專利名稱：生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)用曲霉屬深層發(fā)酵而生產(chǎn)具有多種酶活性的酶產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
酶被廣泛用于食品和飼料工業(yè)中，例如在水果和蔬菜加工工業(yè)中。近年來(lái)，利用酶加工水果(包括漿果)醪液(Mash)已經(jīng)變成果汁(例如，柑橘，蘋(píng)果和梨)生產(chǎn)中的最新水平，因?yàn)樽罡叩目赡墚a(chǎn)量和通量已經(jīng)成為了首要的。果膠(在所有水果中發(fā)現(xiàn)的天然物質(zhì))，作為細(xì)胞膠起作用而給予水果結(jié)構(gòu)。在水果醪液中，果膠結(jié)合水以增加粘性，并使得通過(guò)壓榨機(jī)或傾析器(decanter)在液體/固體分離中釋放果汁變得困難。酶的使用允許生產(chǎn)者根據(jù)需求控制生產(chǎn)。在柑橘水果加工中，酶的應(yīng)用降低了果汁的粘性，消除了果汁濃縮和儲(chǔ)存過(guò)程中膠凝化的風(fēng)險(xiǎn)，確保了高的混濁穩(wěn)定性。在果肉提取過(guò)程中應(yīng)用時(shí)，酶促進(jìn)了果汁和固體的釋放，提高了產(chǎn)量，并改善了成本效率。穩(wěn)定的混濁(或者，在檸檬汁的情況中，成功的澄清)是終產(chǎn)品質(zhì)量上乘的重要評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在柑橘水果加工過(guò)程中利用酶時(shí)也可以回收柑橘屬精油。除了提供有價(jià)值的商品外，柑橘屬精油的回收從可持續(xù)性的角度來(lái)看是重要的， 其確保了廢水中殺菌油的低含量，用于改善的廢水生物可降解能力，并減少了整體上的水消耗。酶也被用于高澄清度的蘋(píng)果和梨汁的生產(chǎn)，其依賴于淀粉和果膠內(nèi)容物的完全分解。 這是通過(guò)在澄清和過(guò)濾之前向果汁中加入果膠酶和降解淀粉的酶實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)在壓榨和果汁分離之前加入到水果醪液中，果膠酶引起醪液粘性的降低，導(dǎo)致增加的果汁產(chǎn)量和優(yōu)化的加工能力。更少的廢果渣和水果壓榨機(jī)更容易清潔是另外的有附加值的優(yōu)點(diǎn)。另外，在葡萄酒生產(chǎn)中，酶被用于將有價(jià)值的成分如芳香、顏色和單寧從葡萄轉(zhuǎn)移到葡萄酒中。酶還可幫助保持葡萄酒的質(zhì)量，有時(shí)保存許多年。它們也減少發(fā)酵時(shí)間并促進(jìn)澄清，過(guò)濾和穩(wěn)定化。如上面所提到的，在果汁生產(chǎn)過(guò)程中，酶制備物通常被用于水果的提取和液化以及果汁澄清的步驟中。商業(yè)的酶制備物含有主要是果膠酶(例如，多聚半乳糖醛酸酶，果膠酯酶，果膠裂解酶)以及少量其它水解酶(如阿拉伯聚糖酶(arabinanases)、半乳聚糖酶和木聚糖酶)的混合物。各種果膠酶的底物是果膠，它們是由α-1，4-糖苷鍵D-半乳糖醛酸聚合物組成的高分子量(20_100kDa)的多聚半乳糖醛酸。一些糖醛酸基團(tuán)用甲醇酯化了。 多聚半乳糖醛酸主鏈被所謂的須狀區(qū)(hairy region)中斷了，所述須狀區(qū)由鼠李糖-半乳糖醛酸主鏈與富含阿拉伯糖的側(cè)鏈組成。果膠降解酶(如多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，果膠裂解酶或果膠酸裂解酶) 是重要的，特別是在水果和蔬菜加工中(例如果汁加工或葡萄酒制造中)，其中利用了它們催化果膠聚合物的主鏈降解的能力。在自然中，果膠是作為高等植物細(xì)胞壁的組分存在的。它們?cè)诔跎诤桶g薄層中被發(fā)現(xiàn)，在那里它們被包埋在纖維素原纖維中。果膠的組成和甲基化程度在植物種類之間是可變的，并且還依賴于水果的年齡和成熟度。果膠最豐富的來(lái)源包括檸檬和桔子皮， 其可含有高達(dá)30%的此種多糖。果膠酶可以通過(guò)水解α-1，4-糖苷鍵(多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶和多聚半乳糖醛酸外切酶)或通過(guò)反式消除反應(yīng)(果膠裂解酶)降解碳水化合物聚合物。果膠酯酶可以將高度酯化的果膠去甲基化成為多聚半乳糖醛酸。果膠裂解酶是特異于高度酯化的果膠的，多聚半乳糖醛酸酶水解低度酯化的果膠。因此，高度酯化的果膠可以由果膠裂解酶或果膠酯化酶與多聚半乳糖醛酸酶的組合來(lái)降解。在水果和蔬菜加工的各種階段中，果膠酶起了重要作用。最初，果膠酶被用于處理軟的水果，以確保壓榨時(shí)果汁和色素的高產(chǎn)量，以及澄清粗壓榨果汁。多聚半乳糖醛酸酶被用作浸解(macerating)酶用于生產(chǎn)果肉蜜，所述果肉蜜是松散的細(xì)胞懸浮液，其是有限的果膠降解的結(jié)果(特別是在胞間薄層中)。需要數(shù)種果膠酶以及纖維素分解酶的組合以幾乎完全地液化水果組織，從而促進(jìn)提取。蘋(píng)果汁的澄清可以例如通過(guò)果膠酯酶與多聚半乳糖醛酸酶的組合活性或通過(guò)果膠裂解酶(對(duì)其而言高度酯化的蘋(píng)果果膠是理想的底物)而被改善。在商業(yè)制備物中存在的大多數(shù)果膠酶是真菌起源的。黑曲霉(Aspergillus niger)對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)果膠降解酶是非常重要的生物體。在黑曲霉中，各種果膠酶不是組成性地表達(dá)的。需要果膠或果膠分子的降解產(chǎn)物作為誘導(dǎo)物質(zhì)。果膠酶生產(chǎn)的發(fā)酵條件常常產(chǎn)生廣泛的果膠酶。此外，黑曲霉產(chǎn)生所述各種果膠酶的許多同功酶。數(shù)個(gè)已公布的專利描述了編碼多聚半乳糖醛酸酶(EP 421 919，EP 0 388 593)，果膠裂解酶(EP 0 278 355， EP 0 353 188)和果膠酯酶(EP 0388 593)的基因已被分離，并且被用于構(gòu)建超量生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化體。這些轉(zhuǎn)化體允許生產(chǎn)在例如浸漬應(yīng)用中、和在對(duì)各種果膠酶在例如液化和澄清的過(guò)程中的影響的研究中所需的特異性的酶。也曾描述了來(lái)自液化處理后所獲得的蘋(píng)果汁的細(xì)胞壁多糖的分離和表征，在所述液化處理中，通過(guò)果膠溶解酶和纖維分解酶的聯(lián)合作用而從蘋(píng)果果肉釋放果汁。這些細(xì)胞壁多糖類似于蘋(píng)果果膠的須狀區(qū)(具有富含阿拉伯糖的側(cè)鏈的鼠李糖-半乳糖醛酸主鏈)，并且被稱為經(jīng)修飾的須狀區(qū)(ΜΗ 。須狀區(qū)已知不僅存在于蘋(píng)果中，也存在于胡蘿
卜、葡萄和草莓中，并且可能是果膠分子共有的部分。經(jīng)修飾的須狀區(qū)對(duì)于由存在于大多數(shù)純的和工業(yè)的果膠酶和纖維素酶制備物中的酶引起的降解有抵抗性。已發(fā)現(xiàn)從棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)獲得的商業(yè)粗制酶制備物能夠使這些片段的鼠李半乳糖醛酸聚糖主鏈解聚。通過(guò)利用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測(cè)量分子量分布中的遷移而使得此活性可見(jiàn)。負(fù)責(zé)降解從蘋(píng)果汁制備的經(jīng)修飾的須狀區(qū)的酶被稱為鼠李糖半乳糖醛酸酶 (rhamnogalacturonase) (RGase)。該酶可分裂(蘋(píng)果)果膠的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖主鏈中的糖苷鍵，從而除了其它還沒(méi)有被完全鑒別出的反應(yīng)產(chǎn)物外，還產(chǎn)生了由半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖構(gòu)成的一系列寡聚物，其中以鼠李糖在非還原末端，因此將此新酶命名為鼠李糖半乳糖醛酸酶(RG-ase)。US 5，591，620描述了編碼鼠李糖半乳糖醛酸酶(RG-ase)的曲霉基因的分離和過(guò)量表達(dá)RG-ase的重組曲霉菌株的構(gòu)建。這些菌株可被用于商業(yè)生產(chǎn)RG-ase。EP1658359描述了包含由橄欖或橄欖組分組成的物質(zhì)和含有至少一種果膠酯酶、 至少一種多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶和至少一種多聚半乳糖醛酸外切酶的酶混合物的制備物。 在所述制備物中，果膠酯酶活性與多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性的比例至少為0. 13，并且果膠酯酶活性與多聚半乳糖醛酸外切酶活性的比例至少為0. 3。WO 2008/117301涉及通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)多酶體系的方法。W02008/117301也描述了在優(yōu)化條件下利用米曲霉(Aspergillus oryzae)MTCC 5154，用于通過(guò)深層發(fā)酵而生產(chǎn)多酶體系。所描述的產(chǎn)品是不同的酶(例如α-淀粉酶，淀粉葡糖苷酶，羧甲基纖維素酶，果膠酶，β半乳糖苷酶和木聚糖酶)的混合物。在"Aspergillus Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Wall Polysaccharies", Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec. 2001,p. 497-522 de Vries等人描述了由曲霉產(chǎn)生的參與植物細(xì)胞壁多糖降解的不同類別的酶、編碼這些酶的基因、和這些基因的調(diào)控。此外還描述了從曲霉屬菌株檢測(cè)到的細(xì)胞壁降解活性。W097/43423描述了從粗制的、混合的酶制備物果膠酶146純化α葡糖醛酸酶，其作為源自具有參考編號(hào)4Μ146的曲霉屬菌株的果膠酶來(lái)源在市場(chǎng)上被出售。還可以得到含有許多不同的降解性酶的商業(yè)制備物。然而，由于在工業(yè)加工中，最高可能的產(chǎn)量和通量越來(lái)越重要，仍然需要更有效的提供酶溶液的方法。
發(fā)明概要在一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法以及由所述方法獲得的酶產(chǎn)品，所述方法包括下述步驟在包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉屬菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在一個(gè)方面，提供了至少包含下列酶活性的酶產(chǎn)品多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果膠酯酶活性，果膠裂解酶活性，纖維素酶活性，木聚糖酶活性和阿拉伯聚糖酶活性并且其中所述酶產(chǎn)品是由曲霉屬菌株的深層發(fā)酵獲得的表達(dá)產(chǎn)品。在一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法以及由所述方法獲得的酶產(chǎn)品，所述方法包括下列步驟在發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，并任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在一個(gè)方面，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料。在一個(gè)方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品、酶載體和任選地穩(wěn)定劑和/或防腐劑的酶產(chǎn)品制備物。在一個(gè)方面，提供了可由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的酶產(chǎn)品。在一個(gè)方面，提供了具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉，或其衍生物或后代。在一個(gè)方面，提供了具有保藏登記號(hào)CBS123488的分離的塔賓曲霉，或其衍生物或后代。在一個(gè)方面，提供了與具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉菌株具有基本上相同的特征的真菌培養(yǎng)物。在其它方面，提供了用于深層發(fā)酵曲霉屬菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含甜菜果肉和麩。


圖1顯示了如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下“測(cè)試2”中所述而制成的AJDU標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下“測(cè)試9”中所述而制成的的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下“測(cè)試11”中所述而制成的木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4顯示了利用如實(shí)施例4中所述的表面發(fā)酵方法發(fā)酵產(chǎn)生的酶產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特征譜。圖5顯示了利用如實(shí)施例4中所述的根據(jù)本發(fā)明的深層發(fā)酵方法的3種發(fā)酵產(chǎn)生的酶產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特征譜。圖6顯示了利用如實(shí)施例4中所述的根據(jù)本發(fā)明的深層發(fā)酵方法和表面發(fā)酵方法發(fā)酵產(chǎn)生的酶產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特征譜。圖7顯示了實(shí)施例4中制備的凝膠掃描。圖8顯示了在位點(diǎn)1的兩個(gè)表面發(fā)酵處(樣品1-2)和在位點(diǎn)1的2個(gè)深層發(fā)酵處(樣品3-4)以及在位點(diǎn)2的7個(gè)深層發(fā)酵處(樣品5-11)獲得的濃縮酶產(chǎn)品的酶活性。發(fā)明詳述在一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉屬菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。另一方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉屬菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在又一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在包含甜菜果肉和麥麩的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉屬菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法和由所述方法獲得的酶產(chǎn)品，所述方法包括下列步驟在發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在另一方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在又一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。將使用的包含果膠和阿拉伯聚糖的植物材料可以是包含果膠和阿拉伯聚糖的任何植物材料，例如甜菜果肉或谷麩或其組合。在另一方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，所述植物材料包含谷麩 (如麥麩)。在又一個(gè)方面，谷麩(例如麥麩)和甜菜果肉的混合物被用作所述植物材料。不愿被任何理論所限，相信包含果膠和阿拉伯聚糖(例如麥麩和/或甜菜果肉) 的植物材料對(duì)所產(chǎn)生的酶產(chǎn)品的組成有影響。還相信，所述植物材料(例如麥麩和/或甜菜果肉中)的阿拉伯聚糖含量直接地或間接地涉及所獲得的酶產(chǎn)品的相對(duì)較高的阿拉伯聚糖酶的含量。此種高阿拉伯聚糖酶含量，以及其它的酶活性，被認(rèn)為對(duì)于酶產(chǎn)品的應(yīng)用(例如在所述酶產(chǎn)品的水果相關(guān)的和/或葡萄酒的應(yīng)用中)是重要的。在一個(gè)方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，發(fā)酵培養(yǎng)基包含1-30% w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉，例如2-8% w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉，或者例如3-7% w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉。在另一方面，所述甜菜果肉具有0. 5-20% w/w的糖含量，或者例如2-8% w/w的糖含量。在另一方面，所述甜菜果肉具有5-40% w/w的阿拉伯聚糖含量。已發(fā)現(xiàn)，特別有用的甜菜果肉類型是未糖蜜化的甜菜果肉。在一個(gè)方面，所述植物材料包含谷麩。在另一方面，所述植物材料是谷麩和甜菜果肉的混合物。在又一方面，所述谷麩是麥麩。在另外的方面，所述麥麩具有2-20% w/w的阿拉伯聚糖含量。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”在本申請(qǐng)的情境中指通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基/培養(yǎng)物中生長(zhǎng)微生物而生產(chǎn)物質(zhì)(例如酶)。在一個(gè)方面，所述曲霉屬菌株作為一種單一的曲霉屬菌株培養(yǎng)物而被發(fā)酵。在另一方面，所述曲霉培養(yǎng)物是塔賓曲霉菌株的一種單一培養(yǎng)物。在又一方面，所述曲霉屬菌株 (例如塔賓曲霉菌株)未經(jīng)遺傳修飾(非GM0)。在又一個(gè)方面，所述曲霉菌株(例如塔賓曲霉菌株)還未經(jīng)自我克隆(self-cloned)。在一個(gè)方面，所述塔賓曲霉菌株具有的保藏登記號(hào)為CBS123488。在又一方面，所述曲霉屬菌株(例如塔賓曲霉菌株)已經(jīng)遺傳修飾 (GMO)。在一個(gè)方面，在發(fā)酵過(guò)程中pH的范圍是2. 7-6. 5。在一個(gè)方面，在發(fā)酵過(guò)程中pH 的范圍是3-4. 5。在另一方面，在發(fā)酵過(guò)程中pH的范圍是3-4。在又一方面，在發(fā)酵過(guò)程中 PH的范圍是3. 2-3. 7。在又一方面，在發(fā)酵過(guò)程中pH的范圍是3. 3-3. 7。在發(fā)酵過(guò)程中， PH譜可以保持恒定或者可以在所述的范圍內(nèi)變化。在一個(gè)方面，在發(fā)酵過(guò)程中保持pH，使得PH最多在士 1的pH-范圍內(nèi)變化，例如在士0.8的pH范圍內(nèi)，例如在士0.6的pH范圍內(nèi)，或者例如在士0.5的pH范圍內(nèi)，例如在士0.3的pH范圍內(nèi)，例如在士0. 25的pH范圍內(nèi)，例如在士0. 2的pH范圍內(nèi)，例如在士0. 15的pH范圍內(nèi)，例如在士0. 1的pH范圍內(nèi)，例如在士0.05的pH范圍內(nèi)。在一個(gè)方面，起始pH是例如，7.0，6. 5，6.0，5. 5，或5.0，而最終的 PH 是例如 4. 5,4. 0，3. 5 或 3. 0。本領(lǐng)域已知，在發(fā)酵器/生物反應(yīng)器中的不同位置處，pH可以變化。此外，這些pH 的變化可取決于培養(yǎng)基/培養(yǎng)液的粘性，其通常在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)比發(fā)酵將近結(jié)束時(shí)更粘。在一個(gè)方面，在發(fā)酵過(guò)程中，溫度在25-40°C的范圍內(nèi)。在另一方面，在發(fā)酵過(guò)程中，溫度在的范圍內(nèi)。在發(fā)酵過(guò)程中，溫度譜可保持恒定或在所述區(qū)間內(nèi)變化。在又一方面，所述發(fā)酵是作為需氧發(fā)酵進(jìn)行的。在一個(gè)方面，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含硫酸銨和/或硝酸鉀。在一個(gè)方面，提供了至少包含下列酶活性的酶產(chǎn)品i.多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性iii.果膠酯酶活性iv.果膠裂解酶活性v. 1，3-β-葡聚糖酶活性(或纖維素酶或昆布多糖酶或其任意組合)vi.木聚糖酶活性
vii.阿拉伯聚糖酶活性和viii.任選地阿拉伯呋喃糖苷酶活性并且其中所述酶產(chǎn)品是通過(guò)深層發(fā)酵曲霉屬菌株而獲得的表達(dá)產(chǎn)品。在根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品是來(lái)自發(fā)酵培養(yǎng)液的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液的形式。 在這方面的變體中，所述酶產(chǎn)品存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中。在一個(gè)方面，提供了至少包含下列酶活性的酶產(chǎn)品i.多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性iii.果膠酯酶活性iv.果膠裂解酶活性v.纖維素酶活性vi.木聚糖酶活性和vii.阿拉伯聚糖酶活性和viii.任選地阿拉伯呋喃糖苷酶。并且其中所述酶產(chǎn)品是由深層發(fā)酵曲霉屬菌株而獲得的表達(dá)產(chǎn)品。在另一方面， 所述曲霉屬菌株是單一培養(yǎng)物。在一個(gè)方面，所提供的酶產(chǎn)品還包含選自下列的一種或多種活性鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，半纖維素酶活性，葡糖淀粉酶活性，全淀粉酶(holoamylase)活性和昆布多糖酶活性。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含鼠李糖半乳糖醛酸酶活性。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含半纖維素酶活性。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含葡糖淀粉酶活性。在另一方面， 所述酶產(chǎn)品還包含全淀粉酶活性。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含昆布多糖酶活性如，1， 3-β -葡聚糖酶。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含淀粉酶活性。 所述酶產(chǎn)品也可包含半纖維素裂解活性。在其它方面，所述酶產(chǎn)品是由深層發(fā)酵曲霉屬菌株的一種單一培養(yǎng)物而獲得的表達(dá)廣品。在另一方面，提供了至少包含下列酶的酶產(chǎn)品i.歸類在EC 3. 2. 1. 15中的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶
ii.歸類在EC3. 2. 1. 67中的多聚半乳糖醛酸外切酶iii.歸類在EC3. 1. 1. 11中的果膠酯酶iv.歸類在EC4. 2. 2. 10中的果膠裂解酶v.歸類在EC3. 2. 1.4 ψ的纖維素酶vi.歸類在EC3. 2. 1. 8中的木聚糖酶和vii.歸類在EC3. 2. 1. 99中的阿拉伯聚糖酶，和viii.任選地歸類在EC3. 2. 1. 55中的阿拉伯呋喃糖苷酶并且其中所述酶產(chǎn)品是由深層發(fā)酵曲霉屬菌株而獲得的表達(dá)產(chǎn)品。在一個(gè)方面，與使用包含谷類/麥麩和甜菜果肉丸粒的類似發(fā)酵培養(yǎng)基、通過(guò)相同培養(yǎng)物的表面發(fā)酵而制備的酶產(chǎn)品中的多聚半乳糖醛酸外切酶活性相比，通過(guò)深層發(fā)酵制備的酶產(chǎn)品具有更高的多聚半乳糖醛酸外切酶活性，例如通過(guò)深層發(fā)酵比表面發(fā)酵高1. 2，1. 3，1. 4，1. 5，1. 6，1. 7，1. 8，1. 9或2. 0倍(如測(cè)試5所測(cè)量的)。在另一方面，與使用
包含谷類/麥麩和甜菜果肉丸粒的類似發(fā)酵培養(yǎng)基、通過(guò)相同培養(yǎng)物的表面發(fā)酵而制備的酶產(chǎn)品中的總酶活性相比(如測(cè)試1所測(cè)量的)，通過(guò)深層發(fā)酵制備的酶產(chǎn)品具有更高的總酶活性(如測(cè)試1所測(cè)量的)，例如通過(guò)深層發(fā)酵比表面發(fā)酵高1. 2，1. 3，1. 4，1. 5，1. 6或 1. 7 倍。在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中，本方法和/或產(chǎn)品提供了包括但不限于下述的一項(xiàng)或多項(xiàng)的優(yōu)勢(shì)更高的產(chǎn)量，改善的過(guò)程控制，改善的PH控制(不依賴于緩沖劑和/或緩沖能力)，改善的通風(fēng)，改善的無(wú)菌性，不需要的微生物/污染物的生長(zhǎng)的減少，在培養(yǎng)基制備過(guò)程中不需要的反應(yīng)的減少(例如Maillard反應(yīng)，即氨基酸和還原糖之間在加熱時(shí)的化學(xué)反應(yīng))。在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的其它優(yōu)勢(shì)是酶活性存在于發(fā)酵培養(yǎng)液的液體/水性/溶解的部分中，這與表面發(fā)酵相反，在表面發(fā)酵中必須用適當(dāng)?shù)木彌_劑提取固體培養(yǎng)基以收獲酶/酶活性。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)中通過(guò)深層發(fā)酵所提供的酶產(chǎn)品具有一種或多種更高的酶活性，例如選自下列的一種或多種活性多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果膠酯酶活性，果膠裂解酶活性，1，3- β -葡聚糖酶/纖維素酶/昆布多糖酶活性，木聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，葡糖淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，根據(jù)測(cè)試1的QVC粘度測(cè)定活性，根據(jù)測(cè)試2的蘋(píng)果汁去果膠化單位，和/或根據(jù)測(cè)試3的果膠反式消去酶(Pectin transeliminase)活性。不愿被任何理論所限，相信選自多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果膠酯酶活性，果膠裂解酶活性，1,3-β葡聚糖酶活性，纖維素酶活性，昆布多糖酶活性，木聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，葡糖淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性中的一種或多種酶活性顯示出與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)的線性或近似線性的相關(guān)性根據(jù)測(cè)試1測(cè)量的QVC粘度測(cè)定活性，根據(jù)測(cè)試2的蘋(píng)果汁去果膠化單位活性和/或根據(jù)測(cè)試3的果膠反式消去酶活性/果膠裂解酶活性。在一個(gè)方面，如“測(cè)試3”中所述的果膠裂解酶活性/果膠反式消去酶活性被用于關(guān)聯(lián)或預(yù)測(cè)本酶產(chǎn)品或本酶制備物的酶活性。另一方面，所述酶產(chǎn)品是由深層發(fā)酵曲霉屬菌株(例如曲霉屬菌株的一種單一培養(yǎng)物)而獲得的表達(dá)產(chǎn)品。在一個(gè)方面，用于所述深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含甜菜果肉。在一個(gè)方面，用于所述深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含谷麩，例如麥麩。在一個(gè)方面，用于深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含1-30% (w/w)范圍內(nèi)的甜菜果肉。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品包含i. 一種或多種多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，ii. 一種或多種多聚半乳糖醛酸外切酶，iii. 一種或多種果膠酯酶，iv. 一種或多種果膠裂解酶，v. 一種或多種昆布多糖酶，vi. 一種或多種木聚糖酶，
vii. 一種或多種阿拉伯聚糖酶和viii.任選地一種或多種阿拉伯呋喃糖苷酶。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品包含i. 一種或多種多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，ii. 一種或多種多聚半乳糖醛酸外切酶，iii. 一種或多種果膠酯酶，iv. 一種或多種果膠裂解酶，v. 一種或多種纖維素酶，vi. 一種或多種木聚糖酶，vii. 一種或多種阿拉伯聚糖酶和viii.任選地一種或多種阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含鼠李糖半乳糖醛酸酶。在另一方面，所述酶產(chǎn)品還包含一種或多種半纖維素酶，例如歸類在EC3. 1. 1. 73 中的阿魏酸酯酶。在又一方面，所述酶產(chǎn)品包含歸類在EC 3. 2. 1.1，EC 3. 2. 1. 2，EC 3. 2. 1. 3，EC 3. 2. 1. 20，EC 3. 2. 1. 60，EC 3. 2. 1. 68，EC 3. 2. 1. 98 或 EC 3. 2. 1. 133 中的一種或多種淀粉酶。在又一方面，所述酶產(chǎn)品包含歸類在EC3. 2. 1. 3或EC3. 2. 1. 20中的一種或多種葡糖淀粉酶。在又一方面，所述酶產(chǎn)品包含歸類在EC3. 2. 1. 133中的一種或多種全淀粉酶。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品至少包含下列酶i. 一種或多種多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，ii. 一種或多種多聚半乳糖醛酸外切酶，iii. 一種或多種果膠酯酶，iv. 一種或多種果膠裂解酶，v. 一種或多種纖維素酶，vi. 一種或多種木聚糖酶，vii. 一種或多種阿拉伯聚糖酶，viii. 一種或多種鼠李糖半乳糖醛酸酶，ix. 一種或多種葡糖淀粉酶，χ. 一種或多種淀粉酶，xi. 一種或多種全淀粉酶和xii.任選地一種或多種阿拉伯呋喃糖苷酶。在本發(fā)明的一方面，多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性是如“測(cè)試6”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，多聚半乳糖醛酸外切酶活性是如“測(cè)試5”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，果膠酯酶活性是如“測(cè)試7”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，果膠裂解酶活性是如“測(cè)試3”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，阿拉伯聚糖酶活性是如“測(cè)試8”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，纖維素酶活性是如“測(cè)試9”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，木聚糖酶活性是如“測(cè)試11”中所述測(cè)定的。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品還可包含一種或多種其它活性。在本發(fā)明的一方面，淀粉酶活性是如“測(cè)試12”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的一方面，葡糖淀粉酶活性是如“測(cè)試14”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的一方面，全淀粉酶活性是如“測(cè)試13”中所述測(cè)定的。在本發(fā)明的另一方面，昆布多糖酶活性是如“測(cè)試10”中所述測(cè)定的。在另一方面，提供了具有下列酶活性的酶產(chǎn)品，例如如在標(biāo)題“測(cè)試”下描述的下列測(cè)試中所測(cè)量的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性，并且具有至少下列活性多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果膠酯酶活性，果膠裂解酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，纖維素酶活性，和木聚糖酶活性，其中所述酶產(chǎn)品是通過(guò)深層發(fā)酵曲霉屬菌株的一種單一培養(yǎng)物而獲得的天然表達(dá)廣品。在本申請(qǐng)中與術(shù)語(yǔ)“酶產(chǎn)品”可互換使用的術(shù)語(yǔ)“酶復(fù)合物”在本申請(qǐng)的情境中指包含數(shù)種酶的混合物的產(chǎn)品或復(fù)合物，所述數(shù)種酶具有不同的酶活性和/或被歸類在不同的酶委員會(huì)(Enzyme Commission)編號(hào)(EC編號(hào))下。在另一方面，所述酶復(fù)合物也包含副活性(side activity)。在一個(gè)方面，所述“酶復(fù)合物”或“酶產(chǎn)品”是通過(guò)深層發(fā)酵獲得的(任選地濃縮的)基本上無(wú)細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液。在另一方面，所述“酶復(fù)合物”或“酶產(chǎn)品”仍然存在于通過(guò)深層發(fā)酵獲得的、包含細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液中。在本申請(qǐng)的情境中，術(shù)語(yǔ)“副活性”指酶對(duì)于不是其主要底物的其它底物可能具有的一種或多種另外的活性，或者其是指酶產(chǎn)品可能具有的其主要活性以外的其它活性。術(shù)語(yǔ)“不同的酶”或“具有不同酶活性的酶”指具有如由本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)方法所測(cè)定的不同底物特異性的酶，或者其中所述酶具有相同的酶底物特異性但是在典型的酶參數(shù)(例如，如由常規(guī)方法所測(cè)量的最佳PH、最佳溫度、Km或Ip(等電點(diǎn)))上不同。因此，在一個(gè)方面，兩種或多種酶活性可以是具有一種或多種副活性的一種或多種酶的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品優(yōu)選地由單一培養(yǎng)物通過(guò)多重表達(dá)而表達(dá)。在一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品因而可通過(guò)單一培養(yǎng)物的發(fā)酵而獲得，其中所述單一培養(yǎng)物指生長(zhǎng)自一種生物體的培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)物優(yōu)選是基本上純的，例如至少 90 %純(按重量)，優(yōu)選至少95 %純(按重量)，更優(yōu)選至少97 %純(按重量)，甚至更優(yōu)選至少99%純(按重量)。將要理解，“基本上純的培養(yǎng)物”可含有更小量的其它生物體，例如相同菌株的其它克隆或其它菌株。果膠是非常復(fù)雜的，并且發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的包含各種具有不同活性的酶的酶產(chǎn)品非常適于果膠的降解。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品包含足夠的副活性以降解非果膠多糖化合物，例如由在標(biāo)題“測(cè)試”下描述的“測(cè)試1”或“測(cè)試2”所測(cè)量的。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品含有降解非常復(fù)雜的非果膠多糖化合物所需的副活性，如由“測(cè)試1”所測(cè)定的。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品包含至少10種不同的副活性。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品包含至少15種不同的副活性。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品包含至少20種不同的副活性。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品包含至少60種不同的副活性。多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶被歸類在EC3. 2. 1. 15中，并且催化果膠酸和其它聚半乳糖醛酸中(1- > 4)-a-D-半乳糖苷連接的隨機(jī)水解。許多不同的酶屬于此類別，包括D-半乳糖醛酸酶，內(nèi)切-D-聚半乳糖醛酸酶，內(nèi)切-D-半乳糖醛酸酶，內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶。多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(EC 3. 2. 1. 15)水解聚半乳糖醛酸鏈中的(內(nèi)部)糖苷連接，形成寡聚半乳糖醛酸片段。“聚半乳糖醛酸酶活性”指水解聚半乳糖醛酸鏈中的糖苷連接的能力。多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(EC. 3. 2. 1. 15)活性指水解聚半乳糖醛酸鏈中的內(nèi)部糖苷連接的能力，這與多聚半乳糖醛酸外切酶(EC. 3. 2. 1. 67)活性相反，后者指通過(guò)水解(末端)糖苷連接而從聚半乳糖醛酸鏈釋放末端聚半乳糖醛酸的能力。多聚半乳糖醛酸外切酶活性可如下文所述被測(cè)定，其中1單位的多聚半乳糖醛酸外切酶活性被定義為下述的酶量其能夠在30°C、在50mM乙酸鈉緩沖液中、pH4. 2、以 0. 25% (w/v)的底物濃度，從作為模式底物的聚半乳糖醛酸(Sigma)中釋放1摩爾還原糖末端/分鐘。多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性可以通過(guò)在含有0. (w/v)聚半乳糖醛酸(pH4) (Sigma,P3850)的瓊脂平板上點(diǎn)一滴培養(yǎng)基來(lái)定性地確定。在于30°C孵育至少30分鐘后， 用4M HCl淹沒(méi)平板。在混濁的背景中，多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性作為白色的暈被顯現(xiàn)出來(lái)。備選地，通過(guò)用0.02% (w/v)釕紅溶液孵育而將平板染色。在那種情況下，多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性被顯示為紅色背景中的白點(diǎn)。介由如以前所描述的(Parenicova等人，在 Eur. J.biochem，251，72-80，1998 中， t示M是“PgaE encodes a fourth member of the endopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger”)比色檢測(cè)還原糖釋放而定量測(cè)定多聚半乳糖醛酸外切酶的催化活性。在30°C、在50mM的乙酸鈉緩沖液中、pH4. 2、以0. 25% (w/v)的聚半乳糖醛酸 (Sigma)作為模式底物而進(jìn)行水解反應(yīng)。酶活性被表達(dá)為U/mg，1單位相應(yīng)于所釋放的1摩爾還原末端/分鐘。在本發(fā)明的一方面，所述產(chǎn)品的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性是通過(guò)如下文中標(biāo)題 “測(cè)試”下所描述的“測(cè)試6”測(cè)量的。此方法測(cè)量所述活性對(duì)于聚半乳糖醛酸酶的物理影響，即粘性的降低。此方法對(duì)于內(nèi)切酶活性是特異性的，因?yàn)槿魏瓮馇忻富钚?糖的產(chǎn)生) 對(duì)于粘性將具有很小的影響或沒(méi)有影響。在本發(fā)明的另一方面，所述產(chǎn)品的多聚半乳糖醛酸外切酶活性是通過(guò)如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下所描述的“測(cè)試5”測(cè)量的。此方法測(cè)量還原基團(tuán)以及因此測(cè)量外切酶活性。在一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性。在本發(fā)明的另一方面，所述酶產(chǎn)品在多聚半乳糖醛酸外切酶活性和多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性之間具有的比例為1 1至8 1，例如2 1至6 1之間，例如 3 1至6 1之間。通過(guò)在“測(cè)試5”中測(cè)量多聚半乳糖醛酸外切酶活性和在“測(cè)試6”中測(cè)量多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性可確定所述比例。如在“測(cè)試6”中所述，一個(gè)單位的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性被定義為在測(cè)試條件下(pH3. 5和30°C )將水解底物、降低溶液粘性、以改變1個(gè)無(wú)量綱單位的相對(duì)流動(dòng)性/ 每分鐘的酶量。如在“測(cè)試5”中所述的，1單位的多聚半乳糖醛酸外切酶活性被定義為在測(cè)試的條件下(pH3. 5和50°C )產(chǎn)生1 μ mole D-半乳糖醛酸當(dāng)量/分鐘的酶量。在一個(gè)方面，多聚半乳糖醛酸外切酶和多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶之間的比例為至少約1 1，至少2 1或至少3 1，如通過(guò)“測(cè)試5”的方法與“測(cè)試6”的方法相比較而由單位確定所定義的。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有果膠酯酶活性。在本發(fā)明的一方面，所述產(chǎn)品的果膠酯酶活性是通過(guò)由果膠酯酶催化的反應(yīng)測(cè)量的，所述反應(yīng)涉及果膠混合物(例如，同聚半乳糖醛酸)中甲酯化的D-半乳糖苷糖醛酸(D-galactosiduronic acid)單位的脫酯化，得到酸性的果膠和甲醇，然后，所述酸性果膠是果膠解聚酶的底物。果膠酯酶(果膠甲酯酶)被歸類在EC3. 1.1.11中并催化反應(yīng)果膠+η H20 < = > η甲醇+果膠酸酯果膠酯酶也被稱為果膠去甲氧基酶，果膠甲氧基酶和果膠甲基酯酶。在本發(fā)明的一方面，所述產(chǎn)品的果膠酯酶活性是如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下描述的 “測(cè)試7”中所測(cè)量的。一個(gè)單位的果膠酯酶活性被定義為在“測(cè)試7”的條件下(ρΗ4. 6和30°C )或其它特定PH和溫度水平下，催化1 μ mole的甲基酯鍵水解(釋放1 μ mole果膠酸)/分鐘的酶量。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有果膠裂解酶活性(1 — 4)-6-0-甲基-α -D-聚半乳糖醛酸裂解酶。果膠裂解酶也被稱為果膠反式消去酶，內(nèi)切-果膠裂解酶，果膠甲基反式消去酶， 果膠裂合酶(pectolyase)或聚甲基半乳糖醛酸反式消去酶。果膠裂解酶(果膠反式消去酶)被歸類為EC4.2.2. 10。此酶催化(1_ > 4)-a-D_聚半乳糖醛酸甲酯的裂解，以得到在其非還原末端具有4-脫氧-6-0-甲基- a -D-半乳糖-4-enuronosyl基團(tuán)的寡糖。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的果膠裂解酶活性是由4，5_不飽和寡聚半乳糖醛酸酯的生成來(lái)測(cè)量的，所述4，5-不飽和寡聚半乳糖醛酸酯是由果膠的半乳糖醛酸殘基之間的內(nèi)部α-1，4鍵的隨機(jī)裂解引起的。可通過(guò)酶促水解蘋(píng)果果膠底物中半乳糖醛酸殘基之間的內(nèi)部α -1，4鍵來(lái)確定果膠裂解酶的活性，例如下文中在標(biāo)題“測(cè)試”下的“測(cè)試3”中所述的。反應(yīng)的進(jìn)展(特征是 4，5-不飽和寡聚半乳糖醛酸酯的增加)繼以利用分光光度計(jì)的吸光度的增加(由于不飽和鍵的形成)。酶活性是由238nm處吸光度的增加/單位時(shí)間來(lái)計(jì)算的?？稍趐H3. 5和30°C下進(jìn)行所述測(cè)試，或者可就酶的其它表征和說(shuō)明在不同的pH和溫度值下進(jìn)行所述測(cè)試。一個(gè)單位的果膠裂解酶活性被定義為在測(cè)試的條件下(pH3.5和30°C)得到 Δ OD238nm. rniiT1增加的酶量(對(duì)于總測(cè)試體積校正的)。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有阿拉伯聚糖酶活性。術(shù)語(yǔ)“阿拉伯糖酶”和術(shù)語(yǔ)“阿拉伯聚糖酶”在本申請(qǐng)中被可互換地使用，兩者均描述了被歸類在EC3. 2. 1.99中的阿拉伯聚糖酶。系統(tǒng)命名是5-α -L-阿拉伯聚糖5-α -L-阿拉伯聚糖水解酶，但是它有數(shù)個(gè)其它的名稱，例如阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-α -L-阿拉伯糖苷酶，和內(nèi)切-1，5-α -L-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切- α -1，5-阿拉伯聚糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切酶，1,5-α-L-阿拉伯聚糖和1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。阿拉伯糖酶內(nèi)切水解(1->5)_阿拉伯聚糖中的(1-> 5)-α-阿拉伯呋喃糖苷連接。阿拉伯聚糖酶也作用于阿拉伯聚糖。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的阿拉伯聚糖酶活性(或阿拉伯糖酶活性)是由如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下描述的“測(cè)試8”所測(cè)定的?？梢栽讦薛?.5和50°C下利用甜菜阿拉伯聚糖作為底物進(jìn)行該測(cè)試，并且可就酶的其它表征和說(shuō)明在不同的PH和溫度值下進(jìn)行所述測(cè)試。酶活性是由540nm處吸光度的增加/單位時(shí)間來(lái)計(jì)算的。一個(gè)單位的阿拉伯聚糖酶活性被定義為在測(cè)試條件下(pH3.5和50°C)得到 Δ OD540nm. miiT1增加的酶量(對(duì)于總的測(cè)試體積校正的)。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。術(shù)語(yǔ)“阿拉伯呋喃糖苷酶”描述了被歸類在EC 3.2. 1.55中的阿拉伯呋喃糖苷酶。其系統(tǒng)命名是α-Ν-阿拉伯呋喃糖苷酶。其它名稱是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。阿拉伯呋喃糖苷酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷，含有(1，3)_和/或(1,5)- 接的α -L-阿拉伯聚糖，阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的阿拉伯呋喃糖苷酶活性是由如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下描述的“測(cè)試16”所測(cè)定的?？梢栽趐H5. 0和50°C下利用對(duì)硝基苯α -L-阿拉伯呋喃糖苷進(jìn)行該測(cè)試，并且可就酶的其它表征和說(shuō)明在不同的PH和溫度值下進(jìn)行所述測(cè)試。反應(yīng)的產(chǎn)物，對(duì)硝基苯，是比色測(cè)定的(在調(diào)整PH后)。酶活性是由對(duì)硝基苯酚的濃度和400nm處的吸光度之間的關(guān)系來(lái)計(jì)算的。一個(gè)單位的α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性被定義為在測(cè)試條件下(ρΗ5.0和 500C (或如所指定的))從對(duì)硝基苯α -L-阿拉伯呋喃糖苷產(chǎn)生1 μ mole對(duì)硝基苯/分鐘的酶量。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有纖維素裂解活性。纖維素酶的系統(tǒng)命名是4-(1，3 ；1，4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和纖維素裂解酶或纖維素酶，被歸類在 EC3. 2. 1. 4中。纖維素酶內(nèi)切水解例如纖維素，地衣多糖和谷物β -D-葡聚糖中的(1- > 4)-β-D-糖苷連接，并且也將水解還含有1，3-連接的β-D-葡聚糖中的1，4-連接。纖維素酶還有其它的名稱，例如內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶，β-1，4-葡聚糖酶，β-1，4-內(nèi)切葡聚糖水解酶，纖維素酶A，cellul0Sin AP，內(nèi)切葡聚糖酶D，堿性纖維素酶，纖維素酶A 3，纖維素糊精酶，9.5纖維素酶，微晶粉末纖維素酶，全細(xì)胞酶55( 皿(^113^ SS)和1，4-(1，3 ； 1，4) - β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的纖維素酶活性是由如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下描述的“測(cè)試9”所測(cè)定的?？梢栽讦薛?. 5或ρΗ5和50°C下，利用CMC作為底物進(jìn)行該測(cè)試，可就酶的其它表征和說(shuō)明在不同的PH和溫度值下進(jìn)行所述測(cè)試。酶活性是由MOnm 處的吸光度增加/單位時(shí)間來(lái)計(jì)算的。一個(gè)單位的纖維素酶活性被定義為在測(cè)試條件下(pH3. 5和50°C )得到Δ OD540nm. miiT1增加的酶量(對(duì)于總的測(cè)試體積校正的)。木聚糖酶被歸類在EC3. 2. 1. 8，EC3. 2. 1. 32，EC3. 2. 1. 136 和 EC3. 2. 1. 156， EC3. 2. 1. 8，EC3. 2. 1. 136和EC3. 2. 1. 156中，活性可例如，如“測(cè)試11”中所述被測(cè)量。內(nèi)切-1，4_β-木聚糖酶被歸類在EC 3.2. 1.8中，該酶引起木聚糖中的1， 4-β-D-木聚糖苷鍵的內(nèi)切水解。
在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有如下文中標(biāo)題“測(cè)試”下描述的“測(cè)試11” 所測(cè)量的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶活性?？稍讦薛?. 5或ρΗ5和50°C下利用木聚糖作為底物進(jìn)行“測(cè)試11”，或者可就酶的其它表征和說(shuō)明在不同的PH和溫度值下進(jìn)行所述測(cè)試。酶活性是由MOnm處由木聚糖引起的吸光度增加/單位時(shí)間來(lái)計(jì)算的。在本申請(qǐng)中，一個(gè)單位的木聚糖酶活性被定義為在測(cè)試11的條件下(pH3.5和 500C )得到Δ OD540nm. miiT1增加的酶量(對(duì)于總的測(cè)試體積校正的)。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有鼠李糖聚半乳糖醛酸酶活性，如，例如 Suykerbuyk 等人在"Cloning, sequence and expression of the gene coding for rhamnogalacturonase of Aspergillus aculeatus ；a novel pectinolytic enzyme"Appl. Microbiol. Biotechnol (1995)43 :861-870 中所描述的而測(cè)量的。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品還包含被歸類在EC3. 1. 1. 73中的半纖維素酶(或阿魏酸酯酶)。半纖維素裂解酶或半纖維素酶被歸類在EC3. 1. 1. 73中，并且被接受的命名是阿魏酸酯酶。它們催化反應(yīng)阿魏?；?多糖+H2O =阿魏酸+多糖，其中阿魏酸是4-羥基-3-甲氧基肉桂酸。半纖維素裂解酶的系統(tǒng)命名是4-羥基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶。其還具有下列名稱阿魏酸酯酶，羥基肉桂酰酯酶，半纖維素酶輔助酶(accessary enzyme) ；FAE-III，肉桂酰酯水解酶，F(xiàn)AEA, cinnAE，F(xiàn)AE-I，和FAE-II。這些酶催化來(lái)自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏?；?基團(tuán)的水解，所述酯化的糖通常是“天然” 底物中的阿拉伯糖。對(duì)硝基苯乙酸和阿魏酸甲酯是較差的底物。所有的微生物阿魏酸酯酶都是被分泌到培養(yǎng)基中的。它們有時(shí)被稱為半纖維素酶輔助酶類，因?yàn)樗鼈冚o助木聚糖酶和果膠酶來(lái)分解植物細(xì)胞壁半纖維素。昆布多糖酶可以是被歸類在E. C. 3. 2. 1. 6中的內(nèi)切-1，3 - β -葡聚糖酶或被歸類在Ε. C. 3. 2. 1.39中的葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-D-葡糖苷酶。內(nèi)切_1，3 - β -葡聚糖酶被歸類在Ε. C. 3.2. 1.6中，其備選的名稱是昆布多糖酶，內(nèi)切-1，3-β-葡聚糖酶，內(nèi)切-1，4- β -葡聚糖酶。底物包括昆布多糖，地衣多糖和谷物D-葡聚糖，并且當(dāng)葡萄糖殘基(其還原基團(tuán)參與待水解的連接)本身在C-3被取代時(shí)，該酶催化β-D-葡聚糖中的 (1- > 3)-或(1- > 4)-連接的內(nèi)切水解。葡聚糖內(nèi)切-1，3- β -D-葡糖苷酶具有備選的名稱(1-> 3)-β -葡聚糖內(nèi)切水解酶，內(nèi)切-1，3-β -葡聚糖酶和昆布多糖酶，其被歸類在 Ε. C. 3. 2. 1.39中，并且水解底物(例如昆布多糖，副淀粉和茯苓聚糖)中(1->3)-β-葡聚糖中的(1_> 3)-β-D-葡糖苷連接。淀粉酶將淀粉分解為糖。所有的淀粉酶均為糖苷水解酶并作用于α -1，4_糖苷鍵上。α-淀粉酶(EC3. 2. 1. 1) (CAS#9014_71_5)(備選名稱1，4_ α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶；糖原酶)所述α-淀粉酶作用在沿淀粉鏈的隨機(jī)位置處并分解長(zhǎng)鏈碳水化合物， 最終由直鏈淀粉產(chǎn)生麥芽三糖和麥芽糖，或從支鏈淀粉產(chǎn)生麥芽糖，葡萄糖和有限糊精。 β -淀粉酶(EC3. 2. 1. 2)(備選名稱1，4- α -D-葡聚糖麥芽糖水解酶；糖原酶；糖原淀粉酶)是淀粉酶的另一種形式，其從非還原末端起作用，淀粉酶催化第二 α-1，4_糖苷鍵的水解，并一次切割掉兩個(gè)葡萄糖單位(麥芽糖)。
葡糖淀粉酶(EC3. 2. 1. 3)(備選名稱葡聚糖1，4_ α -葡糖苷酶；淀粉葡糖苷酶； 外切-1，4- α -葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶酶體-α -葡糖苷酶；1，4- α -D-葡聚糖葡糖水解酶)除了切割直鏈淀粉和支鏈淀粉非還原末端處最后的α (1，4糖苷連接)而產(chǎn)生葡萄糖外，葡糖淀粉酶將切割α (1-6)糖苷連接。全淀粉酶活性是酸性麥芽糖生成活性?！吧顚影l(fā)酵”在本申請(qǐng)的情境中指本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知的發(fā)酵類型，其中微生物在液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵，優(yōu)選使其經(jīng)受攪拌，例如連續(xù)和劇烈的攪拌。所述發(fā)酵可在開(kāi)放的罐或封閉的罐中進(jìn)行，并且可以是批次型、給料批次型或連續(xù)型。在批次發(fā)酵中，生物體在已知量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)確定的時(shí)期，然后可在進(jìn)一步加工之前將細(xì)胞群從液體中分離；而在連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)基可以根據(jù)產(chǎn)物形成的速度和新鮮培養(yǎng)基的流入而被取出。在給料批次型發(fā)酵中，將至少一種限制生長(zhǎng)的化合物(例如營(yíng)養(yǎng)底物)在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)給到發(fā)酵培養(yǎng)液中。具有相似活性的產(chǎn)物可以通過(guò)曲霉屬的表面發(fā)酵而獲得，然而，表面發(fā)酵的操作在實(shí)際中是困難的，并且酶產(chǎn)品有待從表面被純化或提取。此外，為了避免其它微生物的感染，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如熱處理或通過(guò)酸性PH處理)來(lái)滅菌用于深層發(fā)酵的液體培養(yǎng)基比滅菌用于表面發(fā)酵的固體培養(yǎng)基更簡(jiǎn)單。為了使培養(yǎng)基保持最佳的PH 值和/或恒定的PH值，通過(guò)加入ρΗ調(diào)節(jié)劑而在深層發(fā)酵過(guò)程中控制和調(diào)節(jié)ρΗ值也是更方便的。由于這些和其它的原因，深層發(fā)酵因此在工業(yè)規(guī)模中是比表面發(fā)酵優(yōu)選得多的方法。在一個(gè)方面，所述菌株來(lái)自黑曲霉組。在另一方面，所述菌株是塔賓曲霉。塔賓曲霉是黑曲霉組的成員。在又一個(gè)方面，提供了具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉或其衍生物或后代。在又一個(gè)方面，用于發(fā)酵的菌株與具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉菌株具有基本上相同的特征。在另一方面，所述菌株是具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉。在本發(fā)明的情境中，短語(yǔ)“基本上相同的特征”指該菌株具有與保藏在 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, NL-3584CT 烏特勒支，荷蘭 / P.O.Box 85167，NL-3508 AD烏特勒支，荷蘭的，具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選全部)特征。所述具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉被給予了下列登記號(hào)CBS123488塔賓曲霉4M 146，并且保藏日期是2008年9月30日。將理解的是，根據(jù)本發(fā)明而使用的真菌菌株可以是上述經(jīng)保藏的菌株的培養(yǎng)物， 但也可以是具有與上述經(jīng)分離和保藏的菌株基本上相同的特性的菌株的培養(yǎng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述菌株是經(jīng)保藏的菌株或其后代。在本發(fā)明的一方面，曲霉屬菌株的單一真菌培養(yǎng)物選自黑曲霉(Aspergillus niger) 402 (例如 CBS120. 49)，黑曲霉 hennebergii (Aspergillus niger hennebergii)(例如 CBS117. 80)，炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)(例如 CBS 112. 80，CBS420. 64)， 黑曲霉 nanus (Aspergillus niger nanus)(例如 CBS136. 52，CBS117. 48)，臭曲霉 (Aspergillus foetidus)(例如 CBS121. 78，CBS 618.78)，塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)(例如 CBS11529)，中間黑曲霄(Aspergillus niger intermedius)(例如CBS559. 65)和日本曲霉(Aspergillus japonicus)(例如 CBS114. 51，CBS621. 78)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(例如 CBS101. 43，CBS115. 80，CBS172. 66，CBS119. 49)， 淺藍(lán)灰曲霉(Aspergillus caesiellus),亮白曲霉(Aspergillus candidus),肉色曲霉(Aspergillus carneus)，棒曲霉(Aspergillus clavatus)，彎頭曲霉(Aspergillus deflectus)，黃曲霉(Aspergillus flavus)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，灰綠曲霉(Aspergillus glaucus),構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans),黑曲霉(Aspergillus niger)，赫曲霉(Aspergillus ochraceus)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)，青霉?fàn)钋?Aspergillus penicilloides)，局限曲霉 (Aspergillus restrictus)，醬油曲霉(Aspergillus sojae)，薩氏曲霉(Aspergillus sydowi),醬油曲霉(Aspergillus tamari), Aspergillus terreusm,焦曲霉(Aspergillus ustus),或者雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。在本發(fā)明的一方面，所述曲霉屬菌株是未經(jīng)遺傳修飾的。在本發(fā)明的一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品、酶載體和任選地穩(wěn)定劑和/ 或防腐劑的酶產(chǎn)品制備物。在本發(fā)明的又一方面，所述酶載體選自甘油或水。在又一方面，所述制備物包含穩(wěn)定劑。在一個(gè)方面，所述穩(wěn)定劑選自無(wú)機(jī)鹽，多元醇，糖及其組合。在一個(gè)方面，所述穩(wěn)定劑是無(wú)機(jī)鹽，例如氯化鉀。在另一方面，所述多元醇是甘油或山梨醇。在又一方面，所述糖是小分子碳水化合物，特別是數(shù)種甜味糖中的任何糖，例如葡萄糖，果糖和蔗糖。在又一個(gè)方面，所述制備物包含防腐劑。在一個(gè)方面，所述防腐劑是對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，苯甲酸酯，山梨酸酯或其它食品許可的防腐劑，或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品具有數(shù)個(gè)優(yōu)勢(shì)，例如在果汁的生產(chǎn)中。在一個(gè)方面，由于更容易的液體/固體分離和更高的果汁產(chǎn)量，提供了增加的產(chǎn)量。在一個(gè)方面，不論使用什么設(shè)備(臥式壓榨機(jī)，帶式壓榨機(jī)或傾淅器)，由于醪液和次級(jí)醪液的粘性降低，而提供了更高的容量。在一個(gè)方面，提供了更少的果渣，因?yàn)楦叩墓a(chǎn)量對(duì)剩余果渣的量有直接的影響。在一個(gè)方面，提供了壓榨機(jī)的更容易的清潔。在一個(gè)方面，提供了果汁中更少的果膠。 在一個(gè)方面，提供了快速、有效的醪液粘性的降低。在一個(gè)方面，提供了所有系統(tǒng)中良好的固體/液體分離和高的果汁產(chǎn)量。在一個(gè)方面，提供了果汁和濃縮物中高度有效的顏色提取和穩(wěn)定的顏色。在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物中的果膠裂解酶活性在 50-10. 000U/g的范圍內(nèi)，優(yōu)選在75-7000U/g的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選在100_5000U/g的范圍內(nèi)，例如，如下文所述的“測(cè)試3”中所測(cè)量的。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物中的果膠酯酶活性在10-10000U/g的范圍內(nèi)，優(yōu)選在100-7000U/g的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選在500-3000U/g的范圍內(nèi)，例如，如下文所述的“測(cè)試7”中所測(cè)量的。在又一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物中的阿拉伯聚糖酶活性在10-8000U/g 的范圍內(nèi)，優(yōu)選在50-4000U/g的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在100-2500U/g的范圍內(nèi)，例如，如下文所述的“測(cè)試8”中所測(cè)量的。在又一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物中的纖維素酶活性在10_5000U/g的范圍內(nèi)，優(yōu)選在50-4000U/g的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選在100-2000U/g的范圍內(nèi)，例如，如下文所述的“測(cè)試9”中所測(cè)量的。在又一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物中的內(nèi)切-1，4-木聚糖酶活性在 10-10. 000U/g的范圍內(nèi)，優(yōu)選在50-10. 000U/g的范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選在100-7000U/g的范圍內(nèi)，例如，如在“測(cè)試11”的條件下(PH3.5和50°C)所測(cè)量的。在一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品被用于生產(chǎn)果汁濃縮物和葡萄酒。根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品可被用于作為果汁中天然存在的酶的補(bǔ)充，并且可加速和提高蘋(píng)果、梨、葡萄和柑橘水果的加工。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品可被用在例如柑橘水果加工中，其中酶的應(yīng)用降低了果汁的粘性，消除了果汁濃縮和存儲(chǔ)過(guò)程中膠凝化的風(fēng)險(xiǎn)，并且確保了高的混濁穩(wěn)定性。在果肉萃取過(guò)程中應(yīng)用時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品促進(jìn)了果汁和固體的釋放，增加了產(chǎn)量，并改善了成本效率。穩(wěn)定的混濁(或者，在檸檬汁的情況中，成功的澄清)是終產(chǎn)品質(zhì)量上乘的重要評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在柑橘水果加工過(guò)程中利用酶時(shí)也可以回收柑橘屬精油。除了提供有價(jià)值的商品外，柑橘屬精油的回收從可持續(xù)性的角度來(lái)看是重要的，其確保了廢水中殺菌油的低含量， 用于改善的廢水生物可降解能力，并減少了整體上的水消耗。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品被用于檸檬汁的澄清。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品在柑橘屬水果加工中被用于果肉/核清洗、柑橘屬果汁的粘性降低和/或皮提取。高澄清度蘋(píng)果和梨汁的生產(chǎn)取決于淀粉和果膠內(nèi)容物的完全分解。這可通過(guò)在澄清和過(guò)濾之前，向果汁中加入酶產(chǎn)品而實(shí)現(xiàn)。在壓榨和果汁分離之前被加入到水果醪液中， 所述酶產(chǎn)品可引起醪液粘性的降低，導(dǎo)致增加的果汁產(chǎn)量和優(yōu)化的加工能力。更少的果渣和更容易清潔水果壓榨機(jī)可以是其它有附加值的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品被用于蘋(píng)果和梨醪液的浸漬。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品被用于在最初的壓榨后提取蘋(píng)果果渣。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品被用于蘋(píng)果和梨汁中淀粉的降解。在本發(fā)明的一方面，所述酶產(chǎn)品被用于果汁(特別是蘋(píng)果汁)中果膠的降解。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述酶產(chǎn)品被用于果汁(特別是梨汁)中果膠和阿拉伯聚糖的降解。葡萄酒制造者需要年復(fù)一年地生產(chǎn)高質(zhì)量的葡萄酒，無(wú)論天氣的年度變化如何。 根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品可輔助有價(jià)值的成分(例如芳香、顏色和單寧)從葡萄轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，并且可幫助保持葡萄酒的質(zhì)量，有時(shí)保存許多年。所述酶產(chǎn)品也可減少發(fā)酵時(shí)間并促進(jìn)澄清，過(guò)濾和穩(wěn)定化。本發(fā)明也針對(duì)源自上述方法的任何產(chǎn)品。此類產(chǎn)品包括源自植物材料的飲料，例如果汁、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、蘋(píng)果酒和營(yíng)養(yǎng)制備物以及用于食品的成分，例如，用于嬰兒食品、和新的浸漬和/或液化產(chǎn)品。在一個(gè)方面，提供了酶產(chǎn)品或酶產(chǎn)品制備物用于降解植物材料的用途，例如其中所述植物材料是植物細(xì)胞，例如其中所述植物材料是植物細(xì)胞壁或其部分；例如用于釋放化合物，例如其中所述化合物是生物學(xué)活性的化合物或其前體，例如其中所述化合物是藥學(xué)活性的化合物。在一個(gè)方面，所述植物材料是經(jīng)遺傳修飾的。在另一方面，提供了所述酶產(chǎn)品用于降解廢物的用途。在又一個(gè)方面，提供了所述酶產(chǎn)品在果汁和/或葡萄酒制造的過(guò)程中、在水果的提取和/或液化和/或果汁澄清的步驟中的用途。
所述酶產(chǎn)品和/或酶產(chǎn)品制備物的其它應(yīng)用包括下述應(yīng)用其中需要從植物材料 (例如水果)中提取顏色/色素，例如漿果(例如，黑醋栗、紅醋栗、圓醋栗、酸果蔓、藍(lán)莓、 黑莓、覆盆子、雜交草莓(boysenberry)、桑椹、草莓等)的紅顏色，或其它水果(例如，番石榴、果欖屬(lucuma)、石榴、獼猴1 、葡萄、南瓜、葫蘆、黃瓜、甜瓜、橙子、檸檬、酸橙、葡萄柚、 香蕉、桑橙、菠蘿、無(wú)花果、蘋(píng)果、溫柏、梨、薔薇果、桃子、櫻1^、Φ椰子、芒果、油1 、李子、杏等)。所述酶產(chǎn)品和/或酶產(chǎn)品制備物的其它應(yīng)用包括從葡萄提取顏色用于果汁或葡萄酒的生產(chǎn)，例如紅葡萄酒和玫瑰葡萄酒的生產(chǎn)。在來(lái)自植物材料的顏色/色素提取物中，通常希望提取盡可能多的顏色/色素。最終的制備物中，根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的濃度依賴于所設(shè)想的用途。在使用的制備物中，所述酶產(chǎn)品通常的使用劑量是4-300ppm。對(duì)于許多用途而言， 通過(guò)稀釋或濃縮調(diào)節(jié)所述酶產(chǎn)品，使其達(dá)到約300-600U/g的活性，如由“測(cè)試3”作為果膠裂解酶活性而測(cè)量的。在將酶產(chǎn)品調(diào)節(jié)到約300-600U/g的果膠裂解酶活性(如由“測(cè)試3” 所測(cè)量的)后，然后確定剩余的酶活性。然而，任何酶的活性/克當(dāng)然取決于由發(fā)酵獲得的酶產(chǎn)品或最終制備物的稀釋度或濃度。如果所述酶產(chǎn)品的酶活性在100-800U/g(果膠裂解酶單位)的范圍內(nèi)，那么最終應(yīng)用中的活性可被計(jì)算為最小值4ppm(g/噸)的100U/g的產(chǎn)品在最終的應(yīng)用中產(chǎn)生的酶濃度0. 4U/kg最大值300ppm的800U/g的產(chǎn)品在最終的應(yīng)用中產(chǎn)生的酶濃度240U/kg具體應(yīng)用中的相關(guān)劑量取決于溫度、PH和保持時(shí)間。在本發(fā)明的一方面，應(yīng)用產(chǎn)品中的濃度每公斤產(chǎn)品是0. 001U/Kg-10. 000U/kg，其中所述應(yīng)用產(chǎn)品例如是果汁，如蘋(píng)果、梨、葡萄或柑橘水果。在本發(fā)明的一方面，應(yīng)用產(chǎn)品中的濃度每公斤產(chǎn)品是0. 005U/kg-5. 000U/kg，其中所述應(yīng)用產(chǎn)品例如是果汁，如蘋(píng)果、梨、葡萄或柑橘水果。在本發(fā)明的一方面，應(yīng)用產(chǎn)品中的濃度每公斤產(chǎn)品是0. 05U/kg-2000U/kg。在本發(fā)明的一方面，應(yīng)用產(chǎn)品中的濃度每公斤產(chǎn)品是0. lU/kg_500U/kg，其中所述應(yīng)用產(chǎn)品例如是果汁，如蘋(píng)果、梨、葡萄或柑橘水果。在本發(fā)明的一方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品制備物的果汁，例如蘋(píng)果、梨、葡萄或柑橘果汁。在本發(fā)明的一方面，提供了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的酶產(chǎn)品的方法。在一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在另一方面，提供了包括下列步驟的方法在培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉的一種單一培養(yǎng)物以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)
P
ΡΠ O在一個(gè)方面，提供了酶產(chǎn)品的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括下列步驟在包含甜菜果肉的培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在另一方面，提供了包括下述步驟的方法在包含甜菜果肉的培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉的一種單一培養(yǎng)物以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。在另一方面，所述發(fā)酵包括下列步驟
a.在接種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述曲霉菌株(例如曲霉培養(yǎng)物)以獲得接種物，和b.將所述接種物加入到包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中。在一個(gè)方面，所述接種培養(yǎng)基包含甜菜果肉和/或谷麩例如麥麩。在一個(gè)方面，所述接種培養(yǎng)基包含甜菜果肉和谷麩例如麥麩。在本發(fā)明的一方面，提供了通過(guò)深層發(fā)酵生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，其包括下列步驟a.在通風(fēng)的種子底物培養(yǎng)基中(任選地包含谷麩和/或甜菜果肉)生長(zhǎng)曲霉的一種單一培養(yǎng)物以獲得接種物，所述底物培養(yǎng)基具有的PH在2-8的范圍內(nèi)，b.將所述接種物加入到包含谷麩和甜菜果肉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在空氣中孵育所述經(jīng)接種的發(fā)酵培養(yǎng)基以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和c.從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收酶產(chǎn)品。在本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，其包括下列步驟a.在任選地包含谷麩和/或甜菜果肉的通風(fēng)種培養(yǎng)基中使曲霉的一種單一培養(yǎng)物生長(zhǎng)10-60小時(shí)以獲得接種物，所述培養(yǎng)基具有的pH在2-8的范圍內(nèi)，b.以10-20% (ν/ν)范圍內(nèi)的濃度將所述接種物加入到包含谷麩和甜菜果肉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在空氣中孵育所述發(fā)酵培養(yǎng)基20-140小時(shí)以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和c.從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收酶產(chǎn)品。在第一個(gè)步驟(a)中，在含有之前經(jīng)滅菌的原材料和水的培養(yǎng)基中培育或生長(zhǎng)生產(chǎn)菌株。用于發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)基可由許多不同的原材料制成。在本發(fā)明的一方面，用于生長(zhǎng)所述真菌培養(yǎng)物以獲得接種物的培養(yǎng)基包含甜菜果肉和任選地谷麩。在一個(gè)方面，通過(guò)酸性PH處理而使所述培養(yǎng)基被滅菌，例如通過(guò)2-7范圍內(nèi)的pH、2. 25-6范圍內(nèi)的pH、2. 5-5 范圍內(nèi)的pH、3-4范圍內(nèi)的pH、或約3. 5的pH的處理。在另一方面，通過(guò)酸性pH處理而使所述培養(yǎng)基被滅菌，例如通過(guò)PH值為至少2、至少2. 5或至少3的pH處理。在本發(fā)明的另一方面，在步驟(b)中用于所述深層發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基包含谷麩。 在本發(fā)明的另一方面，用于所述深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含谷麩和甜菜果肉二者。本發(fā)明可用于工業(yè)規(guī)模中的任何深層發(fā)酵，例如用于任何具有至少5L的培養(yǎng)基的發(fā)酵。在另一方面，所述發(fā)酵可在50L、500L、5000L、50000L或150m3的培養(yǎng)基中進(jìn)行。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的酶產(chǎn)品。在本發(fā)明的一方面，在發(fā)酵過(guò)程中加入泡沫抑制劑。作為抗泡沫劑的例子可提及的有基于聚丙二醇的混合物，例如Erol DF 6000K(CAS 009082-00-2)或例如，SI擬60。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)和/或步驟(b)中的pH在2-8的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)和/或步驟(b)中的pH在2. 5-6的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，步驟 (a)和/或步驟(b)中的pH在3-4. 5的范圍內(nèi)，例如在3_4的范圍內(nèi)，例如在3. 2-3. 7的范圍內(nèi)，例如在3. 3-3. 7的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)和/或步驟(b)的pH在 3. 3-3. 7的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)和/或步驟(b)中的溫度在25-40°C的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)和/或步驟(b)中的溫度在范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一方面，所述深層發(fā)酵是作為需氧發(fā)酵進(jìn)行的。在本發(fā)明的一方面，在步驟(a)中在包含谷麩和甜菜果肉的通風(fēng)種培養(yǎng)基(所述培養(yǎng)基具有2-8范圍內(nèi)的pH)中生長(zhǎng)曲霉培養(yǎng)物10至60小時(shí)。在另一方面，生長(zhǎng)時(shí)期是15-50小時(shí)，例如20-40小時(shí)。在本發(fā)明的一方面，步驟(b)中的pH被調(diào)節(jié)為pH2-8，例如2. 5_6，例如pH 3_4。在步驟(b)中，在20-45°C的溫度范圍內(nèi)孵育所述培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一方面，在步驟(b)中， 在25-35°C的溫度范圍內(nèi)孵育所述培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一方面，在步驟(b)中，在
的溫度范圍內(nèi)孵育所述培養(yǎng)物。在一個(gè)方面，在通風(fēng)過(guò)程中，在步驟(b)中孵育所述培養(yǎng)物 40-140小時(shí)。在另一方面，在步驟(b)中孵育所述培養(yǎng)物60-120個(gè)小時(shí)，例如在通風(fēng)過(guò)程中孵育70-110個(gè)小時(shí)。在發(fā)酵過(guò)程中溫度譜在所述間隔內(nèi)可保持恒定或變化。在本發(fā)明的一方面，步驟(a)中生長(zhǎng)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和步驟(b)中的發(fā)酵培養(yǎng)基均包含谷麩和甜菜果肉。在另一方面，所述培養(yǎng)基包含硝酸鉀。在另一方面，所述培養(yǎng)基包含硫酸銨。在另一方面，所述培養(yǎng)基包含硫酸銨和硝酸鉀二者。在另一方面，所述培養(yǎng)基包含谷麩、甜菜果肉、硫酸銨和水中的硝酸鉀。在本發(fā)明的一方面，谷麩是以麥麩丸粒的形式。麥麩丸粒可由麥麩制成，所述麥麩是生產(chǎn)面粉和粗磨粉的副產(chǎn)品，其主要由外殼和比例可變的胚乳組成，通過(guò)加入合適的粘合劑(例如，1-3% (w/w)的糖蜜、脂肪或膠狀粘土)，然后在制粒機(jī)或擠壓機(jī)中、在高壓下擠壓所述組合物以形成圓柱形狀的丸粒。丸粒通常具有與原始植物殘留物相同的特征，特別是在產(chǎn)品的油和水含量方面。取決于其來(lái)源，在壓榨丸粒(expeller pellet)和提取粉狀丸粒(extraction meal pellet)之間進(jìn)行區(qū)分。麩是谷粒的硬的外層，且包含組合的糊粉和谷皮。其與胚芽一起是整個(gè)谷粒的完整部分，并且可作為精制谷物生產(chǎn)中研磨的副產(chǎn)品而被生產(chǎn)。麩尤其富含飲食纖維并且可含有顯著量的淀粉、蛋白質(zhì)、維生素和膳食礦物質(zhì)。麩的相對(duì)高的油含量使其經(jīng)受酸敗作用，這是它為什么經(jīng)常在儲(chǔ)存或進(jìn)一步加工之前從谷粒中被分離的原因之一。麩本身可被熱處理以增加其壽命。當(dāng)麩從谷粒中被除去時(shí)，它們失去其一部分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。麩存在于任何谷粒中并且可從任何谷粒中被研磨出來(lái)，所述谷粒包括稻、玉米、小麥、玉蜀黍、燕麥、大麥和粟。稻麩是稻研磨過(guò)程(棕色稻到白色稻的轉(zhuǎn)換)中的副產(chǎn)品。稻組成了禾本科 (Poaceae)(或禾本科(Gramineae))的稻屬，普通的稻被歸類為水稻(Oryza sativa)。在本申請(qǐng)的情境中，術(shù)語(yǔ)“麥麩”涉及包含麥粒的硬外層的產(chǎn)品，并且包含組合的糊粉和谷皮。在一個(gè)方面，麥麩具有2-20% w/w含量的阿拉伯聚糖。在一個(gè)方面，麥麩具有 5-15% w/w的阿拉伯聚糖含量。在一個(gè)方面，麥麩包含至少2% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少3% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少4% w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少5% w/w的阿拉伯聚糖。在另一方面，所述麥麩在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在于3-7% w/w的范圍內(nèi)。另一方面，所述麥麩在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在于3. 5-6% w/w的范圍內(nèi)。在另一方面，麥麩在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在于4-5% w/w的范圍內(nèi)。在一個(gè)方面，麥麩中的面粉濃度是低的。類似地，相信甜菜果肉丸粒優(yōu)選地應(yīng)該是未經(jīng)糖蜜處理過(guò)的。商業(yè)上可得的產(chǎn)品 (例如，“pulpetter”)被相信是合適的。也相信，可被丸粒吸收的水的量可以是質(zhì)量的指示，例如在水中吸收約4x其重量的能力(好的質(zhì)量)與例如約&(低質(zhì)量)相比。由于原材料質(zhì)量可能的變化(批次與批次，季節(jié)與季節(jié)，供應(yīng)者與供應(yīng)者等)，建議在較小的規(guī)模上就其用于制備酶產(chǎn)品的可適用性測(cè)試這些原材料。在本發(fā)明的一方面，甜菜果肉被用于a)的基底培養(yǎng)基和b)的發(fā)酵培養(yǎng)基中。甜菜(Beta vulgaris L.)是藜(Chenopodiaceae)科的成員，其是根中含有高濃度蔗糖的植物。商業(yè)上其為了糖而被生長(zhǎng)。甜菜直接涉及甜菜根，牛皮菜和飼料甜菜，都是傳自海甜菜的培育。在本發(fā)明的一方面，甜菜果肉是以甜菜丸?；蚋稍锏奶鸩斯饣蛄；奶鸩斯獾男问健Ｌ鸩斯馐菑那衅奶鸩酥刑崛×颂呛笥嗔粝聛?lái)的植物材料。收獲后，甜菜被拖運(yùn)到工廠，在那里它們被傾倒在通常是混凝土“平板”的接收區(qū)上，在那里它們被移動(dòng)成為大的堆。甜菜從所述堆中被移動(dòng)到中央通道或溝槽中，在那里其被洗滌而朝向加工廠。在加工廠處接收后，甜菜根被洗滌，被機(jī)械地切成稱作甜菜絲的細(xì)條，并被遞送至稱作浸提器 (diffuser)的機(jī)器以提取糖內(nèi)容物成為水溶液。浸提器是許多米的長(zhǎng)管，其中甜菜切片在一個(gè)方向移動(dòng)，而熱水在相反的方向移動(dòng)。移動(dòng)可以是通過(guò)旋轉(zhuǎn)的螺旋或者整個(gè)部件旋轉(zhuǎn)， 而且水和甜菜絲移動(dòng)通過(guò)內(nèi)部的腔。有不同的浸提器的設(shè)計(jì)，例如水平的旋轉(zhuǎn)，傾斜的螺旋，或垂直的螺旋“塔”。較少見(jiàn)的設(shè)計(jì)利用甜菜絲的移動(dòng)帶，伴隨著水被泵到所述帶的頂上并且傾瀉而過(guò)。通常，甜菜絲和水的流速的比率是1比2。通常，甜菜絲花費(fèi)約90分鐘以通過(guò)浸提器，而水僅用45分鐘。這些都是逆流交換方法，與如若甜菜絲僅留在熱水箱中相比， 所述方法利用更少的水從甜菜絲中提取更多的糖。離開(kāi)浸提器的液體被稱為原果汁。取決于氧化作用的量，原果汁的顏色由黑變化為暗紅，而氧化作用的量本身取決于浸提器的設(shè)計(jì)。所使用的甜菜絲或果肉在有約95%的水分但蔗糖含量低時(shí)離開(kāi)浸提器。利用螺旋壓榨器，濕果肉然后被壓榨到濕度降至75%。這回收了從果肉壓出的液體中的其它蔗糖，并且減少了干燥果肉所需的能量。經(jīng)壓榨的果肉可被干燥和出售，例如作為動(dòng)物飼料。此植物材料然后可被制成丸粒以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和處理特性。它是高纖維的且獨(dú)特性在于其纖維是極易消化的。在本發(fā)明的另一方面，甜菜果肉是從Danisco Sugar A/S獲得的甜菜丸粒的形式。 在本發(fā)明的另一方面，甜菜果肉是從Nordic Sugar獲得的Fibrex 甜菜丸粒的形式。甜菜果肉可以是經(jīng)糖蜜化的，或未糖蜜化的，優(yōu)選未糖蜜化的如Fibrex 。糖蜜或糖漿是將甘蔗或甜菜加工成糖時(shí)的粘稠糖漿副產(chǎn)品。糖蜜的質(zhì)量取決于甘蔗或甜菜的成熟度，提取的糖的量，和提取方法。在本發(fā)明的一方面，用于深層發(fā)酵的底物包含的甜菜果肉在1-30% w/w的范圍內(nèi)。在另一方面，用于深層發(fā)酵的底物包含的甜菜果肉在1-20%，2-20%,1-15%, 1-10%， 3-15%的范圍內(nèi)。在另一方面，甜菜果肉在2-8% w/w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在另一方面，甜在3-7% w/w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在另一方面，甜菜果肉在4-7% w/ w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在另一方面，甜菜果肉在3. 5-6% w/w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在另一方面，甜菜果肉在4-6% w/w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在另一方面，甜菜果肉在4-5% w/w的范圍內(nèi)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在一個(gè)方面，甜菜果肉以至少 2% w/w、例如至少3% w/w或例如至少4% w/w的量存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的一方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量大約在0.5-20% (w/w)的范圍內(nèi)。在另一方面，所述甜菜果肉具有1-10% w/w的糖含量。在另一方面，甜菜果肉在干燥的基礎(chǔ)上具有2-8% w/w的糖含量。在一個(gè)方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量為至少0. 5% w/w，例如至少2% w/w，例如至少4% w/w，例如至少6% w/w，或例如至少8% w/w的量。在本發(fā)明的其它方面，所使用的甜菜果肉中的果膠含量在干燥的基礎(chǔ)上在大約 8-35% w/w的范圍內(nèi)，在大約12- % (w/w)的范圍內(nèi)，在干燥基礎(chǔ)上在大約15-22% w/w 的范圍內(nèi)。在一個(gè)方面，所使用的甜菜果肉中的果膠含量為至少9% w/w,例如至少11 % w/ w，例如至少13% w/w，或例如至少15% w/w的量。在本發(fā)明的一方面，甜菜果肉在干燥的基礎(chǔ)上具有1. 5-40% w/w的阿拉伯聚糖含量。在本發(fā)明的一方面，甜菜果肉在干燥的基礎(chǔ)上具有5-40% w/w的阿拉伯聚糖含量。在本發(fā)明的一方面，甜菜果肉在干燥的基礎(chǔ)上具有10-30% w/w或5-30% w/w的阿拉伯聚糖含量。這些范圍可取決于所使用的甜菜果肉的特定類型而變化。在一個(gè)方面，甜菜果肉包含至少1. 5% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少2% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少3% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少4% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少5% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少6% w/ w的阿拉伯聚糖，例如至少7% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少8% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少9% w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少10% w/w的阿拉伯聚糖。在一個(gè)方面，待用于發(fā)酵培養(yǎng)基中的、包含果膠和阿拉伯聚糖的植物材料是谷麩(例如麥麩)和甜菜果肉的混合物，所述谷麩(例如麥麩)和甜菜果肉的比例為大約 20 80 至 80 20,30 70 至 70 30,40 60 至 60 40，或 45 55 至 55 45 (w w)。 在另一方面，谷麩(例如麥麩)和甜菜果肉的混合物的比例為大約50 50;大約45 55； 大約55 45;大約40 60;大約60 40 ；大約30 70 ；大約70 30 ；大約20 80 ；大約80 20 (w W)。在一個(gè)方面，所述混合物含有比谷麩(例如麥麩)更多的甜菜果肉，例如比例為大約51 49至60 40或大約51 49至55 40 (w/w)。在一個(gè)方面，混合物含有比谷麩(例如麥麩)更多的甜菜果肉，例如比例為大約51 49，大約52 48至大約 53 47，或大約 54 46(w W)。在其它方面，甜菜果肉和麥麩各自在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的范圍是3-7% w/w。在另一方面，甜菜果肉和麥麩各自在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的范圍是3. 5-6% w/w。在另一方面，甜菜果肉和麥麩各自在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的范圍是4-6% w/w。在另一方面，甜菜果肉和麥麩各自在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的范圍是4-5% w/w，例如各自以大約4% w/w，大約4. 2% w/w，大約 4. 3% w/w，大約 4. 4% w/w，大約 4. 5% w/w，大約 4. 6% w/w，大約 4. 7% w/w，大約 4. 8% w/w，大約4. 9% w/w，或大約5. 0% w/w的量存在。在本申請(qǐng)的情境中，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)液”和“培養(yǎng)基”指含有各種用于生長(zhǎng)(發(fā)酵)微生物培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一方面，所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包含谷麩例如麥麩和甜菜果肉。在一些實(shí)施方案中，已發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用谷麩(如麥麩)和甜菜果肉產(chǎn)生具有高的總酶活性和許多不同的酶活性(在不同的酶以及許多不同的副活性方面)的酶產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，也已發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用谷麩(如麥麩)和甜菜果肉產(chǎn)生具有酶活性(例如阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯聚糖酶)的酶產(chǎn)品。在本發(fā)明的其它方面，步驟(b)中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基具有下列組成谷麩，甜菜
25果肉，硫酸銨和硝酸鉀?？赏ㄟ^(guò)加入硫酸來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH?？墒褂貌煌姆椒▉?lái)決定發(fā)酵何時(shí)完成。發(fā)酵后可測(cè)量培養(yǎng)基的粘性。這對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是通常的實(shí)踐，測(cè)量可通過(guò)使用Vibro Viscometer SV-IO型號(hào)的粘度計(jì)(A&D公司)而進(jìn)行。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的粘性通常> 150mPa. s例如> 200m Pa. s，并且當(dāng)粘性< 150mPa. s (例如在IOOmPa. s以下，在75mPa. s以下或在50mPa. s以下)時(shí)可停止發(fā)酵。在本發(fā)明的一方面，所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基具有如下組成
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料的發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵曲霉屬 (Aspergillus)菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述植物材料包含甜菜果肉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含1-30%w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含2-8%w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含3-7%w/w范圍內(nèi)的甜菜果肉。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述甜菜果肉具有0.5-20% w/w的糖含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述甜菜果肉具有2-8%w/w的糖含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述甜菜果肉具有5-40%w/w的阿拉伯聚糖含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述甜菜果肉是未糖蜜化的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物材料包含谷麩。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物材料是谷麩與甜菜果肉的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述谷麩是麥麩。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述麥麩具有2-20%w/w的阿拉伯聚糖含量。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述曲霉屬菌株是曲霉屬菌株的一種單一培養(yǎng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述曲霉菌株是塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株的一種單一培養(yǎng)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述塔賓曲霉菌株是未經(jīng)遺傳修飾的(非-GM0)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述塔賓曲霉菌株未被自我克隆。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述塔賓曲霉菌株具有保藏登記號(hào)CBS123488。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵過(guò)程中的pH在3-4.5的范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵過(guò)程中的pH在3-4的范圍內(nèi)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵過(guò)程中的pH在3.2-3. 7的范圍內(nèi)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵過(guò)程中的溫度在25-40°C的范圍內(nèi)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵過(guò)程中的溫度在觀-341的范圍內(nèi)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵是作為需氧發(fā)酵進(jìn)行的。
25.根據(jù)權(quán)利要求I-M中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含硫酸銨和/或硝酸鉀。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵包括下列步驟 a.在接種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述曲霉屬菌株以獲得接種物，和b.將所述接種物加入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的方法，其中所述接種培養(yǎng)基包含谷麩和/或甜菜果肉。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述接種培養(yǎng)基包含麥麩。
29.由根據(jù)權(quán)利要求118中任一項(xiàng)的方法可獲得的酶產(chǎn)品。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的酶產(chǎn)品，其如在權(quán)利要求31-35和42的任一項(xiàng)中所進(jìn)一步定義的。
31.包含至少下列酶活性的酶產(chǎn)品 i.多聚半乳糖醛酸酶內(nèi)切酶活性 .多聚半乳糖醛酸外切酶活性iii.果膠酯酶活性iv.果膠裂解酶活性v.纖維素酶活性vi.木聚糖酶活性和vii.阿拉伯聚糖酶活性并且其中所述酶產(chǎn)品是由深層發(fā)酵曲霉屬菌株而獲得的表達(dá)產(chǎn)品。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的酶產(chǎn)品，還包含鼠李糖聚半乳糖醛酸酶活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，還包含葡糖淀粉酶活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的酶產(chǎn)品，其中所述菌株是塔賓曲霉菌株。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的酶產(chǎn)品，其中所述菌株是具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲毒ο
36.根據(jù)權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其中用于所述深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含甜菜果肉。
37.根據(jù)權(quán)利要求31-36中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其中用于所述深層發(fā)酵的培養(yǎng)基包含谷鼓。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的酶產(chǎn)品，其中所述谷麩是麥麩。
39.根據(jù)權(quán)利要求31-38中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求31-39中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其中所述曲霉屬菌株未經(jīng)遺傳修飾。
41.根據(jù)權(quán)利要求31-40中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其中所述曲霉屬菌株未經(jīng)自我克隆。
42.用于生產(chǎn)酶產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟在發(fā)酵培養(yǎng)基中深層發(fā)酵塔賓曲霉菌株以獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，和任選地從所述發(fā)酵培養(yǎng)液中回收無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液形式的酶產(chǎn)品。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含含有果膠和阿拉伯聚糖的植物材料。
44.根據(jù)權(quán)利要求42-43中任一項(xiàng)的方法，其如權(quán)利要求2-13和15-28中的任一項(xiàng)所進(jìn)一步限定的。
45.根據(jù)權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)的方法可獲得的酶產(chǎn)品。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的酶產(chǎn)品，其如權(quán)利要求31-41中的任一項(xiàng)所進(jìn)一步限定的。
47.包含根據(jù)權(quán)利要求30-42和45-46中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品、酶載體以及任選地穩(wěn)定劑和/或防腐劑的酶產(chǎn)品制備物。
48.根據(jù)權(quán)利要求30-42和44-47中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其是來(lái)自發(fā)酵培養(yǎng)液的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液的形式。
49.根據(jù)權(quán)利要求30-42和44-47中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品，其存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中。
50.根據(jù)權(quán)利要求30-42和44-47中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品或根據(jù)權(quán)利要求49的酶產(chǎn)品制備物用于降解植物材料的用途。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的酶產(chǎn)品的用途，其中所述植物材料是植物細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的酶產(chǎn)品的用途，其中所述植物材料是植物細(xì)胞壁或其部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品用于釋放化合物的用途。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的酶產(chǎn)品的用途，其中所述化合物是生物活性化合物或其前體。
55.根據(jù)權(quán)利要求53的酶產(chǎn)品的用途，其中所述化合物是藥物活性化合物。
56.根據(jù)權(quán)利要求50的酶產(chǎn)品的用途，其中所述植物材料是經(jīng)遺傳修飾的。
57.根據(jù)權(quán)利要求30-42和45-47中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品用于降解廢物的用途。
58.根據(jù)權(quán)利要求30-42和45-47中任一項(xiàng)的酶產(chǎn)品在果汁和/或葡萄酒制造的過(guò)程中、在水果的提取和/或液化和/或果汁澄清的步驟中的用途。
59.具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉或其衍生物或后代。
60.具有保藏登記號(hào)CBS123488的經(jīng)分離的塔賓曲霉或其衍生物或后代。
61.與具有保藏登記號(hào)CBS123488的塔賓曲霉菌株具有基本上相同的特征的真菌培養(yǎng)物。
62.權(quán)利要求61的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物具有與所述經(jīng)保藏的菌株相同的特性。
63.權(quán)利要求61的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物是所述經(jīng)保藏的菌株或其后代。
64.用于深層發(fā)酵曲霉屬菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含甜菜果肉和麥麩。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵曲霉屬菌株而獲得的具有多種酶活性的酶產(chǎn)品的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102292437SQ200980155410
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者M·Z·格羅恩菲爾德 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司