離加入的，外源的多核苷酸的后代。適當(dāng)?shù)暮蟠淖越豢僧a(chǎn)生對于全部加入的，外源的編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸純合的植物。也考慮與親本植物回交及與非-轉(zhuǎn)基因植物遠(yuǎn)交。將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞后，通過各方法確認(rèn)多核苷酸轉(zhuǎn)化或整合入植物基因組，例如與整合的序列相關(guān)的多核苷酸，多肽及代謝物的分析。IV.0sEN0D93結(jié)合偶體及活化劑本發(fā)明還公開鑒定0sEN0D93結(jié)合偶體及0sEN0D93活化劑的測定。0sEN0D93活化劑是改變0sEN0D93蛋白的化學(xué)及生物活性或性質(zhì)的試劑。所述化學(xué)及生物活性及性質(zhì)可包括但不限于，0sEN0D93核酸表達(dá)水平及經(jīng)0sEN0D93調(diào)節(jié)的核酸的表達(dá)水平。鑒定活化劑的方法涉及在一或多種測試試劑的存在下測定0sEN0D93功能的增強(qiáng)的，水平或質(zhì)量。代表性的0sEN0D93活化劑包括小分子以及生物實(shí)體，如本文以下所述。0sEN0D93活性的對照水平或質(zhì)量指野生型0sEN0D93活性的水平或質(zhì)量，例如，當(dāng)使用包括SEQ ID NO :3表達(dá)的重組表達(dá)系統(tǒng)時(shí)。當(dāng)評估測試試劑的活化能力時(shí)，0sEN0D93 活性的對照水平或質(zhì)量包括無測試試劑的情況下的活性的水平或質(zhì)量。0sEN0D93蛋白的顯著變化的活性指可測量的大于測量技術(shù)中固有的誤差容限的質(zhì)量的可定量的變化。例如，顯著的抑制指相對于對照測量降低約2倍以上，或約5倍以上降低，或約10倍以上降低的0sEN0D93活性。顯著的增強(qiáng)指相對于對照測量增加約2倍以上，或約5倍以上增加，或約10倍以上增加的0sEN0D93活性。0sEN0D93功能的測定可包括確定0sEN0D93基因表達(dá)水平；確定重組表達(dá)的 0sEN0D93蛋白的DNA結(jié)合活性；確定0sEN0D93蛋白的活性構(gòu)象；或確定響應(yīng)0sEN0D93活化劑結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的活化(例如，增強(qiáng)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)，增加的硝酸鹽含量，增加的氨基酸含量，增加的硝酸鹽攝取，增加的側(cè)根萌發(fā)，和/或增加的生物質(zhì))。例如，鑒定 0sEN0D93活化劑的方法包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93蛋白的細(xì)胞；(b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定編碼0sEN0D93蛋白的核酸的表達(dá)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)，誘導(dǎo)核酸的升高的表達(dá)的測試試劑。根據(jù)本發(fā)明，也提供依賴于本文所述的方法的快速及高通量篩選方法。此篩選方法包括使0sEN0D93蛋白與多個測試試劑獨(dú)立地接觸。在所述篩選方法中，多種測試試劑可包括多于約IO4樣品，或多于約IO5樣品，或多于約IO6樣品。本發(fā)明的體外及細(xì)胞測定可包括可溶性測定，或可還包括用于固定一或多種測定成分的固相基材。例如，可將0sEN0D93蛋白，或表達(dá)0sEN0D93蛋白的細(xì)胞，與固體狀態(tài)成分經(jīng)共價(jià)或非-共價(jià)連接直接結(jié)合。任選地，結(jié)合可包括介導(dǎo)0sEN0D93蛋白與基材的間接結(jié)合的接頭分子或標(biāo)簽。
[IV. A.測試試劑測試試劑指與0sEN0D93核酸或蛋白(包括任何合成的，重組，或天然的產(chǎn)物)潛在地相互作用的任何試劑?？墒褂帽疚闹泄_的方法評價(jià)疑似與蛋白相互作用的測試試劑的所述相互作用。代表性的測試試劑包括但不限于肽，蛋白，核酸，小分子(例如，有機(jī)和無機(jī)化合物)，抗體或其片段，核酸-蛋白融合體，任何其他親和性試劑，及其組合。待測試的測試試劑可為純化的分子，同質(zhì)的樣品，或分子或化合物的混合物。小分子指化合物，例如，有小于約1，000道爾頓，更優(yōu)選小于約750道爾頓，再更優(yōu)選為小于約600道爾頓，及再更優(yōu)選為小于約500道爾頓的分子量的有機(jī)化合物。小分子也優(yōu)選具有在約-4 約+14范圍內(nèi)的，更優(yōu)選在約-2 約+7. 5范圍內(nèi)的計(jì)算的對數(shù)辛醇-水分配系數(shù)。測試試劑可作為分子庫或收集得到或制備。庫可含從約10個分子 幾十億個分子或更多變化的少或大的不同的分子數(shù)。分子可包括天然存在的分子，重組分子，或合成的分子。庫中多個測試試劑可測定同時(shí)。任選地，可將源于不同的庫的測試試劑合并用于同時(shí)評估。代表性的庫包括但不限于肽庫(美國專利No. 6，156，511，6，107，059， 5，922，545，及 5，223，409)，寡聚體庫(美國專利 No. 5，650，489 和 5，858，670)，適體庫 (美國專禾IJ No. 7，338，762 ；7，329，742 ；6，949，379 ；6，180，348 ；及 5，756，291)，小分子庫 (美國專禾U No. 6，168，912和5，738，996)，抗體或抗體片段庫(美國專利No. 6，174，708， 6，057，098，5，922，254，5，840，479，5，780，225，5，702，892，及 5，667，988)，核酸-蛋白融合體庫(美國專利No. 6，214，55 ，及任可潛在地結(jié)合0sEN0D93蛋白的何其他親和性試劑庫。庫可包括一批隨機(jī)收集的分子?；蛘?，庫可包括一批有對于特定序列，結(jié)構(gòu)，或構(gòu)象的偏好的分子，例如，關(guān)于抑制性核酸。見例如，美國專利No. 5，264, 563和5，824，483。 制備庫含各種類型的分子的多樣的群的方法為本領(lǐng)域所知，例如本文中以上引用的美國專利中所述。多種庫也可商購。[IV. B.結(jié)合測定在本發(fā)明的另一方面，鑒定0sEN0D93活化劑的方法包括確定測試試劑與 0sEN0D93蛋白的特異性結(jié)合。例如，鑒定0sEN0D93結(jié)合偶體的方法可包括(a)提供SEQ ID NO :3的0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白與一或多種測試試劑在對于結(jié)合而言足夠的條件下接觸；(c)測定測試試劑與分離的0sEN0D93蛋白的結(jié)合；及(d)選擇展示特異性結(jié)合0sEN0D93蛋白的測試試劑。特異性結(jié)合也可含蓋相互作用的質(zhì)量或狀態(tài)，以至于測試試劑與0sEN0D93蛋白的結(jié)合是抑制性或誘導(dǎo)性的。特異性結(jié)合指確定蛋白及其他生物材料的異質(zhì)的群中有蛋白的結(jié)合反應(yīng)。如果結(jié)合親和力為約IXlO4M-1 約IXlO6M-1以上，測試試劑與0SEN0D93蛋白的結(jié)合可認(rèn)為是特異性的。特異性結(jié)合也指可飽和的結(jié)合。為展示測試試劑與0sEN0D93蛋白的可飽和的結(jié)合，可進(jìn)行 katchard 分析，例如，Mak et al，J. Biol. Chem.，1989，洸4 :21613-21618 所述。幾種技術(shù)可用于不采用已知的競爭性抑制劑地檢測0sEN0D93蛋白與測試試劑之間的相互作用。代表性的方法包括但不限于，熒光相關(guān)性光譜學(xué)，表面-增強(qiáng)的激光解吸/ 電離飛行時(shí)間光譜學(xué)，及BIACORE 技術(shù)，本文以下所述的各技術(shù)。這些方法服從自動化的，高-通量篩選。熒光相關(guān)性光譜學(xué)(FCQ測量小的樣品體積之內(nèi)熒光分子的平均擴(kuò)散速度。樣品尺寸可低至IO3個熒光分子及樣品體積低至單個細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)。擴(kuò)散速度是分子質(zhì)量的函數(shù)， 及隨著質(zhì)量增加而降低。因此可通過測量結(jié)合之后分子的質(zhì)量變化、從而擴(kuò)散速度而將FCS 應(yīng)用于蛋白-配體相互作用分析。在典型的實(shí)驗(yàn)中，待分析的靶(例如，0sEN0D93蛋白)作為有在N-端或C-端插入的序列標(biāo)簽(例如聚-組氨酸序列)的重組蛋白表達(dá)。表達(dá)在宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌，酵母，爪蟾卵母細(xì)胞，或哺乳動物細(xì)胞)中介導(dǎo)。蛋白使用層析方法純化。例如，可將聚-組氨酸標(biāo)簽用于將表達(dá)的蛋白結(jié)合到金屬螯合物柱(例如鰲合到亞氨基二乙酸瓊脂糖的Ni2+)。然后將蛋白用熒光標(biāo)簽，例如羧基四甲基羅丹明或B0DIPY 試劑(獲自Molecular Probes of Eugene, Oregon)標(biāo)記。然后將蛋白在溶液中暴露于潛在配體，及通過 FCS 使用獲自 Carl Zeiss, Inc. (Thornwood of New York, New York)的儀表測定其擴(kuò)散速度。配體結(jié)合通過蛋白擴(kuò)散速度的變化測定。表面-增強(qiáng)的激光解吸/ 電離(SELDI)由 Hutchens&Yip，Rapid Commun· Mass Spectrom.，1993，7 :576-580開發(fā)。當(dāng)偶聯(lián)于飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF)時(shí)，SELDI提供快速分析芯片上保留的分子的技術(shù)?？赏ㄟ^將靶蛋白，或其部分，共價(jià)結(jié)合到芯片上及通過質(zhì)量光譜法分析結(jié)合此蛋白的小分子來將其應(yīng)用于配體-蛋白相互作用分析(Worrall et al, Anal Chem.，1998，70 (4) :750-756)。在典型的實(shí)驗(yàn)中，使靶蛋白(例如，0sEN0D93蛋白)重組表達(dá)及純化。通過利用聚-組氨酸標(biāo)簽或通過其他相互作用(例如離子交換或疏水相互作用)將靶蛋白結(jié)合到SELDI芯片。然后將由此制備的芯片經(jīng)，例如，能夠以連續(xù)方式移液配體的遞送系統(tǒng)(自動采樣器)暴露于潛在配體。然后將芯片在增加嚴(yán)格度溶液中洗滌， 例如用含增加離子強(qiáng)度的緩沖溶液的一系列洗滌。各洗滌后，通過將芯片交付于SELDI-T0F 來分析結(jié)合物質(zhì)。特異性地結(jié)合靶蛋白的配體通過洗脫它們需要的洗滌嚴(yán)格度來鑒定。BIACORE 依賴于配體與固定到層的靶蛋白(例如，0sEN0D93蛋白)結(jié)合之后在表面層折射率的變化。在此系統(tǒng)中，以2 5μ 1細(xì)胞依次注射一批小的配體，其中所述靶蛋白固定到細(xì)胞之內(nèi)。通過表面等離子體共振(SPR)通過記錄從表面折射的激光來檢測結(jié)合。一般而言，對于在表面層的質(zhì)量濃度的給定變化的折射率變化對于全部蛋白及肽實(shí)際上相同，使單個方法對于任何蛋白可應(yīng)用。在典型的實(shí)驗(yàn)中，使靶蛋白重組表達(dá)，純化， 及結(jié)合到BIACORE 芯片。結(jié)合可通過利用聚-組氨酸標(biāo)簽或通過其他相互作用(例如離子交換或疏水相互作用)輔助。然后將由此制備的芯片經(jīng)合并入由Biacore (Uppsala， Sweden)出售的儀器的遞送系統(tǒng)暴露于一或多種潛在配體，以便以連續(xù)方式移液配體(自動采樣器)。記錄芯片上的sra信號，及折射率變化表示固定的靶和配體之間的相互作用。結(jié)合速率及解離速率的信號動力學(xué)分析使非特異性和特異性相互作用之間區(qū)別。也見 Homola et al. , Sensors and Actuators, 1999, 54 :3-15,及該文的參考文獻(xiàn)。[IV. C.構(gòu)象測定本發(fā)明也提供鑒定0sEN0D93結(jié)合偶體及活化劑的方法，其依賴于當(dāng)被測試試劑結(jié)合或與測試試劑別樣地相互作用時(shí)，0sEN0D93蛋白的構(gòu)象變化。例如，將圓二色性應(yīng)用到大分子溶液顯示這些大分子的構(gòu)象狀態(tài)。技術(shù)可區(qū)別隨機(jī)卷曲，α螺旋，及β鏈構(gòu)象狀態(tài)。為鑒定0sEN0D93蛋白的結(jié)合偶體及活化劑，可使用重組表達(dá)的EN0D93蛋白進(jìn)行圓二色性分析。0sEN0D93蛋白，例如通過離子交換及大小排阻層析純化，及與測試試劑混合。使混合物經(jīng)歷圓二色性。將測試試劑存在下0sEN0D93蛋白構(gòu)象與無測試試劑的情況下0sEN0D93蛋白構(gòu)象比較。在測試試劑的存在下0sEN0D93蛋白構(gòu)象狀態(tài)的變化鑒定 0sEN0D93結(jié)合偶體或活化劑。代表性的方法描述于美國專利No. 5，776，859和5，780，2420 結(jié)合偶體或活化劑的活性可使用功能測定評定，所述測定包括硝酸鹽含量，硝酸鹽攝取， 側(cè)根生長，籽產(chǎn)率，氨基酸含量或植物生物質(zhì)，如本文所述。[IV. D.功能測定在本發(fā)明的另一方面，鑒定0sEN0D93活化劑的方法采用有功能的0sEN0D93蛋白， 例如，如SEQ ID NO :3所示的。代表性的確定0sEN0D93功能的方法包括測定由0sEN0D93活性引起的生理變化，例如增強(qiáng)的側(cè)根生長，增加的硝酸鹽攝取，增加的硝酸鹽含量，增加的籽產(chǎn)率，增加的氨基酸含量和/或增加的植物生物質(zhì)(見，例如，實(shí)施例1，3 6，10和12)。例如，鑒定0sEN0D93活化劑的方法可包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93蛋白的細(xì)胞； (b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定0sEN0D93靶基因的表達(dá)；及(d) 選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)升高的0sEN0D93靶基因的表達(dá)的測試試劑， 該基因被0sEN0D93正常誘導(dǎo)(例如，氮代謝基因，碳代謝基因及光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)基因)。根據(jù)公開的方法，表達(dá)0sEN0D93的細(xì)胞可以對于進(jìn)行測定0sEN0D93功能有用的試劑盒的形式提供。例如，用于檢測0sEN0D93活化劑的測試試劑盒可包括用編碼全長0sEN0D93蛋白的 DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及用于生長細(xì)胞的培養(yǎng)基。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的0sEN0D93活性的測定可包括從非-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞區(qū)別轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的標(biāo)記物。標(biāo)記物可由用于0sEN0D93表達(dá)的構(gòu)建體編碼或別樣地與用于0sEN0D93 表達(dá)的構(gòu)建體相關(guān)，以至于細(xì)胞用編碼0sEN0D93的核酸分子及標(biāo)記物同時(shí)轉(zhuǎn)染。作為標(biāo)記物有用的代表性的可檢測的分子包括但不限于異源核酸，由轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體編碼的蛋白 (例如，酶或熒光蛋白)，結(jié)合蛋白，及抗原。鑒定0sEN0D93活化劑的方法也可包括(a)提供表達(dá)0sEN0D93蛋白的植物；(b) 使植物與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定(i)硝酸鹽含量；(ii)硝酸鹽攝取； (iii)氨基酸含量；(iv)籽產(chǎn)率；或(V)生物質(zhì)；及(d)選擇誘導(dǎo)(i)增加的硝酸鹽含量， ( )增加的硝酸鹽攝取，(iii)增加的氨基酸含量，(iv)增加的籽產(chǎn)率，或(V)增加的生物質(zhì)的測試試劑。采用表達(dá)重組0sEN0D93的細(xì)胞或表達(dá)0sEN0D93的植物的測定可附加地采用基本上無天然的0sEN0D93及，任選地，基本上類似于0sEN0D93蛋白的蛋白的對照細(xì)胞或植物。當(dāng)使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時(shí)，對照細(xì)胞可包括，例如，未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。當(dāng)使用表達(dá) 0sEN0D93蛋白的穩(wěn)定的細(xì)胞系時(shí)，對照細(xì)胞可包括，例如，用于衍生0sEN0D93-表達(dá)細(xì)胞系的親本細(xì)胞系。當(dāng)使用植物時(shí)，對照植物可包括0sEN0D93過表達(dá)植物。在此實(shí)例中， 0sEN0D93活化劑引起類似于0sEN0D93過表達(dá)植物的表型。IV.E.合理的設(shè)計(jì)天然的0sEN0D93蛋白的結(jié)構(gòu)的知識提供用于0sEN0D93活化劑的合理的設(shè)計(jì)的方法。簡言之，0sEN0D93蛋白的結(jié)構(gòu)可通過X射線晶體學(xué)和/或通過產(chǎn)生3-維呈現(xiàn)的計(jì)算的算法測定。見 Saqi et al,Bioinformatics, 1999,15 :521-522 ；Huang et al,Pac. Symp. Biocomput，2000，230-241 ；及 PCT 國際公開 No. WO 99/26966?；蛘?，EN0D93 蛋白結(jié)構(gòu)的
22工作模型可通過同源性建模推導(dǎo)(Maalouf et al.，J. Biomol. Struct. Dyn.，1998，15 (5) 841-851)。計(jì)算機(jī)模型可還預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)與可合成及使用本文以上所述的測定測試的各底物分子的結(jié)合。額外的化合物設(shè)計(jì)技術(shù)描述于美國專利No. 5，834，228和5，872，011。0sEN0D93蛋白是可溶性蛋白，其可純化及濃縮用于結(jié)晶化?？蓪⒓兓?sEN0D93 蛋白在以下之至少一種變化的條件下結(jié)晶化pH，緩沖液類型，緩沖液濃度，鹽類型，聚合物類型，聚合物濃度，其他沉淀配體，及純化的0sEN0D93濃度。產(chǎn)生晶體蛋白的方法為本領(lǐng)域所知，及可合理地適于確定如本文所述的0sEN0D93蛋白。見例如，Deisenhofer et al.， J. Mol. Biol, 1984,180 :385-398 ；Weiss et al.，F(xiàn)EBS Lett.，1990，267 :268-272 ；或商業(yè)試劑盒中提供的方法，例如結(jié)晶篩選 試劑盒(獲自Hampton Research of Riverside, California, USA)。可測試結(jié)晶化的0sEN0D93蛋白的功能活性，及進(jìn)一步測試不同尺寸的及形狀的結(jié)晶的X射線衍射中的適應(yīng)性。一般而言，更大的結(jié)晶相比更小的結(jié)晶提供更佳晶體學(xué)，及更厚的結(jié)晶相比更薄的結(jié)晶提供更佳晶體學(xué)。優(yōu)選地，0sEN0D93結(jié)晶尺寸跨0. 1 1. 5mm。 這些結(jié)晶衍射X射線到至少10人分辨率，例如1.5~ 10.0人或該值內(nèi)任何范圍，例如1.5， 1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4， 3. 5或3，3.5人或以下對于最高分辨率優(yōu)選。IV. F. 0sEN0D93 抗體在本發(fā)明的另一方面，提供產(chǎn)生特異性結(jié)合0sEN0D93蛋白的抗體的方法。根據(jù)方法，配制全長重組0sEN0D93蛋白，從而其可將用作有效免疫原，及用于免疫動物，以產(chǎn)生動物的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答特征在于產(chǎn)生可收集自動物血清的抗體?？贵w是包括抗原結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白，或抗體片段(例如，F(xiàn)ab，修飾的Fab， Fab' , F(ab' )2或Fv片段，或具有至少一個免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)或至少一個免疫球蛋白重鏈區(qū)的蛋白)。本發(fā)明的抗體包括二體，四聚體抗體，單鏈抗體，四價(jià)抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，及識別特定表位的結(jié)構(gòu)域-特異性抗體。產(chǎn)生抗-0sEN0D93 抗體的細(xì)胞系也包括在本發(fā)明內(nèi)。針對0sEN0D93蛋白的抗體的特異性結(jié)合指在包括多種不同的抗原的異質(zhì)的樣品中優(yōu)先結(jié)合到0sEN0D93蛋白?；旧先鄙俳Y(jié)合描述抗體結(jié)合到對照蛋白或樣品，即，結(jié)合水平表征為非特異性或背景結(jié)合。如果結(jié)合親和力至少為約10_7M或更高，例如至少約10_8M 或更高，包括至少約ΙΟ—Μ或更高，至少約1(Γ"Μ或更高，或至少約或更高，抗體與抗原的結(jié)合是特異性的。如本文所述制備的0sEN0D93抗體可用于本領(lǐng)域中已知的涉及0sEN0D93蛋白的表達(dá)及活性的方法，例如，用于克隆編碼0sEN0D93蛋白的核酸，免疫純化0sEN0D93蛋白，及在植物樣品中檢測0sEN0D93蛋白，及在植物樣品中測量0sEN0D93蛋白的水平。為實(shí)施所述方法，本發(fā)明的抗體可還包括可檢測的標(biāo)記物，包括但不限于放射性的標(biāo)記物，熒光標(biāo)記物， 表位標(biāo)記物，及可體內(nèi)檢測的標(biāo)記物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知選擇適宜于特定檢測技術(shù)的標(biāo)記物的方法，及綴合到或別樣地聯(lián)系可檢測的標(biāo)記物與抗體的方法。V. 0sEN0D93的過表達(dá)公開的0sEN0D93結(jié)合偶體及0sEN0D93活化劑對于通常與評定對氮水平的應(yīng)答及促進(jìn)氮使用效率相關(guān)的應(yīng)用體外及體內(nèi)有用。尤其是，0sEN0D93活化劑可用于誘導(dǎo)0sEN0D93的轉(zhuǎn)錄，增加植物的硝酸鹽含量，增加硝酸鹽攝取入植物根，增加植物籽產(chǎn)率，增加植物的氨基酸含量及增加植物生物質(zhì)。本發(fā)明提供將有效量的0sEN0D93活化劑施用于植物，即，足以引起期望的生物應(yīng)答的量。例如，有效量的0sEN0D93活化劑可包括足以引起下列的量升高的0sEN0D93，正常用于0sEN0D93誘導(dǎo)的基因(例如，氮代謝基因，碳代謝基因及光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)基因)的表達(dá)，植物根中增加的硝酸鹽含量，植物根中增加的硝酸鹽攝取，增加的側(cè)根萌發(fā)，增加的籽產(chǎn)率，增加的氨基酸含量及增加的生物質(zhì)。可受益于0sEN0D93活化的植物包括但不限于，玉米，高粱，小麥，葵花，番茄，十字花科植物，胡椒，馬鈴薯，棉花，稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，及油籽油菜，蕓苔屬，紫花苜蓿，黑麥，粟，紅花，花生，蕃薯，木薯，咖啡，椰子，菠蘿，柑橘樹，可可，茶，香蕉，鱷梨，無花果，番石榴，芒果，橄欖，番木瓜，腰果，澳洲堅(jiān)果，杏仁，燕麥，蔬菜，觀賞植物，及松柏類植物。代表性的蔬菜包括番茄，萵苣，四季豆，利馬豆，豌豆，山藥，洋蔥，及甜瓜屬成員(例如黃瓜，羅馬甜瓜，及香瓜)。代表性的觀賞植物包括但不限于，杜鵑花，八仙花，芙蓉屬植物， 薔薇科植物，郁金香，水仙花，牽?；?，康乃馨，一品紅，及菊花。前述植物之任何可為野生型植物，近親交配植物，或轉(zhuǎn)基因植物，例如，農(nóng)業(yè)環(huán)境中使用的植物株及遺傳修飾的植物。用0sEN0D93活化劑處理的植物可為轉(zhuǎn)基因植物，S卩，為賦予增強(qiáng)的氮使用效率或其他特性目的在0sEN0D93，或在不同于0sEN0D93的座位遺傳修飾的植物。代表性的期望的特性包括改善的作物產(chǎn)率；增加的籽產(chǎn)率；增加的氨基酸含量；增加的硝酸鹽含量；增加的應(yīng)激耐受性；昆蟲抗性；廣譜除草劑耐受性；對于由病毒，細(xì)菌，真菌，及蟲所致的疾病的抗性；及從環(huán)境應(yīng)激(例如熱，冷，旱，及高鹽濃度)保護(hù)的機(jī)理增強(qiáng)。額外的期望的特性包括使消費(fèi)者受益的輸出特性，例如，含更多淀粉或蛋白，更多維生素，更多抗氧化劑，和 /或更少反式-脂肪酸的營養(yǎng)增強(qiáng)的食品；有改善的口味，增加的貨價(jià)期，及更佳成熟特征的食品；使少環(huán)境損害地產(chǎn)生紙可能的樹；無煙堿煙草；有新色彩，芳香，及增加的壽命的觀賞植物花卉；等。再者，根據(jù)本發(fā)明可使用的期望特性包括植物中產(chǎn)生的作為用于制備以下的手段的基因產(chǎn)物，例如，用于疾病治療及疫苗接種的治療性蛋白；織物纖維；可生物降解的塑料；用于漆，去污劑，及潤滑劑的油；等。對于賦予與增加的改變的基因表達(dá)，硝酸鹽含量，硝酸鹽攝取，側(cè)根生長，籽產(chǎn)率，氨基酸含量或植物生物質(zhì)相關(guān)的特性的遺傳修飾， 用0sEN0D93活化劑及遺傳修飾處理的組合可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，即，基因表達(dá)，硝酸鹽含量，硝酸鹽攝取，側(cè)根生長，籽產(chǎn)率，氨基酸含量或植物生物質(zhì)中的變化大于由任一遺傳修飾單獨(dú)引起的變化。
實(shí)施例已包括以下實(shí)施例來闡述本發(fā)明的模式。以技術(shù)術(shù)語及被本共-發(fā)明人發(fā)現(xiàn)或含蓋的方法描述以下實(shí)施例的某些方面，以在本發(fā)明的實(shí)踐中工作良好。鑒于本公開內(nèi)容及本領(lǐng)于技術(shù)人員的一般水平，那些技術(shù)人員將認(rèn)同以下實(shí)施例僅旨在例示，及在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可采用多種變化，修飾，及改變。實(shí)施例1暴露于不同的氮水平的植物中生物質(zhì)的變化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica)Donjin變種植物生長在泥炭蘚及蛭土的混合物(1 4) (SunGro Horticulture Canada Ltd. BC, Canada)中，一周一次添加含不同的量的硝酸鹽的營養(yǎng)溶液直到收獲。營養(yǎng)溶液含4mM MgSO4, 5mM KCl,5mM CaCl2, ImMKH2PO4,0. ImM Fe-EDTA,0. 5mM MES (ρΗ6· 0)，9 μ M MnSO4,0. 7μ M ZnSO4,0. 3μ M CuSO4, 46 μ M NaB4O7和0. 2μΜ(ΝΗ4)6Μο702。將IOmM硝酸鹽用作高氮條件，5mM硝酸鹽作為中氮，及 ImM硝酸鹽作為低氮。植物生長在有于28 30°C 16小時(shí)光照(-400 μ moIm^s"1)及于22 24V 8小時(shí)暗的生長室4周。獨(dú)立地收獲芽及根，及評定生物質(zhì)差異作為生長標(biāo)記物。在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下通過芽生物質(zhì)所測的植物生長降至大致在高氮濃度 (IOmM硝酸鹽)的70% (干重的73% )，及在低氮濃度(ImM硝酸鹽)下通過芽生物質(zhì)所測的植物生長進(jìn)一步降至在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)的大致30% (干重的33%)(圖1A)。 在2種限制氮濃度下根生物質(zhì)降低稍微多于芽，其分別為干重的69%及25% (圖1B)，導(dǎo)致增加的芽/根比及增加的氮應(yīng)激(圖1C)。實(shí)施例2響應(yīng)氮缺乏使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。當(dāng)N缺乏發(fā)生時(shí)，葉黃化及有紫色類黃酮花青苷是植物具有的一些典型的應(yīng)答(Diaz U，et al, Plant and Cell Physiology，2006，47 :74-83)。相對花青苷含量基于由 Neff 及 Chory 描述的方法分析(Neff MM&Chory J,Plant Physiol, 1998,118 :27-35)?？?cè)~綠素任一使用Minolta SPAD 502DL葉綠素儀(Tokyo，Japan)測量，或通過乙醇提取及通過分光光度計(jì)根據(jù)Kirk(Kirk，JT0，Planta，Berl，1968，78 :200)測試。葉中葉綠素及花青苷水平在高及中氮條件下類似。在低氮條件下，植物不是明顯的黃或紫，盡管相比高及中氮條件，葉綠素降低及花青苷增加顯著(圖ID及1E)。實(shí)施例3暴露于不同的氮水平的植物中游離的硝酸鹽含量的變化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。冷凍的芽及根組織用于測定在不同的氮條件下硝酸鹽含量的差異。硝酸鹽含量根據(jù) Cataldo DA, et al, Commun. Soil ScL Plant Anal 1975，6 :71-80 通過比色測定分析。芽中的游離的硝酸鹽含量在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下降至在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)的70 % (3. 35mg/gFff對比4. 55mg/gFff)，及在低氮濃度(ImM硝酸鹽)下不更降低 (2. 85mg/gFW對比4. 55mg/gFff)(圖2A)。根中的游離的硝酸鹽含量在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下相比高氮濃度(IOmM硝酸鹽)降低約半(4. 8mg/gFff對比9. 9mg/gFff)，及在低氮濃度(ImM硝酸鹽)下相比在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)發(fā)生幾乎20倍下降(0. 45mg/gFW對比 9. 9mg/gFff)(圖 2B)。實(shí)施例4暴露于不同的氮水平的植物中氨基酸含量的變化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。將冷凍的芽及根組織用于測定在不同的氮條件下氨基酸含量的差異。用80%，50% 及0%乙醇在IOmM HEPES-K0H(pH 7.4)中連續(xù)提取總氨基酸，將上清合并，及根據(jù)Rosen H, Arch. Biochem. Biophys. 1957,67 :10-15 測定總氨基酸。芽中的總氨基酸含量在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下降至在高氮濃度(IOmM硝酸鹽) 的77%，及在低氮濃度(ImM硝酸鹽)下降至在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)的35% (圖2C)。 在根中觀察到類似降低(圖2D)。實(shí)施例5暴露于不同的氮水平的植物中可溶性蛋白含量的變化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。將冷凍的芽及根組織用于測定在不同的氮條件下可溶性蛋白含量的差異?？偪扇苄缘鞍子煤?IOOmM HEPES-KOH, pH 7. 5，及 0. 1 % iTriton X-100 的緩沖液提取，及使用 Bio-Rad 蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc. , California, USA)測定。在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下芽中的總可溶性蛋白類似于在來自在高氮濃度 (IOmM)下生長的植物的芽中觀察到的水平，但在低氮濃度(ImM)下顯著更低(圖2E)。在相同的條件下生長的根中觀察到類似結(jié)果(圖2F)。實(shí)施例6暴露于不同的氮水平的植物中總氮含量的變化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。將冷凍的芽及根組織用于測定在不同的氮條件下總氮含量的差異。干燥的組織中總氮的百分率通過微-Dumas燃燒分析方法使用Carlo Erba NA1500 C/N分析儀測量(Carlo Erba Strumentazione, Milan, Italy)。在中氮濃度(5mM硝酸鹽)下芽中的總氮百分率類似于在來自在高氮濃度(IOmM) 下生長的植物的芽中觀察到的水平，但在低氮濃度(ImM)下顯著更低(圖2G)。在相同的條件下生長的根中觀察到類似結(jié)果(圖2H)。實(shí)施例7暴露于不同的氮水平的植物中區(qū)別表達(dá)的基因的鑒定使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin變種植物如實(shí)施例1中所述生長。收獲在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)，中氮濃度(5mM硝酸鹽)及低氮濃度(ImM硝酸鹽) 下生長的4周齡野生型稻植物的芽及根來比較在不同的，但穩(wěn)定的氮濃度下基線基因表達(dá)水平。各氮濃度具有3個生物學(xué)重復(fù)。附加地，在收獲之前2小時(shí)，將在低氮濃度(ImM硝酸鹽)下生長的一些植物轉(zhuǎn)移到高氮濃度(IOmM硝酸鹽)來評定響應(yīng)2小時(shí)氮誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。將在高氮濃度(IOmM硝酸鹽)下生長的其他植物轉(zhuǎn)移到低氮濃度(ImM硝酸鹽) 來評定響應(yīng)2小時(shí)氮降低的基因表達(dá)變化。全部樣品在中午采取，以最小化碳及氮代謝的晝變化。收集各時(shí)間點(diǎn)的3個生物學(xué)重復(fù)。將來自各樣品的5 μ g的總RNA用于合成雙鏈cDNA。將從cDNA合成的標(biāo)記的互補(bǔ) RNA與自定義設(shè)計(jì)的稻GENECHIP 全基因組陣列雜交(zhu T，Current Opinion in Plant Biology 2003,6 :418-425)。由GENECHIP 掃描儀3000獲得陣列的雜交信號， 及通過MAS 5.0(Affymetrix, California，美國)定量。探針組測量總結(jié)為一組中全部探針的加權(quán)平均值，使用自定義算法減去整個陣列的平均強(qiáng)度的底部5%。將各陣列的全部探針組的總體強(qiáng)度進(jìn)一步標(biāo)度到100的靶強(qiáng)度以使直接比較。在以下樣品(對于芽及根各4個)之間進(jìn)行8個比較(1)高氮濃度對比中氮濃度(IOmM硝酸鹽對比5mM硝酸鹽)；( 高氮濃度對比低氮濃度(IOmM硝酸鹽對比ImM硝酸鹽)；(3)低氮濃度(ImM硝酸鹽)對比低to高氮濃度O小時(shí)氮誘導(dǎo))；及⑷高氮濃度 (IOmM硝酸鹽)對比高到低氮濃度O小時(shí)氮降低)。收集的數(shù)據(jù)使用GeneSpring(Agilent，California，美國)分析。數(shù)據(jù)使用程序的默認(rèn)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)化，然后是基因篩選，其要求各基因在3個復(fù)制樣品中必需具有任一'P' 或'M'標(biāo)記。此之后是第二篩選步驟要求3個樣品之至少一個具有'P'標(biāo)記。此基本上保證組中留下的每個基因?qū)⑹?個重復(fù)之中'PMM'，‘ PPM'，或'PPP'。對于配對組比較，首先鑒定有2-倍變化的基因，然后將ANOVA用于鑒定顯著的基因(Welch t檢驗(yàn)， 0. 05的ρ-值截止值)。
為確認(rèn)微陣列分析的結(jié)果，通過定量實(shí)時(shí)PCR測試來自不同的比較組的8個顯著的基因的表達(dá)。使用TRIZOL試劑(Invitrogen，California，美國)從植物組織分離總 RNA。為消除任何殘留的基因組DNA，總RNA用無RQl RNA酶的DNA酶(!Iomega，Wisconsin， 美國)處理。通過使用反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(ftOmega)從總RNA合成第一鏈cDNA。將 PRIMER EXPRESS 2· 0 軟件(Applied Biosystems, California, USA)用于設(shè)計(jì)引物。 基本上根據(jù) Kant S，et al. ,Plant Cell Environ.，2006，四1220-12 進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。各靶基因的相對定量(RQ)值通過方法(Livak KJ, Schmittgen TD,Methods, 2001, 25 402-408)使用ACTIN2作為內(nèi)部參照基因(用于比較來自不同的PCR運(yùn)行或cDNA樣品的數(shù)據(jù))計(jì)算。為確保2_“"方法的有效性，將來自對照植物鹽芥(Thellimgiella)及擬南芥的cDNA的2倍系列稀釋液用于創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，及靶及參照基因的擴(kuò)增效率顯示大致相等 (Livak &khmittgen，2001年)。相對表達(dá)水平的結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)非常一致。對于芽及根，全部基因的基線表達(dá)水平在高及中氮濃度下生長的樣品之間仍類似(表1)。但是，在低氮濃度下根及芽之間的轉(zhuǎn)錄變化不同，如在根樣品中鑒定59種顯著的基因(27種上調(diào)的， 及32種下調(diào)的)，但在芽樣品中無(表1)。表1
權(quán)利要求
1.分離的0sEN0D93核酸，其包括(a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；(b)與SEQID NO 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸； (C)SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(d)與SEQID NO 2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸；(e)核苷酸序列，其編碼包括SEQID NO 3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白；或(f)互補(bǔ)于(a) (e)的核酸的核苷酸序列。
2.載體，其包括權(quán)利要求1的核酸。
3.宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求2的載體。
4.權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
5.分離的0sEN0D93蛋白，其包括SEQID NO 3所示的氨基酸序列。
6.抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合權(quán)利要求5的分離的0sEN0D93蛋白。
7.轉(zhuǎn)基因植物，其經(jīng)權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)化。
8.權(quán)利要求7的植物，其是單子葉植物。
9.權(quán)利要求7的植物，其是雙子葉植物。
10.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將重組核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，其中所述重組核酸包括(a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；(b)與SEQID NO 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸； (C)SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；(d)與SEQID NO 2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下特異性地雜交的核酸；或(e)核苷酸序列，其編碼包括SEQID N0:3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
13.權(quán)利要求10的方法，其中使用選自下列的方法將所述重組核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞微粒轟擊，土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，及頸須-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸的導(dǎo)入導(dǎo)致權(quán)利要求10的核酸序列的組成性過表達(dá)。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物顯示在以下方面增加氮使用效率，籽產(chǎn)率，應(yīng)激耐受性，硝酸鹽水平，生物質(zhì)，或氨基酸水平。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述植物顯示增加的氮使用效率。
17.鑒定增強(qiáng)編碼0sEN0D93蛋白的核酸的表達(dá)水平的試劑的方法，包括(a)提供表達(dá)權(quán)利要求5的0sEN0D93蛋白的細(xì)胞；(b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定編碼0sEN0D93蛋白的核酸的表達(dá)；(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)，誘導(dǎo)核酸的升高的表達(dá)的測試試劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述一或多種測試試劑是肽，蛋白，寡聚體，核酸，小分子，無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，有機(jī)化學(xué)物質(zhì)或抗體。
19.增加編碼0sEN0D93蛋白的核酸的表達(dá)水平的方法，其包括使表達(dá)權(quán)利要求5的0sEN0D93蛋白的植物或細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求17的試劑接觸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述核酸顯示組織-特異性表達(dá)。
21.鑒定0sEN0D93蛋白的結(jié)合偶體的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供權(quán)利要求5的0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┰趯τ诮Y(jié)合而言足夠的條件下接觸；(c)測定測試試劑與分離的0sEN0D93蛋白的結(jié)合；及(d)選擇展示特異性結(jié)合0sEN0D93蛋白的測試試劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述一或多種測試試劑是肽，蛋白，寡聚體，核酸，小分子，無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，有機(jī)化學(xué)物質(zhì)或抗體。
23.鑒定0sEN0D93活化劑的方法，其包括下列步驟(a)提供表達(dá)權(quán)利要求5的0sEN0D93蛋白的細(xì)胞；(b)使細(xì)胞與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定0sEN0D93靶基因的表達(dá)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑與測試試劑接觸時(shí)誘導(dǎo)靶基因的升高的表達(dá)的測試試劑，該基因正常經(jīng)歷0sEN0D93誘導(dǎo)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述一或多種測試試劑是肽，蛋白，寡聚體，核酸，小分子，無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，有機(jī)化學(xué)物質(zhì)或抗體。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述靶基因選自氮代謝基因，碳代謝基因，及光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)基因。
26.鑒定0sEN0D93活化劑的方法，其包括下列步驟(a)提供表達(dá)權(quán)利要求5的0sEN0D93蛋白的植物；(b)使植物與一或多種測試試劑或?qū)φ赵噭┙佑|；(c)測定所述植物的硝酸鹽含量，氨基酸含量，氮攝取，籽產(chǎn)率，或生物質(zhì)；及(d)選擇當(dāng)相比對照試劑在測試試劑的存在下誘導(dǎo)增加的硝酸鹽含量，增加的氨基酸含量，增加的硝酸鹽攝取，增加的籽產(chǎn)率或增加的生物質(zhì)的測試試劑。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述一或多種測試試劑是肽，蛋白，寡聚體，核酸，小分子，無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，有機(jī)化學(xué)物質(zhì)或抗體。
28.改良植物產(chǎn)率的方法，包括使植物與權(quán)利要求21的0sEN0D93結(jié)合劑接觸。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述植物是單子葉植物。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
31.改良植物產(chǎn)率的方法，包括使植物與權(quán)利要求沈的0sEN0D93活化劑接觸。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述植物是單子葉植物。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
全文摘要
用于改善的氮利用，增加的產(chǎn)率，及增加的應(yīng)激耐受性的分離的核酸及蛋白、以及表達(dá)所述分離的核酸及蛋白的植物。
文檔編號C12N15/82GK102164953SQ200980137557
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者J·克拉克, S·康德, S·羅思坦, Y-M·比 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司, 圭爾夫大學(xué)