專利名稱：一種輔助篩選不同千粒重小麥的方法及其專用標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助篩選不同千粒重小麥的方法及其專用標(biāo)記。

背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，其產(chǎn)量的高低直接影響人們的生活水平和國家糧食安全。隨著人口的增長、耕地面積減少和糧食生產(chǎn)成本的不斷提高，高產(chǎn)育種將是我國小麥育種的永恒主題。然而，目前我國小麥高產(chǎn)育種正處于爬坡階段。利用先進的分子生物學(xué)技術(shù)挖掘、利用與小麥產(chǎn)量直接相關(guān)的功能基因，為小麥分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種貯備并提供基因資源，對提高我國小麥育種水平、加速育種進程、大幅提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。
小麥產(chǎn)量主要由畝穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重構(gòu)成，在產(chǎn)量三要素中穗粒數(shù)與畝穗數(shù)成一定的負相關(guān)，即畝穗數(shù)多則穗粒數(shù)相對較少，反之亦然，而千粒重則相對獨立。因此，小麥千粒重的提高必將是今后我國小麥單產(chǎn)提升的主要途徑之一(胡延吉，趙檀方.小麥高產(chǎn)育種中粒重作用的研究.作物學(xué)報，1995，21671-678；許為鋼，胡琳，吳兆蘇，蓋鈞鎰.關(guān)中地區(qū)小麥品種產(chǎn)量與產(chǎn)量結(jié)構(gòu)遺傳改良的研究.作物學(xué)報，2000，26352-358)。千粒重主要由粒長、粒寬和粒厚等因素構(gòu)成，是一個典型的數(shù)量性狀，受多基因控制(Ammiraju J S S，Dholakia B B，SantraD K，et al.Identification of inter simple sequence repeat(ISSR)markersassociated with seed size in wheat.Theor Appl Genet，2001，102726-732；Groos C，Robert N，Bervas E，Charmet G.Genetic analysis of grainprotein-content，grain yield and thousand-kernel weight in bread wheat.Theor Appl Genet，2003，1061032-1040；Huang X Q，

H，Ganal M W，

M S.Advanced backcross QTL analysis for the identification of quantitativetrait loci alleles from wild relatives of wheat(Triticum aestivum L.).TheorAppl Genet，2003，1061379-1389；Kumar N，Kulwal P，Gaur A，Tyagi A，KhuranaJ，Khurana P，Balyan H，Gupta P.QTL analysis for grain weight in commonwheat.Euphytica，2006，151135-144)。千粒重的三個構(gòu)成要素與千粒重均呈正相關(guān)關(guān)系，且它們之間無負相關(guān)。因此，可以通過提高千粒重的任一構(gòu)成要素來達到提高小麥千粒重的目的。研究結(jié)果表明，在小麥千粒重的構(gòu)成因素中，粒寬對千粒重的關(guān)聯(lián)度和貢獻率最高(Sun X Y，Wu K，Zhao Y.QTL analysis of kernelshape and weight using recombinant inbred lines in wheat[J].Euphytica，2008，165615-624；蓋紅梅.我國小麥主要品種的選擇牽連效用分析[博士學(xué)位論文].北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文，2007)。雖然在小麥中通過連鎖作圖的方法已經(jīng)定位了若干與小麥粒重相關(guān)的QTLs(Li S S，Jia J Z，Wei X Y，ZhangX C，Chen H M，Sun H Y，et al.An intervarietal genetic map and QTL analysisfor yield traits in wheat.Mol Breed，2007，20167-178；Kumar K，KulwalP L，Balyan H S，Gupta P K.QTL mapping for yield and yield contributingtraits in two mapping populations of bread wheat.Mol Breed，2007，19167-177)，但由于小麥基因組龐大、研究困難，目前仍無相關(guān)基因克隆的報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助篩選不同千粒重小麥的方法及其專用標(biāo)記。
本發(fā)明提供的輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的方法，是如下(a)或(b) (a)檢測待測小麥的基因組DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸是A還是G，AA基因型(優(yōu)異等位變異)小麥的千粒重和/或粒寬在統(tǒng)計學(xué)上大于GG基因型小麥；所述AA基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為G的純合體； (b)檢測待測小麥的基因組DNA中序列7所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸是A還是G，AA基因型小麥的千粒重和/或粒寬在統(tǒng)計學(xué)上大于GG基因型小麥；所述AA基因型為序列7所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸為G的純合體。
序列7所示核苷酸即為序列2所示核苷酸白5’末端第2455-2872位核苷酸。
所述方法可包括基因組DNA提取、PCR擴增和酶切。
所述方法具體包括如下步驟 (1)提取待測小麥的基因組DNA； (2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增；所述引物對甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對； (3)以步驟(2)的PCR產(chǎn)物為模板，用引物對乙進行PCR擴增；所述引物對乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對； (4)用限制性內(nèi)切酶Taq I酶切步驟(3)的PCR產(chǎn)物；如果得到167bp的酶切產(chǎn)物，待測小麥為AA基因型；如果得到218bp的酶切產(chǎn)物，待測小麥為GG基因型。
所述步驟(2)中PCR擴增所用的聚合酶具體可為pfu酶；PCR反應(yīng)程序具體可為94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
所述步驟(3)中PCR擴增所用的聚合酶具體可為Taq酶；PCR反應(yīng)程序具體可為94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32個循環(huán)；72℃10min。
所述步驟(4)中，酶切條件具體可為65℃、1h。
可用瓊脂糖凝膠電泳檢測所述酶切的酶切產(chǎn)物，如2.0％(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳。
本發(fā)明還保護輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的專用引物，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對。
所述專用引物在制備輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明同時保護一種輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的試劑盒，包括所述專用引物。
所述方法、所述專用引物、所述試劑盒均可應(yīng)用于小麥育種中，具體可將AA基因型的小麥用于育種。所述AA基因型小麥的千粒重和/或粒寬在統(tǒng)計學(xué)上大于GG基因型小麥，具體可為差異達極顯著水平(P＜0.01)。
本發(fā)明公開了如下內(nèi)容小麥千粒重候選基因TaGW2-A1 cDNA編碼序列，并該基因定位于小麥6A染色體上；通過該基因獲得了TaGW2-A1編碼區(qū)上游約3.3kb的啟動子區(qū)序列，預(yù)測了核心啟動子功能元件的位置；發(fā)現(xiàn)不同粒重(粒寬)材料間TaGW2-A1基因-593(起始密碼子上游)處存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，構(gòu)成兩個不同基因型，該基因型與籽粒寬窄呈較好的對應(yīng)關(guān)系；根據(jù)TaGW2-A1基因上游啟動子區(qū)單核苷酸位點(-593處，G/A)的差異開發(fā)了SNP標(biāo)記，命名為SNP593；應(yīng)用開發(fā)的SNP593標(biāo)記掃描我國255份小麥微核心種質(zhì)，結(jié)合全部材料的籽粒性狀數(shù)據(jù)，利用標(biāo)記/性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，SNP593-A等位變異與小麥高粒重接近顯著相關(guān)(P＜0.0528)、與粒寬極顯著相關(guān)(P＜0.004)。該SNP為共顯性標(biāo)記，重復(fù)性好、成本低，在提高小麥千粒重(粒寬)的分子標(biāo)記輔助選擇和分子設(shè)計育種中具有較好的應(yīng)用前景。



圖1為中國春小麥種子cDNA GW2的擴增；1-4PCR擴增產(chǎn)物；MMarker。
圖2為主要禾本科植物GW2編碼區(qū)序列同源性比較(DNAMAN軟件)；除TaGW2-A1外其他序列均來自于NCBI數(shù)據(jù)庫。
圖3為TaGW2-A1上游啟動子區(qū)序列擴增；1-3PCR擴增產(chǎn)物；MMarker。
圖4為TaGW2-A1核心啟動子原件示意圖。
圖5為不同粒寬材料啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點。
圖6為TaGW2-A1 SNP593標(biāo)記的染色體定位；NT6A6B、NT6A6D、NT6B6A、NT6D6B分別代表小麥6A，6A，6B，6D染色體的缺失；H2O和中國春(CS)分別代表陰性和陽性對照。
圖7為SNP標(biāo)記二次PCR擴增結(jié)果；MMarker；1白芒麥；2三月黃；3紅冬麥；4蘭考906；5徐州22；6萊州953。
圖8為大粒與小粒品種SNP標(biāo)記瓊脂糖凝膠檢測；MMarker；1、2白芒麥；3、4三月黃；5、6紅冬麥；7、8蘭考906；9、10徐州22；11、12萊州953。
圖9為不同年代育成品種的千粒重、粒寬以及SNP593-A頻率的變化趨勢分析；A千粒重；B粒寬；C等位變異SNP593_A分布。

具體實施例方式 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
實施例中的小麥品種均獲自中國作物種質(zhì)信息網(wǎng)，表1和表2中的編號為網(wǎng)內(nèi)編號。網(wǎng)址http://www.cgris.net/zhongzhidinggou/index.php。
實施例1、特異引物對(分子標(biāo)記)的發(fā)現(xiàn) 實驗材料見表1。
表1實施例1中所用的小麥材料 一、TaGW2-A1 cDNA及其啟動子區(qū)核苷酸序列的獲得 1、TaGW2-A1 cDNA的克隆 以水稻GW2序列為目標(biāo)，在小麥的EST數(shù)據(jù)庫中BLAST同源序列，比對上的小麥EST序列進行電子拼接，以電子拼接序列為模板設(shè)計引物。以中國春小麥種子cDNA為模板，用特異性引物對(cDNA擴增引物)進行PCR擴增，得到1.2kb左右的目標(biāo)片段(擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1)。經(jīng)測序驗證，擴增產(chǎn)物長度為1275bp，定名為TaGW2-A1(核苷酸序列見序列表的序列1)。TaGW2-A1與NCBI上公布的水稻、大麥、短柄草、玉米和高粱的基因存在較高的同源性(同源性比較見圖2)。因此可明確，在小麥中獲得的cDNA克隆為水稻GW2的同源基因。
cDNA擴增引物GW2F5′-ATGGGGAACAGAATAGGAGGGAGGA-3′； GW2R5′-TTACAACCATGCCAACCCTTGCGTG-3′。
PCR聚合酶TRANSGENE的Pfu酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、60℃30sec、72℃2min，32個循環(huán)；72℃10min。
2、中國春小麥BAC文庫的篩選 中國春BAC混合池保存的菌種混勻后取5ul接種到LB培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速220rpm、37℃培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，根據(jù)TaGW2-A1基因序列引物進行擴增，對陽性混合池進行如下篩選 1)將陽性BAC混合池的保存菌液稀釋之后，涂布在LB固體培養(yǎng)基表面，37℃過夜培養(yǎng)，然后挑取5倍于混合池中克隆數(shù)的單克隆接種于384孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)基冷凍保存； 2)用每塊384孔板中的所有單克隆制備成混合池，接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測； 3)對步驟2)中呈陽性的混合池進行陽性單克隆篩選。將384孔板中16個橫行(A-P)和24個縱列(1-24)中的克隆分別混合，共得到40個更小的克隆混合池。分別以其菌液為模板，用等位特異性PCR引物擴增，檢測是否含有陽性克隆。含有陽性克隆的橫行和縱列的交叉點就是可能的陽性單克??；對384孔板中相應(yīng)位置的單克隆用PCR引物加以驗證。
3、BAC單克隆質(zhì)粒的提取 利用Qiagen Large-Construct Kit(德國)提取BAC質(zhì)粒DNA，操作參考試劑盒說明。
4、BAC單克隆質(zhì)粒的末端測序 采用ABI3730分析儀(Applied Biosystems)進行測序。根據(jù)已知序列設(shè)計測序引物，逐步向起始密碼子上游序列進行測序。測序BAC質(zhì)粒模板濃度≥300ng。測序完成后利用Seqman軟件進行序列拼接、整合(TaGW2-A1編碼區(qū)上游3kb的序列如序列表的序列2所示)。TaGW2-A1上游啟動子區(qū)序列擴增結(jié)果見圖3。TaGW2-A1核心啟動子原件示意圖見圖4。
二、品種間TaGW2-A1啟動子區(qū)SNP位點的發(fā)掘 選擇下列小麥品種作為標(biāo)記發(fā)掘材料地方小(窄)粒品種(千粒重＜35g，粒寬≤3.0mm)白芒麥、三月黃、紅冬麥；育成大(寬)粒品種(千粒重＞45g，粒寬＞3.3mm)蘭考906、徐州22、萊州953。
1、SNP位點的發(fā)現(xiàn) 根據(jù)步驟一獲得的啟動子末端序列設(shè)計引物(啟動子區(qū)擴增引物，下游引物包含ATG下游387bp的序列)。分別提取上述小麥品種的基因組DNA作為模板，用啟動子區(qū)擴增引物進行PCR擴增。
啟動子區(qū)擴增引物F5955′-GTTTTCCTGGGCTGGCACAATCA-3′； R17815′-GCGGCACTCTACGGCAGAACAAAT-3′。
PCR聚合酶TRANSGENE的pfu酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
片段擴增后利用Bioteke公司的DNA回收試劑盒進行回收，回收片段利用TranGen公司的P-easy Blunt Kit進行連接轉(zhuǎn)化。采用堿裂解法提取連接轉(zhuǎn)化的單克隆陽性載體，應(yīng)用ABI3730分析儀進行測序。利用DNAStar中的Seqman進行序列拼接，MegAlign進行序列比對。序列比對發(fā)現(xiàn)不同材料間在小麥A基因組的編碼區(qū)上游-593處有一個SNP位點(SNP593標(biāo)記)(見圖5)，小(窄)粒品種為(-593G)，大(寬)粒品種為(-593A)，大粒品種(TCGA)與小粒品種(TCGG)相比，具有一個Taq I內(nèi)切酶位點。根據(jù)此差異進行SNP標(biāo)記的開發(fā)。
2、染色體定位 根據(jù)SNP所在區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計特異引物(定位引物)，并應(yīng)用小麥缺-四體進行SNP標(biāo)記的染色體定位，將其定位于小麥的6A染色體上(見圖6)。
定位引物L(fēng)ocAF35′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′； LocAR35′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。
PCR酶TRANSGENE公司的pfu酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、60℃45sec、72℃1min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
3、SNP標(biāo)記的開發(fā) 特異性引物對(分子標(biāo)記)的設(shè)計原則1)小麥A、B、D三個基因組在SNP位點區(qū)相似性較高不能在此附近設(shè)計一個引物擴增出A基因組特異的序列；2)TaqI內(nèi)切酶只識別4個堿基，在序列中的酶切位點較多；3)內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物要求較高，PCR產(chǎn)物中應(yīng)盡可能減少非特異擴增及引物二聚體的出現(xiàn)。
采用如下流程進行SNP標(biāo)記的開發(fā) 1)分別提取六種小麥材料幼苗葉片的基因組DNA作為模板，用SNP標(biāo)記一次PCR引物擴增含有SNP位點的DNA片段。
SNP標(biāo)記一次PCR引物L(fēng)ocAF35′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′； LocAR35′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。
PCR聚合酶TRANSGENE的pfu酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
一次PCR的目的是擴增小麥A基因組，以避免其它基因組的相似序列的干擾。
2)將一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，取1ul作為二次PCR的模板，SNP標(biāo)記二次PCR引物進行擴增。
SNP標(biāo)記二次PCR引物TAQ1F4035′-GAGAAAGGGCTGGTGCTATGGA-3′； TAQ1R8205′-GTAACGCTTGATAAACATAGGTAAT-3′。
PCR聚合酶Fermentas的Taq酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32個循環(huán)；72℃10min。
擴增產(chǎn)物(二次PCR產(chǎn)物)的電泳圖見圖7。
3)取二次PCR產(chǎn)物用Taq I內(nèi)切酶(Fermentas公司)在65℃下完全酶切1h。
4)將酶切產(chǎn)物在2.0％瓊脂糖上進行酶切片段的檢測，見圖8。三個小粒品種(GG，SNP593)，都得到了218bp的條帶；而三個大粒品種(AA，SNP593)，都得到了167bp的條帶。
實施例2、TaGW2-A1基因SNP593的功能驗證 分別將255份小麥材料進行如下操作 1、提取基因組DNA。
2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增。
引物對甲LocAF35′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′； LocAR35′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。
PCR聚合酶TRANSGENE的pfu酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
3、以步驟2的PCR產(chǎn)物為模板，用引物對乙進行PCR擴增。
引物對乙TAQ1F4035′-GAGAAAGGGCTGGTGCTATGGA-3′； TAQ1R8205′-GTAACGCTTGATAAACATAGGTAAT-3′。
PCR聚合酶Fermentas的Taq酶。
PCR反應(yīng)程序94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32個循環(huán)；72℃10min。
4、用Taq I內(nèi)切酶(Fermentas公司)65℃下將步驟3的PCR產(chǎn)物酶切1h。
5、將酶切產(chǎn)物在2.0％瓊脂糖上進行酶切片段的檢測。具有218bp的條帶的樣本的基因型為GG(SNP593)，具有167bp的條帶的樣本的基因型為AA(SNP593)。
分別檢測各個小麥品種的千粒重和粒寬。其中千粒重為3次測量的平均結(jié)果，粒寬為20粒的平均寬度。將步驟3的PCR產(chǎn)物進行測序驗證，測序結(jié)果與酶切檢測結(jié)果一致。
小麥樣本及檢測結(jié)果見表2。
表2實施例2中所用的小麥材料及檢測結(jié)果






將小麥樣本的基因型和千粒重性狀、粒寬性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表3。
表3關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 結(jié)合千粒重、粒寬表型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AA基因型平均千粒重為36.69g，GG基因型平均千粒重為35.08g，差異接近顯著水平；AA基因型平均粒寬為3.21mm，GG基因型平均粒寬為3.14mm，差異達極顯著水平(P＜0.01)。
實施例3、不同年代育成品種的千粒重、粒寬以及SNP593-A頻率的變化趨勢分析 對微核心種質(zhì)中不同年代育成品種的千粒重、粒寬以及SNP593-A頻率的變化趨勢進行分析發(fā)現(xiàn)(見圖9)隨著年代的推移，我國小麥育成品種的千粒重和粒寬均呈增大的趨勢(圖9A、B)，SNP593-A等位變異在不同年代品種中的出現(xiàn)頻率也逐漸增加，與千粒重和粒寬變化趨勢一致(圖9C)，這表明現(xiàn)代育種對該變異進行了很強的選擇作用，而該變異與粒重、粒寬顯著相關(guān)。因此，該標(biāo)記可作為提高小麥粒重(粒寬)進行小麥高產(chǎn)分子標(biāo)記輔助育種的功能標(biāo)記。
序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)所
<120>一種輔助篩選不同千粒重小麥的方法及其專用標(biāo)記
<130>CGGNARY102021
<160>7
<210>1
<211>1275
<212>DNA
<213>中國春小麥(Triticum aestivum L)
<400>1
atggggaaca gaataggagg gaggaggaag gccggggtgg aggagcggta cacgaggccg60
caggggctgt acgagcacag ggatatcgac cagaagaagc tacgcaagtt gatcctcgag120
gccaagctcg cgccctgcta cccgggggct gacgacgccg cggggggtga cctggaggag180
tgccccatct gcttcctgta ctacccaagc cttaaccgat caaaatgttg ctcgaaaggg240
atatgtacag agtgctttct tcaaatgaaa ccaactcata ctgctcgacc tacacaatgc300
ccattctgca aaacccccaa ctatgctgtg gagtatcgtg gtgtaaagac aaaggaggaa360
aggagcatag agcaatttga agaacagaaa gtcattgaag cacagatgag ggtgcggcag420
caagcacttc aagacgaaga ggataagatg aaaagaaaac agagtaggtg ctcttctagc480
agaacaatcg ctccaacaac agaagtggag tatcgagata tttgcagcac atcctattca540
gtgccatcgt accaatgtac ccagcaagaa actgaatgtt gttcgtctga gccttcatgt600
tctgctcagg ctaacatgcg gtctttccat tctaggcata ctcgtgatga taacatagac660
atgaacatag aggacatgat ggttatggaa gcgatttggc gttcaattca ggagcaagga720
agtataggaa atccttcttg tgggagcttt atgccttttg agcaaccaac gcgtgagagg780
caggcattcg ttgcagctcc tcctctagaa atgccccatc ctggtggatt ttcttgtgct840
gttgctgcta tggctgagca ccagccatca agcatggatt tctcttacat gactggtagt900
agtgcgttcc cagtctttga catgttccgc cgaccgtgca acattgctgg tggaagcatg 960
ggtgctgcgg aaagttcacc agatagctgg agcgggatag cgccaagttg cagcagaagg 1020
gaagtggtaa gagaggaagg agagtgctca accgaccact tgtcagaggg tgcagaggcc 1080
gggacaagct atgccggctc ggacattgtg gtggatgcgg ggacaatgct accgttgcct 1140
tttgctgaca attacagtat ggttgcaagc catttccgtc ctgagagcat cgaagaacaa 1200
atgatgtatt ccatggctgt ttctttagca gaagctcatg gtagaacgca cacgcaaggg 1260
ttggcatggt tgtaa 1275
<210>2
<211>3303
<212>DNA
<213>中國春小麥(Triticum aestivum L)
<400>2
tcttgggggg gggggtcgta ccgctctata caggataatt cctagatgtg agcacgagat60
gaacttgggg gcagaccaac tcgaaatttt agaccaaatc gaaggggaaa ataaaatccg120
aggccaggga atgccaaggg aggtggatcc actttccaag cactagatcc acatatcaaa180
atcagcaaaa actcacaaac aacaaaatgc aagaaatttt ggggggctct tttcatggat240
tttttttgaa atttagaaga aaattcgaac taaaggctag aacatggggg ggggggtagg300
gctccaaatt cgtgtcaacg tggctcatga taccaagatg atataaggca cgggccaaag360
tgccctgatt tgtcccaatg ttcacgaaat tggaggtgga ttcgaggagg aacacgaagg420
gaaaacatgg agaaatcaaa gggggaaaca ctctattgga caagattcac tcccggcact480
cctcaaatca caagcaatac aagaggcgca tcaagatcca agaacaacaa gggaaataaa540
gatacaaggt agttcatcca aatatctagg agagatggct cttgatgatt cacttgggga600
atccttctcc acatgtggag gtcttgcatc cactagggat cttctccata ggaggccttg660
cactccaatg gagtcttctc tctcacaaga ggaatcccac aaagggagat acatgagcta720
agctctatga tatgagttct aatcttagct aaccctagaa atgaggtggg gaaagagtat780
atatagtcct agccaggaag gggtaagtga ggggcagaat gggaaagata gaaggccact840
tggccaactc tacgtgcaga cagaccggtt gtaccggttg tactataact atcgggtggt900
accggtcttg taccgctcga ttacagtaaa gtgtccaagc gaagcagtag tggaccggtt960
gtaccggtgg accggttgtt gaccggtagt ggactagttg taccagtttt cctgggctgg1020
cacaatcatc ttcttccttc tcttccatgc ttccctcccg gatggtgtag ttgtactctt1080
gtgtttggac tcctcgtcat ccataaagct atgacaatac ctatatatgc atacaagagg1140
agtgtcaagt agtataccat cctcgaaggg gtcaagtgaa cacgtgtaaa tgagatgagt1200
cacctttatg tacgtgaagt agatgttgca tgtgtcactt gccaaacgaa ctcttgacat1260
ggtgatgtct gtaggatgct ccacatcaca aacacattag tcccttaacc catttgtctt1320
caatactcca aaaccactta ggggcactag atgcacttac atttatacct ggaattttgc1380
ttgcaaagta acatatggta tctacctatc ttgctcatcc ccttgatgca ccactctgtt1440
agcgatactt cctagagtgt ttatctagtt cctctagcaa tggtaagtta agaagaactt1500
aagaactcct tcaattgtac gatcaaaatg ttggtgtcat ttgtaaagcc cttggacccc1560
caagttctga caagccttca ttaggaaatt gctttttgaa gcatgtagga gcaacaaagg1620
gggttctttt cgtaccttag atggatcatt ctgagccttc ttgaagagct aggcgccgaa1680
gctcccggcg attggcgatt gatccccgcc ggcatctgga tcttgctgtt tcagcaacca1740
agactagatc cagttcagta caaagaatgg aagaacaaaa aaacatgaca tgattcgatc1800
cttgcgctga ttttcttacc cgtcgaggat gtgggtgtgg tcacatggac aatgctgccg1860
atgtccccga caacccgcat gtttcctcct accttctgct tccatgtcgg gcccgcggca1920
catgcacatc atgaacgaga aacacgagta aaagcactac atgaacccct tatgaacgat1980
ttagcaatga acacaaaatt ctagtattta gacatgagaa tgccttgtac agaatttaaa2040
agtcatgaaa aacgttacct ctggtttggg tgtcgtgcaa ataaaacaga gataataaat2100
tccttatagc caatgtggtg aacatagcaa attgattccc ccgggtttga ttccatgtgc2160
tctagccaaa atagatcaaa tcagcaagat atcttatgct atgaatggtg atagtggtcg2220
ctcatgttca tctcgactgc cgaaatcatg tgcccttagc ggacgttgta ctcctcggca2280
gtggccacta tcaacgagcg gcggcagcca aggcgaaggg atccatgcag atcgtgagca2340
accgtccatg cgtggctgcg gcagaccgga gcacgagtag gaggcggcag attccaccat2400
ggaaggccga ggagtggcaa gggtagaggt ggatgcagga gggagggggg gggggagaaa2460
gggctggtgc tatggaccgc gggaggggag gacgtgccag tgacgaggga agcgaagggc2520
ggagcggcag gaggcctgtc gggtcgatga gatcccgtac agcagctcgc aacaaaccct2580
agctcgcgcg agaagagaga ggggatgttc ggatcaaaga gaggacgaga gaaaaccggc2640
gtggtaagaa aaatcgataa ggaaagaaca tcgtatgagt ggagaagggt gagacgaaaa2700
taaatcgaac gaaaataatc ataaagtgaa agctaccaag tccttcttta aaagtagaga2760
tcacatattc gcttagagga aagatgaagg ggtaggtgat gcgcccgcgg tgatgcactc2820
atcatgtcgc ttcccattta cgaaagcatt acctatgttt atcaagcgtt acatgggata2880
ggggatatac acaaacatgt tcctaaatta attaaaaaaa acatgtttct aaattgtgac2940
acagatcgat ggtccagaat ctacgtgtca caaaactaat tgggaagatt ttcgagaggt3000
gtatctcttg cagcgcagcg ggccagcggc agagaagccg aagcctagtg agctgtgttg3060
tcgtcgagtg tcgcgtgcgc cttctctttt gctttgcctc cctgttctcc caccccgagg3120
ggaaatgcat ttttaaaaac agggtaatcc cacctcgcct cggcgctccc caagccccgc3180
agcatcgcgt acgagtgcgt ataccgtatg tatctacagt gaggcggcgc ggggcaaggg3240
tttcgtctcc ggcggcggcg acggcggcgg cggcggcgga ggaggctaga tctgggaggg3300
atg 3303
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
cgttacctct ggtttgggtg tcgtg 25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
cacctctcga aaatcttccc aatta25
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gagaaagggc tggtgctatg ga 22
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gtaacgcttg ataaacatag gtaat25
<210>7
<211>418
<212>DNA
<213>中國春小麥(Triticum aestivum L)
<400>7
gagaaagggc tggtgctatg gaccgcggga ggggaggacg tgccagtgac gagggaagcg60
aagggcggag cggcaggagg cctgtcgggt cgatgagatc ccgtacagca gctcgcaaca120
aaccctagct cgcgcgagaa gagagagggg atgttcggat caaagagagg acgagagaaa180
accggcgtgg taagaaaaat cgataaggaa agaacatcgt atgagtggag aagggtgaga240
cgaaaataaa tcgaacgaaa ataatcataa agtgaaagct accaagtcct tctttaaaag300
tagagatcac atattcgctt agaggaaaga tgaaggggta ggtgatgcgc ccgcggtgat360
gcactcatca tgtcgcttcc catttacgaa agcattacct atgtttatca agcgttac 418
權(quán)利要求
1.一種輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的方法，是如下(a)或(b)
(a)檢測待測小麥的基因組DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸是A還是G，AA基因型小麥的千粒重和/或粒寬在統(tǒng)計學(xué)上大于GG基因型小麥；所述AA基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為G的純合體；
(b)檢測待測小麥的基因組DNA中序列7所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸是A還是G，AA基因型小麥的千粒重和/或粒寬在統(tǒng)計學(xué)上大于GG基因型小麥；所述AA基因型為序列7所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第254位脫氧核糖核苷酸為G的純合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括基因組DNA提取、PCR擴增和酶切。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟
(1)提取待測小麥的基因組DNA；
(2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增；所述引物對甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對；
(3)以步驟(2)的PCR產(chǎn)物為模板，用引物對乙進行PCR擴增；所述引物對乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對；
(4)用限制性內(nèi)切酶Taq I酶切步驟(3)的PCR產(chǎn)物；如果得到167bp的酶切產(chǎn)物，待測小麥為AA基因型；如果得到218bp的酶切產(chǎn)物，待測小麥為GG基因型。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于
所述步驟(2)中PCR擴增所用的聚合酶為pfu酶；PCR反應(yīng)程序為94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32個循環(huán)；72℃10min。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中PCR擴增所用的聚合酶為Taq酶；PCR反應(yīng)程序為94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32個循環(huán)；72℃10min。
6.如權(quán)利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，酶切條件為65℃、1h；用瓊脂糖凝膠電泳檢測所述酶切的酶切產(chǎn)物。
7.輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的專用引物，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對。
8.權(quán)利要求7所述專用引物在制備輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的試劑盒中的應(yīng)用。
9.一種輔助篩選不同千粒重小麥和/或不同粒寬小麥的試劑盒，包括權(quán)利要求7所述專用引物。
10.權(quán)利要求1至6中任一所述方法、權(quán)利要求7所述專用引物、權(quán)利要求9所述試劑盒在小麥育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選不同千粒重小麥的方法及其專用標(biāo)記。本發(fā)明公布的方法是檢測待測小麥基因組DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸是A還是G，確定待測小麥的基因型是AA還是GG；所述AA基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脫氧核糖核苷酸為G的純合體；AA基因型為小麥的優(yōu)異等位變異，其千粒重和/或粒寬高于GG基因型小麥。本標(biāo)記重復(fù)性好、成本低，在提高小麥千粒重(粒寬)的分子標(biāo)記輔助選擇和分子設(shè)計育種中具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK101775439SQ20101003399
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者宿振起, 郝晨陽, 王蘭芬, 董玉琛, 張學(xué)勇 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所